ΤΜΗΜΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ

ΤΜΗΜΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΓΕΝΟΤΥΠΟΥ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΤΗΣ ESCHERICHIA COLI ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΣΤΑ Β-ΛΑΚΤΑΜΙΚΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ1 ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΑΠΟ ΥΓΙΗ ΚΑΙ ΝΟΣΟΥΝΤΑ ΖΩΑ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΦΟΥΡΛΗ ΑΕΜ 797 ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ εκπονήθηκε στο ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ επιβλέπουσα: Dr. Βικτωρία Σιάρκου PhD, DVM, MD Επίκουρος Καθηγήτρια ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1. ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ESCHERICHIA COLI 1.1 Χαρακτηριστικά της Escherichia coli 1.2 Παθογένεια της Escherichia coli 1.3 Εργαστηριακή διάγνωση της Escherichia coli 2. ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ - ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 2.1 Χαρακτηριστικά αντιμικροβιακών παραγόντων 2.2 Χρήση των αντιβιοτικών στην κτηνοτροφία 2.3 Μηχανισμοί δράσης των αντιβιοτικών 2.4 β-λακταμικά αντιβιοτικά 3. ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 3.1 Ανταλλαγή γενετικού υλικού στα βακτήρια 3.2 Μηχανισμοί ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά 3.3 Ανθεκτικότητα στα β-λακταμικά αντιβιοτικά / β-λαταμάσες 3.3.1 Εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσες (ESBLs) 3.3.2 AmpC β-λακταμάσες 3.3.3 Μεταλλο-β-λακταμάσες (MBLs) ΠΑΡΟΥΣΑ ΕΡΕΥΝΑ 4. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Δειγματοληπτικό υλικό 4.2 Καλλιέργεια στελεχών της E. coli 4.3 Ταυτοποίηση στελεχών της E. coli 4.4 Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά των στελεχών 4.5 Έλεγχος του φαινοτύπου παραγωγής β-λακταμασών 4.5.1 Double Disk Synergy Test (DDST) 4.5.1 Δοκιμή του βορονικόυ οξέος (ΒΑ) 4.6 Εκχύλιση του DNA των στελεχών 4.7 Ανίχνευση των bla γονιδίων με δοκιμές PCR 4.7.1 Ανίχνευση των bla AmpC γονιδίων - multiplex PCR 4.7.1.1 Ανίχνευση των bla CYM γονιδίων 4.7.2 Ανίχνευση των bla TEM γονιδίων 4.7.3 Ανίχνευση των bla SHV γονιδίων 4.7.4 Ανίχνευση των bla CTX-M γονιδίων 4.8 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 4.9 Ανάλυση της νουκλεοτιδικής ακολουθίας των γονιδιών 4.10 Συστοίχιση ακολουθιών 4.11 Πειράματα σύζευξης 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1 Απομόνωση καιταυτοποίηση των στελεχών της E. coli 5.2 Φαινότυπος ανθεκτικότητας των στελεχών της E. coli 5.3 Γενότυπος ανθεκτικότητας των στελεχών της E. coli 5.3.1 Ανίχνευση bla TEM και bla CYM γονιδίων 5.3.2 Καθορισμός των αλληλίων των bla TEM και bla CYM γονιδίων 5.4 Μεταβίβαση του bla CYM γονιδίου κατά τη σύζευξη 6. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα αντιβιοτικά χρησιμοποιούνται στα ζώα για τη διασφάλιση της υγείας των ζώων και την πρόληψη μετάδοσης των ζωονόσων και των τρογιμογενών λοιμώξεων στον άνθρωπο. Το 50% περίπου των αντιβιοτικών που χορηγούνται ετησίως στην Ευρωπαϊκή Ένωση δίνεται στα ζώα (European Union Conference, 1998). Οι αντιμικροβιακές ουσίες που χρησιμοποιούνται στην κτηνοτροφία, τόσο για την πρόληψη όσο και για την θεραπεία βακτηριακών λοιμώξεων, ανήκουν στις ίδιες κλάσεις αντιμικροβιακών που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση των βακτηριακών λοιμώξεων του ανθρώπου. Ως εκ τούτου η εμφάνιση ανθεκτικότητας σε βακτηρία που μολύνουν τα ζώα μπορεί να έχει άμεση επίπτωση στη Δημόσια Υγεία. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι με τους οποίους μπορούν ανθεκτικά βακτήρια προερχόμενα από ζώα να μολύνουν ανθρώπους, όπως η άμεση επαφή με τα ζώα ή με μολυσμένα υλικά, η έκθεση σε μολυσμένο αέρα ή η πρόσληψη μολυσμένων τροφίμων ή νερού (Schwarz et al, 2001 van den Bogaard, 2000). Η μόλυνση που οφείλεται στην κατανάλωση τροφίμων ζωικής προέλευσης είναι αυτή που έχει μελετηθεί περισσότερο. Τα παραγωγικά ζώα θεωρούνται οι κύριες δεξαμενές για ζωονοσογόνα βακτήρια όπως Salmonella, Escherichia coli Ο157Η7 και Campylobacter που ευθύνονται για την εκδήλωση εντερικών λοιμώξεων στον άνθρωπο. Στις αναπτυσσόμενες χώρες φαίνεται πως η εξάπλωση των ζωονοσογόνων βακτηρίων γίνεται κυρίως μέσω της τροφικής αλυσίδας, είτε λόγω λανθασμένων χειρισμών είτε από το μη επαρκές μαγείρεμα (Crattoli et al, 2008). Το πρόβλημα της εμφάνισης και επικράτισης ανθεκτικών βακτηρίων έναντι των αντιμικροβιακών ουσιών μπορεί να πηγάζει από την αλόγιστη και μη ορθολογική χρήση των αντιβιοτικών τόσο στον άνθρωπο όσο και στα ζώα και αποτελεί ένα πολύπλοκο και σοβαρό θέμα στον τομέα της Δημόσιας Υγείας. Η χρήση των αντιβιοτικών καταλήγει να είναι αναποτελεσματική για θεραπεία και ως συνέπεια αυτού, επιβιώνουν και μεταδίδονται τα βακτήρια που είναι ανθεκτικά στα υπάρχοντα μέχρι σήμερα αντιβιοτικά. Αξίζει να σημειωθεί ότι η χορήγηση αντιβιοτικών φαρμάκων ασκεί επιλεκτική πίεση και στην φυσιολογική χλωρίδα του οργανισμού που δέχεται την αγωγή με αποτέλεσμα ανθεκτικότητα να εμφανίζεται και σε συμβιωτικά βακτήρια, όπως του Enterococcus και της Escherichia coli (van den Bogaard, 2001). Η ανθεκτικότητα που αποκτούν τα συμβιωτικά βακτήρια, εκτός από το ότι τα καθιστά μια τεράστια δεξαμενή γονιδίων ανθεκτικότητας, αποτελεί και ένα δείκτη τόσο της εκλεκτικής πίεσης που ασκούν τα χορηγούμενα φάρμακα όσο και των προβλημάτων που αναμένεται να εκδηλωθούν από τον ανθεκτικό φαινότυπο των παθογόνων βακτηρίων (van den Bogaard, 2000). Πριν από περίπου 40 χρόνια, απομονώθηκαν για πρώτη φορά από υγιή άτομα συμβιωτικά στελέχη της E.coli, τα οποία αποδείχθηκε ότι έφεραν ανθεκτικότητα. Σήμερα, πολλές μελέτες υπογραμμίζουν την όλο και μεγαλύτερη συχνότητα που παρατηρείται στην εμφάνιση ανθεκτικών στα αντιβιοτικά στελεχών της φυσιολογικής βακτηριακής χλωρίδας στον άνθρωπο και τις επιπτώσεις που επιφέρει αυτό στην λειτουργία των βακτηρίων αυτών ως δεξαμενή γονιδίων ανθεκτικότητας (Bailey, 2010). Αντικείμενο της παρούσας διπλωματικής ερευνητικής εργασίας αποτελεί η ανίχνευση και ταυτοποίηση γονιδίων αντοχής που κωδικοποιούν την παραγωγή ενζύμων (β-λακταμασών) που υδρολύουν τα β-λακταμικά αντιβιοτικά, σε στελέχη της E. coli απομονωμένων από υγιή ζώα ή από κλινικά περιστατικά ζώων.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1. ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ESCHERICHIA COLI 1.1 Χαρακτηριστικά της Escherichia coli Τα βακτήρια της οικογένειας Enterobacteriaceae (Εντεροβακτηριακά) είναι ευρύτατα διαδεδομένα στη φύση. Μπορούν να απομονωθούν από το έδαφος και από υδροβιότοπους, καθώς και από τα φυτά, τα ζώα και τον ανθρώπο. Στην οικογένεια αυτή περιλαμβάνονται πολλά γένη, τα οποία μπορούν να διαφοροποιηθούν με βάση τις βιοχημικές τους ιδιότητες (Αγγέλης, 2007). Η Escherichia coli αποτελεί το κύριο μέλος του γένους Escherichia και παρουσιάζει τους γενικούς χαρακτήρες των εντεροβακτηριακών. Ανήκει στα Gram-αρνητικά βακτήρια παρουσιάζοντας ραβδόμορφο σχήμα, είναι δηλαδή βάκιλλος μεγέθους περίπου 2μm (Εικόνα 1α & 1β) (Madigan et al, 2007). Είναι προαιρετικά αναερόβιος μικροοργανισμός, δηλαδή μπορεί να αναπτυχθεί τόσο παρουσία, όσο και απουσία οξυγόνου. Αναπτύσσεται κατά το πλείστον στους 37 ο C, ενώ υπάρχουν και στελέχη που αναπτύσσονται και σε θερμοκρασίες μέχρι 49 ο C (Fotadar, 2005). Εικόνα 1α Εικόνα 1β Εικόνα 1. Escherichia coli σε επίχρισμα με χρώση Gram (Εικόνα 1α) και σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Εικόνα 1β; http://sgugenetics.pbworks.com/f/e.coli.jpg). Στην E.coli ανιχνεύονται τα σωματικά αντιγόνα (Ο), τα βλεφαριδικά αντιγόνα (Η) και ορισμένες φορές τα αντιγόνα της κάψας (Κ). Τα Ο αντιγόνα αποτελούν τον ειδικό πολυσακχαρίτη του LPS (λιποπολυσακχαρίτη) του κυτταρικού τοιχώματος του μικροοργανισμού, η ειδικότητα του οποίου καθορίζεται από τις υδατανθρακικές πλευρικές αλυσίδες του. Τα Η αντιγόνα είναι πρωτεϊνικής φύσης ενώ τα Κ είναι πολυσακχαρίτες, οι οποίοι βοηθούν το βακτήριο να διαφύγει την φαγοκυττάρωση και παρέχουν προστασία στο κυτταρικό του τοίχωμα από την δράση του συμπληρώματος. Με βάση αυτά τα αντιγόνα χαρακτηρίζονται οι διάφοροι ορότυποί της π.χ. Ο55:Κ5:Η21, Ο157:Η7 Τέλος, τα πρωτείνικής φύσεως ινιδιακά αντιγόνα (F) δρουν ως μόρια προσκόλλησης σε επιφάνεις των βλεννογόνων (Quinn et al, 2002).

