Έλεγχος ποιότητας φαρμακευτικών αναλύσεων

Transcript

1 Έλεγχος ποιότητας φαρμακευτικών αναλύσεων Ιωάννης Τσαγκατάκης, Ph.D. Κατερίνα Κανάκη, Ph.D. ΙΕΚ Ιεράπετρας, Βοηθός Φαρμακείου Το α και το ω μιας φαρμακευτικής ανάλυσης περιλαμβάνει μια ξεκάθαρη στρατηγική που βασίζεται σε επιστημονικά δεδομένα με στόχο την εύρεση, την ποσοτικοποίηση και την εξαγωγή συμπερασμάτων του ρόλου των σχετικών ουσιών, τις δραστικές ουσίες στην υγεία του ανθρώπου. Σε αυτές τις εφαρμογές θα αναφερθούμε εν συντομία στα απαραίτητα εκείνα σημεία που πρέπει να διέπουν αυτού του είδους των αναλύσεων. Η χημική αναλυτική πορεία Για την επιτυχία της αναλυτικής πορείας πρέπει να ακολουθηθεί μια συγκεκριμένη στρατηγική που ονομάζεται πρωτόκολλο της ανάλυσης που προκύπτει από τα ερευνητικά εργαστήρια. Διατύπωση της ερώτησης: θέλω να αναλύσω ένα αναλγητικό δισκίο για να βρω τη συγκέντρωση της παρακεταμόλης. Επιλογή της αναλυτικής διαδικασίας: τη φαρμακευτική ανάλυση απασχολεί κυρίως η συγκέντρωση των δραστικών ουσιών. Για καθεμία από αυτές μπορεί να υπάρχουν περισσότερες από μια επίσημες μέθοδοι που ανάλογα με τις ανάγκες επιλέγεται η πιο κατάλληλη. Αυτή μπορεί να έχει σχέση με το κόστος, την οργανολογία, το χρόνο, την ελάχιστη ποσότητα ανάλυσης (όριο ανίχνευσης) κ.α. Δειγματοληψία: Αυτή αποτελεί ένα πολύ σημαντικό μέρος της διαδικασίας μιας και πρέπει να επιλεγεί αντιπροσωπευτικό δείγμα. Έτσι η ποσότητα που θα ληφθεί πρώτον θα πρέπει να είναι επαρκής και δεύτερον να είναι ξεκάθαρη η ποσότητα που πρέπει να ελεγχθεί δηλαδή από ένα κουτί, από διαφορετικά κουτιά ή και από ολόκληρη παρτίδα. Προετοιμασία του δείγματος: Τις περισσότερες φορές η δραστική ουσία δεν είναι δυνατόν να βρεθεί αυτούσια αλλά μαζί με άλλες ουσίες όπως είναι τα έκδοχα οπότε για να πραγματοποιηθεί ανάλυση θα πρέπει πρώτα να απομονωθεί. Χρησιμοποιώντας και πάλι το παράδειγμα του προανεφερθέντος αναλγητικού αυτό θα πρέπει πρώτα να κονιοποιηθεί και στη συνέχεια να γίνει εκχύλιση. Ανάλυση: Αυτό το στάδιο είναι ίσως το πιο σημαντικό χωρίς να υποτιμάμε τη σημασία των άλλων και αυτό γιατί εδώ λαμβάνονται υπόψη πολλοί παράγοντες για την επιτυχία της.

