Ανοσοαιματολογικός Έλεγχος Αιμοδοσίας ( Βασικές Αρχές Εξετάσεις Ανοσοαιματολογίας ) ΑΡΕΤΗ ΚΟΛΟΚΥΘΑ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ Ν.Υ. ΑΙΜΟΔΟΣΙΑΣ, ΤΖΑΝΕΙΟ 1
Ανοσοαιματολογία Βασικές Αρχές Η μελέτη των αντιγόνων που εκφράζονται στα κύτταρα του αίματος, των αντισωμάτων έναντι αυτών καθώς και των μεταξύ τους αντιδράσεων είναι καθοριστική για την ασφαλή και επιτυχή μετάγγιση Αντιγόνα και αντισώματα Ερυθρών αιμοσφαιρίων Αιμοπεταλίων Λευκών αιμοσφαιρίων 2
Αντιγόνα Αντισώματα (Ερυθρών Αιμοσφαιρίων) Αντιγόνα: Συστήματα ομάδων αίματος (αντιγόνα πάνω στα ερυθρά αιμοσφαίρια) Αντισώματα: Τα αντιερυθροκυτταρικά αντισώματα είναι ανοσοσφαρίνες με ειδική δράση (IgG και IgM). 3
Αντιγόνα ερυθρών αιμοσφαιρίων Ανακάλυψη ΑΒΟ ομάδων αίματος από τον Karl Landsteiner το 1900 Ανακάλυψη συστήματος Rhesus από τους Levine & Stetson το 1939 Ανίχνευση πλέον των 300 αντιγόνων. Σύστημα ΑΒΟ (ολιγοσακχαρίδια) 2 αντιγόνα: Α και Β 4 ομάδες: Ο, Α, Β, ΑΒ Σύστημα Rhesus (πρωτεΐνες) 54 αντιγόνα(61-7 διαγραφή) Τα πλέον σημαντικά για την ανοσοαιματολογία: D, C, c, E, e, C w 4
Λοιπά πλην ΑΒΟ Συστήματα Ομάδων Αίματος Σύστημα RHESUS Αντιγόνα D, C, E, ĉ, ē, C W KELL K, k, Kp a, Kp b, DUFFY KIDD LEWIS Fy a, Fy b Jk a, Jk b Le a, Le b P P 1 MNS LUTHERAN M, N, S, s Lu a, Lu b 5
Γενικά χαρακτηριστικά IgM και IgG αντιερυθροκυτταρικών αντισωμάτων (πλήρη ή τέλεια) (ατελή) 6
Ανοσοσφαιρίνες IgM και IgG 7
Αντισώματα ομάδων αίματος Αντισώματα IgM (τέλεια) είναι τα αντισώματα έναντι των: ABΟ, MN, Lewis, Lutheran a αντιγονικών συστημάτων και Ρ Αντισώματα IgG (ατελή) είναι τα αντισώματα έναντι των: Rh(DCEce), Kell, Ss, Duffy, Kidd και Lutheran b αντιγονικών συστημάτων 8
In vitro γίνεται ορατή ως συγκόλληση ή ως λύση των ερυθρών Δυο στάδια : Αντίδραση αντιγόνου / αντισώματος 1) Σύνδεση του αντισώματος με το αντίστοιχο ερυθροκυτταρικό αντιγόνο (ευαισθητοποίηση) 2) Συγκόλληση ή λύση των ευαισθητοποιημένων ερυθρών ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ / ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ Θερμοκρασία, χρόνος επώασης Δράση ΡΗ ( 6,5 7 ) Ιοντική ισχύ του μέσου της αντίδρασης (υγρό εναιώρησης) Αναλογία αντιγόνου αντισώματος Τύπος ανοσοσφαιρίνης (IgG, IgM) Μέσα ενίσχυσης της αντίδρασης (αλβουμίνη, πρωτεολυτικά ένζυμα π.χ. βρωμελίνη, PEG) Αντισφαιρινικός ορός Φυγοκέντρηση 9
ΑΒΟ αντιγόνα 10
11
ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ ΑΒΟ 12
Αντιγόνα αντισώματα ΑΒΟ 13
