ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΜΙΑΣ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΩΝ ωοκυτταρων ΣΤΙΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ ΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑΣ ΟΜΑΔΑΣ Γκάνιας Κ. 1, Βαβαλίδης Θ. 1, Nunes C. 2, Silva A. 2, Stratoudakis Y. 2 1 Τμήμα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, 2 Instituto Nacional de Recursos Biologicos, INRB/IPIMAR, Avenida de Brasilia s/n, 1449-006, Lisboa, Portugal Περίληψη Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται μία εναλλακτική μέθοδος μέτρησης της γονιμότητας ομάδας της σαρδέλας του Ατλαντικού, Sardina pilchardus, βασισμένης στην επεξεργασία μικροφωτογραφιών ωοθηκών με τη χρήση λογισμικού ψηφιακής ανάλυσης εικόνας. Οι μετρήσεις γονιμότητας μέσω της μεθόδου αυτής αντιπαραβάλλονται τόσο με απευθείας μετρήσεις της γονιμότητας με τη χρήση στερεοσκοπίου (κλασσική μέθοδος) όσο και με μετρήσεις του αριθμού των ωοκυττάρων επί των μικροφωτογραφιών (μέθοδος αναφοράς). Τα αποτελέσματα των συγκρίσεων αυτών έδειξαν ότι η ρουτίνα του λογισμικού ψηφιακής ανάλυσης εικόνας είναι ικανή να παράγει σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα αξιόπιστα αποτελέσματα γεγονός το οποίο σε συνδυασμό με τη δημιουργία ψηφιακού αρχείου μικροφωτογραφιών καθιστά τη συγκεκριμένη μέθοδο ως μία δελεαστική εναλλακτική της κλασσικής μεθόδου μέτρησης της γονιμότητας όχι μόνο στη σαρδέλα αλλά και σε όλους τους τελεόστεους με υψηλή γονιμότητα. Λέξεις κλειδιά: γονιμότητα ομάδας, πολλαπλοί αποθέτες, Ατλαντικός, Sardina pilchardus. USE OF αν AUTOMATED METHOD FOR COUNTING oocytes IN BATCH FECUNDITY MEASUREMENTS Ganias K. 1, Vavalidis T. 1, Nunes C. 2, Silva A. 2, Stratoudakis Y. 2 1 School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, 54 124 Thessaloniki, Greece, 2 Instituto Nacional de Recursos Biologicos, INRB/IPIMAR, Avenida de Brasilia s/n, 1449-006, Lisboa, Portugal Abstract We present a method for measuring batch fecundity of multiple spawning fish with indeterminate fecundity like sardine, Sardina pilchardus, based on the processing of microphotographs of ovarian whole mounts with digital image analysis software. These measurements are compared with fecundity measurements derived by direct counting of hydrated oocytes either under the stereoscope (classic method) or on-screen (reference method). The results of these comparisons suggest that the automated procedure is capable of producing easily and quickly accurate fecundity measurements, fact which combined with the archiving of microphotographic material of fish ovaries makes the method rather appealing for future applications both in sardine and other multiple spawning fish. Keywords: batch fecundity, image analysis, multiple spawners, N. Atlantic, Sardina pilchardus. 