COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, version 2.0

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, version 2.0 ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HI2CAP 48 Tests P/N: 05212294 190 HIV-1 Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 Wash Reagent ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HΙV-1 Test, έκδοση 2.0 (v2.0) είναι μια in vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ποσοτικοποίηση του RNA του Ιού Ανοσοανεπάρκειας του Ανθρώπου Τύπου 1 (HIV-1) στο ανθρώπινο πλάσμα, με τη χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου για την αυτόματη επεξεργασία δειγμάτων και τη χρήση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για την αυτόματη ενίσχυση και ανίχνευση. Με την εξέταση μπορεί να εκτελεστεί ποσοτικοποίηση του HIV-1 RNA σε εύρος 20-10.000.000 αντιγράφων/ml (33 έως 1,67 x 10 7 Διεθνείς Μονάδες/mL). Ένα αντίγραφο HIV-1 RNA ισοδυναμεί με 1,67 Διεθνείς Μονάδες (IU), βάσει του 1 ου Διεθνούς Προτύπου του ΠΟΥ σχετικά με το HIV-1 RNA για Τεχνικές με Βάση τα Νουκλεϊκά Οξέα (NAT) (NIBSC 97/656) 36. Η εξέταση προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με κλινική παρουσίαση και με άλλους εργαστηριακούς δείκτες εξέλιξης της νόσου για την κλινική αντιμετώπιση ασθενών που έχουν προσβληθεί από τον ιό HIV-1 ομάδας Μ και από τον ιό HIV-1 ομάδας Ο. Η εξέταση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της πρόγνωσης του ασθενή με τη μέτρηση του αρχικού επιπέδου HIV-1 RNA ή για την παρακολούθηση των αποτελεσμάτων της αντιρετροϊικής θεραπείας με τη μέτρηση των μεταβολών στα επίπεδα HIV-1 RNA στο πλάσμα EDTA κατά τη διάρκεια της αντιρετροϊικής θεραπείας. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 δεν προορίζεται για χρήση ως τεστ ελέγχου (screening test) σε αίμα ή παράγωγα αίματος για την παρουσία HIV-1 ή ως διαγνωστική εξέταση για την επιβεβαίωση της παρουσίας μόλυνσης HIV-1. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Ο Ιός Ανοσοανεπάρκειας του Ανθρώπου (HIV) είναι ο αιτιολογικός παράγοντας του Συνδρόμου Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας (AIDS) 1-3. Η μόλυνση από το HIV μπορεί να μεταδοθεί με τη σεξουαλική επαφή, με την έκθεση σε μολυσμένο αίμα ή προϊόντα αίματος ή από μητέρα που έχει μολυνθεί στο έμβρυο 4. Μέσα σε τρεις έως έξι εβδομάδες από την έκθεση στον ιό HIV, τα άτομα που έχουν μολυνθεί εμφανίζουν συνήθως ένα σύντομο, οξύ σύνδρομο, που χαρακτηρίζεται από συμπτώματα παρόμοια με της γρίπης και συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα ιαιμίας στο περιφερικό αίμα 5-8. Στα περισσότερα άτομα που έχουν μολυνθεί, μετά από αυτό το σύμπτωμα ακολουθεί μια ανοσοαπάντηση στο HIV και υποχώρηση της ιαιμίας του πλάσματος, συνήθως εντός τεσσάρων με έξι εβδομάδων από την εμφάνιση των συμπτωμάτων 9,10. Μετά την ορομετατροπή, τα άτομα που έχουν μολυνθεί εισέρχονται συνήθως σε μια κλινικά σταθερή, ασυμπτωματική φάση, που μπορεί να διαρκέσει για πολλά χρόνια 11-13. Η ασυμπτωματική περίοδος χαρακτηρίζεται από επίμονη, χαμηλού βαθμού ιαιμία του πλάσματος 14 και βαθμιαία ελάττωση των CD4 + TΙ λεμφοκυττάρων, που οδηγεί σε σοβαρή ανοσοανεπάρκεια, πολλαπλές ευκαιριακές μολύνσεις, κακοήθειες και θάνατο 15. Παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα του ιού στο περιφερικό αίμα είναι σχετικά χαμηλά κατά τη διάρκεια της ασυμπτωματικής φάσης της μόλυνσης, ο αναδιπλασιασμός και η κάθαρση του ιού εμφανίζονται ως δυναμικές διαδικασίες, κατά τις οποίες οι υψηλοί βαθμοί παραγωγής ιού και μόλυνσης των CD4 + κυττάρων αντισταθμίζονται από εξίσου υψηλά επίπεδα κάθαρσης του ιού, θανάτου των μολυνθέντων κυττάρων και ανανέωσης των CD4 + κυττάρων, που οδηγούν σε σχετικά σταθερά επίπεδα, τόσο της ιαιμίας του πλάσματος όσο και των CD4 + κυττάρων 16-18. Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου. 05447925001-07EL 1 Doc Rev. 8.0

