ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΑΝΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΑΓΚΙΝΑΡΑΣ, ΤΗΣ ΑΓΡΙΑΓΚΙΝΑΡΑΣ, ΤΗΣ ΡΙΓΑΝΗΣ, ΤΟΥ ΡΟΔΙΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΓΚΟΤΖΙ ΜΠΕΡΙ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΟΓΟΝΟΥ ΜΥΚΗΤΑ ASPERGILLUS PARASITICUS. Ελένη Κόλλια 1, Αλκυόνη Γουρδομιχάλη 1, Έφη Πριλή 1, Παναγιώτα Μαρκάκη 1, Χαράλαμπος Προεστός 1, Παναγιώτης Ζουμπουλάκης 2 1 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών 2 Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών. 6 ο Πανελλήνιο Επιστημονικό συνέδριο «ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΤΑΣΕΙΣ ΣΤΟΝ ΤΟΜΕΑ ΤΩΝ ΛΙΠΙΔΙΩΝ» Αθήνα 11 και 12 Ιουνίου 2015, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών
Aspergillus parasiticus- Αφλατοξίνες Αποικίζει σε μια μεγάλη κατηγορία τροφίμων με αποτέλεσμα την παραγωγή αφλατοξινών Οι αφλατοξίνες αποτελούν μια τάξη ισχυρά τοξικών και καρκινογόνων ενώσεων Αφλατοξίνες με μεγαλύτερο ενδιαφέρον : B 1, B 2, M 1, G 1 & G 2. Κυρίαρχη και πιο τοξική ΑΦΒ 1. Ιδιαιτέρως ευπρόσβλητα τα τρόφιμα με υψηλό λιπιδικό περιεχόμενο κυρίως ελαιώδεις καρποί (καλαμπόκι, σουσάμι, φιστίκια, ελιές κ.α ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΣΤΗΝ ΥΓΕΙΑ 5 δισ. Άνθρωποι παγκοσμίως σε χρόνια έκθεση σε αφλατοξίνες προκαλούν >100.000 θάνατοι από καρκίνο ετησίως Όργανο στόχος σε ανθρώπους και ζώα το ήπαρ ΗΠΑΡ Βλάβες και καρκίνος στο ήπαρ Έχουν επίσης: Νεφροτοξική και αιμοραγική δράση Και σχετίζονται με: Καθυστέρηση ανάπτυξης Παιδικό νανισμό Καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΣΤΑ ΖΩΑ Σε γενικές γραμμές επηρεάζονται με τον ίδιο τρόπο
ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΕΣ ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ 25% των καλλιεργειών παγκοσμίως μολύνονται ετησίως με μυκοτοξίνες και κυρίως αφλατοξίνες (FAO, 2000) Ζημιά 450 εκατ. $ ετησίως στις Αφρικανικές οικονομίες Απώλειες 1 δισεκατομμυρίου τόνων σε τρόφιμα και προϊόντα τροφίμων ετησίως 1.2 δισ. $ ζημιά στο παγκόσμιο εμπόριο Απώλειες στην κτηνοτροφία Εξαιτίας μολυσμένων ζωοτροφών
ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Κεντρική ιδέα Εύρεση απλού & οικονομικού τρόπου για να αποτραπεί η ανάπτυξη του Α.parasiticus στα τρόφιμα Πολλά βιβλιογραφικά δεδομένα συνδέουν την αντιοξειδωτική δράση διαφόρων ουσιών με αντιμυκητιακές και αντιαφλατοξινογόνες ιδιότητες 1,2 Φυτικά προϊόντα που επιλέχθηκαν Επιλογή των συγκεκριμένων φυτικών προϊόντων Πλούσια σε φαινολικά συστατικά (αντιοξειδωτική δράση) Αυξανόμενη αναγνώριση και αποδοχή από το καταναλωτικό κοινό για τις ευεργετικές τους ιδιότητες. Έλλειψη βιβλιογραφικών δεδομένων για την επίδραση τους στην ανάπτυξη του A. parasiticus και την παραγωγή της AΦB 1 Σκοπός της έρευνας: Αναστολή της ανάπτυξης του Α.parasiticus στα τρόφιμα μέσω εκχυλισμάτων φυτικής προέλευσης 1 Tzanidi, C., Proestos, C., Markaki, P., (2012), Saffron (Crocus sativus L.) Inhibits Aflatoxin B 1 production by Aspergillus parasiticus, Advances in Microbiology, 2(03), 310-316. 2 Abhishek et al. (2015), Evaluation of Phyllanthus polyphyllus L. extract and its active constituent as a source of antifungal, anti-flatoxigenic, and antioxidant activities, International Journal of Food Properties., 18(3), 585-596.