Αντιγόνα αντισώματα ΑΒΟ 14
Αντιδράσεις αντιγόνων αντισωμάτων ΑΒΟ 15
Τυποποίηση Ομάδων Αίματος στο Εργαστήριο Αντίδραση Αιμοσυγκόλλησης Βαθμονόμηση αντίδρασης (ένταση συγκόλλησης) Τεχνική σωληναρίου 16
Τυποποίηση Ομάδων Αίματος στο Εργαστήριο Αντίδραση Αιμοσυγκόλλησης Βαθμονόμηση αντίδρασης (ένταση συγκόλλησης) Τεχνική μικροστηλών 17
Τυποποίηση Ομάδων Αίματος στο Εργαστήριο Αντίδραση Αιμοσυγκόλλησης Συγκριτική απεικόνιση τεχνικών 18
Τυποποίηση Ομάδων Αίματος στο Εργαστήριο Αντίδραση Αιμοσυγκόλλησης Τυποποίηση ομάδας ΑΒΟ στα ερυθρά και στο πλάσμα (ανάστροφη ομάδα) Απαραίτητα: Αντιοροί Anti-A, Anti-B, Anti-AB Ερυθρά γνωστών ομάδων Α, Β, Ο Εξέταση στην πλάκα 19
Καθημερινή πρακτική αιμοδοσίας Καθορισμός ομάδος ΑΒΟ Rh(D) στους ασθενείς και στους αιμοδότες Επιπλέον: Στους Rh(D) αρνητικούς ασθενείς: C, c, E, e και Du (ασθενές D) Στους αιμοδότες: C, c, E, e, Du (ασθενές D) και Kell Σε ειδικές περιπτώσεις ασθενών: Καθορισμός λοιπών αντιγόνων 20
21
Τυποποίηση ΑΒΟ - Rh(D) στο Εργαστήριο Αντίδραση Αιμοσυγκόλλησης Τυποποίηση ομάδας στην Πλάκα Αντι-Α Αντι-Β Αντι-D Αντι-Α Αντι-Β Αντι-D Ομάδα B- Ομάδα A+ 22
Τυποποίηση ABO Rh(D) στο Εργαστήριο Αντίδραση Αιμοσυγκόλλησης Τυποποίηση ομάδας επί μικροστηλών Ομάδα Β+ Τυποποίηση στα ερυθρά Ομάδα Ο+ Τυποποίηση στα ερυθρά και στο πλάσμα 23
Τυποποίηση Πλήρους Φαινοτύπου Rhesus - Kell Αντίδραση Αιμοσυγκόλλησης Τυποποίηση επί μικροστηλών Φαινότυπος Rh-K CC ee K ( ) 24
Άμεση και Εμμεση Coombs Αντιδράσεις Αιμοσυγκόλλησης Το 1945 για πρώτη φορά ο Coombs παρασκεύασε τον αντισφαιρινικό ορό (AHG) Η αρχή της παρασκευής του είναι η εξής : Ενίονται σε πειραματόζωα (π.χ. κουνέλια) ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες, ή συμπλήρωμα ή και τα δυο. Προκαλείται ανοσολογική αντίδραση που έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή αντι-ανθρώπινων αντι-igg και/ή αντι-c 3 d αντισωμάτων (αντι-αντισωμάτων) που στη συνέχεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο εργαστήριο 25
Άμεση Συγκολλητινοαντίδραση που ανιχνεύει την in Vivo ευαισθητοποίηση ερυθροκυττάρων με ατελή αντισώματα (IgG) και/ή συμπλήρωμα (C3d). Ελέγχεται σε: Άμεση δοκιμασία Coombs (DAT) Αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία θερμού η ψυχρού τύπου Αιμολυτική νόσος του νεογνού Αιμολυτική αντίδραση σε ασθενή μετά από ασύμβατη μετάγγιση Λήψη κάποιων φαρμάκων Άλλες παθολογικές καταστάσεις (π.χ. αυτοάνοσα νοσ, λεμφοϋπερπλαστικά νοσ, ιογενείς λοιμώξεις κ.ά.) Απαραίτητα για την εκτέλεση: Ερυθρά ασθενούς ΑΣΟ (Αντισφαιρινικός Ορός Coombs) Τεχνικές εκτέλεσης: Σωληναρίου Μικροστηλών Στερεάς Φάσης 26