2 Έτσι είναι η στιγμή που λαμβάνουμε τα αποτελέσματα τα οποία στη συνέχεια θα επεξεργαστούν κατάλληλα με τα σχετικά υπολογιστικά εργαλεία. Προηγούμενα όμως θα πρέπει να έχει αποφασισθεί ο αριθμός των μετρήσεων, να έχει επιλεγεί ο εκπαιδευμένος αναλυτής, να έχει ληφθεί πρόνοια της εκμηδένισης των λαθών, να έχει προηγηθεί η βαθμονόμηση/διακρίβωση του οργάνου κ.ά. Παρουσίαση των αποτελεσμάτων. Αφού έχει γίνει η κατάλληλη μορφή των αποτελεσμάτων με τα αναγκαία στατιστικά φέρονται στους αρμόδιους αποδέκτες που μπορεί να είναι ο καθηγητής του εργαστηρίου, ο προϊστάμενος της υπηρεσίας ίσως και αυτός ο επενδυτής (π.χ κάποια φαρμακοβιομηχανία). Εξαγωγή συμπερασμάτων: τέλος συντάσσεται σχετική έκθεση που πιθανόν να αναφέρει στοιχεία για τη δράση του φαρμάκου. Ερωτήματα που απαντά η φαρμακευτική ανάλυση 1. Ποια είναι η ταυτότητα του φαρμάκου 1 και ποια η περιεκτικότητά του στο σκεύασμα; 2. Ποια και πως πολεμάει την ασθένεια; 3. Τι προσμίξεις (ξένες ουσίες σε μικρές ποσότητες) μπορεί να περιέχονται στο φάρμακο που επηρεάζουν τα αναλυτικά αποτελέσματα δίνοντας παρόμοιο σήμα με τη δραστική ουσία ή την παρεμποδίζουν στη δράση της; 4. Ποια είναι η σταθερότητα του φαρμάκου και κατά συνέπεια ο χρόνος ζωής του; 5. Με ποιο ρυθμό απελευθερώνεται το φάρμακο από το σκεύασμα ώστε να απορροφάται από τον οργανισμό και να δρα; 6. Εκπληρώνει το φάρμακο τις προδιαγραφές της δράσης του σε συνδυασμό με τη δράση ολόκληρου του σκευάσματος δηλαδή με τη συμμετοχή και των εκδόχων; 7. Ποια μπορεί να είναι η συγκέντρωση του φαρμάκου σε ένα βιολογικό δείγμα, ιστό ή αίμα; 8. Ποιες είναι οι φυσικοχημικές ιδιότητες έχει το φάρμακο, όπως pka, διαλυτότητα, συντελεστής κατανομής (εκχύλιση); Τα παραπάνω θεσπίζονται από τη «διεθνή διάσκεψη για την εναρμόνιση των τεχνικών απαιτήσεων και την έγκριση φαρμάκων για ανθρώπινη χρήση» ή πιο συνοπτικά την ICH ( που ιδρύθηκε το 1990 και συγκέντρωσε αντιπροσώπους των διεθνών 1 Όταν λέμε φάρμακο εννοούμε «δραστική ουσία» και για το προϊόν που περιέχει τη δραστική ουσία εννοούμε το «σκεύασμα».

