ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ (Μοριακή Βελτίωση) 1
Βασίζεται στη χρήση μοριακών δεικτών που είναι συνδεδεμένοι με επιθυμητές χρωμοσωμικές περιοχές. Μοριακοί δείκτες είναι τυχαία επιλεγμένα τμήματα DNA χωρίς άμεση επίδραση στο φαινότυτο, που δεν επηρεάζονται από το περιβάλλον και δεν εξαρτώνται από το αναπτυξιακό στάδιο του φυτού. Συμβολή στην κλασική βελτίωση: Ηχρήση δεικτών δίνει τη δυνατότητα διαλογής των υπό αξιολόγηση γενοτύπων πριν μπουν στο χωράφι, είτε πρόκειται για υλικό στο οποίο θα εφαρμοστεί επιλογή είτε πρόκειται για απογονικό έλεγχο, ώστε να αξιολογούνται μόνο φυτά και οικογένειες που φέρουν την επιθυμητή χρωμοσωμική περιοχή (πχ αντοχής σε κάποια ασθένεια). 2
Μέθοδοι: 1. RFLP 2. RAPD 3. AFLP 4. SCARS 5. CAPS 5. SSR Με βάση την PCR 3
Γενική αρχή της μεθόδου: μοριακός δείκτης Θέση ομόλογη του μοριακού δείκτη Θέση επιθυμητής χρωμοσωμικής περιοχής Η ανάλυση του γονιδιώματος δίνει τη δυνατότητα διερεύνησης της ύπαρξης τη επιθυμητής θέσης. Αν η ανάλυση με τον μοριακό δείκτη είναι θετική (πχ υβριδισμός) σημαίνει ότι υφίσταται η επιθυμητή χρωμοσωμική περιοχή λόγω σύνδεσης. 4
Γενική αρχή της μεθόδου: 5
Χάρτες σύνδεσης των μοριακών δεικτών: Χρ. 1 a b Χρ. 5 c d 6
Εφαρμογές των μοριακών δεικτών : διερεύνηση γενετικής ποικιλότητας (συγγένειας ποικιλιών ή σειρών) χαρτογράφηση γονιδίων προσδιορισμός χρωμοσωμικών θέσεων που σχετίζονται με ποσοτικά γνωρίσματα (QTL) πλειοτροπική δράση γονιδίων, δηλ. γονιδίων που ελέγχουν περισσότερα από ένα γνωρίσματα (όταν προκύπτει σύνδεση του μοριακού δείκτη με περισσότερα γνωρίσματα) πρόβλεψη συμπεριφοράς διασταυρώσεων με βάση τη γενετική συγγένεια των σειρών επίδραση περιβάλλοντος στην έκφραση γνωρισμάτων, δηλ. την κληρονομικότητα του γνωρίσματος (από φαινοτυπικές διαφορές συγγενών γενοτύπων) διευκόλυνση αναδιασταυρώσεων (ελέγχεται η γενετική συγγένεια του δέκτη με τους υποψήφιους δότες και επιλέγεται ο πιο συγγενής δότης για να επιταχυνθεί το πρόγραμμα) 7
Επιθυμητά χαρακτηριστικά μοριακών δεικτών : παρουσία πολυμορφισμού (ο δείκτης να συνδέεται με περιοχές που εμφανίζουν πολυμορφισμό ή αντιστοιχούν σε γονιδιακές θέσεις με πολλά αλληλόμορφα) απλή κληρονομικότητα, και υψηλός συντελεστής κληρονομικότητας διασπορά και ή δυνατόν ισοκατανομή στο γονιδίωμα μικρό κόστος, χωρίς αρνητικές συνέπειες στο φυτό, και εύκολη στα νεαρά στάδια αναγνώριση 8
Μέθοδος RFLP (Restriction fragment length polymorphism) Βασίζεται στη διερεύνηση του πολυμορφισμού χρωμοσωμικών περιοχών. Πολυμορφισμός προκύπτει από μετάλλαξη, έλλειψηήπροσθήκηβάσηςστη χρωμοσωμική περιοχή Με χρήση κατάλληλου περιοριστικού ενζύμου η χρωμοσωμική περιοχή τεμαχίζεται και υβριδίζεται με τον κατάλληλο μοριακό δείκτη (ιχνηλάτη) κατά Southern, οπότε αναγνωρίζονται τόσες ζώνες όσες και τα τμήματα που προέκυψαν από τον τεμαχισμό με το ένζυμο. Όταν η τεχνική εφαρμόζεται χρησιμοποιώντας χρωμοσωμική περιοχή από διαφορετικές πηγές (πχ ποικιλίες) προκύπτουν διαφορές είτε στον αριθμό είτε στο μέγεθος των ζωνών. 9