1. Εισαγωγή Επειδή οι περισσότεροι τελεόστεοι έχουν πολύ υψηλή γονιμότητα ο υπολογισμός της γίνεται συνήθως μετρώντας τον αριθμό των αβγών σε υποδείγματα ιστού γνωστού βάρους/όγκου με αναγωγή στο συνολικό βάρος/όγκο της ωοθήκης (βαρυμετρική ή ογκομετρική μέθοδος αντίστοιχα). Παραδοσιακά η μέτρηση αυτή γίνεται με απευθείας μέτρηση των ωοκυττάρων με τη χρήση στερεοσκοπίου, γεγονός που καθιστά τις εκτιμήσεις τις γονιμότητας αρκετά επίπονες και συχνά ανακριβείς. Η εισαγωγή εναλλακτικών μεθόδων εκτίμησης της γονιμότητας άρχισε ήδη από τα τέλη της δεκαετίας του 1980 και αφορούσε είτε σε διατάξεις δανεισμένες από τη μελέτη της βιολογίας του πλαγκτού (Witthames and Greer-Walker, 1987) είτε στην εφαρμογή των αρχών της στερεολογίας σε ιστολογικά παρασκευάσματα ωοθηκών (π.χ. Emerson et al., 1990). Αν και οι μέθοδοι αυτές ήταν πιο αυτοματοποιημένες και παρουσίαζαν σημαντικές βελτιώσεις σε ότι αφορά την ακρίβεια των -872-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ μετρήσεων απαιτούσαν ειδική υποδομή και/ή τεχνογνωσία κάνοντας τες αρκετά εξεζητημένες και δύσκολες να εφαρμοστούν από την ευρύτερη επιστημονική κοινότητα. Μία από τις σημαντικότερες τεχνολογικές εξελίξεις στην αυτοματοποίηση των μετρήσεων της γονιμότητας στα ψάρια ήταν η εφαρμογή συστημάτων ψηφιακής ανάλυσης εικόνας στη μελέτη της δυναμικής των ωοκυττάρων. Μια τέτοια εφαρμογή είναι και η αυτοδιαμετρική μέθοδος (autodiametric method, Thorsen & Kjesbu, 2001) σύμφωνα με την οποία η ολική γονιμότητα ενός ώριμου θηλυκού είναι δυνατό να εκτιμηθεί από τη μέση διάμετρο των ωοκυττάρων της ωοθήκης έτσι όπως αυτή υπολογίζεται από λογισμικό ψηφιακής ανάλυσης εικόνας. Απο την άλλη πλευρά η αυτοδιαμετρική μέθοδος δεν είναι δυνατόν να εφαρμοστεί σε μετρήσεις γονιμότητας ομάδας η οποία για τα περισσότερα είδη ψαριών αποτελεί ένα ακαθόριστο κλάσμα της ολικής γονιμότητας. Παρόλη τη σημασία της στη μελέτη της αναπαραγωγικής βιολογίας των ψαριών και στον υπολογισμό της αναπαραγόμενης βιομάζας τους η γονιμότητα ομάδας εξακολουθεί να μετράται με την κλασική μέθοδο μιας και έως τις μέρες μας δεν υπάρχουν βιβλιογραφικές αναφορές που να περιγράφουν τη μέτρηση της με μία αυτοματοποιημένη ψηφιακή διαδικασία. Στην παρούσα εργασία επιχειρείται η αξιοποίηση των δυνατοτήτων ενός λογισμικού ψηφιακής ανάλυσης εικόνας (ImageJ) στις μετρήσεις γονιμότητας ομάδας της σαρδέλας, Sardina pilchardus του Β. Ατλαντικού. Η σαρδέλα είναι πολλαπλός αποθέτης με ακαθόριστο πρότυπο γονιμότητας (Ganias et al., 2004). Αυτό σημαίνει ότι καθ όλη τη διάρκεια της αναπαραγωγικής τους περιόδου (μέσα φθινόπωρου έως άνοιξη, Stratoudakis et