3 νομοθετικών αρχών καθώς και τους συνδέσμους βιομηχάνων για τις διαδικασίες προτυποποίησης των φαρμακευτικών αναλύσεων. Έλεγχος σφαλμάτων στη φαρμακευτική ανάλυση Σε οποιαδήποτε χημική ποσοτική ανάλυση υπεισέρχονται διάφοροι παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την ορθότητά της και σε πολλές περιπτώσεις είναι δύσκολο να ελεγχθούν. Έτσι λέμε ότι αντιμετωπίζουμε πειραματικά σφάλματα που πολλές φορές μπορεί να είναι καθοριστικής σημασίας για την αποδοχή ή την απόρριψη ενός προϊόντος. Για την αντιμετώπισή τους λαμβάνεται πρόνοια εκμηδένισης ή ελάττωσης σε αποδεκτά επίπεδα με διάφορους τρόπους που θα δούμε στη συνέχεια. Τα είδη των σφαλμάτων είναι τρία: τα χονδρικά, τα συστηματικά και τα τυχαία. Τα πρώτα οφείλονται συνήθως σε αστοχίες ή αδυναμία από την πλευρά του αναλυτή που συνήθως γίνονται αντιληπτές, τα αποτελέσματα απορρίπτονται και η διαδικασία διορθώνεται και επαναλαμβάνεται. Τα άλλα δύο μπορούν να αντιμετωπιστούν με τη χρήση κατάλληλων στατιστικών εργαλείων και μπορούν να γίνουν αντιληπτά με μικρότερη ή μεγαλύτερη δυσκολία. Για την κατανόηση τους θα χρησιμοποιηθεί το ακόλουθο παράδειγμα. Τέσσερις φοιτητές αναλαμβάνουν την ανάλυση με φασματοφωτομετρία εκχυλισμάτων μιας παρτίδας δισκίων παρακεταμόλης 500mg ποσό που αντιστοιχεί στο 100% της πραγματικής περιεκτικότητας και βρήκαν τα ακόλουθα ποσοστιαία αποτελέσματα που φαίνονται στο παρακάτω σχήμα (βρείτε τους μέσους όρους, Μ.Ο.): Μ.Ο. Φοιτητής 1 99,5 99,9 100,2 100,5 99,4 Φοιτητής 2 95,6 96,1 95,2 95,1 96,1 Φοιτητής 3 93,5 98,3 92,5 102,5 97,6 Φοιτητής 4 94,4 100,2 104,5 97,4 102,1 Ο φοιτητής 1 κατάφερε να πάρει και τις πέντε μετρήσεις πολύ κοντά στην πραγματική τιμή που σημαίνει άριστη ακρίβεια και παράλληλα σε μια στενή περιοχή (διασπορά) που σημαίνει, με τη σειρά του, άριστη επαναληψιμότητα (θα δούμε παρακάτω τους 2 όρους). Τα λάθη στις μετρήσεις του ήταν αμελητέα και έχουν να κάνουν μόνο με το στατιστικό σφάλμα που θα δούμε παρακάτω. Ο φοιτητής 2 έκανε πέντε μετρήσεις επίσης σε στενή περιοχή δηλαδή άριστη επαναληψιμότητα αλλά μακριά από την ορθή απάντηση οπότε έχουμε ένα σοβαρό σφάλμα

4 που είναι το συστηματικό ή καθορισμένο. Αυτά μπορεί να προκύψουν από τρεις παράγοντες: Τα σφάλματα της μεθόδου όπως η ατελής ολοκλήρωση χημικής αντιδράσεως, η απώλεια ιζήματος, η μη αντιστρεπτή προσρόφηση της προς ανάλυση ουσίας σε χρωματογραφική στήλη κ.ά. Τα σφάλματα των οργάνων και σκευών κυρίως από κακή βαθμονόμησή τους (πεχάμετρο, ζυγός, φασματοφωτόμετο κ.ά). Τα σφάλματα του αναλυτή όπως η προκατάληψη προς την κατεύθυνση μίας μέτρησης, κακή εκτέλεση του πειράματος (ζύγιση ζεστού χωνευτηρίου, μη προφύλαξη υγροσκοπικών αντιδραστηρίων κ.ά). Για τη διόρθωσή τους μπορεί να γίνει θεωρητικός προσδιορισμός του σφάλματος, βαθμονόμηση, μέτρηση τυφλού (που δεν περιέχει την προς ανάλυση ουσία), καμπύλη βαθμονόμησης κ.ά. Ο φοιτητής 3 έλαβε αποτελέσματα πρώτον σε μια ευρεία διασπορά (κακή επαναληψιμότητα) και δεύτερον μακριά από την πραγματική τιμή (κακή ακρίβεια). Εδώ είμαστε στην περίπτωση ταυτόχρονα μπροστά σε συστηματικά και τυχαία σφάλματα. Αυτά τα δύο γίνονται εύκολα αντιληπτά και θα πρέπει να αναπροσαρμοστεί η τεχνική, η μέθοδος και η χρήση της οργανολογίας. Τα τυχαία σφάλματα συνοδεύουν κάθε ανάλυση και προέρχονται από μη μόνιμες αιτίες όπως ο θόρυβος (διακυμάνσεις) στην καταγραφή του σήματος από το όργανο, ατέλειες στην ανάγνωση του μέτρησης του αισθητήριου οργάνου (ανιχνευτής). Αυτά τα σφάλματα είναι δικατευθυνόμενα δηλαδή εκατέρωθεν της πραγματικής τιμής και πιθανόν να μη συνεισφέρουν σε συνολικό σφάλμα στο τελικό αποτέλεσμα. Ο φοιτητής 4 έλαβε ένα μέσο όρο κοντά στην πραγματική τιμή που μάλλον είναι τυχαίο γεγονός αφού η διασπορά των μετρήσεων δεν επιτρέπει την αποδοχή του αποτελέσματος κάτι που γίνεται εύκολα κατανοητό από τη στατιστική ανάλυση. Έτσι ενώ είχε καλή ακρίβεια, η επαναληψιμότητα ήταν κακή.