Μέθοδος RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 1. Ταυτοποίηση γενετικών υλικών Χρωμοσώματα από 5 διαφορετικά φυτά (1,2,3,4 θέσεις περιορισμού) Τεμαχισμός με ένζυμο περιορισμού ηλεκτροφόρηση Υβριδισμός με μοριακό δείκτη Εικ. 9.1 Σε σύγκριση με το Α, ο πολυμορφισμός προκύπτει από την ένθεση της θέσης 4 (Β) ή την έλλειψη της θέσης 2 (Γ) ελάττωση της ζώνης 2-3 (Δ), ή επιμήκυνση της ζώνης 1-2 (Ε) Έστω η πολυμορφική ζώνη Γ είναι συνδεδεμένη με την επιθυμητή περιοχή 10
Μέθοδος RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 2. Αναδιασταύρωση Α/Α x Γ/Γ Α/Γ και επιλογή Νέα αναδιασταύρωση ευελπιστώντας σε ανταλλαγή που θα δώσει τη δυνατότητα σταθεροποίησης της επιθυμητής περιοχής στο συνδυασμό ΑΑ Κρατάμε τα άτομα Α/Γ 11 Εικ. 9.1
Μέθοδος RFLP (Restriction fragment length polymorphism) Χαρακτηριστικά της μεθόδου: απαιτεί εντατική εργασία, είναι χρονοβόρα και έχει μεγάλο κόστος απαιτεί μεγάλες ποσότητες DNA ανιχνεύει μεγάλες γενετικές διαφορές, δυσκολεύεται όμως να εντοπίσει διαφορές μεταξύ ποικιλιών, ή ατόμων του ίδιου είδους έχει πολύ καλή επαναληψιμότητα σε σχέση με τις άλλες μεθόδους 12
Μέθοδος RAPD (Random amplified polymorphic DNA) Βασίζεται στην ανάπτυξη μοριακών δεικτών με τη χρήση τυχαίων εκκινητών (συνήθως 10μερή), σε PCR, οπότε οι περιοχές στις οποίες υβριδίζεται ο δείκτης πολλαπλασιάζονται. Ο πολυμορφισμός μεταξύ φυτών εκδηλώνεται με τις διαφορές του προτύπου των ζωνών DNA στην ηλεκτροφόρηση και μπορεί να οφείλεται 1. Σε αλλαγές της θέσης υβριδισμού που την καθιστούν μη αναγνωρίσιμη από τον εκκινητή 2. Απάλειψη της θέσης υβριδισμού 3. Προσθήκες ή ελλείψεις τμημάτων DNA 13
Μέθοδος RAPD (Random amplified polymorphic DNA) 1. Ταυτοποίηση γενετικών υλικών Α Β Εικ. 9.2 Ηεμφάνιση της ζώνης 1 έστω ότι συνδέεται με την επιθυμητή προς επιλογή περιοχή 14
Μέθοδος RAPD (Random amplified polymorphic DNA) 2. Επιλογή ΑxB F1 F1 F2 Εικ. 9.2 Η διασταύρωση των απογόνων της F2 με τον αρχικό γονέα Α διευκολύνει στην ταυτοποίηση και επιλογή των ομοζύγωτων 1/1, γιατί δεν θα προκύψει διάσπαση 15
Ταυτοποίηση ποικιλιών ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ Πολυμορφισμός RAPD ποικιλιών ελιάς με δύο εκκινητές (βέλη) Πολυμορφισμός RAPD ποικιλιών ελιάς με εννέα εκκινητές 16 Εικ. 9.4&9.5
Δενδρόγραμμα των 28 ποικιλιών ελιάς με βάση τον πολυμορφισμό RAPD 17 Εικ. 9.6
