ΚΙΤ ΓΙΑ ΤΗ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΟΣΟΜΕΤΡΗΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ

ΚΙΤ ΓΙΑ ΤΗ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΟΣΟΜΕΤΡΗΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ IgM ANTI-HD Μέθοδος για τον ποιοτικό προσδιορισµό των ανοσοσφαιρινών IgM κατευθυνόµενων ενάντια του αντιγόνου του ιού της Ηπατίτιδας Delta (IgM anti-hd) σε δείγµατα ανθρώπινου ορού ή πλάσµατος Μόνο για χρήση in vitro 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ορολογική απόκριση στην οξεία λοίµωξη από ιό της ηπατίτιδας Delta (HDV) συνίσταται σε µια αρχική φάση κατά τη διάρκεια της οποίας το HDAg κυκλοφορεί στο αίµα, ακολουθούµενη από οροµετατροπή σε anti-hd. Η ιαιµία είναι µεταβατική και περιορισµένη στην πρώιµη φάση της λοίµωξης. Για το λόγο αυτό η δυνατότητα της ανίχνευσης του HDAg στο αίµα ελαττώνεται δραστικά µέσα στις επόµενες ηµέρες από την εµφάνιση της συµπτωµατολογίας. ιαφορετικά µε ό,τι συµβαίνει στην ηπατίτιδα Α και Β, η αντισωµατική απόκριση τύπου IgM (IgM anti-hd) εµφανίζεται πιο αργά και εµφανίζει λιγότερο υψηλούς τίτλους. Η πορεία της εξαρτάται κυρίως από τον τρόπο προσβολής της λοίµωξης, δηλαδή από το εάν πρόκειται για συλλοίµωξη από HBV/HDV (σε υγειή άτοµα) ή για υπερλοίµωξη σε φορείς HBsAg. Στη συλλοίµωξη από HBV/HDV συναντάται η παρουσία IgM anti-hd από ορισµένες ηµέρες µέχρι ορισµένες εβδοµάδες έπειτα από την εµφάνιση της συµπτωµατολογίας. Η οροµετατροπή σε IgG anti-hd πραγµατοποιείται αργότερα. Από τη στιγµή που οι IgM anti-hd αντιπροσωπεύουν την πρώτη και συνήθως τη µόνη παρατηρήσιµη αντισωµατική απόκριση κατά τη διάρκεια της οξείας φάσης της ασθένειας, αυτές αντιπροσωπεύουν τον δείκτη-επιλογή για την αναγνώριση της συλλοίµωξης από HBV/HDV σε περίπτωση οξείας ηπατίτιδας θετικής για HBsAg. Η επαναλαµβανόµενη δοσοµέτρηση για αρκετές εβδοµάδες βελτιώνει την πιθανότητα µιας ακριβούς διάγνωσης: µια λογική λύση συνίσταται σε µια πρώτη δοσοµέτρηση κατά την εµφάνιση της συµπτωµατολογίας, ακολουθούµενη από µια δεύτερη δύο εβδοµάδες αργότερα. Αυτό το σύστηµα επιτρέπει την αναγνώριση 35-50% επιπλέον συλλοιµώξεων από HBV/HDV σε σχέση µε µια απλή δοσοµέτρηση. Κατά κανόνα, η αντισωµατική απόκριση στην υπερλοίµωξη είναι πιο γρήγορη και παρουσιάζει ανώτερους τίτλους σε σχέση µε τη συλλοίµωξη. Οι IgM anti-hd είναι παρατηρήσιµες αµέσως µετά από την εµφάνιση της συµπτωµατολογίας και οι IgG anti- HD λίγο µετά. Για το λόγο αυτό η πορεία των IgM anti-hd είναι χρήσιµη για τη διαφορική διάγνωση ανάµεσα στη συλλοίµωξη και την υπερλοίµωξη. Ακόµα πιο σηµαντικό είναι το γεγονός ότι ενώ οι IgG συνήθως παραµένουν στο χρόνο, οι IgM anti-hd ελαττώνονται γρήγορα στις ηπατίτιδες D που µέλεται να θεραπευθούν και αυξάνονται αντιθέτως µέχρι σε υψηλούς τίτλους στις λοιµώξεις που εξελίσονται προς τη χρονιοποίηση. Για το λόγο αυτό η παραµονή της αντισωµατικής απόκρισης τύπου IgM δείχνει χρονιοποίηση της ασθένειας, Πράγµατι, η παρουσία και ο τίτλος των IgM anti-hd σχετίζονται µε την αντιγραφή του ιού και µε τη δραστηριότητα της φλεγµονής της ηπατικής ασθένειας που υφίσταται από κάτω. 2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΟΣΟΜΕΤΡΗΣΗΣ Η µέθοδος για τον ποιοτικό προσδιορισµό των ανοσοσφαιρινών IgM anti-hd είναι ανοσοενζυµικού τύπου (ELISA) και διαµορφώνεται ως µια ανοσοµετρική δοσοµέτρηση σύλληψης αντισωµάτων της οποίας το σχεδιάγραµµα παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. Η χρήση της δοσοµέτρησης HDAg που επιτυγχάνεται µε τεχνικές γενετικής µηχανικής και µε αποσπάσµατα µονοκλωνικών αντισωµάτων anti-hd επιτρέπει τη βελτίωση της αξιοπιστίας και της αναπαραγωγιµότητας της δοσοµέτρησης. 73

1 2 + επωάστε (µία ώρα στους 37 C) πλύνετε + 3 επωάστε (µία ώρα στους 37 C) πλύνετε 4 επωάστε (µία ώρα στους 37 C) πλύνετε + Εικόνα 1 ➀ Κοιλότητα ευαισθητοποιηµένη µε ανθρώπινες IgG anti-igm (µονοκλωνικές ποντικού). ➁ είγµα ή έλεγχος: IgM anti-hd. ➂ HDAg (Ανασυνδυασµένο DNA). ➃ Ενζυµατικός Ιχνηθέτης: Fab anti-hd (ανθρώπινες και µονοκλωνικές ποντικού) συνδυασµένες µε υπεροξειδάση ραφάνου (HRP). 74 επωάστε (30 min σε θερµοκρασία περιβάλλοντος) χρωµογενές/υπόστρωµα Ανάγνωση οργάνων σε 450/630 nm. αντιδραστήριο εµπλοκής