1.2 Παθογένεια της Escherichia coli Η E.coli αποικεί φυσιολογικά στο παχύ έντερο όλων των θηλαστικών και στα κατώτερα τμήματα του λεπτού εντέρου, αποτελώντας μέρος της χλωρίδας του εντερικού σωλήνα (Songer και Post, 2004). Η αποίκηση ξεκινάει λίγες ώρες αμέσως μετά την γέννηση του ξενιστή με στελέχη που υπάρχουν στο περιβάλλον. Μέσω της της χλωρίδας του εντέρου μπορεί να μολύνει το νερό, το έδαφος ή τα τρόφιμα ζωικής προέλευσης. Τα περισσότερα στελέχη της Ε.coli είναι χαμηλής λοιμογόνου δύναμης και μπορούν να προκαλέσουν λοίμωξη ευκαιριακά αν βρεθούν σε περιοχές εκτός του εντέρου. Ωστόσο, υπάρχουν στελέχη της Ε.coli που χαρακτηρίζονται την παρουσία λοιμογόνων παραγόντων και ως εκ τούτου είναι παθογόνα σωλήνα (Songer και Post, 2004). Έχουν αναγνωριστεί τουλάχιστον έξι ομάδες παθογόνων στελεχών. Αυτά που προκαλούν εντερίτιδα στα ζώα είναι ταξινομημένα σε τρεις κατηγορίες: Τα εντεροτοξικά (ETEC) φέρουν ινιδιακά αντιγόνα, π.χ. K88, K99, τα οποία λειτουργούν ως συγκολλητίνες, βοηθώντας την προσκόλληση της Ε.coli στα επιθηλιακά κύτταρα του λεπτού εντέρου του ξενιστή. Η παρουσία αυτών των αντιγόνων σχετίζεται με την παραγωγή εντεροτοξινών. Τα ETEC στελέχη προκαλλούν την κολιβακίλλωση. Τα εντεροπαθογόνα (EPEC) δεν παράγουν εντεροτοξίνες, αλλά με άλλους μηχανισμούς, π.χ. με τη βοήθεια εκκριτικών πρωτεϊνών, μπορούν να προκαλέσουν εντερίτιδα και διάρροια. Τα εντεροαιμορραγικά (EΗEC) προσκολλώνται στα κύτταρα προσκολλώνται στο εντερικό επιθήλιο, συνήθως του παχέος εντέρου, μέσω ειδικών πρωτεϊνών και παράγουν τοξίνες οι οποίες είναι όμοιες δομικά, λειτουργικά και αντιγονικά με τη Shiga τοξίνη (Stx) της Shigella dysenteriae, ως εκτούτου τα EHEC στελέχη ονομάζονται και Shiga toxin producing (STEC). Ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στο στέλεχος Ο157 της E. coli, το οποίο παράγει Shiga τοξίνη, είναι δηλαδή EΗEC. Δύο ορότυποι του στελέχους αυτού (Η7 και ΝΜ) αποτελούν την κύρια αιτία του αιμολυτικού-ουραιμικού συνδρόμου, ένα σύνδρομο το οποίο μπορεί να οδηγήσει στο θάνατο, καθώς και της αιμορραγικής κολίτιδας στον άνθρωπο (Songer και Post, 2004 Schroeder et al, 2002). H ανάγκη χορήγησης αντιβιοτικών για την αντιμετώπιση νοσημάτων που προκαλούν τα παθογόνα αλλά και τα ευκαιριακά παθογόνα στελέχη της E. coli εντείνει το πρόβλημα που προκαλείται στην δημόσια υγεία από την εμφάνιση ανθεκτικότητας στα χορηγούμενα φάρμακα. Επιπλέον, εκτός από την εκλεκτική πίεση που ασκεί η συνεχής χορήγηση αντιβιοτικών στην εμφάνιση ανθεκτικότητας, η E.coli ανήκει στα βακτήρια που μπορούν να δεχτούν πλασμίδια και άλλα μεταθετά γενετικά στοιχεία τα οποία μπορεί να φέρουν γονίδια που κωδικοποιούν λοιμογόνους παράγοντες ή αντιμικροβιακή αντοχή (Songer και Post, 2004).

1.3 Εργαστηριακή διάγνωση της Escherichia coli Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιείται συνηθέστερα για την καλλιέργεια της E.coli είναι το MacConkey άγαρ. Η E.coli διασπά τη λακτόζη που εμπεριέχεται στο MacConkey άγαρ και ως εκτούτου παράγει χαρακτηριστικές ροζ αποικίες όταν καλλιεργηθεί σε αυτό το υπόστρωμα. Πιο σπάνια χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα το Εosin blue agar (EMB), στο οποίο οι αποικίες της E.coli έχουν μια μοναδική και χαρακτηριστική μεταλλική λάμψη. Η E.coli δίνει θετική τη δοκιμή της καταλάσης και αρνητική τη δοκιμή της οξειδάσης. Η δοκιμή της καταλάσης ανιχνεύει το ένζυμο καταλάση του βακτηρίου, το οποίο μετατρέπει το υπεροξείδιο του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο. Η δοκιμή της οξειδάσης βασίζεται στην παρουσία της οξειδάσης του κυτοχρώματος c στο κύτταρο (Quinn et al, 1994 Quinn et al, 2002 Songer και Post, 2004). Μέθοδος βιοχημικής ταυτοποίησης της E.coli, η οποία χρησιμοποιείται τις περισσότερες φορές στο εργαστήριο για γρήγορα αποτελέσματα, είναι η δοκιμή IMViC (Indol, Methyl red, Vogues-Proskauer, Citrate). Περιλαμβάνει μια σειρά από τέσσερις επιμέρους δοκιμές. Η δοκιμή της ινδόλης που ανιχνεύει την παραγωγή της ινδόλης από τη διάσπαση της τρυπτοφάνης, η δοκιμή του ερυθρού του μεθυλίου το οποίο ελέγχει την παραγωγή οξέος, η δοκιμή Voges-Proskauer, που ανιχνεύει την παραγωγή ακετοϊνης, ενός ενδιαμέσου προϊόντος της γλυκόλης του βουτυλενίου, και τέλος, η δοκιμή που εξετάζει την αξιοποίηση του κιτρικού ως τη μοναδική πηγή άνθρακα (http://www.eplantscience.com/index/biotechnology_methods/ microbiology/imvic_test.php). Η E.coli παρουσιάζει IMViC: ++--, αναλυτικά: - Θετική στην παραγωγή της ινδόλης - Θετική για το ερυθρό του μεθυλίου - Αρνητική για το Voges-Proskauer και - Αρνητική για το κιτρικό O συνδυασμός αυτός δεν απαντάται σε κανένα άλλο μέλος των εντεροβακτηριακών που είναι μεταβολίτες της λακτόζης. Αυτές οι διαγνωστικές μέθοδοι είναι χρήσιμες για την ταυτοποίηση των στελεχών της E.coli που είναι δυνητικά παθογόνα. Για την απομόνωση και ταυτοποίηση των παθογόνων στελεχών χρησιμοποιούνται πιο εξειδικευμένες μέθοδοι, όπως η αναγνώριση των Ο, Η, Κ και F αντιγόνων ή των παραγόμενων, αν υπάρχουν, εντεροτοξινών (Quinn et al, 1994 Quinn et al, 2002).

2. ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ - ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 2.1 Χαρακτηριστικά αντιμικροβιακών παραγόντων Ως αντιμικροβιακοί παράγοντες γενικά χαρακτηρίζονται οι ουσίες οι οποίες επηρεάζουν δυσμενώς τους διάφορους μικροοργανισμούς. Διακρίνονται σε 3 κατηγορίες: αντιβιοτικά και συνθετικά ειδικά χημειοθεραπευτικά χημικές μη ειδικές αντιμικροβιακές ενώσεις όπως αντισηπτικά και απολυμαντικά ανοσοβιολογικά προϊόντα, για παράδειγμα οροί. Ως αντιβιοτικά ορίστηκαν αρχικά μικρού μοριακού βάρους μεταβολίτες μικροοργανισμών, οι οποίοι είτε θανατώνουν είτε αναστέλλουν την ανάπτυξη άλλων βακτηρίων, ευαίσθητων στην δράση τους. Αυτά ονομάζονται φυσικά αντιβιοτικά. Σήμερα, με την ανάπτυξη κατάλληλων χημικών μεθόδων μπορούν να παρασκευαστούν συνθετικές ενώσεις, που καλούνται συνθετικά αντιβιοτικά, επεκτείνοντας έτσι το φάσμα των αντιβιοτικών. Η τελευταία κατηγορία αντιβιοτικών περιλαμβάνει επίσης τα ημισυνθετικά αντιβιοτικά, τα οποία προέρχονται από χημικές τροποποιήσεις ενός φυσικού αντιβιοτικού. Ένα ιδανικό αντιβιοτικό θα πρέπει να είναι δραστικό έναντι του παθογόνου βακτηρίου, χωρίς όμως να αποτελεί τοξική ουσία για τα κύτταρα του ζώου (ή του ανθρώπου) στο οποίο χορηγείται. Η επιλεκτικότητα αυτή στηρίζεται στα διαφορετικά μεταβολικά μονοπάτια και τις διαφορές που φέρουν στην δομή τους, τα κύτταρα των θηλαστικών και των βακτηρίων. Αυτές οι ιδιότητες είναι απαραίτητες, έτσι ώστε ένα αντιβιοτικό να θεωρείται κατάλληλο για θεραπευτική χρήση. Επιπλέον, τα αντιβιοτικά δεν είναι αποτελεσματικά για όλα τα είδη των παθογόνων βακτηρίων. Ορισμένες ομάδες (κλάσεις) αντιβιοτικών δρούν έναντι ενός στενού φάσματος βακτηρίων, ενώ άλλες είναι αποτελεσματικές για ένα ευρύ φάσμα βακτηριακών ειδών (Quinn et al, 2002 Κολιάης, 2001). 2.2 Χρήση των αντιβιοτικών στην κτηνοτροφία Ενώ η χρήση των αντιμικροβιακών παραγόντων στην ιατρική αφορά στην αντιμετώπιση των βακτηριακών λοιμώξεων, στην κτηνοτροφία, και ειδικότερα στα ζώα παραγωγής-τροφίμων, τα αντιβιοτικά χρησιμοποιούνται για δύο λόγους. Ο πρώτος είναι για την πρόληψη και έλεγχο των βακτηριακών λοιμώξεων, και ο δεύτερος για τη βελτίωση της ανάπτυξης των ζώων (Schwarz et al, 2001). Η πρόληψη και ο έλεγχος επιτυγχάνεται με τη θεραπευτική, τη μεταφυλακτική και την προφυλακτική εφαρμογή των αντιμικροβιακών παραγόντων. Η θεραπευτική χρήση γίνεται με σκοπό την αντιμετώπιση μιας ήδη υπάρχουσας λοίμωξης. Η μεταφύλαξη, εφαρμόζεται με σκοπό να προλάβει την εξάπλωση μιας λοίμωξης, από τα μεμονωμένα ζώα της ομάδας που εκδηλώνουν συμπτώματα, στα φαινομενικά υγιή. Τέλος, η προφύλαξη είναι ένα μέτρο πρόληψης, που πρέπει φυσικά να χρησιμοποιείται με σύνεση, και χρησιμοποιείται ευρέως για την μεταχειρουργική προφύλαξη στα ζώα.

Ένας ορισμένος αριθμός από εγκεκριμένες ουσίες με αντιμικροβιακή δράση, χρησιμοποιείται για την βελτίωση της ανάπτυξης στα παραγωγικά ζώα. Οι παράγοντες αυτοί, χορηγούνται καθ' όλη την περίοδο ανάπτυξης των ζώων. Οι διαθέσιμες ουσίες και οι συνθήκες τους είναι αυστηρά καθορισμένες τόσο ως προς το ζώο στο οποίο χορηγούνται, όσο και προς τη διάρκεια και τη δοσολογία της χορήγησής τους (Schwarz et al, 2001 Schwarz και Chaslus-Dancla, 2001). 2.3 Μηχανισμοί δράσης των αντιβιοτικών Προκειμένου ο αντιμικροβιακός παράγοντας να εμποδίσει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού θα πρέπει να αλληλεπιδράσει με κάποια ζωτικής σημασίας δομή του βακτηριακού κυττάρου ή να σταματήσει την διεξαγωγή κάποιας μεταβολικής οδού. Διακρίνονται 4 μηχανισμοί μέσω των οποίων τα αντιβιοτικά φάρμακα επιτυγχάνουν αυτές τις λειτουργίες: Αναστολή της λειτουργίας της μεμβράνης. Η μεμβράνη των βακτηρίων διασπάται περισσότερο εύκολα από αυτήν των κυττάρων των ανώτερων οργανισμών, υπό την επίδραση ειδικών παραγόντων. Αυτή η διαταραχή στην μεμβράνη οδηγεί σε διαφυγή μακρομορίων και ιόντων, με αποτέλεσμα το θάνατο του κυττάρου. Αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης. Μερικά από τα αντιβιοτικά αυτής της κατηγορίας έχουν την ικανότητα διάκρισης των προκαρυωτικών (βακτηριακών) και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων, και να προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς στα ριβοσώματων των προκαρυωτών (βακτηρίων). Με αυτό τον τρόπο παρεμποδίζουν την εκτέλεση ορισμένων βημάτων της πρωτεϊνοσύνθεσης με αποτέλεσμα να παράγονται μη-λειτουργικές πρωτεΐνες. Αναστολή της σύνθεσης νουκλεϊκών οξέων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων απαιτεί τον διπλασιασμό του γενετικού υλικού τους. Αντιβιοτικά όπως οι κινολόνες επιδρούν σε ένζυμα που είναι απαραίτητα για το διαχωρισμό της διπλής έλικας του DNA. Άλλα αντιβιοτικά περιορίζουν τη σύνθεση του RNA με το να επεμβαίνουν στη λειτουργικότητα της DNAεξαρτώμενης RNA πολυμεράσης. Αναστολή της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος. Σε αντίθεση με τα ζωικά κύτταρα, τα βακτηριακά κύτταρα περιβάλλονται από κυτταρικό τοίχωμα. Βλάβες στο κυτταρικό τοίχωμα οδηγούν σε λύση του κυττάρου και θάνατο. Η πεπτιδογλυκάνη αποτελεί ένα μοναδικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων, που δεν απαντάται στους ευκαρυώτες (π.χ. ζωικά κύτταρα). Αντιβιοτικά όπως οι κεφαλοσπορίνες, που ανήκουν στις β-λακτάμες και είναι αποτελούν μια από τις σημαντικότερες ομάδες αντιβιοτικών, εμποδίζουν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων, αποτρέποντας τη διασταυρούμενη σύνδεση των αλυσίδων της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος (Quinn et al, 2002 Κολιάης, 2001). 2.4 β-λακταμικά αντιβιοτικά Τα β-λακταμικά αντιβιοτικά, ή β-λακτάμες, συγκαταλέγονται μεταξύ των πιο σημαντικών αντιβιοτικών για χρήση τόσο στην Ιατρική όσο και στην Κτηνιατρική. Στη Δανία μάλιστα,

υπολογίζεται ότι με βάση την συνολική κατανάλωση αντιβιοτικών είναι τα πιο συχνά χορηγούμενα φάρμακα σε παραγωγικά ζώα. Στην ομάδα των αντιβιοτικών αυτών ανήκουν οι πενικιλλίνες, οι κεφαλοσπορίνες, οι αναστολείς των β-λακταμασών, οι μονοβακτάμες, και οι καρβαπενέμες (Li et al, 2007). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.1, οι β-λακτάμες που κυρίως χρησιμοποιούνται για θεραπευτικούς και προληπτικούς σκοπούς στην Κτηνιατρική είναι οι πεινικιλλίνες, είτε μόνες τους είτε σε συνδυασμό με αναστολείς των β-λακταμασών και οι κεφαλοσπορίνες. Οι μονοβακτάμες και οι καρβαπενέμες δεν έχουν εγκριθεί για κτηνιατρική χρήση, μέχρι σήμερα. Δομικά, οι β-λακτάμες αποτελούνται από ένα β-λακταμικό δακτύλιο, ο οποίος είναι συνδεδεμένος με πενταμελή και εξαμελή ετεροκυκλικό ή μη ετεροκυκλικό δακτύλιο (Τσιφτσόγλου, 2011). Το μοντέλο δράσης των β-λακταμών περιλαμβάνει την πρόσδεση αυτών, σε κατάλληλους υποδοχείς των ενζύμων που καταλύουν το σχηματισμό των πεπτιδικών δεσμών του πεπτιδογλυκανικού περιβλήματος. Το στρώμα της πεπτιδογλυκάνης διατηρεί το κυτταρικό σχήμα και παράλληλα προστατεύει το βακτήριο από οσμωτικές δυνάμεις. Το αντιβιοτικό αφαιρεί ή αδρανοποιεί έναν αναστολέα των αυτολυτικών ενζύμων, τα οποία σε ισοτονικό περιβάλλον οδηγούν τελικά σε λύση του βακτηριακού κυττάρου (Κολιάης, 2001 Smet et al, 2010). Η δραστικότητα μεταξύ των β-λακταμών ποικίλει. Ενώ οι πενικιλλίνες και οι 1 ης γενεάς κεφαλοσπορίνες είναι δραστικές έναντι Gram-θετικών βακτηρίων, οι αμινο-πενικιλλίνες και οι κεφαλοσπορίνες δρουν έναντι Gram-αρνητικών βακτηρίων. Οι 3 ης και 4 ης γενεάς κεφαλοσπορίνες είναι αποτελεσματικές τόσο έναντι των Gram-θετικών όσο και έναντι των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Οι πενικιλλίνες πέραν της θεραπευτικής τους χρήσης χορηγούνται στα ζώα και ως παράγοντες προώθησης του ρυθμού ανάπτυξης αυτών (Li et al, 2007).Οι αναστολείς των β-λακταμασών, δηλαδή το κλαβουλανικό οξύ, η σουλβακτάμη και η ταρζοβακτάμη, αποτελούν μια κατηγορία β-λακταμικών αντιβιοτικών τα οποία αναστέλλουν τις β-λακταμάσες, ενζύμων που παράγουν τα βακτήρια. To κλαβουλανικό οξύ αποτελεί ισχυρό αναστολέα της β-λακταμάσης του Staphylococcus aureus αλλά και πολλών Gram-αρνητικών βακτηρίων. Είναι αποτελεσματικό για β-λακταμάσες που κωδικοποιούνται από πλασμιδιακά γονίδια, δεν παρουσιάζει όμως την ίδια δραστικότητα στις β- λακταμάσες που κωδικοποιούνται από το βακτηριακό χρωμόσωμα. O μηχανισμός δράσης του αφορά την πρόσδεση του αντιβιοτικού μη-αντιστρεπτά στις β-λακταμάσες με αποτέλεσμα την απενεργοποίησή τους. Η σουλβακτάμη και η ταζοβακτάμη αποτελούν παράγωγα του πενικιλλανικού οξέος. Η σουλβακτάμη έχει περιορισμένη δραστικότητα έναντι των εντεροβακτηρίων και Gram-θετικών κόκκων. O μηχανισμός δράσης της είναι παρόμοιος με αυτόν του κλαβουλανικού οξέος (Τσιφτσόγλου, 2007).