Δενδρόγραμμα 19 τοπικών πληθυσμών φασολιού (Δ. Μακεδονία Καβάλα FYROM) με βάση τον πολυμορφισμό RAPD για 11 εκκινητές 18 Εικ. 9.6
Μέθοδος RAPD (Random amplified polymorphic DNA) Χαρακτηριστικά της μεθόδου: μπορούν να εμφανιστούν μέχρι και 20 ζώνες με ένα εκκινητή δίνοντας τη δυνατότητα εκτίμησης πολλών γονιδιακών θέσεων με λίγους εκκινητές απλή, δεν απαιτεί ιδιαίτερη εξειδίκευση, όχι χρονοβόρα, μικρό κόστος μικρή επαναληψιμότητα λόγω διαφορών στις τεχνικές, τις DNA πολυμεράσες και τις συσκευές PCR δεν είναι η πλέον κατάλληλη για ανίχνευση μικρών γενετικών διαφορών 19
Μέθοδος AFLP (Amplified fragment length polymorphism) Βασίζεται στην επιλεκτική ενίσχυση μιας υποομάδας τμημάτων που έχουν παραχθεί μετάαπόπέψητουγονιδιωματικούdna με ένζυμα περιορισμού. Ο πολυμορφισμός μεταξύ φυτών εκδηλώνεται με τις διαφορές του προτύπου των ζωνών DNA στην ηλεκτροφόρηση και μπορεί να οφείλεται 1. Σε διαφορές των θέσεων αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού (όπως στα RFLPs) 2. Σε αλλαγές των βάσεων λόγω μεταλλάξεων κοντά στις θέσεις αναγνώρισης 3. Προσθήκες ή ελλείψεις στα τμήματα DNA που ενισχύονται 20
Μέθοδος AFLP (Amplified fragment length polymorphism) Τεχνική 1. Πέψη γονιδιωματικού DNA με δύο ένζυμα περιορισμού 6 και 4 βάσεων 21 Εικ. 9.3
Μέθοδος AFLP (Amplified fragment length polymorphism) Τεχνική 2. Λιγοποίηση αντίθετων άκρων με προσαρμοστές συμβατών για τα άκρα περιορισμού 22 Εικ. 9.3
Μέθοδος AFLP (Amplified fragment length polymorphism) Τεχνική 3. Ενίσχυση σε PCR μιας υποομάδας τμημάτων που έχουν τα δύο διαφορετικά άκρα με τη χρήση κατάλληλων εκκινητών οι οποίοι φέρουν στο 3 άκρο «επιλεκτικά νουκλεοτίδια» 23 Εικ. 9.3
Μέθοδος AFLP (Amplified fragment length polymorphism) Τεχνική 4. Διαχωρισμός ενισχυμένων τμημάτων με ηλεκτροφόρηση σε πηχτή πολυακρυλαμίδης 24 Εικ. 9.3
Μέθοδος AFLP (Amplified fragment length polymorphism) Χαρακτηριστικά της μεθόδου: μεγάλη επαναληψιμότητα, άρα και αξιοπιστία πολύπλοκη, απαιτεί ιδιαίτερη εξειδίκευση, είναι χρονοβόρα, έχει μεγάλο κόστος 25
Μέθοδος με μικροδορυφόρους (Single sequence repeats-ssr) Βασίζεται στην ταυτοποίηση με μοριακούς δείκτες μικρών συνεχών επαναλήψεων απλών αλληλουχιών 2, 3 ή 4 νουκλεοτιδίων. Η πλέον συχνή μορφή είναι η επανάληψη της αλληλουχίας GT/CA: 3.. G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-A. 5 5.. C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A. 3 Κατάλληλοι εκκινητές χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση των τμημάτων αυτών σε PCR, και στη συνέχεια ηλεκτροφόρηση αποκαλύπτει τον πολυμορφισμό των τμημάτων αυτών. 3 5 (GT) n 5 (CA) n 3 26