Η παρουσία ειδικών IgM anti-hd µεσολαβεί στο δεσµό του ιχνηθέτη στη στερά µορφή µέσω της παρεµβολής του HDAg. Η ενζυµική δραστηριότητα προκύπτει εποµένως ανάλογη µε τη συγκέντρωση των IgM anti-hd που υπάρχει στα δείγµατα ή στους ελέγχους. Η µέτρηση της ενζυµικής δραστηριότητας εκτελείται θέτοντας σε επαφή ένα άχρωµο διάλυµα χρωµογενούς/υποστρώµατος που, έπειτα από τη δράση του ενζύµου, παράγει ένα µετρήσιµο χρωµατισµό µέσω ενός φωτοµέτρου. 3. ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΑΞΕΣΟΥΑΡ 3.1. Αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ Ευαισθητοποιηµένα Strip 12 x 8 κοιλότητες Ενζυµατικός Ιχνηθέτης 1 φιαλίδιο, 0,4 ml Αρνητικός έλεγχος 1 φιαλίδιο, 3,3 ml Θετικός έλεγχος 1 φιαλίδιο, 3,3 ml rhdag 1 φιαλίδιο, 15 ml ιαλύτης του ιχνηθέτη 1 φιαλίδιο, 14,7 ml ιαλύτης δειγµάτων 2 φιαλίδια, 70 ml Ρυθµιστικό πλύσης 1 φιαλίδιο, 40 ml Χρωµογενές 1 φιαλίδιο, 9 ml Υπόστρωµα 1 φιαλίδιο, 9 ml Αντιδραστήριο εµπλοκής 1 φιαλίδιο, 30 ml Αριθµός δοσοµετρήσεων 96 ΤΡΟΠΟΣ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗΣ: Κατά τη στιγµή της άφιξης, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να διατηρούνται στους 2-8 C προστατευόµενα από το φως. Μην καταψύχετε. Έπειτα από το άνοιγµα, τα αντιδραστήρια αυτού του κιτ είναι σταθερά για οκτώ εβδοµάδες υπό κατάλληλη συντήρηση, εκτός και εάν επισηµαίνεται διαφορετικά. Το κιτ είναι σταθερό για µια εργάσιµη εβδοµάδα εάν χρησιµοποιηθεί κατά τη διάρκεια της ηµέρας για οκτώ ώρες σε θερµοκρασία περιβάλλοντος και εάν διατηρείται στους 2-8 C κατά τη διάρκεια της νύκτας. Μη χρησιµοποιείτε τα αντιδραστήρια πέραν της ηµεροµηνίας λήξεως. Η ηµεροµηνία λήξεως του κιτ φαίνεται στην εξωτερική ετικέτα. Η ηµεροµηνία λήξεως καθενός συστατικού φέρεται στις ετικέτες των αντίστοιχων φιαλιδίων. Μην αναµιγνύετε ειδικά αντιδραστήρια (βλέπε 4.a) που προέρχονται από διαφορετικές παρτίδες. Τα κοινά αντιδραστήρια (βλέπε 4.b) είναι εναλλάξιµα ανάµεσα στις διαφορετικές παρτίδες. 3.2. Υλικά που παρέχονται µε το κιτ 2 αυτοκόλλητα τυποποιηµένα χαρτόνια για strip 2 αυτοκόλλητα ολόκληρα τυποποιηµένα χαρτόνια για 12 strip (ένα τρυβλίο) Ρυθµιστής κλείστρου - σακιδίου για strip. 3.3. Υλικά και απαιτούµενα όργανα, τα οποία όµως δεν παρέχονται Φωτόµετρο κατακόρυφης ανάγνωσης (παράδειγµα ETI-SYSTEM reader) µε τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: Μήκος κύµατος: διπλό µήκος κύµατος, 450 nm και 620-630 nm Πλάτος ζώνης: 10 nm ιάστηµα απορρόφησης: από 0 έως 2,5 µονάδες απορρόφησης Επαναληπτικότητα καλύτερη από ή ίση µε 0,005 µονάδες απορρόφησης, ή 1% ανάλογα µε το ποια επιλογή είναι µεγαλύτερη Γραµµικότητα ή ακρίβεια: καλύτερη από ή ίση µε 0,010 µονάδες απορρόφησης, ή 2% ανάλογα µε το ποια επιλογή είναι µεγαλύτερη Εκτροπή: µικρότερη από 0,005 µονάδες απορρόφησης ανά ώρα. 75

Υγρός θάλαµος που ελέγχεται από θερµοστάτη µε τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: Θερµοκρασία: 37 C ± 1 C. Χειροκίνητη ή αυτόµατη συσκευή για την πλύση των κοιλοτήτων (παράδειγµα ETI- SYSTEM washer) µε τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: Κατανεµηµένος όγκος: 300-370 µl Αριθµός κύκλων πλύσης: 5 Χρόνος αναµονής: 30 δευτερόλεπτα. Αναρροφήστε το τελευταίο κλάσµα του κατανεµηµένου υγρού: sµ. Μικροµετρικές σύριγγες µε άκρα µίας χρήσεως των 10 µl (ακρίβεια ± 3%, επαναληπτικότητα 2%), 100 µl (ακρίβεια ± 2%, επαναληπτικότητα 1%). Γυάλινα είδη εργαστηρίου. Απεσταγµένο νερό. Τα όργανα ETI-LAB ή ETI-MAX 3000 µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την αυτόµατη εκτέλεση του τεστ. 4. ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Όλες οι µονάδες ορού και πλάσµατος που χρησιµοποιούνται για την κατασκευή των συστατικών αυτού του κιτ έχουν αναλυθεί και έχει βρεθεί ότι δεν είναι αντιδραστικές για HBsAg, anti-hcv και anti-hiv-1/2, εκτός από το υλικό που είναι θετικό για anti-hd, και που είναι αντιδραστικό για HBsAg και anti-hcv. Η παρουσία HBsAg και HCV στα αντιδραστήρια του κιτ, παρ όλα αυτά, αποκλείεται, διότι το HBsAg έχει αποµακρυνθεί µέσω καθαρισµού και το HCV-RNA είναι αρνητικό. Παρ όλα αυτά, από τη στιγµή που καµία µέθοδος δεν µπορεί να δώσει απόλυτη σιγουριά για το ότι απουσιάζουν παθογόνοι παράγοντες, όλο το υλικό ανθρώπινης προέλευσης θα πρέπει να θεωρείται δυνητικώς µολυσµατικό και να µεταχειρίζεται καταλλήλως. Το κιτ χρησιµοποιεί HDAg που επιτυγχάνεται µε τεχνικές γενετικής µηχανικής και χιµαιρικές IgM anti-hd και αποφεύγει τη χρήση υψηλά µολυσµατικού υλικού ανθρώπινης προέλευσης. a) ΕΙ ΙΚΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΤΟΥ ΚΙΤ 4.1. Ευαισθητοποιηµένα Strip Οι κοιλότητες είναι ευαισθητοποιηµένες µε µονοκλωνικές IgG ποντικού, ανθρώπινες anti- IgM ειδικές για τις αλυσίδες µ. Τα strip, έτοιµα πλέον προς χρήση, πρέπει να διατηρηθούν στους 2-8 C. Κλιµατίστε σε θερµοκρασία περιβάλλοντος πριν να ανοίξετε το σακίδιο, ώστε να αποφύγετε τη συµπύκνωση υγρασίας στις κοιλότητες. Τα µη χρησιµοποιηµένα strip πρέπει να επανατοποθετηθούν στο σακίδιο το οποίο θα κλεισθεί ερµητικά και θα διατηρηθεί στους 2-8 C. 4.2. Ενζυµατικός Ιχνηθέτης (συζευγµένος 50x) Το φιαλίδιο περιέχει 0,4 ml από αποσπάσµατα ανθρώπινων αντισωµάτων Fab anti-hd και µονοκλωνικά ποντικού συζευγµένα µε το ένζυµο υπεροξειδάση ραφάνου (HRP), ρυθµιστικό TRIS, BSA, σταθεροποιητικά και συντηρητικά. Πριν τη χρήση, αραιώστε το διάλυµα µε έναν παράγοντα 50 µε το διαλύτη του ιχνηθέτη (4.6) (παράδειγµα 100 µl ιχνηθέτη + 4,9 ml διαλύτη). Προετοιµάστε την επαρκή ποσότητα του αραιωµ ένου ιχνηθέτη για τη δοσοµ έτρηση και διατηρήστε τον συµπυκνωµένο ιχνηθέτη στους 2-8 C. Ο αραιωµένος ενζυµατικός ιχνηθέτης µπορεί να διατηρηθεί στους 2-8 C για µία εβδοµάδα. 4.3. Αρνητικός έλεγχος Το φιαλίδιο περιέχει 3,3 ml ανθρώπινου ορού/πλάσµατος µη αντιδραστικού για anti-hd, αραιωµένο µε ρυθµιστικό PBS, BSA, σταθεροποιητικά, συντηρητικά και µια µπλε αδρανή 76