Πίνακας 1. β-λακτάμες που χρησιμοποιούνται στην Κτηνιατρική Ομάδα β-λακταμικού αντιμικροβιακού Πενικιλλίνη Πενικιλλίνη σε συνδυασμό με αναστολείς β-λακταμασών Πρώτης & Δεύτερης γενεάς κεφαλοσπορίνη Δεύτερης γενεάς κεφαλοσπορίνη Τρίτης γενεάς κεφαλοσπορίνη Tέταρτης γενιάς κεφαλοσπορίνη Ουσία Ampicillin, amoxicillin, benzypenicillin, cloxacillin Amoxicillin/clavulanate acid Cefapirin, cephalexin, cefadroxil Cefoxitin, cefuroxime Cefovecin, cefpodoxime, ceftiofur Cefquinome 3. ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 3.1 Ανταλλαγή γενετικού υλικού στα βακτήρια Πολλά βακτήρια έχουν την ικανότητα να ανταλλάσουν μεταξύ τους γενετικό υλικό. Η μεταφορά γενετικού υλικού από ένα ανθεκτικό σε ένα ευαίσθητο βακτήριο, καθιστά το δεύτερο επίσης ανθεκτικό. Επιπλέον, αντοχή σε ένα αντιβιοτικό συνήθως καθιστά το βακτήριο ανθεκτικό και σε άλλες αντιμικροβιακές ουσίες που ανήκουν στην ίδια ομάδα (Schwarz και Chaslus-Dancla, 2001). Τρεις είναι οι βασικοί μηχανισμοί ανταλλαγής γενετικού υλικού στα βακτήρια: η σύζευξη, ο μετασχηματισμός και η μεταγωγή. Η σύζευξη είναι μια αντιγραφική διαδικασία και βασίζεται στην άμεση κυτταρική επαφή. Περιλαμβάνει την διακυτταρική μεταφορά είτε πλασμιδίου είτε τμήματος του χρωμοσώματος του κυττάρου που φέρει το πλασμίδιο. Η κυριότερη, για την έρευνα αυτή, κατηγορία πλασμιδίων είναι τα πλασμίδια ανθεκτικότητας (R). Τα πλασμίδια R προσδίδουν ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά καθώς και σε αναστολείς της ανάπτυξης. Μπορούν να μεταφέρουν τις ιδιότητες τους σε ευαίσθητα βακτηριακά στελέχη και με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η διάδοση της ανθεκτικότητας μέσω σύζευξης. Ορισμένα πλασμίδια ανθεκτικότητας μάλιστα φέρουν ποικίλα γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά δυσκολεύοντας ακόμα περισσότερο την θεραπεία των μολυσματικών νόσων (Madigan et al, 2007). Ένας άλλος τρόπος ανταλλαγής γενετικού υλικού μεταξύ βακτηριακών κυττάρων είναι ο μετασχηματισμός. Ο μηχανισμός αυτός περιλαμβάνει την ενσωμάτωση ελεύθερου DNA σε ένα κύτταρο-δέκτη με αποτέλεσμα την αλλαγή της γενετικής του σύστασης. Μετασχηματισμός μπορεί να συμβεί τόσο σε Gram-αρνητικά όσο και σε Gram-θετικά βακτήρια. Για να μπορεί ένα κύτταρο να μετασχηματιστεί θα πρέπει να είναι δεκτικό, δηλαδή ικανό να δεχθεί μόρια DNA. Η ιδιότητα αυτή είναι γενετικά καθορισμένη. Η πρόσληψη και επεξεργασία του DNA μεσολαβείται από ειδικές πρωτεϊνες στις οποίες περιλαμβάνονται μια μεμβρανική πρωτείνη δέσμευσης DNA, μια αυτολυσίνη κυτταρικού τοιχώματος και διάφορες νουκλεάσες. Τα Gram-

αρνητικά βακτήρια προσλαμβάνουν μόνο δίκλωνο DNA, ενώ η ενσωμάτωσή του στο γνοδιώμα συμβαίνει με ανασυνδυασμό του ενός μόνο κλώνου. Αντίθετα, τα Gram-θετικά βακτήρια προσλαμβάνουν μόνο μονόκλωνο DNA ενώ ο δεύτερος κλώνος αποικοδομείται. Βακτήρια ικανά να μετασχηματίζονται με υψηλή απόδοση αποτελούν τη μειονότητα του συνόλου των βακτηρίων. Έτσι, εφαρμόζονται τεχνικές, χημική επεξεργασία ή εναλλακτικές μέθοδοι όπως ηλεκτροδιάτρηση, ώστε να καθιστούν τα κύτταρα δεκτικά (Madigan et al, 2007). Ο τρίτος μηχανισμός μεταφοράς γενετικού υλικού είναι η μεταγωγή, όπου DNA μεταφέρεται από κύτταρο σε κύτταρο μέσω ιών. Διακρίνονται δύο τύποι μεταγωγής, η γενικευμένη και η εξειδικευμένη. Στη γενικευμένη μεταγωγή μπορεί να γίνει μεταφορά οποιουδήποτε γονιδιού από το κύτταρο-δότη στο δέκτη. Η διαδικασία περιλαμβάνει τη μόλυνση βακτηρίου με φάγο ο οποίος κατα την διάρκεια του λυτικού κύκλου μπορεί κατά λάθος να ενσωματώσει μέρος του γονιδιώματος του ξενιστή. Έτσι παράγονται τα μεταγωγικά σωμάτια τα οποία φέρουν το ξένο DNA και φυσιολογικά ιϊκά σωμάτια τα οποία απελευθερώνονται μαζί όταν γίνει λύση του βακτηριακού κυττάρου. Σε μια επόμενη μόλυνση ενός βακτηριακού πληθυσμού, πολύ μικρό ποσοστό αυτών θα προσλάβει μεταγωγικά σωμάτια. Σε αυτά, δεν συμβαίνει αντιγραφή του DNA αλλά γενετικός ανασυνδυασμός με το DNA του νέου ξενιστή (Madigan et al, 2007). 3.2 Μηχανισμοί ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά Ένα βακτήριο θεωρείται ανθεκτικό ως προς έναν αντιμικροβιακό παράγοντα όταν η συγκέντρωση του φαρμάκου στο σημείο της μόλυνσης δεν επαρκεί για την καταστολή του πολλαπλασιασμού του βακτηρίου ή το θάνατό του. Η ιδιότητα των βακτηρίων να είναι ανθεκτικά έναντι ενός αντιμικροβιακού παράγοντα εξαρτάται τόσο από τον ίδιο τον παράγοντα όσο από το είδος και από τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας που διαθέτει το ίδιο το βακτήριο (Schwarz και Chaslus-Dancla, 2001). Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί έως και έξι διαφορετικοί μηχανισμοί που μπορεί να προσδίδουν αντοχή ακόμη και στον ίδιο αντιμικροβιακό παράγοντα. Μερικοί μηχανισμοί παρατηρούνται σε πολλά διαφορετικά είδη βακτηρίων ενώ άλλοι φαίνεται να είναι ειδικοί για συγκεκριμένα είδη ή γένη βακτηρίων (Schwarz και Chaslus-Dancla, 2001). Οι εγγενείς ιδιότητες αντοχής των βακτηρίων, που περιλαμβάνουν κυρίως την έλλειψη ή την αδυναμία πρόσβασης του αντιβιοτικού στο στόχο, δεν φαίνεται να αποτελούν το κυρίαρχο πρόβλημα που αντιμετωπίζει η Ιατρική και η Κτηνιατρική, ενώ αντίθετα, οι επίκτητες ιδιότητες είναι εκείνες που ευθύνονται για το μεγαλύτερο ποσοστό αντοχής στα αντιβιοτικά που παρατηρείται σήμερα. Η επίκτητη αντοχή αντιπροσωπεύει μια ειδο-ειδική ιδιότητα που μπορεί να βασίζεται σε μεταλλάξεις λίγων συνήθως βάσεων σε συγκεκριμένα "housekeeping" γονίδια, τα οποία αποτελούν στόχους για πολλά αντιβιοτικά. Οι αλλαγές στην αλληλουχία των προϊόντων των γονιδίων αυτών έχουν μικρή ή και καθόλου επίπτωση στην βιολογική ενεργότητά τους, παρ όλα αυτά όμως τα καθιστούν ανθεκτικά στην ανασταλτική δράση των αντίστοιχων αντιβιοτικών. Συνηθέστερα όμως η αποκτούμενη αντοχή σχετίζεται με την απόκτηση κινητών γενετικών στοιχείων τα οποία φέρουν ένα ή περισσότερα γονίδια ανθεκτικότητας (Schwarz και Chaslus-Dancla, 2001).

