Έλεγχος ποιότητας και σταθερότητας βελτιωμένων σκευασμάτων, με σύμπλοκα αντιμικροβιακών παραγόντων και συνθετικά τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών Μελέτες δομής και ιδιοτήτων των συμπλόκων Η προσκόλληση των παθογόνων οργανισμών στους ιστούς υποδοχής του ξενιστή είναι προαπαιτούμενο, για την έναρξη μιας μολυσματικής ασθένειας. Σε πολλά συστήματα η πρόσδεση διευκολύνεται από τις λεκτίνες, που βρίσκονται στην επιφάνεια των βακτηρίων μέσω ενός μηχανισμού μοριακής αναγνώρισης με τα σάκχαρα της επιφάνειας των κυττάρων των ιστών υποδοχής. Η παρουσία σακχάρων που αναγνωρίζονται από τις μικροβιακές λεκτίνες, μπορεί να περιορίσει την επαφή των παθογόνων στελεχών με τους ιστούς του ξενιστή και να εμποδίσει την προσκόλληση των βακτηρίων σε αυτούς. Στο παρόν έργο χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες (CDς), οι οποίες φέρουν ομοιοπολικά συνδεδεμένα σάκχαρα (υδατανθρακικά συμπλέγματα, glycoclusters) και στις οποίες με μοριακό εγκλεισμό εγκλωβίστηκαν αντιμικροβιακοί παράγοντες. Οι ουσίες αυτές είναι επτα- και οκτα- υποκατεστημένα παράγωγα της β- και γ-κυκλοδεξτρίνης, συνδεδεμένα μέσω μικρών γεφυρών με τα σάκχαρα D-(+)-μαννόζη (Man), D-(+)- γαλακτόζη (Gal), D-(+)-γλυκόζη (Glu), L-(-)-φουκόζη (Fuc), N-ακετυλο-Dγλυκοζαμίνη (NAcGlu) και Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη (NΑcGal). Το σκεπτικό της παρούσας εργασίας αφορά σε μια αντιμικροβιακή στρατηγική, η οποία θα στηρίζεται στην γονιδιακή απαίτηση της στερεοειδικότητας των βακτηριακών προσκολλητινών των λοιμογόνων στελεχών, τα οποία με τις λεκτίνες που διαθέτουν θα αναγνωρίζουν τα συγκεκριμένα σάκχαρα, ώστε να επιτευχθεί βελτιστοποίηση της αναγνώρισης και, κυρίως, στόχευση του αντιμικροβιακού παράγοντα στο παθογόνο βακτήριο. Οι νέες κυκλοδεξτρίνες παρασκευάστηκαν από τις συναδέλφους του συνεργαζόμενου φορέα (Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. Δημόκριτος): Γιαννακοπούλου Κωνσταντίνα, Μαυρίδου Ειρήνη (Ερευνήτριες Α) και Δρ. Λαμπροπούλου Μαρία. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές CDς: α) φυσικές CDς, β) διαθέσιμα στο εμπόριο συνθετικά παράγωγα των φυσικών CDς και γ) συνθετικά τροποποιημένες CDς, οι οποίες φέρουν τα επιλεγμένα σάκχαρα, που θα αναγνωρίζουν και θα προσεγγίζουν επιλεκτικά τα παθογόνα βακτήρια. Στη κοιλότητά των παραπάνω CDς βρίσκονται εγκλωβισμένοι και προστατευμένοι οι αντιμικροβιακοί παράγοντες, οι οποίοι θα μεταφέρονται και θα απελευθερώνονται
στο σημείο στόχο, όπου και θα εκδηλώνουν τη δράση τους. Η κατηγορία των αντιμικροβιακών που μελετήθηκε είναι οι κινολόνες: οξολινικό οξύ (ΟΧΑ) και κυπροφλοξακίνη (CIP), εκπρόσωποι πρώτης και δεύτερης γενιάς αντίστοιχα. Στη παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε παρασκευή των συμπλόκων των επιλεγμένων αντιμικροβιακών με διάφορες CDς. Στη συνέχεια ακολούθησε ο χαρακτηρισμός των παραπάνω συμπλόκων. Για τον έλεγχο σταθερότητας, αναπτύχθηκαν μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισμού του ΟΧΑ και της CIP, παρουσία των προϊόντων φωτοαποικοδόμησής τους, εκδόχων ή και προσμίξεων. Ελέγχεται εάν ο εγκλεισμός των δραστικών ενώσεων στις CDς επηρεάζει τη σταθερότητα και την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων που εγκλείονται. Παρασκευάστηκαν στείρα υδατικά διαλύματα των επιλεγμένων κινολονών και των συμπλόκων τους με τις διάφορες CDς που μελετήθηκαν και πραγματοποιήθηκε μικροβιολογικός έλεγχος σε αυτά (εύρεση MIC). Αφού αποδείχτηκε μεταβολή δραστικότητας στα διαλύματα που περιείχαν σύμπλοκα με τις διάφορες CDς, αναπτύχθηκαν ειδικές μέθοδοι για τον ποσοτικό προσδιορισμό και των CDς, όπως ορίζουν οι Διεθνείς Κανονιστικές Διατάξεις. Αρχικά παρασκευάστηκε το σύμπλοκο OXA με την υδροξυπροπυλο-β-cd (ΗΡβCD). Ο απαιτούμενος χρόνος σχηματισμού και η σταθερά σύνδεσης του συμπλόκου προσδιορίστηκαν με Φασματοσκοπία Υπεριώδους (UV). Ο εγκλεισμός επιβεβαιώθηκε με φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) δύο διαστάσεων ROESY. Η στοιχειομετρία του συμπλόκου βρέθηκε 1:1, ακολουθώντας τη μέθοδο των συνεχών μεταβολών (κατά Job), και σχεδιάστηκε η πιθανή δομή του δημιουργούμενου συμπλόκου. Ακολούθησε η παρασκευή των συμπλόκων της CIP με τη βcd και της CIP με τη μαλτοζυλο-β-cd (ΜalβCD). Επιλέχτηκε η ΜalβCD ως μια CD που φέρει ομοιοπολικά συνδεδεμένα σάκχαρα και είναι διαθέσιμη στο εμπόριο, η οποία και χρησιμοποιήθηκε στα περισσότερα προκαταρκτικά πειράματα, καθώς τα παρασκευαζόμενα συνθετικά παράγωγα των CD λαμβάνονταν μετά από χρονοβόρο διαδικασία και σε πολύ μικρές ποσότητες. Ο σχηματισμός των ανωτέρω συμπλόκων επιβεβαιώθηκε με φασματοσκοπία 1 Η NMR δύο διαστάσεων ROESY και με Φασματοσκοπία Μάζας (MS). Σε διάλυμα CIP:βCD 1:1 λαμβάνεται θραύσμα: m/z 1467,5, το οποίο αντιστοιχεί στο σύμπλοκο. Η στοιχειομετρία του συμπλόκου CIP:ΜalβCD βρέθηκε 1:1 με φασματοσκοπία NMR, ακολουθώντας τη μέθοδο των συνεχών
μεταβολών. Η προσθήκη DMSO-d 6 στα διαλύματα των πειραμάτων εξάλειψε τη μεταβολή της χημικής μετατόπισης που οφείλεται στα μοριακά διμερή του φαρμάκου. Ελήφθησαν τα φάσματα 1 Η-ΝΜR της CIP, της οκτακις{6-δεοξυ-6-θειο- [6-(2-ακεταμιδο-2-δεοξυ-α-D-γλυκοπυρανοζο-1 -υλο)-4-αζα-3-οξοεξανο-1-υλο]-6- θειο}-γ-κυκλοδεξτρίνη (gpsp+nacgluohnh 2 ) και διαλύματος του 1:1 συμπλόκου τους σε D 2 O. Αντίστοιχη μελέτη έγινε με την επτακις{6-δεοξυ-6-θειο-[6-(α,β-dγαλακτοπυρανοζο-1 -υλο)-4-αζα-3-οξοεξανο-1-υλο]-6-θειο}-β-κυκλοδεξτρίνη (bpsp+galohnh 2 ). Οι μετατοπίσεις των κορυφών που παρατηρήθηκαν στα φάσματα αποδόθηκαν στη μεταξύ τους αλληλεπίδραση και στη δημιουργία συμπλόκου. Παρασκευάστηκαν τα σύμπλοκα της CIP με όλες τις συνθετικές CDς επτακις-[6-(καρβοξυαιθυλοθειο)-6-δεοξυ]-β-κυκλοδεξτρίνη (bpsp), οκτακις-[6- (καρβοξυαιθυλοθειο)-6-δεοξυ]-γ-κυκλοδεξτρίνη (gpsp), bpsp+manohnh 2, gpsp+manohnh 2, bpsp+galohnh 2, gpsp+νacgluohnh 2, bpsp+nacgalohnh 2, bpsp+nacgluohnh 2, bpsp+fucohnh 2 και μελετήθηκε η φωτοσταθερότητα του δραστικού συστατικού που βρίσκεται εγκλωβισμένο στη κοιλότητα των ανωτέρω CDς. Πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθόδων HPLC, ειδικών για τον ποσοτικό προσδιορισμό των υπό μελέτη αντιμικροβιακών παραγόντων και τον έλεγχο φωτοσταθερότητάς τους. Με τη βοήθεια των συγκεκριμένων ειδικών μεθόδων διαχωρίζεται το εκάστοτε δραστικό συστατικό από τα προϊόντα διάσπασης και τα προϊόντα διάσπασης μεταξύ τους, παρουσία των CD ως εκδόχων. Οι μέθοδοι αξιολογήθηκαν και επικυρώθηκαν σύμφωνα