χρωστική. Το αντιδραστήριο, έτοιµο πλέον προς χρήση, πρέπει να διατηρηθεί στους 2-8 C. 4.4. Θετικός έλεγχος Το φιαλίδιο περιέχει 3,3 ml χιµαιρικές IgM anti-hd, αραιωµένες µε ρυθµιστικό PBS, BSA, σταθεροποιητικά, συντηρητικά και µια µπλε αδρανή χρωστική. Το αντιδραστήριο, έτοιµο πλέον προς χρήση, πρέπει να διατηρηθεί στους 2-8 C. 4.5. rhdag Το φιαλίδιο περιέχει 15 ml ανασυνδυασµένου αντιγόνου της ηπατίτιδας D, εµβρυικό βόειο ορό, ρυθµιστικό φοσφωρικό-κιτρικό και συντηρητικά. Το αντιδραστήριο, έτοιµο πλέον προς χρήση, πρέπει να διατηρηθεί στους 2-8 C. 4.6. ιαλύτης του ιχνηθέτη Το φιαλίδιο περιέχει 14,7 ml ανθρώπινου ορού/πλάσµατος, ρυθµιστικό PBS, εµβρυικό βόειο ορό και συντηρητικά. Το αντιδραστήριο, έτοιµο πλέον προς χρήση, πρέπει να διατηρηθεί στους 2-8 C. Το διάλυµα χρησιµοποιείται για την αραίωση του ενζυµικού ιχνηθέτη (4.2). 4.7. ιαλύτης δειγµάτων Κάθε φιαλίδιο περιέχει 70 ml ρυθµιστικού PBS, ανθρώπινες µη ειδικές IgG, µη ειδικές µονοκλωνικές IgG ποντικού, BSA, σταθεροποιητικά, συντηρητικά και µια αδρανή µπλε χρωστική. Το αντιδραστήριο, έτοιµο πλέον προς χρήση, πρέπει να διατηρηθεί στους 2-8 C. Το διάλυµα χρησιµοποιείται για την αραίωση των δειγµάτων πριν από τη δοσοµέτρηση. b) ΚΟΙΝΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑΜΕ ΑΛΛΑ KIT ETI 4.8. Ρυθµιστικό πλύσης (25x) Το φιαλίδιο περιέχει 40 ml ενός ρυθµιστικού διαλύµατος PBS, Tween 20 και συντηρητικά. Φέρατε σε όγκο ενός λίτρου µε απεσταγµένο νερό ολόκληρο το περιεχόµενο του φιαλιδίου. Το αραιωµένο διάλυµα είναι σταθερό στους 2-8 C για µια εβδοµάδα και χρησιµοποιείται για την πλύση των κοιλοτήτων. Όταν το συµπυκνωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης διατηρείται στους 2-8 C, όπως στο ακόµα κλειστό κιτ, µπορούν να δηµιουργηθούν κρύσταλλοι.σε αυτήν την περίπτωση διαλύστε στους 37 C και αναµίξτε καλά πριν να αραιώσετε. 4.9. Χρωµογενές Το φιαλίδιο περιέχει 9 ml ενός παραγώγου της τετραµεθυλβενζιδίνης σε διάλυµα ρυθµιστικού κιτρικού. Πριν τη χρήση, αναµίξτε το διάλυµα µε αναλογία 1:1 µε το υπόστρωµα (4.10). 4.10. Υπόστρωµα Το φιαλίδιο περιέχει 9 ml ενός ρυθµιστικού διαλύµατος κιτρικού που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου. Πριν τη χρήση, αναµίξτε το διάλυµα µε αναλογία 1:1 µε το υπόστρωµα (4.9) (παράδειγµα 1 ml χρωµογενούς + 1 ml υποστρώµατος). Προετοιµάστε την επαρκή ποσότητα χρωµογενούς/υποστρώµατος για τη δοσοµέτρηση και διατηρήστε τα αντιδραστήρια στους 2-8 C. Το µίγµα χρωµογενούς/υποστρώµατος είναι σταθερό για 8 ώρες σε θερµοκρασία περιβάλλοντος, υπό προστασία από το φως. Το διάλυµα πρέπει να είναι άχρωµο ή ελαφρώς θαλασσί. 77