Μέθοδος με μικροδορυφόρους (Single sequence repeats-ssr) Ανίχνευση ενός γονιδίου (Λ) υπεύθυνου για μια ασθένεια στενά συνδεδεμένου με τέτοιες επαναλήψεις: λ Ε3 Λ: αλληλόμορφο ασθένειας εκκινητής Λ Ε4 Μικροδορυφορική επανάληψη λ λ Ε2 Ε8 Λλ(E3/E4) λλ(e2/e8) Λλ Λλ λλ λλ Λλ Λλ E4/E2 E4/E8 E3/E8 E2/E3 E4/E8 E2/E4 27
Μέθοδος με μικροδορυφόρους (Single sequence repeats-ssr) Λλ(E3/E4) λλ(e2/e8) Λλ Λλ λλ λλ Λλ Λλ E4/E2 E4/E8 E3/E8 E2/E3 E4/E8 E2/E4 Ε8 Ε4 Ε3 Ε2 σε όλα τα ασθενή παιδιά βρέθηκε η επανάληψη Ε4 που είναι συνδεδεμένη με την αρρώστεια 28
Gethi et al. (2002). CROP SCIENCE, 42: 951-957 : Διερεύνηση γενετικής παραλλακτικότητας με μοριακούς δείκτες SSR (single sequence repeats) σε έξι καθαρές σειρές καλαμποκιού προερχόμενες από οχτώ διαφορετικές πηγές σειρές: B73 CM105 Mo17 Oh43 W153R Wf9 29
Olufowote et al. (1997). GENOME 40: 370-378 : Διερεύνηση γενετικής παραλλακτικότητας σε ποικιλίες ρυζιού με βάση τη φαινοτυπική διαφοροποίηση, μοριακή ανάλυση RFLP και μικροδορυφόρους SSLP (single sequence length polymorphism) Σύνολο ποικιλιών Ποικιλίες με φαινοτυπική διαφοροποίηση Ποικιλίες με γενετική RFLP διαφοροποίηση Ποικιλίες με γενετική SSLP διαφοροποίηση 71-11 32 30
ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Ποια η γενική αρχή της μεθόδου Μοριακή Βελτίωση, που βασίζεται, ποια η συμβολή στην κλασική βελτίωση; Εφαρμογές των μοριακών δεικτών Επιθυμητά χαρακτηριστικά των μοριακών δεικτών Μέθοδος RFLP: Πού βασίζεται και ποια η διαδικασία εφαρμογής της Ποια είναι τα χαρακτηριστικά της μεθόδου RFLP; Μέθοδος RAPD: Πού βασίζεται και ποια η διαδικασία εφαρμογής της Ποια είναι τα χαρακτηριστικά της μεθόδου RAPD; Μέθοδος AFLP: Πού βασίζεται και ποια η διαδικασία εφαρμογής της Ποια είναι τα χαρακτηριστικά της μεθόδου AFLP; Μέθοδος με μικροδορυφόρους (SSR): Πού βασίζεται και ποια η διαδικασία εφαρμογής της 31
2 Για τη διευκόλυνση της κλασικής βελτίωσης επινοήθηκαν δείκτες: - Φαινοτυπικοί (αριθμός αδελφιών, σπαδίκων) (μειονέκτημα η επίδραση από το περιβάλλον) - Βιοχημικοί (βασίζονται στον πολυμορφισμό ισοενζύμων) (μειονέκτημα η πιθανή μη έκφραση και η επίδραση από το περιβάλλον) - Γενετικοί δείκτες: λειτουργικά γονίδια που επηρεάζουν το γενότυπο (στη τομάτα ένα γονίδιο που παράγει συγκεκριμένο ισοένζυμο βρέθηκε στενά συνδεδεμενο με αντοχή σε νηματώδεις, χωρίς να έχει άμεση σχέση με την ανθεκτικότητα) 4-5 Η ανάλυση του γονιδιώματος δίνει τη δυνατότητα διερεύνησης της ύπαρξης της «επιθυμητής» θέσης. Χρησιμοποιείται μοριακός δείκτης που είναι γνωστό ότι συνδέεται με τη θέση, δηλ. όταν υπάρχει η θέση υπάρχει και ομόλογη θέση του δείκτη. Αν η ανάλυση με το μοριακό δείκτη είναι θετική (πχ υβριδισμός) σημαίνει ότι υφίσταται η επιθυμητή χρωμοσωμική περιοχή λόγω σύνδεσης. Με σκανάρισμα του τεμαχισμένου γονιδιώματος με το μοριακό δείκτη, αν υφίσταται η θέση υφίσταται και η ομόλογη με το δείκτη θέση, οπότε ο δείκτης υβριδίζεται (προσκολάται) με την ομόλογη θέση και μαρτυρά την ύπαρξη της επιθυμητής θέσης. 