με όσα ορίζουν οι Διεθνείς Κανονιστικές Διατάξεις (International Conference on Harmonization, ICH), για τον έλεγχο ποιότητας και σταθερότητας. Η διαδικασία αξιολόγησης της αναλυτικής μεθόδου εφαρμόστηκε και στα διαλύματα που περιείχαν τις χρησιμοποιούμενες CDς και τα σύμπλοκα των δραστικών συστατικών με αυτές, διαδικασία απαραίτητη, προκειμένου μία αναλυτική μέθοδος να θεωρηθεί κατάλληλη παρουσία CD ως έκδοχο και ως σύμπλοκο. Μετά τον έλεγχο περιεκτικότητας των δραστικών συστατικών στα δείγματα των συμπλόκων και μετά τη διαπίστωση αποκλίσεων (ελάττωση), οι οποίες οφείλονταν σε φωτοεπαγόμενες αντιδράσεις αποικοδόμησης έγινε εκτενής μελέτη φωτοσταθερότητας των δραστικών συστατικών σε ελεύθερη μορφή και στα
αντίστοιχα σύμπλοκα με τις διαφορετικές CDς. Κατά τη μελέτη φωτοσταθερότητας χρησιμοποιήθηκε ακτινοβολία τόξου αερίου Ξένου, σύμφωνα με τις οδηγίες ICH. Μελετήθηκαν οι παράγοντες, οι οποίοι επηρεάζουν το ρυθμό φωτοαποικοδόμησης, όπως η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης και της συμπλοκοποίησης στην φωτοσταθερότητα του OXA. Βρέθηκε ότι η φωτοαποικοδόμηση του ΟΧΑ είναι ταχύτερη στις υψηλές συγκεντρώσεις και ακολουθεί μηδενοταξική κινητική στο αρχικό τμήμα. Αποδείχτηκε ότι ο εγκλεισμός στην CD δεν επηρεάζει αρνητικά τη σταθερότητα του OXA, αντίθετα οδηγεί σε βελτίωση της φωτοσταθερότητάς του. Η διαλυτότητα του ΟΧΑ βελτιώνεται επίσης σημαντικά, όπως αυτό αποδείχτηκε από τη μέθοδο διαλυτότητας φάσεων. Οι παράγοντες, οι οποίοι είναι πιθανό να μεταβάλλουν τη ταχύτητα φωτοαποικοδόμησης της CIP και μελετήθηκε η επίδρασή τους είναι: η αρχική συγκέντρωση και το ph των δειγμάτων, η δημιουργία συμπλόκων με CDς. Βρέθηκε ότι η φωτοαποικοδόμηση της CIP ακολουθεί πρωτοταξική κινητική και βελτιώνεται η σταθερότητα της σε υψηλότερες συγκεντρώσεις και μικρότερες τιμές ph. Ο σχηματισμός συμπλόκων με CDς και ειδικότερα με τις CDς που φέρουν σάκχαρα, δεν επηρεάζει αρνητικά τη σταθερότητα, αντίθετα οδηγεί σε σταθεροποίηση του φαρμάκου. Όπως φαίνεται από εργασίες που εκπονήθηκαν παράλληλα στο συνεργαζόμενο φορέα αποδεικνύεται αλληλεπίδραση των νέων CDς με ζώντα βακτήρια και προσκόλληση σε αυτά, αλλά και από τα μικροβιολογικά πειράματα που έγιναν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας φαίνεται ότι η σύμπλεξη με τις νέες CDς συνεπάγεται σε αρκετές περιπτώσεις μεταβολή δραστικότητας. Επομένως, σύμφωνα με τις διατάξεις ICH θα πρέπει να υπάρχει μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού εκτός του δραστικού συστατικού και των CDς. Αρχικά αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε κατάλληλη μέθοδος για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό CIP και ΜalβCD, με φασματοσκοπία NMR. Η μέθοδος βασίστηκε στην ολοκλήρωση των κορυφών επιλεγμένων πρωτονίων σε συνάρτηση με την απόκριση ενός εσωτερικού προτύπου. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθόδου υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με εξατμιστικό ανιχνευτή σκέδασης φωτός (Evaporative Light Scattering Detector) για την ταυτόχρονη αναλυτική διαδικασία CIP και ΜalβCD, η οποία επιτυγχάνεται με τον προσδιορισμό της ποσότητας του ελεύθερου φαρμάκου και του συνόλου της κυκλοδεξτρίνης.