Οι τρεις βασικότεροι μηχανισμοί αντοχής περιλαμβάνουν α) την ενζυμική απενεργοποίηση του αντιμικροβιακού παράγοντα, β) τη μειωμένη ενδοκυτταρική συσσώρευση του φαρμάκου, καθώς και γ) τη μεταλλαγή ή αντικατάσταση των κυτταρικών στοιχείων που αποτελούν το στόχο του αντιμικροβιακού (Li et al, 2007). Ένα ευρύ φάσμα ενζύμων είναι ικανό να καταστείλει τη δράση του αντιβιοτικού μέσω μεταφοράς ακετυλικών, αδενυλικών ή φοσφωρικών ομάδων. Άλλα ένζυμα δρουν απευθείας πάνω στο αντιμικροβιακό μόριο καταστρέφοντάς το. Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν οι β- λακταμάσες, οι υδρολάσες και οι εστεράσες. Το φάσμα των υποστρωμάτων για τα διάφορα ένζυμα απενεργοποίησης περιορίζεται συνήθως σε ένα μικρό αριθμό αντιβιοτικών, αποτελούμενα από δομικά παρόμοιες ενώσεις (Schwarz και Chaslus-Dancla, 2001). Μειωμένη ενδοκυτταρική συσσώρευση του φαρμάκου μπορεί να επιτευχθεί με δύο τρόπους, είτε με μειωμένη πρόσληψη του φαρμάκου είτε με αυξημένη απέκκρισή του από το κύτταρο. Η μειωμένη πρόσληψη συνήθως οφείλεται στη μειωμένη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης ορισμένων Gram-αρνητικών βακτηρίων (Wilson et al, 2011). Αυξημένη απέκκριση των αντιμικροβιακών παραγόντων μπορεί να οφείλεται σε μεμβρανο-συνδεόμενες πρωτεϊνες εκροής οι οποίες κωδικοποιούνται από γονίδια ανθεκτικότητας που έχουν βρεθεί σε τρανσποζόνια ή γενετικές κασέτες κασέτες (Schwarz και Chaslus-Dancla, 2001). Σε συστήματα εκροής οφείλεται η αντοχή σε αντιβιοτικά όπως οι τετρακυκλίνες, τόσο σε Gram-θετικά όσο και σε Gram-αρνητικά βακτήρια (Roberts, 1996). Η χημική τροποποίηση της θέσης στόχου μπορεί να την καθιστά το στόχο απρόσιτο στο φάρμακο. Ακόμα, προστασία του στόχου από ειδικές πρωτεϊνες ή και αντικατάσταση της θέσης στόχου από νέους στόχους με χαμηλή συγγένεια στο αντιβιοτικό αποτελούν άλλους μηχανισμούς που χρησιμοποιούν τα βακτήρια ώστε να διαφεύγουν της δράσης των αντιμικροβιακών παραγόντων κασέτες (Schwarz και Chaslus-Dancla, 2001). 3.3 Ανθεκτικότητα στα β-λακταμικά αντιβιοτικά / β-λαταμάσες Αντοχή σε β-λακταμικά αντιβιοτικά μπορεί να προκληθεί από τουλάχιστον 3 μηχανισμούς: αλλοίωση του στόχου του φαρμάκου, αδυναμία πρόσβασης στο στόχο, ή/και στην ενζυμική απενεργοποίηση του χορηγούμενου αντιβιοτικού. Ο θεμελιώδης μηχανισμός ανθεκτικότητας των Gram-αρνητικών βακτηρίων στις β-λακτάμες είναι η ενζυμική απενεργοποίηση, υδρόλυση του τετρατομικού β-λακταμικού δακτυλίου, των β-λακταμικών αντιμικροβιακών από τις β- λακταμάσες. Ορισμένα βακτήρια παράγουν β-λακταμάσες κωδικοποιούμενες από χρωμοσωμικό DNA, είτε ιδιοστατικά είτε από επαγωγή. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, φαίνεται πως οι β- λακταμάσες που κωδικοποιούνται από πλασμιδιακό DNA είναι οι επικρατέστερες στα Gramαρνητικά βακτήρια (Li et al, 2007). Οι β-λακταμάσες περιλαμβάνουν ένζυμα τα οποία διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την ικανότητά τους να υδρολύουν τα διάφορα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον το γεγονός ότι η αντοχή σε β-λακταμικά αντιβιοτικά ξεκίνησε πριν ακόμα την ανάπτυξη της

πενικιλλίνης ως αντιμικροβιακού, του πρώτου δηλαδή β-λακταμικού αντιβιοτικού (Bradford, 2001). Υπάρχουν δύο τρόποι ταξινόμησης των β-λακταμασών, η μοριακή ταξινόμηση κατά Ambler και η λειτουργική ταξινόμηση των πρωτεινών αυτών κατά Bush-Jacoby-Medeiros. Οι β-λακταμάσες σύμφωνα με τον Ambler διακρίνονται σε 4 κατηγορίες με βάση την πρωτεϊνική ομολογία των ενζύμων. Οι β-λακταμάσες των τάξεων Α, C και D είναι β-λακταμάσες σερίνης, ενώ στην τάξη Β ανήκουν οι μεταλλο-β-λακταμάσες. H δεύτερη κατηγοριοποίηση των β-λακταμασών κατά Bush-Jacoby-Medeiros χρησιμοποιεί τις βιοχημικές ιδιότητες των ενζύμων σε συνδυασμό με την μοριακή δομή και την νουκλεοτιδική αλληλουχία των γονιδίων τους ώστε να ταξινομήσει τις β- λακτάμασες με βάση την λειτουργία τους (Harada et al, 2008). Αντοχή σε εκτεταμένο φάσμα β-λακταμικών αντιβιοτικών έχει συσχετιστεί με την παραγωγή β- λακταμασών ευρέως φάσματος, όπως είναι οι AmpC β-λακταμάσες, οι εκτεταμένου-φάσματος β-λακταμάσες (extended spectrum β-λακταμάσες, ESBLs) και οι μεταλλο-β-λακταμάσες (metallo-β-lactamases, MBLs) (Batchelor et al,2005). 3.3.1 Εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσες (ESBLs) Ο όρος εκτεταμένου-φάσματος β-λακταμάσες χρησιμοποιήθηκε αρχικά για να περιγράψει παράγωγα των TEM και SHV ενζύμων, τα οποία κωδικοποιούνται από τα bla TEM και bla SHV γονίδια αντίστοιχα, και τα οποία υδρολύουν οξυιμινο-κεφαλοσπορίνες. Αργότερα όμως, η ανακάλυψη αρκετών νέων ενζύμων αποτέλεσε αιτία για τον επαναπροσδιορισμό του αρχικού ορισμού των ESBLs (Harada et al, 2008). Οι β-λακταμάσες που ανήκουν στις ESBLs πρέπει να διακρίνονται από άλλες β-λακταμάσες, οι οποίες επίσης υδρολύουν ένα ευρύ φάσμα κεφαλοσπορινών, όπως οι AmpC β-λακταμάσες και οι MBLs (καρβαπεναμάσες) (Paterson, 2006). Με βάση τη μοριακή ταξινόμηση κατά Ambler, η πλειοψηφία των ESBLs ανήκει στην τάξη Α, η οποία περιλαμβάνει τις β-λακταμάσες που περιέχουν ένα κατάλοιπο σερίνης στο ενεργό τους κέντρο. Η ταξινόμηση αυτή όμως δεν επιτρέπει τον επαρκή διαχωρισμό μεταξύ των TEM και SHV ενζύμων και των ESBLs παραγώγων τους. Έτσι, χρησιμοποιώντας την κατά Bush-Jacoby- Medeiros ταξινόμηση, οι ESBLs ανήκουν στις β-λακταμάσες οι οποίες έχουν την δυνατότητα να υδρολύουν οξυιμινο-κεφαλοσπορίνες, οι περισσότερες όμως αναστέλλονται από τη δράση του κλαβουλανικού οξέως (ομάδα 2be). Δεν είναι δραστικές έναντι των καφαμυκινών και των καρβαπενεμών με τα περισσότερα από τα στελέχη που εκφράζουν ESBLs να μην είναι ανθεκτικά έναντι των αντιβιοτικών κεφοξιτίνη και κεφοτετάνη (Harada et al, 2008 Smet et al, 2010) Έχουν αναγνωρισθεί περισσότερες από 200 TEM β-λακταμάσες και περισσότερες από 150 SHV β-λακταμάσες. Σημειακές μεταλλάξεις σε επιλεγμένες θέσεις μέσα στο υπεύθυνο γονίδιο επέτρεψαν την εμφάνιση ενός φαινότυπου εκτεταμένου-φάσματος αντοχής στις δύο αυτές ομάδες ενζύμων (Bradford, 2001 Harada et al, 2008 Lahey Studies,