al., 2007) τα θηλυκά παράγουν ομάδες ωοκυττάρων απευθείας από τα ωογόνια κι όχι από μία δεξαμενή λεκιθικών ωοκυττάρων, όπως στα ψάρια με καθορισμένη γονιμότητα. Η μέθοδος που προτείνεται στην παρούσα εργασία βασίζεται στην ανάπτυξη μιας αυτοματοποιημένης διαδικασίας για την επεξεργασία μεγάλων αρχείων ψηφιακών μικροφωτογραφιών ωοθηκών η οποία αναγνωρίζει και διαχωρίζει τα ωοκύτταρα ωοτοκίας από τα υπόλοιπα ωοκύτταρα της ωοθήκης παρέχοντας μετρήσεις γονιμότητας ομάδας. 2. Υλικά και Μέθοδοι Δείγματα ενηλίκων ατόμων σαρδέλας συλλέχθηκαν ανοιχτά της Πορτογαλίας και του κόλπου της Cadiz (ΝΔ Ισπανία) το Χειμώνα (24/1-15/2) του 2008 στο πλαίσιο της εκτίμησης της αναπαραγόμενης βιομάζας του Ατλαντο-Ιβηρικού αποθέματος της σαρδέλας με τη μέθοδο της ημερήσιας παραγωγής αβγών (daily egg production method, DEPM). Αμέσως μετά τη σύλληψη τα δείγματα τοποθετούνταν σε δοχεία με διάλυμα φορμαλίνης 4% και μεταφέρονταν στο εργαστήριο όπου γινόταν προσδιορισμός του φύλου και βιομετρικές αναλύσεις (μήκος & βάρος σώματος, βάρος γονάδας). Το στάδιο ωρίμανσης των γονάδων αρχικά προσδιορίζονταν μακροσκοπικά και στη συνέχεια οι ωοθήκες των θηλυκών ατόμων αφαιρούνταν και τοποθετούνταν σε μικρά μπουκάλια με διάλυμα φορμαλίνης 4%. Για τις μετρήσεις γονιμότητας επιλέχθηκαν θηλυκά με ωοθήκες στο στάδιο της ενυδάτωσης επειδή στο στάδιο αυτό η ομάδα ωοκυττάρων ωοτοκίας είναι αρκετά ευδιάκριτη. Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 179 θηλυκά. Οι μετρήσεις γονιμότητας ομάδας πραγματοποιήθηκαν με τη βαρυμετρική μέθοδο λαμβάνοντας από κάθε ενυδατωμένη ωοθήκη ένα υποδείγμα 100-150mg το οποίο αφού ζυγίζονταν τοποθετούνταν σε ένα τριβλίο με διάλυμα γλυκερόλης 33% και στη συνέχεια υποβάλλονταν σε μέτρια ανάδευση έως ότου ξεχωρίσουν τα ωοκύτταρα αναμεταξύ τους. Σε μία πρώτη φάση εφαρμόστηκε η συνήθης διαδικασία μέτρησης της γονιμότητας και τα ενυδατωμένα ωοκύτταρα του υποδείγματος της κάθε ωοθήκης μετρήθηκαν με τη χρήση στερεοσκοπίου (κλασική μέθοδος). Η γονιμότητα ομάδας υπολογίζονταν τελικά ανάγοντας την πυκνότητα των ενυδατωμένων ωοκυττάρων (αριθμός ωοκυττάρων ανά g ιστού υποδέιγματος) στο ολικό βάρος της ωοθήκης. Η παραπάνω διαδικασία επαναλήφθηκε άλλη μία φορά για το σύνολο των 179 ατόμων της μελέ- -873-
της μόνο που αυτή τη φορά το τριβλίο με το υποδείγμα των ενυδατωμένων ωοκυττάρων τοποθετούνταν σε στερεοσκόπιο με προσαρμοσμένη κάμερα μικροσκοπίας. Το υποδείγμα φωτογραφίζονταν ψηφιακά κατά ένα τέτοιον τρόπο ώστε στο πλαίσιο της εικόνας να βρίσκονται όλα τα ωοκύτταρα του υποδείγματος (Εικ. 1α). Προκειμένου η ποιότητα των φωτογραφιών να είναι η καλύτερη δυνατή και να περιλαμβάνει μόνο ωοκύτταρα, πριν τη φωτογράφιση γίνονταν καθαρισμός του δείγματος από τις μεμβράνες