4.11. Αντιδραστήριο εµπλοκής Το φιαλίδιο περιέχει 30 ml ενός διαλύµατος θειϊκού οξέως 1 Ν (R 36/38, S 26). Το αντιδραστήριο, έτοιµο πλέον προς χρήση, πρέπει να διατηρηθεί στους 2-8 C. 5. ΕΞΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Η δοσοµέτρηση µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε δείγµατα άνθρώπινου ορού ή πλάσµατος. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν αντιπηκτικά όπως το κιτρικό, EDTA και ηπαρίνη. Πραγµατοποιήστε την αιµοληψία από φλέβα, αφήστε το αίµα να πήξει και διαχωρήστε τον ορό από το θρόµβο το συντοµότερο δυνατόν. Καθαρίστε µε φιλτράρισµα ή φυγοκέντριση πριν από το τεστ τα δείγµατα που παρουσιάζουν υλικό σε αιώρηση, λευκαύγεια, λιπαιµία ή ερυθροκυτταρικά υπόλοιπα. Μη χρησιµοποιείτε δείγµατα που έχουν υποστεί ισχυρή αιµόλυση ή λιπαιµικά, ούτε επίσης και δείγµατα που παρουσιάζουν υλικό σε αιώρηση ή προφανή µόλυνση από µικρόβια. Εάν η δοσοµέτρηση έχει εκτελεσθεί στις επόµενες 48 ώρες από την αιµοληψία, τα δείγµατα µπορούν να διατηρηθούν στους 2-8 C. Σε αντίθετη περίπτωση, πρέπει να διαιρεθούν σε κατεψυγµένα κλάσµατα στους 20 C ή σε κατώτερες θερµοκρασίες. Εάν τα δείγµατα έχουν κατεψυχθεί, ανακινήστε µε προσοχή πριν να τα δοσοµετρήσετε. Αποφεύγετε επαναλαµβανόµενους κύκλους ψύξης και απόψυξης. Μη δοσοµετρείτε δείγµατα απενεργοποιηµένα µε θερµότητα. Αραίωση των δειγµάτων Τα δείγµατα πρέπει να είναι αραιωµένα µε αναλογία 1:100 µε το διαλύτη δειγµάτων (4.7) πριν από τη δοσοµέτρηση (παράδειγµα 10 µl δείγµατος + 1 ml διαλύτη δειγµάτων). Αναδεύστε σε Vortex ώστε να επιτύχετε ένα οµοιογενές µίγµα. Μην αραιώνετε τον αρνητικό και θετικό έλεγχο. 6. ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΙΑΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ Κλιµατίστε τα αντιδραστήρια σε θερµοκρασία περιβάλλοντος (20-25 C) πριν από τη δοσοµέτρηση. Εκτελέστε τις φάσεις της δοσοµέτρησης µε την προβλεπόµενη σειρά, χωρίς διακοπές. Αποµονώστε τα απαραίτητα strip για να πραγµ ατοποιήσετε τη δοσοµ έτρηση, προβλέποντας τον προσδιορισµό εις τριπλούν του αρνητικού ελέγχου, εις διπλούν του θετικού ελέγχου και εις απλούν των δειγµάτων. Πρέπει να εκτελεσθεί ο προσδιορισµός του αρνητικού και θετικού ελέγχου για κάθε τρυβλίο που εµπεριέχει τα δείγµατα. Η επιχειρησιακή µέθοδος πρέπει να είναι αυστηρά όµοια για τους ελέγχους και για τα δείγµατα υπό εξέταση. Προβλέψατε µια ελεύθερη κοιλότητα για τη µέτρηση της τιµής του λευκού του υποστρώµατος που οφείλεται στο αντιδραστήριο χρωµογόνο/υπόστρωµα. Χρησιµοποιήστε µια νέα άκρη µίας χρήσεως για να διανήµετε τους ελέγχους και τα δείγµατα. 78

Ταυτοποιήστε τις κοιλότητες αντίδρασης για τη δοσοµέτρηση των ελέγχων και των δειγµάτων. Σας συνιστούµε να διανήµετε τους ελέγχους και τα δείγµατα σύµφωνα µε το ακόλουθο σχεδιάγραµµα: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A BLK S3 A B NC S4 B C NC C D NC D E PC E F PC F G S1 G H S2 O Υπόµνηµα: = κοιλότητα NC = αρνητικός έλεγχος BLK = λευκό PC = θετικός έλεγχος S = δείγµατα. Ρυθµίστε τη θερµοκρασία του συστήµατος του θερµοστάτη στους 37 ± 1 C. 1. ιανήµετε 100 µl αρνητικού ελέγχουκαι θετικού ελέγχου στις αντίστοιχες κοιλότητες. ιανήµετε 100 µl δειγµάτων αραιωµένων 1:100 στις αντίστοιχες κοιλότητες. 2. Σφραγίστε τα strip µε το ειδικό αυτοκόλλητο χαρτόνι ώστε να αποφύγετε την εξάτµιση. Ανακινήστε ελαφρά ώστε να αποβάλλετε πιθανές φυσαλίδες αέρα. 3. Αφήστε για επώαση για µία ώρα ± 5 min στους 37 ± 1 C. 4. Στο τέλος της επώασης, αποβάλλετε το αυτοκόλλητο χαρτόνι και εκτελέστε την πλύση των strip µε ειδική αυτόµατη ή ηµιαυτόµατη συσκευή. Αναρροφήστε το µέσο αντίδρασης και πραγµατοποιήστε πέντε πλύσεις µε έναν όγκο ρυθµιστικού πλύσης που να κυµαίνεται ανάµεσα στα 0,30 και στα 0,37 ml. Αποφύγετε τη διαρροή υγρού από τις κοιλότητες. Πραγµατοποιήστε τους πέντε κύκλους πλύσης µε ένα χρονικό διάστηµ α 30 sec ανάµ εσα σε κάθε φάση απόθεσης/ αναρρόφησης, είτε χρησιµοποιείται αυτόµατη συσκευή πλύσης είτε ηµιαυτόµατη. Στο τέλος της πλύσης, αναστρέψτε τα strip πάνω σε απορροφητικό χαρτί και ανακινήστε τα ελαφρά ώστε να αποβάλλετε κάθε πλεόνασµα υγρού από τις κοιλότητες. Για να αποφύγετε την εξάτµιση, αφήστε τα strip αναποδογυρισµένα πάνω σε απορροφητικό χαρτί µέχρι τη διανοµή του επόµενου αντιδραστηρίου. 5. ιανήµετε 100 µl διαλύµατος HDAg σε όλες τις κοιλότητες εκτός από εκείνο του λευκού. Επαναλάβετε την επέµβαση που περιγράφεται στο σηµείο 2. 6. Αφήστε για επώαση για µία ώρα ± 5 min στους 37 ± 1 C. 7. Προετοιµάστε το διάλυµα του αραιωµένου ενζυµατικού ιχνηθέτη (4.2 + 4.6) πριν τη δεύτερη επώαση. 8. Επαναλάβετε την επέµβαση που περιγράφεται στο σηµείο 4. H 79