Άμεση δοκιμασία Coombs (DAT) Αρχή της εξέτασης 27
Άμεση δοκιμασία Coombs (DAT) Τεχνική μικροστηλών Άμεσος Coombs θετική 2/3+ IgG 1/2+, C3d 2+ 28
Έμμεση δοκιμασία Coombs (IAT) Έμμεση Συγκολλητινοαντίδραση χρήσιμη στην ανίχνευση και ταυτοποίηση ατελών (IgG) μη αναμενομενων αντιερυθροκυτταρικων αντισωμάτων στον ορό ή πλάσμα του ασθενούς. Περιπτώσεις εφαρμογής: Ανάπτυξη αντισωμάτων σε Αυτοάνοση Αιμολυτική Αναιμία (αυτοαντισώματα θερμού τύπου) μετά από μετάγγιση ή κύηση (αλλοαντισώματα) Δοκιμασία Διασταύρωσης Καθορισμός αρκετών ερυθροκυτταρικών αντιγόνων Απαραίτητα για την εκτέλεση: Ορός ή πλάσμα του ασθενούς Φιαλίδια 3 ή 4 δειγμάτων εναιωρήματος ερυθροκυττάρων 0 ομάδας, με επιλεγμένους συνδυασμούς των λοιπών πλην του ΑΒ0 κλινικά σημαντικών ερυθροκυτταρικών αντιγόνων (συνήθως του εμπορίου) ΑΣΟ - (Αντισφαιρινικός Ορός Coombs) Αλβουμίνη ή Liss 29
Έμμεση δοκιμασία Coombs (IAT) Αρχή της εξέτασης 30
Έμμεση δοκιμασία Coombs (IAT) Τεχνικές εκτέλεσης: Σωληναρίου Μικροστηλών (Ο ΑΣΟ είναι ενσωματωμένος στο περιεχόμενο της στήλης) Στερεάς Φάσης Κλασσική τεχνική σωληναρίου Επώαση ορού ή πλάσματος με εναιώρημα ερυθρών των 3-4 φιαλιδίων (37οC) μαζί με αλβουμίνη ή LISS. Η φάση αυτή επιτρέπει την επαφή-προσκολληση των αντισωμάτων του ορού με τα αντιγόνα των ερυθρών. Πλύσιμο 3 φορές Προσθήκη αντισφαιρινικού ορού Φυγοκέντρηση Έλεγχος ύπαρξης συγκόλλησης 31
Έμμεση δοκιμασία Coombs (IAT) Τεχνική σωληναρίου 32
Έμμεση δοκιμασία Coombs (IAT) Τεχνική μικροστηλών Ανίχνευση αλλοαντισωμάτων (screnning test) και δοκιμασία διασταύρωσης Ταυτοποίηση αντισωμάτων 33
Προμεταγγισιακός έλεγχος Τυποποίηση ομάδας αίματος ασθενή ως προς ΑΒΟ Rh(D) Ανίχνευση και ταυτοποίηση αλλοαντισώματος Επιλογή κατάλληλων ερυθρών για διασταύρωση Δοκιμασία διασταύρωσης Καθορισμός αντιγόνων λοιπών συστημάτων σε ειδικές περιπτώσεις - Πολυμεταγγιζόμενοι - Ανάπτυξη αλλοαντισωμάτων 34
Ανίχνευση αλλοαντισωμάτων (Screening Test) Εξέταση Εμμέσου Coombs Ο έλεγχος ανίχνευσης αντιερυθροκυτταρικών αντισωμάτων (screening test) πρέπει να είναι απλός, γρήγορος, αξιόπιστος και να ανιχνεύει όσο το δυνατό περισσότερα κλινικώς σημαντικά αντισώματα (αντισώματα που μπορεί να προκαλέσουν αιμολυτικές αντιδράσεις από μετάγγιση ή HDN) Στο screening test ο ορός του ασθενή ελέγχεται συνήθως με 3 δείγματα ερυθρών ομάδας Ο που έχουν ισχυρή έκφραση και επιλεγμένους συνδυασμούς των κάτωθι αντιγόνων: D, C, E, c, e, C w, M, N, S, s, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, Lea, Leb, Lua, Lub, P1. 35