6. Οι χάρτες σύνδεσης δείχνουν για διάφορες περιοχές του γενώματος με ποιους δείκτες είναι συνδεδεμένοι. Πχ η κόκκινη περιοχή είναι συνδεδεμένη με το δείκτη a, η καφέ με τον b κοκ. Έτσι διευκολύνουν την επιλογή του κατάλληλου δείκτη. Η κόκκινη περιοχή είναι συνδεδεμένη με το δείκτη a, η καφέ με τον b κοκ. 8 παρουσία πολυμορφισμού (ο δείκτης να συνδέεται με περιοχές που εμφανίζουν πολυμορφισμό /ή δυνατόν η ύπαρξη πολλών αλληλόμορφων για κάθε γονιδιακή θέση) απλή κληρονομικότητα (στην ιδανική περίπτωση ελέγχεται από μια γονιδιακή θέση με συγκυρίαρχα αλληλόμορφα) υψηλός συντελεστής κληρονομικότητας (φαινότυπος που δεν επηρεάζεται από το περιβάλλον ώστε ο πολυμορφισμός να είναι αποτέλεσμα γενετικών και όχι επίκτητων διαφορών 9. RFLP: πολυμορφισμός μεγέθους περιοριστικών τμημάτων Βασίζεται στη διερεύνηση του πολυμορφισμού χρωμοσωμικών περιοχών, δηλ. μια συγκεκριμένη περιοχή του χρωμοσώματος να διαφοροποιείται από γενότυπο σε γενότυπο. Πολυμορφισμός προκύπτει από μετάλλαξη, έλλειψη ή προσθήκη βάσης στη χρωμοσωμική περιοχή Με χρήση κατάλληλου περιοριστικού ενζύμου η χρωμοσωμική περιοχή τεμαχίζεται και υβριδίζεται με τον κατάλληλο μοριακό δείκτη (ιχνηλάτη) κατά Southern, οπότε αναγνωρίζονται τόσες ζώνες όσες και τα τμήματα που προέκυψαν από τον τεμαχισμό με το ένζυμο. Όταν η τεχνική εφαρμόζεται χρησιμοποιώντας χρωμοσωμική περιοχή
από διαφορετικές πηγές (πχ ποικιλίες) προκύπτουν διαφορές είτε στον αριθμό είτε στο μέγεθος των ζωνών. 10 RFLP (Πολυμορφισμός μεγέθους περιοριστικών τμημάτων) Η εικόνα α δείχνει τον πολυμορφισμό μιας χρωμοσωμικής περιοχής σε πέντε γενότυπους: Σε σύγκριση με το Α, ο πολυμορφισμός προέκυψε από την ένθεση της θέσης 4 (Β) ή την έλλειψη της θέσης 2 (Γ) ελάττωση της ζώνης 2-3 (Δ), ή επιμήκυνση της ζώνης 1-2 (Ε). Η μεταχείριση των γονιδιωμάτων με κατάλληλο ένζυμο που αναγνωρίζει τις θέσεις 1,2,3,4 δίνει σωρεία τμημάτων DNA σε κάθε γενότυπο (εικόνα β) και η χρήση μοριακού δείκτη που αναγνωρίζει την περιοχή 1-3 αποκαλύπτει τον πολυμορφισμό (εικόνα γ). Συγκεκριμένα στο γενότυπο Α το ένζυμο θα κόψει στις θέσεις 1, 2 και 3 στην επίμαχη χρωμοσωμική περιοχή γιαυτό και αναγνωρίζονται από το μοριακό δείκτη δύο ζώνες (εικόνα γ) 11 έστω ότι η πολυμορφική ζώνη Γ είναι συνδεδεμένη με την επιθυμητή περιοχή (πχ ένα επιθυμητό γονίδιο), και αυτή θέλουμε να τη μεταφέρουμε στο άτομο Α. Γίνεται η διασταύρωση Α/Α x Γ/Γ, αυτογονιμοποίηση της F1, δηλ. του Α/Γ και από τους απογόνους της F2 απομονώνονται τα άτομα Α/Γ (ε). Η αναγνώριση των Α/Γ μπορεί να