9. ιανήµετε 100 µl αραιωµένου ενζυµατικού ιχνηθέτη σε όλες τις κοιλότητες εκτός από εκείνο του λευκού. Επαναλάβετε την επέµβαση που περιγράφεται στο σηµείο 2. 10. Αφήστε για επώαση για µία ώρα ± 5 min στους 37 ± 1 C. 11. Προετοιµάστε το χρωµογενές/υπόστρωµα (4.9 + 4.10) πριν το τέλος της τρίτης επώασης. 12. Επαναλάβετε την επέµβαση που περιγράφεται στο σηµείο 4. 13. ιανήµετε 100 µl του διαλύµατος χρωµογόνου/υποστρώµατος σε όλες τις κοιλότητες. 14. Αφήστε για επώαση για 30 ± 2 min σε θερµοκρασία περιβάλλοντος αποφεύγοντας την έκθεση των strip σε έντονο φως. 15. ιανήµετε 100 µl του διαλύµατος εµπλοκής σε όλες τις κοιλότητες ακολουθώντας την ίδια σειρά που χρησιµοποιήθηκε για τη διανοµή του χρωµογόνου/υποστρώµατος και εφαρµόζοντας τα ίδια χρονικά διαστήµατα. 16. Μετρήστε την απορρόφηση του διαλύµατος που περιέχεται σε κάθε κοιλότητα σε 450/630 nm εντός µιας ώρας από την προσθήκη του διαλύµατος εµπλοκής. είγµατα που περιέχουν ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις αναλύτη µπορούν παρ όλα αυτά να δηµιουργήσουν ιζήµατα µε επακόλουθη µείωση των αρχικών τιµών απορρόφησης. Αυτό δεν συνεπάγεται κανένα κίνδυνο εσφαλµένης ταξινόµησης των δειγµάτων. Σε αυτές τις περιπτώσεις οι αναγνώσεις που έχουν πραγµατοποιηθεί µέσα στα πρώτα λεπτά από την προσθήκη του διαλύµατος εµπλοκής, προκύπτουν ακριβέστερες. Όταν χρησιµοποιούνται τα ειδικά όργανα, οι τιµές απορρόφησης παρέχονται αυτόµατα επιλέγοντας το σωστό πρωτόκολλο. Όταν χρησιµοποιείται ένα διαφορετικό φωτόµετρο κατακόρυφης ανάγνωσης, µηδενίστε το όργανο µπροστά από την κοιλότητα του λευκού, διαβάστε την απορρόφηση του περιεχόµενου των κοιλοτήτων στα µήκη κύµατος 450/630 nm και αφαιρέστε την τιµή απορρόφησης στα 630 nm από εκείνη στα 450 nm. Τα όργανα ETI-LAB ή ETI-MAX 3000 µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την αυτόµατη εκτέλεση του τεστ. 7. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 7.1. Καθορισµός της οριακής τιµής Η οριακή τιµή επιτυγχάνεται αθροίζοντας 0,100 στο µέσο όρο απορρόφησης του αρνητικού ελέγχου (NC x ). Οριακή τιµή = NC x + 0,100. 7.2. Κριτήρια αποδοχής της δοσοµέτρησης ραστικοποιήστε τη δοσοµέτρηση όπως ακολουθεί πριν να πραγµατοποιήσετε την εκτίµηση των αποτελεσµάτων. Υπολογίστε και εκτιµήστε το µέσο όρο των ελέγχων κάθε τρυβλίου, ακόµα και εάν εκείνοι ανήκουν σε µία µοναδική παρτίδα. Η διαφορά ανάµεσα στην απορρόφηση του θετικού ελέγχου και στην απορρόφηση του αρνητικού ελέγχου πρέπει να είναι ανώτερη ή ίση του 0,300. PC x NC x 0,300. Εάν δεν συµβαίνει αυτό, δεν µπορεί να γίνει αποδεκτή η δοσοµέτρηση και πρέπει να επαναληφθεί. 7.3. Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Η παρουσία ή ή απουσία IgM anti-hd καθορίζεται συγκρίνοντας την τιµή απορρόφησης των δειγµάτων µε την οριακή τιµή. Τα δείγµατα µε απορρόφηση ανώτερη ή ίση µε την οριακή τιµή πρέπει να θεωρούνται αντιδραστικά για IgM anti-hd. Τα δείγµατα µε απορρόφηση κατώτερη από την την οριακή τιµή πρέπει να θεωρούνται µη αντιδραστικά. 80

Σας συνιστούµε να επαναλάβετε το τεστ στα δείγµατα µε τιµές απορρόφησης που κυµαίνονται στο ± 10% της οριακής τιµής, ώστε να επιτύχετε επιβεβαίωση του πρώτου αποτελέσµατος. Εάν ένα δείγµα επαναλαµβάνει να είναι αντιδραστικό πρέπει να θεωρείται θετικό. Εάν ένα δείγµα δεν είναι αντιδραστικό στο δεύτερο τεστ, πρέπει να θεωρείται αρνητικό. 7.4. Παράδειγµα υπολογισµού Οι ακόλουθες τιµές πρέπει να θεωρηθούν µόνο ένα παράδειγµα και δεν πρέπει να χρησιµοποιηθούν ανάµεσα στα στοιχεία που θα προκύψουν στο χρήστη. Απορρόφηση του αρνητικού ελέγχου Αρνητικός έλεγχος Καθαρή απορρόφηση σε 450/630 nm 1 0,038 2 0,027 3 0,032 Μέσος όρος απορρόφησης, NC x = 0,032. Απορρόφηση του θετικού ελέγχου Θετικός έλεγχος Καθαρή απορρόφηση σε 450/630 nm 1 1,092 2 1,048 Μέσος όρος απορρόφησης, PC x = 1,070. Οριακή τιµή (NC x + 0,100) = 0,032 + 0,100 = 0,132. ιαφορά ανάµεσα σε θετικό και αρνητικό έλεγχο (P N) = 1,070 0,032 = 1,038. Στο παράδειγµα που παρουσιάστηκε η διαφορά ανάµεσα σε θετικό και αρνητικό έλεγχο είναι µεγαλύτερη του 0,300. Για το λόγο αυτό είναι αποδεκτή και τα δεδοµένα πρέπει να θεωρηθούν έγκυρα. Ανάλυση του δείγµατος υπό εξέταση είγµα 1 = απορρόφηση 0,834 είγµα 2 = απορρόφηση 0,061 Το δείγµα 1 προκύπτει αντιδραστικό για IgM anti-hd και το δείγµα 2 προκύπτει µη αντιδραστικό, από τη στιγµή που η οριακή τιµή είναι 0,132. 8. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΠΙ ΟΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΙΤ 8.1. Ειδικότητα ανάλυσης Η αναλυτική ειδικότητα ορίζεται σαν η ικανότητα του τεστ να ανιχνεύει ακριβώς τον αναλύτη παρουσία παραγόντων δυνητικά παρεµβαλλόντων στο στέλεχος του δείγµατος (για παράδειγµα, αντιπηκτικά, αιµόλυση, αποτελέσµατα της επεξεργασίας του δείγµατος), ή διασταυρωτές αντιδράσεις µε αντισώµατα δυνητικώς παρεµβάλλοντα. Μελέτες που έχουν ελεγχθεί σχετικά µε παράγοντες δυνητικώς παρεµβάλοντες, έχουν αποδείξει το ότι οι επιδόσεις του τεστ δεν επηρεάζονται από αντιπηκτικά (EDTA, ηπαρίνη, κιτρικό), λιπαιµία (µέχρι 3000 mg/dl τριγλυκερίδια), χολερυθριναιµία (µέχρι 100 mg/dl χολερυθρίνη), ή από την παρουσία αντισωµάτων εναντίων άλλων παθογόνων παραγόντων. Οι τιµές απορρόφησης που επιτυγχάνονται µε δείγµατα που περιέχουν 1000 mg/dl αιµοσφαιρίνης προκύπτουν περίπου 18% ανώτερες από εκείνες που επιτυγχάνονται µε φυσιολογικά δείγµατα. 81