http://www.lahey.org/studies/). Πιο συγκεκριμένα, οι οικογένειες των ενζύμων που συμπεριλαμβάνονται στις ESBLs είναι: TEM ESBLs: Η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει τα παράγωγα των ΤΕΜ-1 και ΤΕΜ-2 ενζύμων. Σε αντίθεση με την πλειοψηφία των ΤΕΜ β-λακταμασών, οι ΤΕΜ-1, ΤΕΜ-2 και ΤΕΜ-13 και ορισμένες άλλες ΤΕΜ β-λακταμάσες δεν ανήκουν στις ESBLs και είναι δραστικές μόνο έναντι των ευρέοςφάσματος πενικιλλινών και 1ης γενεάς κεφαλοσπορινών. Η ΤΕΜ-2 β-λακταμάση διαφέρει από την ΤΕΜ-1 κατά ένα αμινοξύ. Από τη στιγμή που αναφέρθηκε η πρώτη παραλλαγή ΤΕΜ ενζύμου έχουν προσδιοριστεί πάνω από 200 ΤΕΜ β-λακταμάσες, από τις οποίες το μεγαλύτερο ποσοστό ανήκει στις ESBLs. Οι αμινοξικές υποκαταστάσεις στην αλληλουχία ενός ΤΕΜ ενζύμου συμβαίνουν σε έναν περιορισμένο αριθμό θέσεων. Ο συνδυασμός αυτών των αμινοξικών αλλαγών μεταβάλλει τους ESBL φαινότυπους, όπως για παράδειγμα μια αλλαγή στο ισοηλεκτρικό σημείο ή την ικανότητα να υδρολύουν οξυίμινο-κεφαλοσπορίνες, όπως κεφοταξίμη και κεφταζιδίμη. Υποκαταστάσεις αμινοξέων σε συγκεκριμένες θέσεις του ΤΕΜ ενζύμου παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην παραγωγή ενός ESBL φαινότυπου. Σε αυτές περιλαμβάνεται η θέση 104, όπου το γλουταμινικό οξύ αντικαθίσταται από λυσίνη, η θέση 164, όπου γίνεται αντικατάσταση της αργινίνης από ιστιδίνη ή σερίνη, η θέση 238 με αντικατάσταση της γλυκίνης από σερίνη, και τέλος η θέση 240 με αντικατάσταση του γλουταμινικού από λυσίνη (Bradford, 2001 Harada et al, 2008 Smet et al, 2010). SHV ESBLs: Η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει παράγωγα, που έχουν προέλθει επίσης από αμινοξικές υποκαταστάσεις, του SHV-1 ενζύμου. Η SHV-1-β-λακταμάση είναι δραστική στις ευρέοςφάσματος πενικιλλινών και 1ης γενεάς κεφαλοσπορινών, και είναι υπεύθυνη για περισσότερο από το 20% της μεσολαβούμενης-από-πλασμίδιο αντοχής στην αμπικιλίνη, σε στελέχη της K. pneumoniae. Στο στέλεχος αυτό έχει βρεθεί η πλειονότητα των SHV ESBLs. Τα ένζυμα αυτά έχουν επίσης βρεθεί και σε άλλα είδη βακτηρίων, συμπεριλαμβανομένης και της E. coli. Αναφορικά με τις ΤΕΜ β-λακταμάσες υπάρχουν λίγα SHV παράγωγα. Επιπλέον, οι θέσεις μέσα στο bla SHV γονίδιο στις οποίες έχουν παρατηρηθεί, μέχρι σήμερα, αλλαγές υπεύθυνες για την δημιουργία SHV παραλλαγών, είναι πολύ λιγότερες. Είναι αξιοσημείωτο ότι η πλειοψηφία των SHV ενζύμων με ESBL φαινότυπο, προέρχεται από μια αντικατάσταση στη θέση 238 της σερίνης από τη γλυκίνη (Bradford, 2001 Matthew et al, 1979 Smet et al,2010 Tzouvelekis και Bonomo, 1999). CTX-M ESBLs: Αυτή η οικογένεια ενζύμων περιλαμβάνει εκτεταμένου-φάσματος β-λακταμάσες, η έκφραση των οποίων μεσολαβείται από πλασμίδια. Κωδικοποιούνται από τα bla CTX-M γονίδια και έχουν βρεθεί κυρίως στα εντεροβακτηριοειδή, με μεγαλύτερη συχνότητα στη σαλμονέλα και την E. coli. Μια φυλογενετική μελέτη της οικογένειας των CTX-M β-λακταμασών διέκρινε 5 ομάδες, με βάση την αμινοξική αλληλουχία τους: - CTX-M-1, η οποία περιλαμβάνει τις CTX-M-1, -3, -10, -12, -15,και FEC-1 - CTX-M-2, η οποία περιλαμβάνει τις CTX-M-2, -4, -4L, -5, -6, -7, -20, και Toho-1 - CTX-M-8, η οποία αποτελείται μόνο από ένα ένζυμο κωδικοποιούμενο από πλασμίδιο

- CTX-M-9, η οποία περιλαμβάνει τις CTX-M-9, -13, -14, -16, -17, -19, -21, -27, και Toho-2 - CTX-M-25, η οποία περιλαμβάνει τις CTX-M-25 και -26 β-λακταμάσες. Η οικογένεια αυτή των β-λακταμασών υδρολύει κατά προτίμηση την κεφοταξίμη έναντι της κεφταζιδίμης και επίσης την κεφαλοθίνη ή την κεφαλοριδίνη αποτελεσματικότερα από την βενζυλο-πενικιλίνη. Η σερίνη στη θέση 237, σε όλα τα CTX-M-τύπου ένζυμα, φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην ικανότητα των ενζύμων αυτών να δρουν ως εκτεταμένου-φάσματος β-λακταμάσες. Στελέχη που να εκφράζουν CTX-M β-λακταμάσες έχουν απομονωθεί από πολλά μέρη του κόσμου, με έμφαση σε περιοχές της Δυτικής Ευρώπης, της Ιαπωνίας και της Νότιας Αμερικής (Bonnet, 2004 Bradford, 2001). OXA ESBLs: Μια ακόμα οικογένεια ESBLs αποτελούν τα ΟΧΑ ένζυμα, τα οποία προσδίδουν αντοχή έναντι της αμπικιλίνης και της κεφαλοθίνης, υδρολύουν ιδιαίτερα αποτελεσματικά την οξακιλίνη και την κλοξακιλίνη, ενώ αναστέλλονται ελάχιστα από το κλαβουλανικό οξύ. Η οικογένεια αυτή δημιουργήθηκε αρχικά από τα φαινοτυπικά παρά από τα γενοτυπικά χαρακτηριστικά των β- λακταμασών, διότι εμφάνιζαν ένα συγκεκριμένο προφίλ υδρόλυσης. Για το λόγο αυτό τα ένζυμα αυτού του τύπου εμφανίζουν μικρή γενοτυπική ομολογία μεταξύ τους. Αρκετά από τα ΟΧΑ ένζυμα που ανήκουν στις ESBLs έχουν προέλθει από το ένζυμο ΟΧΑ-10. Φέρουν μία από τις δύο αμινοξικές υποκαταστάσεις: αντικατάσταση της ασπαραγίνης από σερίνη στη θέση 73 ή της γλυκίνης από ασπαρτικό στη θέση 157. Οι αντικαταστάσεις αυτές φαίνεται να είναι απαραίτητες για να εμφανιστεί ESBL φαινότυπος. Όταν οι ΟΧΑ ESBLs κλωνοποιήθηκαν σε στελέχη E.coli παρείχαν ανεπαρκή δραστικότητα έναντι των οξυιμινο-κεφαλοσπορινών. Επιπλέον, ενώ η πλειοψηφία των ενζύμων αυτών είναι δραστική έναντι της κεφταζιδίμης, το ΟΧΑ-17 βρέθηκε να προστατεύει έναντι κεφτριαξόνης και κεφοταξίμης, με οριακή όμως δραστικότητα έναντι της κεφταζιδίμης (Bradford, 2001 Bush et al, 1995). Έχουν ανιχνευθεί και ορισμένες άλλες ESBLs όπως οι PER-1, PER-2, VEB-1, CME-1 και TLA-1 β-λακταμάσες, οι οποίες παρουσιάζουν με μεταξύ τους ομολογία 40-50%, προσδίδουν ανθεκτικότητα έναντι των οξυιμινο-κεφαλοσπορινών, και ιδιαίτερα στην κεφταζιδίμη και την αζτρεονάμη (Bradford, 2001). Μελέτες που έχουν γίνει σχετικά με την έκφραση των ESBLs στα εντεροβακτηριοειδή, σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές δείχνουν αναλογικά με την Ευρώπη, αυξημένη έκφραση στην Λατινική Αμερική και την Ασία, και μειωμένη στην Βόρια Αμερική (Εικόνα 2). Επιπλέον, το 2006 αναφορές του EARSS σημειώνουν μία συνεχή αύξηση, από το 2000, των ανθεκτικών παθογόνων στελεχών E.coli σε 3 ης γενεάς κεφαλοσπορίνες σε ποσοστό μεγαλύτερο του 10% στις μισές από τις χώρες που συμμετείχαν στην έρευνα (Coque et al, 2008).