5 Σε σύγκριση των μετρήσεων των φοιτητών 1 και 2 τίθεται ένα ερώτημα ότι στις περισσότερες περιπτώσεις η πραγματική τιμή ενός δείγματος είναι άγνωστη αλλά σε πολλές φορές αναμενόμενη και θα πρέπει να είμαστε πολύ προσεκτικοί στην εξαγωγή συμπερασμάτων. Η πιστότητα Είπαμε προηγούμενα ότι σε όλες τις αναλύσεις υπεισέρχεται πειραματικό σφάλμα, που καλούμαστε όμως να αναγνωρίσουμε και να διορθώσουμε. Αυτό το σφάλμα εκφράζεται με ένα μέγεθος που ονομάζεται τυπική απόκλιση s και δίνεται από ένα τύπο που ξεφεύγει από την ανάγκη να τον μάθουμε αφού βρίσκεται πολύ εύκολα από το excel χρησιμοποιώντας την εξίσωση stdev. Το αποτέλεσμα δίνεται ως εξής: x ± s Όπου x ο μέσος όρος των μετρήσεων του κάθε φοιτητή Έτσι για το φοιτητή 1 το s είναι 0,46% και το αποτέλεσμα: 99,9 ± 0,46%. Ένας άλλος τρόπος έκφρασης της πιστότητας είναι η σχετική τυπική απόκλιση που δίνεται από τη σχέση: RSD = s x 100 Άσκηση Βρείτε τις τυπικές αποκλίσεις και των άλλων φοιτητών και εκφράστε τα αποτελέσματα.

6 Η πιστότητα (precision) είναι μια ευρεία έννοια που στο παράδειγμά μας με τους 4 φοιτητές εκφράστηκε ως επαναληψιμότητα. Οι κατευθυντήριες οδηγίες της ICM τη δίνουν ως εξής: «Η πιστότητα μιας αναλυτικής διαδικασίας εκφράζει την εγγύτητα της συμφωνίας (βαθμός διασποράς) μεταξύ μιας σειράς μετρήσεων που ελήφθησαν από πολλαπλή δειγματοληψία του ίδιου ομογενούς δείγματος κάτω από τις περιγραφόμενες συνθήκες Η πιστότητα εκφράζεται συνήθως ως τυπική απόκλιση (και άλλους όρους που δε μας ενδιαφέρουν)». Δεν υπάρχει απόλυτη οδηγία για το πόση πρέπει να είναι η πιστότητα γεγονός που εξαρτάται κατά κύριο λόγο από τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο, τη φύση του δείγματος που αναλύεται και την ποσότητα της αναλυόμενης ένωσης στο δείγμα. Έτσι μια χρωματογραφική μέθοδος δίνει σε ίδια ανάλυση μεγαλύτερη πιστότητα από ένα χημικό αισθητήρα αλλά έχουν διαφορετικές εφαρμογές. Γενικά πιστότητα της τάξεως RSD = ±1,0% είναι συνήθως επαρκής και αποδεκτή. Η πιστότητα μπορεί να εξεταστεί σε τρία επίπεδα την επαναληψιμότητα, που είδαμε, την ενδιάμεση πιστότητα και την αναπαραγωγιμότητα που δε θα μας απασχολήσουν περαιτέρω. Για την εξασφάλιση της μεγαλύτερης δυνατής πιστότητας πρέπει οι αναλύσεις να ακολουθούν μια πρότυπη μέθοδο που θα έχει διακριτά στάδια που πέραν της διαδικασίας αυτής καθαυτής της ανάλυσης (φαίνεται παρακάτω) μπορεί να περιλαμβάνει θέματα ασφαλείας, παρασκευή και αποθήκευση διαλυμάτων, τα γυάλινα σκεύη που απαιτούνται, τις προδιαγραφές του εξοπλισμού που θα χρησιμοποιηθεί κ.ά. Αυτά επισήμως καταγράφονται στις μορφές της τυποποιημένης διαδικασίας λειτουργίας (ΤΔΛ) και δημιουργούν το πρωτόκολλο της πειραματικής διαδικασίας. Έτσι αυτές πρέπει να είναι αναπαραγώγιμες από όλους τους αναλυτές διαφορετικών εργαστηρίων και με τον τρόπο αυτό τα αποτελέσματα να είναι αποδεκτά από όλους τους επιστήμονες. Για παράδειγμα οι αναλύσεις αίματος σε ένα εργαστήριο πρέπει να ταυτίζονται με αυτές ενός άλλου για τη σωστή διάγνωση από το θεράποντα ιατρό.