Cynara scolymus L. Μορφή που προήλθε από καλλιέργεια και διαλογή άγριων ειδών. Γνωστή με το όνομα αγκινάρα Αντιοξειδωτική δράση Goji Berry Ανήκει στο γένος Lycium Καλλιεργείται κυρίως στην Κίνα και το Θιβέτ Τρόφιμο & φαρμακευτικόβότανο Αντιοξειδωτική δράση Origanum vulgare ssp hirtum Αρωματικό φυτό Αντιμικροβιακή δράση Ισχυρή αντιοξειδωτική δράση Cynara cardunculus L. Eίδος κοινό της ελληνικής και κυπριακής χλωρίδας. Γνωστή με το όνομα αγριαγκινάρα. Αντιοξειδωτική δράση Punica granatum «Θεραπευτικές ιδιότητες» Αντιμικροβιακή δράση Αντιοξειδωτική δράση
ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΣ Μελέτη ρυθμού ανάπτυξης του μύκητα Α.parasiticus σε θρεπτικό υλικό AFPA (Aspergillus Flavus Parasiticus Agar) υπό την επίδραση εκχυλισμάτων Προσδιορισμός της μυκηλιακής μάζας του μύκητα Α.parasiticus σε μικροβιολογικό εργαστηριακό θρεπτικό υλικό YES (Yeast Extract Sucrose) με προσθήκη εκχυλισμάτων
ΣΤΑΔΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΠΟΡΕΙΑΣ Παρασκευή θρεπτικού υλικού AFPA Ανακαλλιέργεια μύκητα A.parasiticus Παρασκευή εκχυλισμάτων φυτικών προϊόντων Εμβολιασμός του θρεπτικού υλικού AFPA με τον A.parasiticus Προσθήκη των εκχυλισμάτων των τροφίμων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Μελέτη του ρυθμού ανάπτυξης του μύκητα για 7 ημέρες
ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ Τεμαχισμός Ζύγιση Προσθήκη διαλύτη MeOH/H2O (80/20 v/v) Εκχύλιση για 48 h σε θερμοκρασία δωματίου Διήθηση για παραλαβή πυκνών εκχυλισμάτων Παρασκευή κατάλληλων αραιώσεων για κάθε εκχύλισμα
ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΕΜΒΟΛΙΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Προσθήκη αποστειρωμένου διάλυματος TWEEN 80 0,05%v/v στο slant που περιέχει το ώριμο μυκήλιο του εκάστοτε μύκητα 7 ημερών Ήπια ανακίνηση Μεταφορά σε αποστειρωμένο σωλήνα φυγοκέντρου Φυγοκέντρηση (2500 r.p.m. για 10 min) εις διπλούν Μεταφορά κονιδίων σε αποστειρωμένο φιαλίδιο Universal (Πυκνό) Αραίωση του πυκνού διαλύματος (10-1, 10-2, 10-3, 10-4 ) Εμβολιασμός τρυβλίων θρεπτικού υλικού AFPA (Aspergillus Flavus Parasiticus Agar) Επώαση για 2 ημέρες στους 30 C Καταμέτρηση αποικιών και υπολογισμός όγκου εμβολίου V = 0,1 x/a Όπου: V = όγκος εμβολίου, Α = αριθμός αποικιών στο τρυβλίο, 0,1 = όγκος εμβολίου στο τρυβλίο, x = 100 (επιθυμητός αριθμός κονιδίων)
ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ-ΜΕΛΕΤΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ 3. Εμβολιασμός με 10 2 κονίδια του A.parasiticus (εντός οπής) 4. Προσθήκη 50μl εκχυλίσματος περιμετρικά της οπής 2. Άνοιγμα οπής στο θρεπτικό υλικό με χρήση αποστειρωμένου δοκιμαστικού σωλήνα 1. Προετοιμασία τρυβλίων με θρεπτικό υλικό AFPA Αποστείρωση θ.υ στους 121 ο C για 15min 5. Επώαση στους 30 ο C 6. Μακροσκοπική παρατήρηση της ανάπτυξης του A.parasiticus με καθημερινή μέτρηση της διαμέτρου του μυκηλίου