γίνει με διασταύρωση της F2 με το γενότυπο Γ, καθώς τα ομοζύγωτα για την επιθυμητή περιοχή δεν θα δώσουν διάσπαση. Στη συνέχεια τα άτομα Α/Γ αναδιασταυρώνονται με το γενότυπο Α (ζ) επιλέγοντας πάντοτε άτομα που φέρουν την επιθυμητή περιοχή Γ, ώστε τα επιλεγόμενα να έχουν το επιθυμητό γνώρισμα. Με ανταλλαγή ευελπιστούμε το επιθυμητό γονίδιο να περάσει στο γένωμα Α ώστε να σταθεροποιείται σε ομοζύγωτη κατάσταση. 12 RAPD ( τυχαίο ενισχυμένο πολυμορφικό DNA) 13. RAPD ( τυχαίο ενισχυμένο πολυμορφικό DNA) Τυχαίοι εκκινητές σημαίνει ότι αυτοί υβριδίζουν σε τυχαία τμήματα τα οποία ενισχύονται (πολλαπλασιάζονται) σε PCR και στη συνέχεια ηλεκτροφορούνται 14 Στο γενότυπο Α ο εκκινητής αναγνωρίζει δύο θέσεις την 1 και 1, αυτές πολλαπλασιάζονται σε PCR και μετά από ηλεκτροφόρηση αποκαλύπτονται. Ο γενότυπος Β στερείται της ζώνης 1 άρα ο εκκινητής αναγνωρίζει μόνο την 1 που στη συνέχεια πολλαπλασιάζεται, οπότε μετά από την ηλεκτροφόρηση αποκαλύπτεται, απουσιάζει όμως η 1. Η σύγκριση των ζωνών μετά από ηλεκτροφόρηση αποκαλύπτει τη διαφορά αυτή μεταξύ των γενοτύπων Α και Β. Η ζώνη 1 έστω ότι συνδέεται με την επιθυμητή προς επιλογή περιοχή και θέλουμε να τη μεταφέρουμε στο γενότυπο Β.
15 Οι δύο γενότυποι διασταυρώνονται, το υβρίδιο F1 είναι ετεροζύγωτο για τη ζώνη 1 δηλ. 1/0 και η αυτογονιμοποίησή του δίνει μια φορά ομοζύγωτο για τη ζώνη 1 (1/1), 2 φορές ετεροζύγωτο (1/0) και μια ομοζύγωτο χωρίς τη ζώνη 1 (0/0). Η διασταύρωση των απογόνων της F2 με τον αρχικό γονέα Α διευκολύνει στην ταυτοποίηση και επιλογή των ομοζύγωτων 1/1, γιατί δεν θα προκύψει διάσπαση. Αυτοί στη συνέχεια με συνεχείς αναδιασταυρώσεις με το γενότυπο Β θα οδηγήσουν σε σταθεροποίηση της θέσης 1 στο γενότυπο Β (μετά από χίασμα και ανταλλαγή) 16 Η σύγκριση των δύο εικόνων δείχνει ότι η χρήση εννέα εκκινητών αποκάλυψε περισσότερες διαφορές μεταξύ των ποικιλιών της ελιάς παρά η χρήση μόνο δύο εκκινητών. Αυτό είναι εύλογο αφού περισσότεροι εκκινητές αφορούν και περισσότερα τμήματα στα γονιδιώματα των ποικιλιών, με συνέπεια η πιθανότητα να βρεθούν διαφορές είναι μεγαλύτερες. 17 Με βάση τις ζώνες που προκύπτουν για κάθε ποικιλία από την εφαρμογή της RAPD τεχνικής, εκτιμάται ο βαθμός γενετικής συγγένειας μεταξύ των ποικιλιών, οι ποικιλίες ταξινομούνται και σχηματίζεται το δενδρόγραμμα. Τα νούμερα πάνω στο δενδρόγραμμα αντιστοιχούν στις γενετικές αποστάσεις μεταξύ των κόμβων. 18 Στο δεδρόγραμμα αυτό, που αφορά τη γενετική συγγένεια 19 τοπικών πληθυσμών φασολιού, προέκυψε μετά από RAPD ανάλυση με 11 εκκινητές. Τα νούμερα στην κάτω γραμμή αφορούν τους συντελεστές ανομοιότητας μεταξύ των ποικιλιών. 