7 Άλλοι σημαντικοί όροι για αναλυτικές διαδικασίες Καταλληλόλητα συστήματος Είναι διαδικασίες οι οποίες συνήθως αναφέρονται στη μέθοδο, στον κατάλληλο εξοπλισμό και την απαιτούμενη απόδοσή του. Έτσι ανάλογα με την εφαρμογή και τις ανάγκες της ανάλυσης επιλέγονται η κατάλληλη μέθοδος και ο εξοπλισμός ενώ περιοδικά ελέγχονται ως προς την ορθότητα της λειτουργίας τους. Αναλυτικό λευκό (ή τυφλό) Έχουμε πει ότι για να επιτελέσουμε μια χημική ανάλυση μετράμε ένα σήμα το οποίο ανάγεται σε συγκέντρωση. Για να το πετύχουμε αυτό χρησιμοποιούμε πρότυπα διαλύματα (δηλαδή γνωστής συγκέντρωσης που τα παρασκευάζουμε εμείς). Όμως υπάρχει η πιθανότητα και είναι συχνή κάποια συστατικά των διαλυμάτων πέραν της δραστικής ουσίας να δίνουν μικρό αλλά υπολογίσιμο σήμα. Έτσι το τυφλό δεν περιέχει τη δραστική ουσία αλλά όλα τα άλλα συστατικά, διαλύτες και αντιδραστήρια, οπότε η τιμή του αφαιρείται από αυτή των δειγμάτων. Σε πολλές περιπτώσεις γίνεται μέτρηση εκ διαφοράς πχ με το μηδενισμό του τυφλού στη φασματοφωτομετρία. Διακρίβωση / βαθμονόμηση Διακρίβωση είναι διαδικασίες με την πρώτη να γίνεται σε ειδικά εξειδικευμένα εργαστήρια με αυστηρά καθορισμένες συνθήκες και πρότυπα που διασφαλίζουν την ορθή και