8.2. Επαναληπτικότητα Η επαναληπτικότητα και η αναπαραγωγιµότητα του δείγµατος (ή αλλιώς η δια-δειγµατική και ενδο-δειγµατική µεταβλητότητα) έχουν καθοριστεί χρησιµοποιώντας δείγµατα αναφοράς (από A σε C) υπό διαφορετικές συγκεντρώσεις αναλύτη. Η παρατηρούµενη µεταβλητότητα δεν έχει προκαλέσει λανθασµένη ταξινόµηση των δειγµάτων. Επαναληπτικότητα Pool A Pool B Pool C Αριθµός καθορισµών 22 22 22 Μέσος όρος απορρόφησης 0,139 0,440 1,076 Τυπική απόκλιση 0,012 0,020 0,058 Βαθµός µεταβολής % 8,3 4,5 5,4 Αναπαραγωγιµότητα Pool A Pool B Pool C Αριθµός καθορισµών 66 66 66 Μέσος όρος απορρόφησης 0,151 0,421 1,023 Τυπική απόκλιση 0,021 0,040 0,076 Βαθµός µεταβολής % 13,7 9,5 7,4 8.3. ιαγνωστική ειδικότητα Η διαγνωστική ειδικότητα του τεστ ορίζεται σαν η πιθανότητα του τεστ να παρέχει ένα αρνητικό αποτέλεσµα απουσία του ειδικού αναλύτη. Η διαγνωστική ειδικότητα έχει προσδιοριστεί δοσοµετρώντας 603 επιλεγµένα δείγµατα από ένα πληθυσµό πιθανότατα αρνητικό για IgM anti-hd (αιµοδότες, ασθενείς σε αιµ οκάθαρση, ασθενείς που πάσχουν από λοιµ ώδεις ασθένειες µε παρόµ οια συµπτωµατολογία, όπως λοίµωξη από HBV οξεία ή χρόνια και προηγούµενη λοίµωξη από HDV, ασθενείς που πάσχουν από άλλες λοιµώδεις ασθένειες, ασθενείς που πάσχουν από αυτοάνοσες ασθένειες, θετικά άτοµα για τον ρευµατοειδή παράγοντα, για ετερόφιλα αντισώµατα ή αντισώµατα anti-hrp). Στον πληθυσµό που µελετήθηκε έξι δείγµατα προέκυψαν θετικά - διαγνωστική ειδικότητα: 99,00% (περιθώριο εµπιστοσύνης στο 95%: 97,85-99,64%). 8.4. ιαγνωστική ευαισθησία Η διαγνωστική ευαισθησία ορίζεται σαν η πιθανότητα του τεστ να παρέχει ένα θετικό αποτέλεσµα παρουσία του ειδικού αναλύτη. Η διαγνωστική ευαισθησία έχει αξιολογηθεί δοσοµετρώντας 210 επιλεγµένα δείγµατα από ένα πληθυσµό µάλλον θετικό για IgM anti-hd (ασυµπτωµατικοί φορείς HBsAg και ασθενείς µε λοίµωξη από HBV και HDV οξεία ή χρόνια). Στον πληθυσµό που µελετήθηκε ένα δείγµα προέκυψε αρνητικό - διαγνωστική ευαισθησία: 99,52% (περιθώριο εµπιστοσύνης στο 95%: 97,38-99,99%). 8.5. Αποτέλεσµα κορεσµού σε υψηλές δόσεις Όταν δοσοµετρούνται δείγµατα που περιέχουν εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις αντισωµάτων, είναι δυνατόν να επιτευχθούν φαινοµενικά κατώτερα επίπεδα αντισώµατος ως αποτέλεσµα του κορεσµού. Μια τελειοποιηµένη µέθοδος δύο ανοσολογικών επωάσεων αποκλείει όµως το να επιτυγχάνονται αποτελέσµατα χονδροειδώς υποτιµηµένα, διότι το αναλυτικό σήµα παραµένει πάντα υψηλό (καµπύλη κορεσµού). Η πιθανή παρουσία µιας επίδρασης προ-ζώνης έχει αξιολογηθεί αναλύοντας τέσσερα θετικά δείγµατα για IgM anti-hd υψηλού τίτλου. Όλα τα δείγµατα παρουσίασαν τιµές απορρόφησης πολύ υψηλές, όπως αναµένεται από δείγµατα υψηλού τίτλου, δείχνοντας ότι δεν υπάρχει επίδραση προ-ζώνης και ότι η ταξινόµηση των δειγµάτων παραµένει εποµένως σωστή. 82

9. ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΟΣΟΜΕΤΡΗΣΗΣ Η βακτηριδιακή µόλυνση των δειγµάτων, επαναλαµβανόµενοι κύκλοι ψύξης/απόψυξης ή αδρανοποίηση λόγω θερµότητας µπορούν να µεταβάλλουν τις τιµές απορρόφησης µε επακόλουθη αλλοίωση των επιπέδων των IgM anti-hd. Η διάγνωση µιας λοιµώδους ασθένειας δεν πρέπει να διατυπώνεται µε βάση το αποτέλεσµα µιας µοναδικής δοσοµέτρησης, αλλά χρειάζεται να λαµβάνεται υπ όψην το ιστορικό και η συµπτωµατολογία του ασθενούς εκτός από τα ορολογικά στοιχεία. 10. ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΛΑΞΕΙΣ Για να επιτευχθούν αξιόπιστα αποτελέσµατα χρειάζεται να ακολουθούνται πιστά οι οδηγίες χρήσεως και να κατέχεται µια κατάλληλη τεχνική χειρογνωσία. Ειδικότερα, είναι σηµαντικό το να γίνεται προσεκτική και ακριβής διανοµή των αντιδραστηρίων, όπως επίσης το ίδιο πρέπει να συµβαίνει και στην περίπτωση της αναρρόφησης και της πλύσης. Αποτελέσµατα που δεν προκύπτουν αντιδραστικά κατ επανάληψη οφείλονται σε παράγοντες που έχουν σχέση µε τη µεθοδολογία όπως για παράδειγµα: εναλλαγή στις κάψουλες ανάµεσα στα φιαλίδια χρήση του ίδιου άκρου µικροσύριγγας για τις αναλήψεις από διαφορετικά φιαλίδια ή από διαφορετικά δείγµατα. έκθεση των αντιδραστηρίων ή των δειγµάτων σε έντονη θερµότητα, ή σε ισχυρές πηγές βακτηριακής µόλυνσης. ανεπαρκής πλύση των κοιλοτήτων µόλυνση του άκρου των κοιλοτήτων µε τον ιχνηθέτη ή µε τα δείγµατα εναλλαγή των ειδικών αντιδραστηρίων προερχόµενων από διαφορετικές παρτίδες. Είναι απαραίτητες οι ακόλουθες προφυλλάξεις: στην περίπτωση που χρησιµοποιείται ειδικό όργανο για τον ενζυµατικό ιχνηθέτη, φυλάξτε το όργανο αυτό για αυτό µόνο το σκοπό ώστε να αποφύγετε την µόλυνσή του. διατηρείτε το ρυθµιστικό πλύσης σε καθαρά δοχεία ώστε να προλάβετε µολύνσεις που να αναστέλλουν την ενζυµατική δραστηριότητα. χρησιµοποιείτε γυάλινα υλικά προσεκτικά καθαρά για την αραίωση του χρωµογενούς/ υποστρώµατος. 11. ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Να χειρίζεστε µε προσοχή το χρωµογόνο, το υπόστρωµα και το αντιδραστήριο εµπλοκής. Αποφεύγετε οποιαδήποτε επαφή αυτών µε οξειδωτικούς παράγοντες ή µεταλλικά υλικά. Μην τρώτε, πίνετε, καπνίζετε ή χρησιµοποιείτε καλλυντικά κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης της δοσοµέτρησης. Μην πραγµατοποιείτε αναρρόφηση µε το στόµα. Αποφεύγετε την άµεση επαφή µε τα υλικά που ενδεχοµένως να είναι µολυσµένα, φορώντας κατάλληλη ένδυση εργαστηρίου, προστατευτικά γυαλιά και γάντια µίας χρήσεως. Πλένετε προσεκτικά τα χέρια στο τέλος της δοσοµέτρησης. Αποφεύγετε να προκαλείτε πιτσιλίσµατα ή αεροζόλ. Κάθε σταγόνα βιολογικού αντιδραστηρίου πρέπει να αποβάλλεται µε ένα διάλυµα υποχλωριώδους νατρίου 5% και το χρησιµοποιούµενο µέσο θα πρέπει να τυγχάνει µεταχείρισης κατάλληλης για µολυσµένα απόβλητα. Όλα τα δείγµατα, όλα τα βιολογικά αντιδραστήρια του κιτ και όλα τα υλικά που χρησιµοποιούνται για την πραγµατοποίηση της δοσοµέτρησης θα πρέπει να θεωρούνται ικανά να µεταδώσουν µολυσµατικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό τα απόβλητα πρέπει να διατεθούν σύµφωνα µε τις νοµοθετικές διατάξεις και τους ισχύοντες κανονισµούς κάθε Κράτους. Τα υλικά µίας χρήσεως θα πρέπει να 83

αποτεφρώνονται. Τα υγρά απόβλητα θα πρέπει να απολυµαίνονται µε υποχλωριώδες νάτριο σε µία τελική συγκέντρωση της τάξεως του 5% για τουλάχιστον µισή ώρα. Τα υγρά απόβλητα που περιέχουν οξύ πρέπει να εξουδετερώνονται πριν την αποβολή τους. Οποιοδήποτε υλικό που πρέπει να επαναχρησιµοποιηθεί θα πρέπει να τίθεται σε κλίβανο µε µια προσέγγιση overkill (USP 24, 2000, p. 2143). Γενικά θεωρείται ότι µία ώρα στους 121 C είναι ένας επαρκής χρόνος αποστείρωσης. Παρ όλα αυτά συνιστούµε σε κάθε χρήστη να επιβεβαιώνεται σχετικά µε την αποτελεσµατικότητα του κύκλου απολύµανσης µέσω µιας αρχικής επικύρωσης και την χρήση,σε βάση ρουτίνας, βιολογικών δεικτών. Αντιδραστήριο εµπλοκής (Council Directive 99/45/EC): R 36/38 Ερεθιστικό για τα µάτια και το δέρµα. S 26 Σε περίπτωση επαφής µε τα µάτια, πλύνετε αµέσως µε άφθονο νερό και συµβουλευθείτε ιατρό. 84