Για τον υπολογισμό του ρυθμού ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκε ο εξής τύπος: Ρ.Α. = (Μ n - Μ 0 )/Μ 0 Όπου: Μ n είναι η διάμετρος της αποικίας για κάθε ημέρα επώασης (με n= 1 έως 6) και Μ 0 η διάμετρος της αποικίας την ημέρα 0.
ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ A.PARASITICUS ΣΕ AFPA
ΜΕΛΕΤΗ ΡΥΘΜΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Α.PARASITICUS ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ AFPA ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΑΓΚΙΝΑΡΑ Ρυθμός Ανάπτυξης Ρυθμός Ανάπτυξης 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 12.00 1 2 3 4 5 6 Ημέρες επώασης ΑΓΡΙΑΓΚΙΝΑΡΑ 1 2 3 4 5 6 Ημέρες επώασης ΡΙΓΑΝΗ CONTROL ΠΥΚΝΟ 125000ppm 12500ppm 6250ppm 2500ppm 1250ppm 125ppm Control 1000ppm 300ppm 250ppm 200ppm 50ppm 20ppm 15ppm 10ppm 5ppm Τα εκχυλίσματα και των 3 φυτικών προιόντων προκάλεσαν αναστολή της ανάπτυξης του A.parasiticus σε όλες τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν Τα μεγαλύτερα ποσοστά αναστολής του μύκητα παρατηρήθηκαν την 2 η και 3 η ημέρα επώασης. Ρυθμός Ανάπτυξης 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 1 2 3 4 5 6 Ημέρες επώασης CONTROL ΠΥΚΝΟ 25000ppm 12500ppm 6250ppm 2500ppm 1250ppm 125ppm
ΜΕΛΕΤΗ ΡΥΘΜΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Α.PARASITICUS ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ AFPA ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ GOJI BERRY Ρυθμός Ανάπτυξης 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 Ημέρες επώασης CONTROL ΠΥΚΝΟ125000ppm 1250ppm 125ppm 12.5ppm 1.25ppm Οι μεγάλες συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων goji berry και ρόδι προκάλεσαν αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα όλες τις ημέρες επώασης (έως 37,12 %) Ρυθμός Ανάπτυξης 6 5 4 3 2 1 0 ΡΟΔΙ 1 2 3 4 5 6 Ημέρες επώασης CONTROL ΠΥΚΝΟ 125000ppm 1250ppm 125ppm 12.5ppm 1.25ppm Oι μικρότερες συγκεντρώσεις προκάλεσαν διέγερση της ανάπτυξης του μύκητα όλες τις ημέρες επώασης (2,62-34,67% )
ΜΕΛΕΤΗ ΜΥΚΗΛΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ 10 ml YES + 100 κονίδια + εκχυλίσματα τροφίμων σε συγκεκριμένες αραιώσεις Επώαση για 7 ημέρες στους 30 ο C Αποστείρωση στους 115 ο C για 30 min Προσθήκη 30 ml MeOH και ανάδευση για 10 min Εκχύλιση Ξήρανση μυκηλίου στους 100 ο C για 24h Ζύγιση μυκηλίων
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΥΚΗΛΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΟΥ Α.PARASITICUS ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ YES ΕΠΕΙΤΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΑΓΚΙΝΑΡΑ AΓΡΙΑΓΚΙΝΑΡΑ Μυκηλιακή Μάζα (g) 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 Μυκηλιακή Μάζα (g) 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 Α 2500ppm (200 μl) A 6250ppm (500μL) control GOJI BERRY 0.000 1000ppm 300ppm control ΡΙΓΑΝΗ Μυκηλιακή Μάζα (g) 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 1250ppm 2500ppm control ΡΟΔΙ 0.250 Μυκηλιακή Μάζα (g) 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 500ppm 1250ppm control Μυκηλιακή Μάζα (g) 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 1250ppm 2500ppm control