8 αξιόπιστη λειτουργία των οργάνων που χρησιμοποιούνται περαιτέρω για την επιθυμητή ανάλυση. Από τη άλλη η βαθμονόμηση γίνεται ενδοεργαστηριακά με τη χρήση ενός ή περισσοτέρων προτύπων παρασκευασμένων από αξιόπιστη πηγή. Για παράδειγμα για τη βαθμονόμηση του πεχάμετρου αναλύονται τα πρότυπα διαλύματα 4,00, 7,00 και 10,00. Αν κάποια τιμή απέχει κατά τι από αυτές τότε γίνεται διόρθωση της τιμής και έτσι το όργανο μπορεί να μετρήσει ορθά το άγνωστο. Όριο ανίχνευσης - Όριο ποσοτικοποίησης Όριο ανίχνευσης (LOD) είναι η μικρότερη δυνατή τιμή της προς ανάλυσης ουσίας που μπορεί να μετρήσει ένα όργανο με την απαιτούμενη πιστότητα και ακρίβεια 99,6% και τυπικά ορίζεται ως εξής: x x B= 3s B όπου x το σήμα του δείγματος, x B η τιμή του τυφλού και s B η τυπική απόκλιση του τυφλού. Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) είναι το σήμα που δίνει το όργανο με ικανοποιητικό βαθμό εμπιστοσύνης στην ακρίβεια και την πιστότητα. Αν η τυπική απόκλιση των μετρήσεων του χαμηλότερου προτύπου εκφρασμένη σε αναλυτική πληροφορία Χ (συγκέντρωση ή ποσότητα) είναι s X, τότε είναι: LOD = 3 s x και LOQ = 10 s X Τα LOD και LOQ υπολογίζονται από την καμπύλη αναφοράς. Ευαισθησία Είναι η ικανότητα του οργάνου μέτρησης να μετρά μικρές μεταβολές της συγκέντρωσης του αναλύτη. Μπορεί να εκφραστεί με την κλίση της καμπύλης αναφοράς (το α στη γραμμική εξίσωση που αναφέραμε προηγούμενα. Γραμμικότητα Όπως ξαναείπαμε στην ενόργανη ανάλυση μετράμε ένα σήμα το οποίο μετατρέπεται σε συγκέντρωση του προτύπου ή του δείγματος και επιδιώκεται συνήθως να συνδέονται γραμμικά μεταξύ τους με την καμπύλη αναφοράς όπως αναφέρεται η εξίσωση (της ευθείας) που ικανοποιούν και δίνεται παρακάτω: y = ax + b

9 με το y η μετρούμενη ποσότητα και x η συγκέντρωση του προτύπου ή του αγνώστου Άσκηση Κάντε την καμπύλη αναφοράς για τα δεδομένα του φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της προκαΐνης και βρείτε από το excel την εξίσωση της ευθείας Συγκέντρωση προκαΐνης mg/100 ml Ένδειξη απορρόφησης 0,8 0,604 1,0 0,763 1,2 0,931 Περιοχή Είναι η δυνατότητα του οργάνου αλλά και της μεθόδου να εφαρμοστεί σε ένα συγκεκριμένο διάστημα μεταξύ δύο ακραίων τιμών, δηλαδή της μικρότερης και της μεγαλύτερης μέσα στο οποίο επιτυγχάνεται αποδεκτή στάθμη πιστότητας. Αποδεκτά όρια για αυτή είναι το % της αναμενόμενης συγκέντρωσης π.χ σε δισκία Ανθεκτικότητα Είναι μια παράμετρος κατά την οποία αξιολογείται η δυνατότητα διατήρησης της πιστότητας και της ακρίβειας σε μικρές διακυμάνσεις της μεθόδου. Μια τέτοια παράμετρος είναι η σταθερότητα των αναλυτικών δειγμάτων, η χρονική διάρκεια της εκχύλισης και ο έλεγχος του ph της κινητής φάσης στην HPLC. Εκλεκτικότητα

10 Σε ένα δείγμα μπορεί να υπάρχουν περισσότερες από μια ουσίες που να δίνουν σήμα και παρεμποδίζουν την ανάλυση δίνοντας μεγαλύτερες τιμές από αυτές που θα λαμβάνονταν αν ήταν μόνος του ο αναλύτης. Η κατ εξοχήν εκλεκτική μέθοδος είναι η χρωματογραφία γιατί επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των ουσιών. Βιβλιογραφία D. G. Watson, Φαρμακευτική Ανάλυση, εκδ. Παριζιανου, 2015 D. C. Harris, Ποσοτική χημική ανάλυση, εκδ. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, iek-amarous.att.sch.gr/announcements/kef1-zaras.pdf Πως υπολογίζουμε το όριο ανίχνευσης και το όριο ποσοτικοποίησης μιας μεθόδου,