Η μέθοδος αξιολογήθηκε και χρησιμοποιήθηκε ακολούθως στον υπολογισμό της σταθεράς σύνδεσης του συμπλόκου με ανάλυση κατά Scatchard. Συγκριτικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η χρωματογραφική μέθοδος με ανιχνευτή ELS πλεονεκτεί έναντι της φασματοσκοπικής με NMR (σε όργανα ισχύος 400 και 600 ΜHz που χρησιμοποιήθηκαν) σε ότι αφορά στην γραμμικότητα και την επαναληψιμότητα της μεθόδου και δίνει χαμηλότερο όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης. Οι μικροβιολογικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν στο Νομαρχιακό Νοσοκομείο Πατησίων. Παρασκευάστηκαν στείρα υδατικά διαλύματα 1:1 ή 1:3 των δραστικών ενώσεων και των συμπλόκων τους με τις διαφορετικές CDς. Μελετήθηκαν με σκοπό τον συγκριτικό έλεγχο της μικροβιολογικής δραστικότητας αυτών και τον προσδιορισμό της χαμηλότερης συγκέντρωσης αναστολής (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) σε κάθε διάλυμα, έναντι ανθεκτικών και ευαίσθητων στελεχών κυρίως του κολοβακτηριδίου (E.Coli), αλλά και άλλων παθογόνων μικροβίων. Η απώλεια δραστικού συστατικού που διαπιστώθηκε στα προκαταρκτικά πειράματα κατά τον έλεγχο περιεκτικότητας, αποδόθηκε σε φωτοαποικοδομήσεις και σε κατακράτηση στους ηθμούς. Δεν καταγράφονται απώλειες δραστικού συστατικού (HPLC-UV) και των κυκλοδεξτρινών (HPLC-ELSD) στα δείγματα, εφόσον: όλες οι διαδικασίες ολοκληρώνονται σε προφυλαγμένους από το φως χώρους, το υδατικό περιβάλλον διατηρείται ουδέτερο, οι ηθμοί είναι από κατάλληλα υλικά που δεν προσροφούν τις υπό μελέτη ενώσεις και εφόσον τα δείγματα φυλάσσονται στους -30 C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Ακολούθησε μικροβιολογικός έλεγχος και η εύρεση των αντίστοιχων τιμών MIC σε διαφορετικά στελέχη των μικροβίων, τα οποία απομονώθηκαν από το ουροποιητικό σύστημα ασθενών. Αρχικά έγιναν δοκιμές της CIP και των συμπλόκων της με βcd, ΗΡβCD, μεθυλο-β-cd (MeβCD), bpsp, gpsp, bpen και ΜalβCD σε πέντε διαφορετικά ανθεκτικά στελέχη Escherichia coli. Παρατηρούνται θετικά αποτελέσματα (υποδιπλασιασμός της δραστικής συγκέντρωσης MIC): σε ποσοστό 40% των στελεχών που μελετήθηκαν παρουσία συμπλόκου CIP:MeβCD και 20% όταν η CIP βρίσκεται υπό τη μορφή συμπλόκου με τη bpsp ή τη ΜalβCD. Τα ίδια στελέχη εμφανίζουν κάθε φορά μεγαλύτερη ευαισθησία στα σύμπλοκα της CIP με
διαφορετικές συνθετικά τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες, που φέρουν ομοιοπολικά συνδεδεμένα σάκχαρα. Τέλος έγιναν δοκιμές σε τριάντα τέσσερα επιπλέον στελέχη. Τα αποτελέσματα ήταν και πάλι ενθαρρυντικά.