της ωοθήκης. Η διαδικασία αυτή οδήγησε τελικά στη δημιουργία ενός ψηφιακού αρχείου με μικροφωτογραφίες από το σύνολο των ενυδατωμένων θηλυκών που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση. Η επεξεργασία των ψηφιακών αρχείων εικόνας έγινε σε μια πρώτη φάση με απευθείας διάκριση και καταμέτρηση των ενυδατωμένων ωοκυττάρων επί της οθόνης του υπολογιστή με τη χρήση του πρόσθετου Cell Counter του λογισμικού ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Η διαδικασία αυτή ήταν κατά πολύ πιο αποτελεσματική σε σύγκριση με την κλασική μέθοδο τόσο λόγω της βελτιωμένης απεικόνισης του αναλυθέντος οπτικού πεδίου στην οθόνη του υπολογιστή σε σχέση με τους προσοφθάλμιους φακούς του στερεοσκοπίου όσο και λόγω των ευκολιών που παρέχει το λογισμικό ανάλυσης εικόνας (π.χ. χρωματική σήμανση των μετρούμενων ωοκυττάρων). Λόγω αυτών των πλεονεκτημάτων και της αναμενόμενης ακρίβειας στο τελικό αποτέλεσμα, η διαδικασία αυτή ονομάστηκε και μέθοδος αναφοράς. Σε ένα τελικό στάδιο, προσπαθήσαμε να αναπτύξουμε μια αυτοματοποιημένη διαδικασία μέσω του ImageJ για την αναγνώριση, το διαχωρισμό και την καταμέτρηση σε κάθε μικροφωτογραφία μόνο των ενυδατωμένων ωοκυττάρων (μέθοδος ImageJ, Eικ. 1). Οι τιμές των παραμέτρων σε καθεμία από τις παραπάνω επιμέρους διαδικασίες (π.χ. φωτεινότητα, thresholding, κτλ.) επιλέχθηκαν έτσι ώστε να δίνουν αριθμό ενυδατωμένων ωοκυττάρων όσο το δυνατόν πιο κοντά στα αποτελέσματα της μεθόδου αναφοράς. Όταν αυτό τελικά επετεύχθη δημιουργήθηκε μία μακροεντολή μέσω της οποίας αυτοματοποιήθηκε η όλη διαδικασία από το άνοιγμα της φωτογραφίας μέχρι τον υπολογισμό της γονιμότητας. Εικ. 1: Διαδοχικές φάσεις επεξεργασίας των μικροφωτογραφιών ωοθηκών σαρδέλας, Sardina pilchardus, για τη μέτρηση του αριθμού των ενυδατωμένων ωοκυττάρων με το λογισμικό ImageJ. α) μετατροπή της εικόνας σε αρχείο 8bit, β) περιορισμός του χρωματικού φάσματος (thresholding), γ) διαχωρισμός των μεριδίων (segmentation) και δ) επιλογή των μεριδίων ως προς το μέγεθος και τη σφαιρικότητα για τη μέτρηση τους. Η πρώτη και η δεύτερη σειρά μετρήσεων της πυκνότητας ωoκυττάρων που προέκυψαν από την κλασική μέθοδο και τη μέθοδο αναφοράς αντίστοιχα ουσιαστικά αντανακλούσαν την ίδια μέθοδο δεδομένου ότι και οι δύο βασίστηκαν στην ένα προς ένα καταμέτρηση των ενυδατωμένων ωοκυττάρων. Συνεπώς, η μεταξύ τους σύγκριση χρησιμοποιήθηκε κυρίως για τη μελέτη της διακύμανσης της πυκνότητας των ωοκυττάρων μεταξύ των διαφόρων υπο-δειγμάτων της ίδιας ωοθήκης. Αντίθετα, ενώ η δεύτερη και η τρίτη σειρά μετρήσεων (μέθοδοι αναφοράς και ImageJ) προήλθαν από τα ίδια υπο-δείγματα ιστού ωοθήκης, η καταμέτρηση των ωοκυττάρων πραγματοποιήθηκε με διαφορετική μεθοδολογία. Επομένως, στην περίπτωση αυτή η σύγκριση μεταξύ των δύο σειρών -874-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ μετρήσεων είχε ως κύριο στόχο να ελέγξει αν η μακροεντολή που δημιουργήθηκε στο ImageJ θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια έγκυρη ρουτίνα σε μετρήσεις γονιμότητας ομάδας. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων των διαφορετικών σειρών μετρήσεων πραγματοποιήθηκε συγκρίνοντας την εξίσωση παλινδρόμησης των πυκνοτήτων των ωοκυττάρων των διαφορετικών μεθόδων με τη διαγώνιο (σημείο τομής αξόνων = 0, κλίση = 1). 3. Αποτελέσματα - Συμπεράσματα Τα αποτελέσματα της μέτρησης της πυκνότητας των ενυδατωμένων ωοκυττάρων μέσω της μακροεντολής του ImageJ παρουσίασαν μεγάλη συνάφεια με τα αποτελέσματα από τις μετρήσεις των ωοκυττάρων επί των ψηφιακών φωτογραφιών (μετρήσεις αναφοράς) (Εικ. 2α, Πίν. 1). Από την άλλη πλευρά, ακόμη και αν τα αποτελέσματα της κλασικής μεθόδου (in-situ στερεοσκοπική καταμέτρηση) σχετίζονταν σημαντικά με τα αποτελέσματα της μεθόδου αναφοράς το επίπεδο της συσχέτισης ήταν αρκετά χαμηλό (53%, Πίν. 1, Εικ. 2β). Επιπλέον, η μέση πυκνότητα των ωοκυττάρων από την κλασική μέθοδο ήταν σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με τα αποτελέσματα της μεθόδου αναφοράς (t-test, P <0,05). Σε αντίθεση, η μέθοδος ImageJ δεν έδωσε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τη μέθοδο αναφοράς γεγονός που επιβεβαιώθηκε τόσο μέσω t-test, (P> 0.05), όσο και από τη σύγκριση της ευθείας ελαχίστων τετραγώνων με τη διαγώνιο (Πίν. 1). Εικ. 2: Σχέση ανάμεσα στην πυκνότητα των ωοκυττάρων (ooc/g) της μεθόδου αναφοράς (ΜΑ) με α) τη μέθοδο του ImageJ (ΜImJ) και β) την κλασική μέθοδο. Οι συμπαγής γραμμές αντιστοιχούν στις ευθείες ελαχίστων τετραγώνων της ανάλυσης γραμμικής παλινδρόμησης και οι διακεκομένες στα 95% όρια εμπιστοσύνης. Πίνακας 1: Αποτελέσματα της ανάλυσης παλινδρόμησης ανάμεσα στις πυκνότητες των ωοκυττάρων της μεθόδου αναφοράς και α) της ρουτίνας του ImageJ και β) της κλασικής μεθόδου. t: στατιστικό του ελέγχου-t για τη σύγκριση της κλίσης της εξίσωσης με τη μονάδα. Μέθοδος Συντελεστής ανόρθωσης Κλίση r 2 t ImageJ 57,17 0,99 92% 0,02 (P>0,1) (P<0,001) (P>0,5) Κλασσική 418,71 0,78 53% 3,82 (P<0,001) (P<0,001) (P<0,001) Είναι πιθανόν ότι το πιο σημαντικό ποσοστό αυτής της διαφωνίας μεταξύ των αποτελεσμάτων της κλασικής μεθόδου με τη μέθοδο αναφοράς οφείλεται στη χρήση διαφορετικών υποδειγμάτων ιστού για την καταμέτρηση της πυκνότητας των ωοκυττάρων. Απο την άλλη πλευρά, η μέθοδοι ImageJ και αναφοράς βασίστηκαν στην ανάλυση των ίδιων μικροφωτογραφιών και κατά συνέπεια των ίδιων υποδειγμάτων ωοθήκης. Ωστόσο, επειδή η υπολοιπόμενη διακύμανση στη σχέση της -875-