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΥΚΗΛΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΟΥ Α.PARASITICUS ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ YES ΕΠΕΙΤΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ Το εκχύλισμα της ρίγανης συγκέντρωσης 1250ppm προκάλεσε μείωση της μυκηλιακής μάζας του A.parasiticus σε θρεπτικό υλικό YES κατά 55%. Το εκχύλισμα αγριαγκινάρας συγκέντρωσης 1000ppm προκάλεσε μείωση της μυκηλιακής μάζας του A.parasiticus σε θρεπτικό υλικό YES κατά 40%. Ενώ το εκχύλισμα goji berry συγκέντρωσης 2500ppm προκάλεσε αύξηση της μυκηλιακής μάζας κατά 36,5%.
ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ στις πολύ μεγάλες αραιώσεις των εκχυλισμάτων ο μύκητας ενδέχεται να χρησιμοποιεί τα συστατικά του εκχυλίσματος προς όφελος του. ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ εξαρτάται από την συγκέντρωσης των εκχυλισμάτων & τη σύσταση του εκάστοτε προϊόντος που επηρεάζει και επεμβαίνει στις φυσιολογικές λειτουργίες και στο μεταβολισμό του μύκητα.
ΤΕΛΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Από τα προϊόντα που εξετάστηκαν διαπιστώθηκε ότι τα εκχυλίσματα της ρίγανης (66%) της αγκινάρας (64%) και της αγριαγκινάρας (46%) προκάλεσαν τη μεγαλύτερη αναστολή σε όλες τις συγκεντρώσεις. Τα εκχυλίσματα του goji berry (18%) και του ροδιού (37%) παρουσίασαν μικρότερα ποσοστά αναστολής και μόνο στις μεγάλες συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων τους.
Τα αποτελέσματα της επίδρασης των εκχυλισμάτων στην ανάπτυξη του μύκητα μπορεί είναι ανεξάρτητα της παραγωγής ΑΦΒ1. Ενδέχεται η αναστολή της παραγωγής της ΑΦΒ1 να είναι σημαντικά μεγαλύτερη της αναστολής της ανάπτυξης του μύκητα, όπως ήδη έχουμε διαπιστώσει σε μελέτη της αντι-αφλατοξινογόνου δράσης της αγριαγκινάρας, όπου η παραγωγή της ΑΦΒ1 μειώθηκε κατά 99,4%.
ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ Με αφορμή τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας αλλά και άλλων ερευνητικών δεδομένων από την βιβλιογραφία προτείνεται να γίνει μια προσπάθεια εκμετάλλευσης των αγροτικών προϊόντων που προσφέρει η ελληνική χλωρίδα. Χρησιμοποίηση ως προστατευτικό των καλλιεργειών από τους αφλατοξινογόνους μύκητες, αντί των τοξικών φυτοφαρμάκων. Χρησιμοποίηση ως προστατευτικό των τροφίμων κατά την διάρκεια της αποθήκευσης για να αποτραπεί η ανάπτυξη αφλατοξινογόνων μυκήτων και κατ επέκταση η παραγωγή αφλατοξινών στα βιομηχανοποιημένα τρόφιμα.