Ανίχνευση Αντισώματος 36
Τυποποίηση Αντισώματος Χρήση panels φιαλιδίων ερυθρών ομάδας Ο με επιλεγμένους συνδυασμούς των λοιπών ερυθροκυτταρικών αντιγόνων 37
Τυποποίηση αντι Κ, Ε 38
Δοκιμασία Διασταύρωσης Ανάλογα με την καθορισθείσα ομάδα αίματος ως προς ΑΒΟ και Rh(D) ενός ασθενούς που πρόκειται να μεταγγισθεί, γίνεται επιλογή μονάδων αίματος από τις προς διάθεση μονάδες αίματος συμβατών ως προς ΑΒΟ, Rh(D) και στερουμένων των αντιγόνων έναντι των οποίων ανιχνεύθηκε και τυποποιήθηκε αλλοαντίσωμα. Επιλογή μονάδων αίματος συμβατών ως προς ΑΒΟ για μετάγγιση ασθενών. Ομάδα ασθενούς 1 η επιλογή 2 η επιλογή Ο Ο - Α Α Ο-ΣΕ Α 2 Α 2 Α ή Ο-ΣΕ Β Β Ο-ΣΕ ΑΒ ΑΒ Α ή Β ή Ο-ΣΕ A 2 Β Α 2 Β Α 2 ή Α ή Β ή Ο-ΣΕ Για ασθενείς Rh(D) θετικούς επιλέγονται για διασταύρωση και μετάγγιση Rh(D) θετικές μονάδες και για ασθενείς Rh(D) αρνητικούς επιλέγονται Rh(D) αρνητικές μονάδες. Σε έλλειψη Rh(D) αρνητικών μονάδων αίματος επιλέγουμε Rh(D) θετικές μονάδες για μετάγγιση Rh(D) αρνητικών ασθενών μόνον εάν οι ασθενείς έχουν screen αρνητικό και είναι μεγάλης ηλικίας. Τέλος, σε επείγουσες καταστάσεις χορηγούμε Ο Rh(D) αρνητικές μονάδες. 39
Δοκιμασία Διασταύρωσης Γίνεται με εξέταση Εμμέσου Coombs. Διασταυρώνουμε (φέρνουμε σε επαφή) τον ορό ή πλάσμα του ασθενούς προς μετάγγιση με εναιώρημα ερυθρών από το «κοτσανάκι» του ασκού που επιλέξαμε για τη διασταυρωση + αντισφαιρινικό ορό Coombs + LISS, με τεχνική σωληναρίου η μικροστηλών η στερεάς φάσης. Αξιολόγηση αποτελέσματος (συμβατότητα ή ασυμβατότητα) Χορήγηση στον ασθενή κατά κανόνα συμβατού αίματος 1. Ερυθρά Ε- /Κ- (Συμβατότητα) 2. Ερυθρά Ε+/Κ- (Ασυμβατότητα) 3. Ερυθρά Ε-/Κ+ >> 4. Ερυθρά Ε+/Κ+ >> 40
Εναλλακτική επιλογή ερυθρών και πλάσματος προς μετάγγιση 41
Ιστορική αναδρομή της διασταύρωσης 1907 Διατύπωση της θεωρητικής βάσης 1908 Πραγματοποιείται η πρώτη εξέταση 1945 Ορός Coombs 1951-1957 Αναγνώριση του ρόλου των ενζύμων θρυψίνης, βρωμελίνης κλπ 1958 ΑΑΒΒ- φυσιολογικός ορός, αλβουμίνη, 2% ερυθρά 1962 Περιορισμένη αναγνώριση του ρόλου της εξέτασης των αλλοαντισωμάτων 1970 LISS, 1975 Μονοκλωνικά αντισώματα 1980 Type and Screen, 1987 Στερεά φάση 1990 Μικροστήλες 1998 Computer Crossmatch 2000 Αυτοματισμός 42
Ευχαριστώ! 43