κλασσικής μεθόδου με τη μέθοδο αναφοράς ήταν πολύ υψηλή (47%) θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι ένα μέρος αυτής της υπολοιπόμενης διακύμανσης θα πρέπει να οφείλεται σε πιθανές περιπλοκές της κλασικής μεθόδου. Πράγματι, η απευθείας αναγνώριση και καταμέτρηση των ενυδατωμένων ωοκυττάρων επί της οθόνης του υπολογιστή χρησιμοποιώντας τις ευκολίες που περέχουν τα σύγχρονα λογισμικά ανάλυσης εικόνας κάνουν τις μετρήσεις αυτές πολύ πιο εύκολες και αποτελεσματικές σε σύγκριση με τις μετρήσεις στο στερεοσκόπιο. Πέραν της δυνατότητας αύξησης της ακρίβειας των μετρήσεων της γονιμότητας σε σχέση με τις παραδοσιακές μεθόδους, η μέθοδος που παρουσιάζεται στην παρούσα εργασία παρουσιάζει και κάποια άλλα σημαντικά πλεονεκτήματα. Μετά την παραμετροποίηση του λογισμικού, η οποία έγινε με τη χρήση 10-15 ατόμων, και την ανάπτυξη μίας ρουτίνας (από τη λήψη και το φόρτωμα των μικροφωτογραφιών έως την ψηφιακή τους ανάλυση) η διαδικασία ανάλυσης ακόμη και μεγάλου όγκου αρχείων φωτογραφιών γίνεται αρκετά εύκολα και γρήγορα. Πιο συγκεκριμένα, υπολογίσαμε ότι πέραν της τεχνικής δουλειάς που απαιτείται για την προετοιμασία του ιστού η μέτρηση των ωοκυττάρων στο στερεοσκόπιο απαιτεί περίπου 5min/άτομο, η μέτρηση της φωτογραφίας επί της οθόνης απαιτεί περίπου 3min/άτομο, ενώ με τη μακροεντολή του ImageJ τα 179 άτομα της μελέτης αναλύθηκαν σε λιγότερο από 20 λεπτά (σε υπολογιστή με επεξεργαστή 2,66GHz και με μνήμη RAM 2,00GB). Επίσης η εφαρμογή της μεθόδου αυτής εξασφαλίζει πλούσιο ψηφιακό φωτογραφικό υλικό στο οποίο κάποιος είναι δυνατό να ανατρέξει πολύ εύκολα χωρίς να εξαρτάται από την κατάσταση του αποθηκευμένου βιολογικού υλικού και την υπάρχουσα εργαστηριακή υποδομή (ζυγούς ακριβείας, στερεοσκόπιο, κ.ά.). 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Emerson, L.S., Greer Walker, M. & Witthames, P.R., 1990. A stereological method. for estimating fecundity. Journal of Fish Biology, 36: 721 730. Ganias, K., Somarakis, S., Machias, A. & Theodorou, A. 2004. Pattern of oocyte development and batch fecundity in the Mediterranean sardine. Fisheries Research, 67: 13-23 Stratoudakis, Y., Coombs, S., de Lanzos, A.L., Halliday, N., Costas, G., Caneco, B., Franco, C., Conway, D., Begona Santos, M., Silva, A. & Bernal, M.. 2007. Sardine (Sardina pilchardus) spawning seasonality in European waters of the northeast Atlantic. Marine Biology, 152, 201-212. Thorsen, A. & Kjesbu, O.S., 2001. A rapid method for estimation of oocyte size and potential fecundity in Atlantic cod using a computer-aided particle analysis system. Journal of Sea Research, 46, 295 308. Witthames, P.R., Greer Walker, M., 1987. An automated method for counting and sizing fish eggs. Journal of Fish Biology, 30, 225 235. -876-