ΣΧΕ ΙΑΓΡΑΜΜΑ ΤΗΣ ΟΣΟΜΕΤΡΗΣΗΣ 1 - ΑΡΑΙΩΣΤΕ ΤΑ ΕΙΓΜΑΤΑ 1:100 ΜΕ ΤΟ ΙΑΛΥΤΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ 1 - ΙΑΝΗΜΕΤΕ ΤΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΣΤΙΣ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΕΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΕΣ, ΕΚΤΟΣ ΑΠΟ ΕΚΕΙΝΟ ΤΟΥ ΛΕΥΚΟΥ, ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΟ ΑΚΟΛΟΥΘΟ ΣΧΕ ΙΑΓΡΑΜΜΑ: ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΟΙΛΟΤΗΤΕΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (3x) ΘΕΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (2x) ΕΙΓΜΑΤΑ (1x) ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ 100 µl ΘΕΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ 100 µl ΑΡΑΙΩΜΕΝΑ ΕΙΓΜΑΤΑ 100 µl 2 - ΑΦΗΣΤΕ ΓΙΑ ΕΠΩΑΣΗ ΜΙΑ ΩΡΑ ΣΤΟΥΣ 37 C. 3 - ΑΝΑΡΡΟΦΗΣΤΕ ΤΟΥΣ ΕΛΕΓΧΟΥΣ ΚΑΙ ΤΑ ΕΙΓΜΑΤΑ ΚΑΙ ΠΛΥΝΕΤΕ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΑ ΜΕ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΠΛΥΣΗΣ. 4 - ΙΑΝΗΜΕΤΕ 100 µl HDAg ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΕΣ ΕΚΤΟΣ ΑΠΟ ΕΚΕΙΝΗ ΤΟΥ ΛΕΥΚΟΥ. 5 - ΑΦΗΣΤΕ ΓΙΑ ΕΠΩΑΣΗ ΜΙΑ ΩΡΑ ΣΤΟΥΣ 37 C. 6 - ΑΝΑΡΡΟΦΗΣΤΕ ΤΟ ΥΓΡΟ ΚΑΙ ΠΛΥΝΕΤΕ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΑ ΜΕ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΠΛΥΣΗΣ. 7 - ΙΑΝΗΜΕΤΕ 100 µl ΑΡΑΙΩΜΕΝΟΥ ΕΝΖΥΜΙΚΟΥ ΙΧΝΗΘΕΤΗ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΕΣ ΕΚΤΟΣ ΑΠΟ ΕΚΕΙΝΗ ΤΟΥ ΛΕΥΚΟΥ. 8 - ΑΦΗΣΤΕ ΓΙΑ ΕΠΩΑΣΗ ΜΙΑ ΩΡΑ ΣΤΟΥΣ 37 C. 9 - ΑΝΑΡΡΟΦΗΣΤΕ ΤΟΝ ΕΝΖΥΜΙΚΟ ΙΧΝΗΘΕΤΗ ΚΑΙ ΠΛΥΝΕΤΕ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΑ ΜΕ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΠΛΥΣΗΣ. 10 - ΙΑΝΗΜΕΤΕ 100 µl ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ/ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΕΣ. 11 - ΑΦΗΣΤΕ ΓΙΑ ΕΠΩΑΣΗ 30 MIN ΣΕ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΥΠΟ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΑΠΟ ΤΟ ΦΩΣ. 12 - ΙΑΝΗΜΕΤΕ 100 µl ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟΥ ΕΜΠΛΟΚΗΣ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΕΣ. 13 - ΙΑΒΑΣΤΕ ΤΙΣ ΤΙΜΕΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΣΤΟ ΦΩΤΟΜΕΤΡΟ ΣΤΑ 450/630 nm. 200/007-630, F - 01/2004 85

REFERENCES M. ARAGONA et al. Serological response to hepatitis Delta virus in hepatitis D. Lancel, 1 : 478-480 (1987). K.F. BERGMAN et al. Hepatitis Delta antigen: antigenic structure and humoral immune response. J. Immunol., 143 : 3714-3721 (1989). F. BONELLI, R. CALOGERO, A. BONIOLO European Patent Specification No. EP 485347 (1991). R. CALOGERO et al. Purification of recombinant hepatitis Delta antigen expressed in E. coli cells. FEBS Letters, 318 (3) : 322-324 (1993). R. DIJKEMA, A. KOS European Patent Application No. 86200122.9 (1986). P. FARCI et al. Delta hepatitis in inapparent carriers of hepatitis B surface antigen: a disease simulating acute hepatitis B progressive to chronicity. Gastroenterology, 85 : 669 (1983). P. FARCI et al. Diagnostic and prognostic significance of the IgM antibody to the hepatitis Delta virus. JAMA, 255 (1) : 1443 (1986). E.J. GOWANS et al. Use of recombinant hepatitis Delta antigen in diagnostic assays for HDAg antibody. J. Virol. Meth., 27 : 69-78 (1990). M. PALLA, U. BARBIERI, M. BORLA, M. DE LUCA The use of recombinant Delta antigen and murine monoclonal anti-delta antibodies in an ELISA method for the serological detection of IgM antibodies to HDV. Fifth International Symposium on Hepatitis Delta Virus and Liver Disease, Gold Coast (Australia), Aug. 28- Sept. 3, 1995. J. PUIG, H.A. FIELDS Development of an enzyme immunoassay using recombinant expressed antigen to detect hepatitis Delta virus antibodies. J. Clin. Microbiol., 27 (10) : 2222-2225 (1889). M. RIZZETTO et al. Immunofluorescence detection of a new antigen/antibody system (delta/anti-delta) associated with hepatitis B virus in liver and in serum of HBsAg carriers. Gut, 18 : 997-1003 (1977). M. RIZZETTO et al. Hepatitis Delta virus infection: clinical and epidemiological aspects. In: Viral hepatitis and Delta Infection: progress in clinical and biological research, vol. 143, Alan R. Liss Inc., New York (1988). M. RIZZETTO, O. CRIVELLI The hepatitis Delta virus. In: Progress in Hepatitis Research, O. Crivelli ed., Sorin Biomedica Monograph (1991). A. SMEDILE et al. Radioimmunoassay detection of IgM antibodies to the HBV-associated Delta antigen: clinical significance in Delta infection. J. Med. Virol., 9 : 131 (1982). 86

Additional References Viral Hepatitis and Liver Disease. Proceedings of IX Triennial International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Rome, Italy, 21-25 April 1996, M. Rizzetto, R.H. Purcell, J.L. Gerin, G. Verme eds., Edizioni Minerva Medica, Turin, Italy (1997). **** Connected Patents: EP-B1 251575 by Chiron; EP-B1 485347 by DiaSorin. Brevetti associati: EP-B1 251575 di Chiron; EP-B1 485347 di DiaSorin. Brevets associés: EP-B1 251575 par Chiron; EP-B1 485347 par DiaSorin. Verbundene Patente: EP-B1 251575 von Chiron; EP-B1 485347 von DiaSorin. Patentes asociadas: EP-B1 251575 por Chiron; EP-B1 485347 por DiaSorin. Patentes associadas: EP-B1 251575 por Chiron; EP-B1 485347 por DiaSorin. Συσχετιζόµενα διπλώµατα ευρεσιτεχνίας : EP-B1 251575 της Chiron, EP-B1 485347 της DiaSorin. 87

ETI-DELTA-IGMK-2 (P001653) 89

ETI-DELTA-IGMK-2 / JAN. 2004 200/007-630 Rev. F DiaSorin S.p.A. 13040 SALUGGIA (VERCELLI) - ITALY Tel. 39.0161.487093 - Fax 39.0161.487628 90