Εικόνα 2. Συχνότητα των στελεχών της Escherichia coli που παράγουν ESBLs σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές (Coque et al, 2008) 3.3.2 AmpC β-λακταμάσες Οι AmpC β-λακταμάσες αποτελούν άλλη μία μεγάλη ομάδα β-λακταμασών, που τυπικά κωδικοποιούνται από το χρωμοσωμικό DNA πολλών Gram-αρνητικών βακτηρίων. AmpC β- λακτμάσες παράγονται και σε βακτηριακά είδη που στερούνται χρωμοσωμικών ampc γονιδίων, από γονίδια που μεταφέρονται μέσω πλασμιδίων (Jacoby, 2009). Τα ένζυμα αυτά εντοπίζονται στο περιπλασματικό χώρο των βακτηρίων, με εξαίρεση στο βακτήριο Psychrobacter immobilis, στο οποίο τα ένζυμα εκκρίνονται στην εξωκυττάρια ουσία (Jacoby, 2009 Feller eta al, 1997). Είναι δραστικές έναντι των πενικιλλινών, αλλά είναι ακόμα πιο δραστικές έναντι των κεφαλοσπορινών. Υδρολύουν αποτελεσματικά τις κεφαμυκίνες όπως την κεφοταξίνη, οξυ-ιμινοκεφαλοσπορίνες όπως τις κεφτριαξόνη, κεφταζιδίμη και κεφοταξίμη, και σε ένα μικρό ποσοστό τις μονοβακτάμες όπως την αζτρεονάμη. Η συγγένεια των ενζύμων με αυτά τα υποστρώματα φαίνεται να είναι αρκετά υψηλή, γεγονός που καθιστά το ένζυμο δραστικό ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις (Jacoby, 2009). Το ενεργό κέντρο των AmpC β-λακταμασών βρίσκεται στο κέντρο των ενζύμων και μπορεί να διαιρεθεί στο R1 τμήμα, το οποίο αλληλεπιδρά με την R1 αλυσίδα του πυρήνα της β-λακτάμης και οριοθετείται από τον Ω-βρόγχο, και το R2 το οποίο αλληλεπιδρά με την R2 πλευρική αλυσίδα και περιβάλλεται από τον R2 βρόγχο που περιλαμβάνει τις Η-10 και Η-11 έλικες (Εικόνα 3). Έχουν περιγραφεί αρκετές αμινοξικές υποκαταστάσεις, ενθέσεις ή αφαιρέσεις που διευρύνουν το φάσμα αντιβιοτικών το οποίο μπορούν να υδρολύσουν τα ένζυμα αυτά. Οι αλλαγές αυτές έχουν ανιχνευθεί σε κωδικοποιούμενα τόσο χρωμοσωμικά όσο και πλασμιδιακά AmpC ένζυμα και μεταβάλλουν είτε την δομή του Ω-βρόγχου ώστε να μπορεί να αλληλεπιδρά

με περισσότερα αντιβιοτικά, είτε του R2 βρόγχου καθιστώντας πιο προσβάσιμη την R2 θέση του ενεργού κέντρου (Jacoby, 2009). Εικόνα 3. AmpC ένζυμο στελέχους της E.coli σε σύμπλοκο με κεφταζιδίμη. Οι β- κλώνοι απεικονίζονται με χρυσό και οι α-έλικες με πράσινο χρώμα. [(PDB accession number 1IEL) (265) created with Cn3CD, version 4.1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)] Σε πολλά εντεροβακτηριακά η έκφραση των AmpC β-λακταμασών είναι χαμηλή και επάγεται ως απόκριση στην έκθεση σε β-λακτάμες. Στην E.coli ειδικότερα, έχει παρατηρηθεί ασθενής έκφραση ampc γονιδίων, η οποία δεν είναι ικανή να καθιστά τα στελέχη ανθεκτικά έναντι αμινοπενικιλλινών ή κεφαλοσπορινών (Jacoby, 2009). Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση των ampc γονιδίων δεν επάγεται από έκθεση στο αντιβιοτικό, αλλά ρυθμίζεται από έναν υποκινητή και έναν εξασθενητή ο οποίος βρίσκεται ανοδικά του ampc γονιδίου (Jaurin et al, 1981) Ωστόσο, έχει παρατηρηθεί αύξηση της έκφρασης των AmpC β-λακταμασών στα βακτήρια αυτά είτε με διπλασιασμό του υπεύθυνου γονιδίου, είτε με μεταλλάξεις στην περιοχή του υποκινητή ή του εξασθενητή, οι οποίες ενισχύουν ή αποσταθεροποιούν τη φυσιολογική λειτουργία τους αντίστοιχα. Σε μελέτες που έγιναν σε απομονωμένα από ασθενείς στέλεχη της E.coli βρέθηκαν κλώνοι ανθεκτικοί στην κεφοξιτίνη των οποίων οι υποκινητές έφεραν μεταλλάξεις που οδηγούσαν σε ανθεκτικότητα έναντι αμοξυκιλίνης-κλαβουλανικού σε συνδυασμό με β- λακτάμες, καθώς και μειωμένη ευαισθησία σε εκτεταμένου-φάσματος κεφαλοσπορίνες (Jacoby, 2009). Όπως και οι κωδικοποιούμενες από χρωμοσωμικό DNA ampc β-λακταμάσες, έτσι και αυτές που κωδικοποιούνται από πλασμίδια καθιστούν τα στελέχη ανθεκτικά σε ένα ευρύ-φάσμα β- λακταμών. Τα bla CMY γονίδια, και ειδικότερα το bla CMY-2 φαίνεται να είναι το πιο διαδέμενο σε σχέση με τα υπόλοιπα ampc πλασμιδιακά γονίδια. Επιπλέον, φαίνεται να είναι, στις περισσότερες περιπτώσεις, υπεύθυνο για αντοχή σε εκτεταμένο-φάσμα κεφαλοσπορινών σε στελέχη τόσο της E.coli όσο και της σαλμονέλας, τα οποία έχουν απομονωθεί από ζώα. Είναι σημαντικό ότι τα πλασμίδια που κωδικοποιούν CMY ένζυμα συνήθως σχετίζονται με μεταθετά

γενετικά στοιχεία γεγονός που διευκολύνει την εξάπλωσή τους στα εντεροβακτηριακά (Jacoby, 2009). 3.3.3 Μέταλλο-β-λακταμάσες (MBLs) Η κατηγορία αυτή των β-λακταμασών περιλαμβάνει ένζυμα τα οποία είναι δραστικά έναντι όλων των ομάδων των β-λακταμών, εκτός από τις μονοβακτάμες. Χαρακτηρίζονται από τη δραστικότητά τους έναντι των καρβαπενέμων. Η ιδιότητά τους αυτή μάλιστα φαίνεται να προβληματίζει ιδιαίτερα την επιστημονική κοινότητα, αφού οι καρβαπενέμες είναι τα αντιβιοτικά με το μεγαλύτερο φάσμα ενεργότητας και είναι ανθεκτικές στην υδρόλυση από την πλειοψηφία των β-λακταμασών που παράγουν τα παθογόνα βακτήρια. Επιπλέον, οι αναστολείς β-λακταμασών που χρησιμοποιούνται για θεραπευτικούς λόγους δεν φαίνεται να είναι αποτελεσματικοί έναντι των MBLs (Bebrone, 2007). Η ταξινόμηση των MBLs είναι ιδιαίτερα δύσκολη λόγω της μικρής ομολογίας που έχουν οι αλληλουχίες των ενζύμων αυτών μεταξύ τους. Ανήκουν στη B τάξη των β-λακταμασών, η οποία περιλαμβάνει τις B1, B2 και Β3 υποομάδες. Οι τάξεις Β1 και Β3 περιλαμβάνουν τις MBLs οι οποίες υδρολύουν τα περισσότερα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Τα ένζυμα που ανήκουν στην Β2 τάξη είναι αποκλειστικά καρβαπεναμάσες οι οποίες υδρολύουν μόνο τις καρβαπενέμες, και εμφανίζουν χαμηλή ή ακόμη και καθόλου δραστικότητα έναντι των πενικιλλινών (Bebrone, 2007). Παρόλο που MBLs έχουν αναφερθεί εδώ και αρκετό καιρό, η εμφάνισή τους δεν είναι διαδεδομένη. Η έκφραση τους παραμένει κατά κάποιο τρόπο περιορισμένη μόνο σε επιλεγμένα Gram-αρνητικά βακτήρια. Τα τελευταία χρόνια ωστόσο, χαρακτηρίζονται όλο και περισσότερα στελέχη, τα οποία φέρουν μεταθετά στοιχεία, κυρίως ιντεγκρόνια, που κωδικοποιούν τα ένζυμα αυτά. Το γεγονός αυτό είναι ανησυχητικό, λόγω της αυξημένης ενεργότητας των MBLs έναντι των περισσότερων β-λακταμών (Bush, 1998).

ΠΑΡΟΥΣΑ ΕΡΕΥΝΑ Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η ανίχνευση και ταυτοποίηση γονιδίων αντοχής που κωδικοποιούν την παραγωγή ενζύμων και συγκεκριμένα των β-λακταμασών, που υδρολύουν τα β-λακταμικά αντιβιοτικά, σε στελέχη της E. coli. Συγκεκριμένα, η έρευνα εφαρμόστηκε σε 12 στελέχη της E. coli τα οποία απομονώθηκαν από υγιή πτηνά (9) ή κλινικά περιστατικά ζώων (3) και εμφανίζονταν οριακά ευαίσθητα ή ανθεκτικά στη δοκιμή της ευαισθησίας στα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Μελετήθηκαν οι φαινότυποι αντοχής των στελεχών αυτών ως προς 7 δραστικές ουσίες β-λακταμικών αντιβιοτικών. Ακόμα, έγινε ανίχνευση των γονιδίων που ευθύνονταν για την εκδήλωση του αντίστοιχου φαινότυπου αντοχής και καθορισμός του τύπου των γονιδίων με ανάλυση της νουκλεοτιδική τους αλληλουχίας. Τέλος, προκειμένου να διαπιστωθεί αν τα γονίδια που κωδικοποιούσαν αντοχή στα β- λακταμικά αντιβιοτικά φέρονταν σε πλασμίδια και εάν η αντοχή μεταβιβαζόταν μέσω των πλασμιδίων, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σύζευξης των υπό μελέτη στελεχών της E. coli με κατάλληλο στέλεχος δότη.

4. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Δειγματοληπτικό υλικό Απομόνωση στελεχών της E. coli επιχειρήθηκε από κοπρανώδες υλικό υγιών πτηνών (40) και από παθολογικό υλικό που λήφθηκε από ασθενείς σκύλους (3). Για κάθε δειγματοληψία, σε αποστειρωμένο περιέκτη συλλεγόταν υλικό από το τυφλό έντερο ορνιθίων κατά τη στιγμή της σφαγής τους. Από ασθενείς σκύλους συλλεγόταν παθολογικό υλικό επιπλεκόμενων τραυμάτων ή ούρων. 4.2 Καλλιέργεια στελεχών της E. coli Για την καλλιέργεια και απομόνωση στελεχών της E.coli χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα MacConkey άγαρ, το οποίο είναι ειδικό-εκλεκτικό υπόστρωμα επειδή περιέχει λακτόζη, bile salts και crystal violet, που είναι αναστολείς της ανάπτυξης των Gram-θετικών βακτηρίων. Η σύσταση του MacConkey άγαρ (ανά λίτρο υλικού) ήταν: lactose peptone from gelatin peptone from casein peptone from meat crystal violet neutral red bile salt mixture sodium chloride agar 10.0 g 17.0 g 1.5 g 1.5 g 0.001 g 0.03 g 1.5 g 5.0 g 13.5 g Για την παρασκευή του υποστρώματος, 50 g έτοιμης σκόνης διαλύονταν σε 1lt απεσταγμένου νερού και το διάλυμα θερμαίνονταν μέχρι η σκόνη να διαλυθεί πλήρως. Ελεγχόταν το ph του διαλύματος ώστε σε θερμοκρασία 25 ο C να είναι 7.1± 0.2. Ακολουθούσε αποστείρωση του υλικού σε αυτόκαυστο στους 121 ο C για 15'. Μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του υλικού περί τους 60 ο C γινόταν διανομή του σε τριβλία πετρί. Αφότου είχε επιτεύχθη η πήξη του υποστρώματος μέσα στα τριβλία πετρί, επιχειρούταν ο ενοφθαλμισμός των δειγμάτων. Ο ενοφθαλμισμός ποσότητας δείγματος γινόταν με τη βοήθεια αποστειρωμένου μικροβιολογικού κρίκου. Τα τριβλία μετά την ολοκλήρωση του ενοφθαλμισμού μεταφέρονταν για επώαση σε κλίβανο στους 37 ο C για 24 ώρες.

4.3 Ταυτοποίηση στελεχών της E. coli Όλες οι ύποπτες για ανάπτυξη E. coli (θετικές στη λακτόζη) αποικίες, ταυτοποιούνταν με τις βιοχημικές δοκιμές: indole, methyl red, Voges-Proskauer και citrate (IMViC test). 4.4 Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά των στελεχών Ο έλεγχος της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά γινόταν με τη μέθοδο Kirby-Bauer σε υπόστρωμα Mueller-Hinton άγαρ. Το Mueller-Hinton άγαρ είχε την παρακάτω σύσταση (ανά λίτρο υλικού): beef extract acid hydrolysate of casein starch agar 2.0 g 17.5 g 1.5 g 17.0 g 34 g έτοιμης σκόνης διαλύονταν σε 1lt νερού με θέρμανση και συνεχή ανάδευση έως την πλήρη διάλυση της σκόνης. Το ph ρυθμιζόταν 7.1±0.2 στους 25 ο C. Ακολουθούσε αποστείρωση του υλικού σε αυτόκαυστο στους 121 ο C για 15'. Ακολουθούσε διανομή του υλικού σε τριβλία πετρί, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Από καθαρή καλλιέργεια των στελεχών της E. coli σε MacConkey άγαρ, λαμβάνονταν 1-2 αποικίες οι οποίες εναιωρούνταν σε 2ml φυσιολογικού ορού. Για την καλύτερη ανάμειξη γινόταν στα εναιωρήματα Vortex και στην συνέχεια αφήνονταν να επωαστούν για μερικές ώρες στους 35 ο C. Ακολούθησε εκτίμηση του πληθυσμού των βακτηρίων με σύγκριση της θολερότητας του κάθε ζωμού με θολερότητα 0.5 της κλίμακας McFarland. Η ρύθμιση της θολερότητας γινόταν είτε με προσθήκη φυσιολογικού ορού είτε νέου εναιωρήματος από το ίδιο στέλεχος της E. coli. Το εναιώρημα θολερότητας 0,5 ενοφθαλμιζόταν σε τρυβλίο που περιείχε Mueller-Hinton άγαρ. Η επίστρωση των τριβλίων γινόταν με βαμβακοφόρο στυλεό ο οποίος βυθιζόταν στα εναιωρήματα. Η διαδικασία της επίστρωσης περιλάμβανε την επίστρωση ολόκληρης της επιφάνειας του τριβλίου και στη συνέχεια επανάληψη της διαδικασίας άλλες 2 φορές μετά από περιστροφή του τριβλίου ώστε να επιτευχθεί ισοκατανομή του εναιωρήματος. Ακολουθούσε τοποθέτηση των δισκίων των αντιβιοτικών με αποστειρωμένη λαβίδα. Σε κάθε τρυβλίο τοποθετούνταν 8 δισκία έτσι ώστε να μην απέχουν λιγότερο από 24 mm. Ακολουθούσε επώαση στους 37 ο C. 24 ώρες μετά μετρούνταν με ακρίβεια οι διάμετροι των ζωνών αναστολής ανάπτυξης γύρω από κάθε δισκίο. Όλα τα στελέχη της E. coli ως προς την αντοχή τους στο ναλιδιξικό οξύ, στη σιπροφλοξακίνη, στα β-λακταμικά αντιμικροβιακά: αμπικιλλίνη, αμοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ, κεφοξιτίνη και κεφταζιδίμη, στη δοξυκυκλίνη, στην αμικασίνη, στη γενταμικίνη και στη σουλφαμεθοξαζόλητριμεθοπρίμη, σύμφωνα με τις οδηγίες του Clinical and Laboratory Standards Institute (EUCAST, 2012).

4.5 Έλεγχος του φαινοτύπου παραγωγής β-λακταμασών Ο έλεγχος του φαινοτύπου παραγωγής των β-λακταμασών (ESBLs, AmpCs ή MBLs) έγινε με την εφαρμογή των δοκιμών συνέργειας του διπλού δίσκου (DDST) και του βορονικού οξέος (BA), σύμφωνα με τις οδηγίες του Clinical and Laboratory Standards Institute (Harada et al, 2008 CLSI, 2008). 4.5.1 Double Disk Synergy Test (DDST) Εναιώρημα θολερότητας 0,5 του υπό εξέταση στελέχους επιστρωνόταν σε τρυβλίο που περιείχε Mueller-Hinton άγαρ σε όλη την επιφάνεια, όπως παραπάνω περιγράφηκε. Η τοποθέτηση των δισκίων αντιβιοτικών γινόταν με αποστειρωμένη λαβίδα. Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 1. αμοξυκυλίνη-κλαβουλανικό οξύ (ΑΜC) 2. κεφοξιτίνη (FOX) 2 ης γενεάς κεφαλοσπορίνη 3. κεφτριαξόνη (CRO) 3 ης γενεάς κεφαλοσπορίνη 4. κεφταζιδίμη (CAZ) 3 ης γενεάς κεφαλοσπορίνη 5. κεφοταξίμη (CTX) 3 ης γενεάς κεφαλοσπορίνη 6. κεφεπίμη (FEP) 4 ης γενεάς κεφαλοσπορίνη 7. αζτρεονάμη (ATM) Το δισκίο της αμοξυκυλίνης-κλαβουλανικού οξέος τοποθετούνταν στο κέντρο του κάθε τριβλίου και περιμετρικά αυτού τα υπόλοιπα δισκία όπως ορίζουν οι οδηγίες του CLSI. Τα τριβλία επωάζονταν στη συνέχεια στον κλίβανο στους 37 ο C. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων γινόταν επίσης σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI. 4.5.1 Δοκιμή του βορονικόυ οξέος (ΒΑ) Εναιώρημα θολερότητας 0,5 του υπό εξέταση στελέχους επιστρωνόταν σε τρυβλίο που περιείχε Mueller-Hinton άγαρ σε όλη την επιφάνεια, όπως παραπάνω περιγράφηκε. Δυο δισκία κεφοξιτίνης τοποθετούνταν αντιδιαμετρικά στη μέση του τρυβλίου. Στο ένα εξ αυτών ερρίπτετο βορονικό οξύ. Ακολουθούσε επώαση στους 37 ο C. 4.6 Εκχύλιση του DNA των στελεχών Για την εκχύλιση του DNA παρασκευάσθηκε και χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα LB Broth με την εξής διαδικασία: Αρχικά σε 800μl απεσταγμένου νερού διαλύθηκαν με χρήση θερμότητας 10g NaCl, 10g tryptone και 10g yeast extract. Προστέθηκε η απαραίτητη ποσότητα απεσταγμένου νερού, ώστε ο τελικός όγκος του διαλύματος να ανέρχεται στο 1L. Το διάλυμα αποστειρώθηκε στον αυτόκαυστο στους 121 ο C για 20.