20 AFLP (πολυμορφισμός μήκους ενισχυμένων τμημάτων) 21 AFLP (πολυμορφισμός μήκους ενισχυμένων τμημάτων) Τεχνική: 1. Στο πρώτο στάδιο το γονιδιωματικό DNA τεμαχίζεται με δύο ένζυμα περιορισμού που η θέση περιορισμού (αναγνώρισης) για το ένα περιλαμβάνει 6 βάσεις και για το άλλο 4 βάσεις. Προκύπτουν λιγότερα τμήματα από το ένζυμο 6 θέσεων 22 2. Στα τμήματα που έχουν αντίθετα άκρα, δηλαδή έχουν προκύψει από τη δράση και των δύο ενζύμων (το ένα στο ένα άκρο και το άλλο ένζυμο στο άλλο άκρο), γίνεται λιγοποίηση (προστίθεται σε κάθε άκρο ένας προσαρμοστής που είναι συμβατός για το άκρο, δηλαδή έχει βάσεις αντίστοιχες του προεξέχοντος άκρου) 23 3. Ενίσχυση (πολλαπλασιασμός) των λιγοποιημένων τμημάτων με εκκινητές που είναι συμβατοί (ομόλογοι) για τους προσαρμοστές που έχουν προστεθεί. Οι εκκινητές φέρουν στο 3 άκρο «επιλεκτικά νουκλεοτίδια» για να είναι συμβατοί.
24 4. Διαχωρισμός των ενισχυμένων τμημάτων με ηλεκτροφόρηση σε πηχτή πολυακρυλαμίδης. Ακολουθεί η σύγκριση των ζωνών που προκύπτουν από κάθε πηγή γενετικού υλικού για τον προσδιορισμό του βαθμού συγγένειας (ομοιότητας) και κατασκευάζονται τα δενδρογράμματα όπως και στην προηγούμενη μέθοδο. 27 Ένα παράδειγμα της SSR μεθόδου αφορά την ταυτοποίηση μιας γενετικής ασθένειας που είναι συνδεδεμένη με τέτοιες επαναλήψεις. Το σχήμα δείχνει ότι σε ένα ζευγάρι η γυναίκα ήταν ασθενής καθώς είχε το υπεύθυνο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο γονίδιο (Λ) σε ένα από τα δύο ομόλογα χρωμοσώματά της, που μάλιστα είναι κυρίαρχο στο κανονικό αλληλόμορφο (λ). Ο άνδρας αντίθετα είχε και στα δύο χρωμοσώματα το κανονικό αλληλόμορφο (λ). Το ζευγάρι έκανε έξι παιδιά, τέσσερα από τα οποία είχαν την ασθένεια. Η εικόνα επίσης δείχνει τον αριθμό των μικροδορυφορικών επαναλήψεων σε κάθε χρωμόσωμα των γονέων (πχ Ε3 και Ε4 στη γυναίκα, Ε2 και Ε8 στον άνδρα) αλλά και των παιδιών τους. Στους γονείς και τα παιδιά με κατάλληλους εκκινητές έγινε ενίσχυση των μικροδορυφορικών επαναλήψεων, και όπως δείχνει η επόμενη διαφάνεια το μεταλλαγμένο γονίδιο συνδέθηκε με την Ε4 επανάληψη. Τα βέλη απο αριστερά και δεξιά δείχνουν τους εκκινητές στις επαναλήψεις των συμπληρωματικών αλυσίδων ώστε να γίνει πολλαπλασιασμός τους. 28 Η ηλεκτροφόρηση των ενισχυμένων τμημάτων έδειξε ποικιλομορφία στο σύνολο των ατόμων, λόγω του διαφορετικού αριθμού επαναλήψεων στο καθένα. Σε όλα τα ασθενή παιδιά, όπως και τη μητέρα, βρέθηκε η επανάληψη Ε4 που είναι συνδεδεμένη με την αρρώστια. 29 Δενδρόγραμμα που δείχνει τη γενετική απόσταση μεταξύ 6 σειρών καλαμποκιού και το οποίο κατασκευάστηκε μετά από ταυτοποίηση με μικροδορυφόρους SSR. Στην κάτω κλίμακα δίνεται ο συντελεστής ομοιότητας. Το δενδρόγραμμα αποκαλύπτει γενετικές διαφορές μεταξύ των σειρών αλλά και εντός των σειρών.