Οι ποσοτικές μετρήσεις της ιαιμίας HIV στο περιφερικό αίμα απέδειξαν ότι τα υψηλότερα επίπεδα ιού μπορούν να συσχετιστούν με αυξημένο κίνδυνο κλινικής εξέλιξης της νόσου HIV και ότι τα μειωμένα επίπεδα ιού στο πλάσμα μπορούν να συσχετιστούν με μειωμένο κίνδυνο κλινικής εξέλιξης 19-21. Τα επίπεδα του ιού στο περιφερικό αίμα μπορούν να προσδιοριστούν ποσοτικά με τη μέτρηση του αντιγόνου HIV p24 στον ορό, με την ποσοτική καλλιέργεια του HIV από το πλάσμα ή με άμεση μέτρηση του ιικού RNA στο πλάσμα με τη χρήση τεχνικών ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος ή ενίσχυσης σήματος 22-26. Το p24 αντιγόνο είναι η βασική πυρηνική πρωτεΐνη του HIV και εμφανίζεται στον ορό είτε ελεύθερη, είτε δεσμευμένη με αντι-p24 αντίσωμα. Το ελεύθερο p24 αντιγόνο μπορεί να μετρηθεί με ενζυμοανοσοαναλύσεις (ΕΙΑ) που διατίθενται στο εμπόριο, παρά το γεγονός ότι η χρησιμότητα του p24 αντιγόνου ως δείκτη ιικού φορτίου είναι περιορισμένη, καθώς το αντιγόνο είναι ανιχνεύσιμο μόνο στο 20% των ασυμπτωματικών ασθενών και στο 40-50% των συμπτωματικών. Οι διαδικασίες για το διαχωρισμό των συμπλόκων αντιγόνου-αντισώματος βελτιώνουν την ευαισθησία των εξετάσεων p24 αντιγόνου, αλλά η πρωτεΐνη του ιού παραμένει μη ανιχνεύσιμη στους περισσότερους ασυμπτωματικούς ασθενείς 22. Ο μολυσματικός HIV στο πλάσμα μπορεί να καλλιεργηθεί με ενοφθαλμισμό σε ενεργοποιημένα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC) από φυσιολογικούς δότες. Η ποσοτικοποίηση επιτυγχάνεται με τον ενοφθαλμισμό των PBMC με διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος του πλάσματος. Η ποσοτική καλλιέργεια έχει περιορισμένη εφαρμογή για την παρακολούθηση των επιπέδων του ιού σε άτομα που έχουν μολυνθεί, καθώς μόνο ένα μικρό ποσοστό των σωματιδίων του ιού είναι μολυσματικό in vitro. Ο μολυσματικός ιός συχνά είναι μη ανιχνεύσιμος σε ασυμπτωματικά άτομα 22. Το HΙV RNA στο πλάσμα μπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά με τεχνικές ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος, όπως είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 27-29. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 χρησιμοποιεί την τεχνολογία PCR για την επίτευξη της μέγιστης ευαισθησίας και δυναμικού εύρους για την ποσοτική ανίχνευση του HIV-1 RNA σε πλάσμα με αντιπηκτικό EDTA. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 είναι μία εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ποσοτικοποίηση του RNA του Ιού Ανοσοανεπάρκειας του Ανθρώπου Τύπου 1 (HIV-1) στο ανθρώπινο πλάσμα. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 βασίζεται σε τρεις κύριες διαδικασίες: (1) στην προετοιμασία δειγμάτων για την απομόνωση του HIV-1 RNA, (2) στην αντίστροφη μεταγραφή του RNA στόχου για τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cdna) και (3) στην ταυτόχρονη ενίσχυση PCR του cdna στόχου και την ανίχνευση διασπώμενου διπλά επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη ανίχνευσης ειδικό για το στόχο. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 επιτρέπει την αυτοματοποιημένη προετοιμασία δειγμάτων συνοδευόμενη από αυτοματοποιημένη αντίστροφη μεταγραφή, ενίσχυση PCR και ανίχνευση του RNA στόχου του HIV-1 και του Armored RNA Πρότυπου Ποσοτικοποίησης του HIV-1. Το αντιδραστήριο Κυρίου Μίγματος περιέχει εκκινητές και ιχνηθέτες ειδικούς για το HIV-1 RNA και για το RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1. Το Κύριο Μίγμα έχει αναπτυχθεί για τη διασφάλιση της ισοδύναμης ποσοτικοποίησης των υποτύπων HΙV 1 ομάδας Μ και HIV-1 ομάδας Ο. Η ανίχνευση του ενισχυμένου DNA εκτελείται με ειδικούς για το στόχο και για το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης διπλά επισημασμένους ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες που επιτρέπουν την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του κλώνου (amplicon) HΙV-1 και του κλώνου (amplicon) Πρότυπου Ποσοτικοποίησης HIV-1. Η ποσοτικοποίηση του ιικού RNA του HIV-1 εκτελείται με τη χρήση του Πρότυπου Ποσοτικοποίησης HIV-1. Αντισταθμίζει τυχόν φαινόμενα αναστολής και ελέγχει τις διαδικασίες προετοιμασίας και ενίσχυσης, επιτρέποντας ακριβέστερο ποσοτικό προσδιορισμό του HIV-1 RNA σε κάθε δείγμα. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HIV-1 είναι μια μη μολυσματική σύνθεση Armored RNA που περιέχει αλληλουχίες HIV με τις ίδιες ακριβώς περιοχές δέσμευσης εκκινητή με το RNA-στόχο του HIV-1 και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη που επιτρέπει το διαχωρισμό του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HΙV-1 από τον κλώνο (amplicon) στόχο HΙV-1. 05447925001-07EL 2 Doc Rev. 8.0

Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HIV-1 προστίθεται σε κάθε δείγμα σε γνωστό αριθμό αντιγράφων και μεταφέρεται μέσω διαδοχικών βημάτων προετοιμασίας δειγμάτων, αντίστροφης μεταγραφής, ταυτόχρονης ενίσχυσης PCR και ανίχνευσης διπλά επισημασμένων διασπώμενων ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών ανίχνευσης. Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής υπολογίζει τη συγκέντρωση HIV-1 RNA στα δείγματα εξέτασης συγκρίνοντας το σήμα HIV-1 με το σήμα Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. Επιλογή Στόχου Η επιλογή της αλληλουχίας του RNA-στόχου για το HIV-1 εξαρτάται από την ταυτοποίηση των περιοχών εντός του γονιδιώματος HIV-1 που επιδεικνύουν μέγιστο βαθμό διατήρησης αλληλουχίας μεταξύ των διάφορων υποτύπων HΙV-1 ομάδας Μ και δειγμάτων HIV-1 ομάδας Ο. Για την αναφορά στην υψηλή γενετική μεταβλητότητα του ιού, επιλέγονται ταυτόχρονα δύο περιοχές από το γονιδίωμα του HIV για ενίσχυση και ανίχνευση με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0. Δύο ειδικοί για το στόχο και ένας ειδικός για το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης διπλά επισημασμένοι ολιγονουκλεοτιδικοί ιχνηθέτες επιτρέπουν την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του κλώνου (amplicon) HIV-1 και του κλώνου (amplicon) Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1. Αντίστοιχα, η κατάλληλη επιλογή εκκινητών και διπλά επισημασμένων ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών είναι ιδιαίτερα σημαντική για την επίτευξη ενίσχυσης και ανίχνευσης των υποτύπων HΙV-1 ομάδας Μ και των υποτύπων HΙV-1 ομάδας Ο κατά την εξέταση. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 χρησιμοποιεί αντίστροφη μεταγραφή και εκκινητές ενίσχυσης PCR που καθορίζουν αλληλουχίες μέσα στις περιοχές υψηλής διατήρησης του γονιδίου gag 32 του HIV-1 και της περιοχής LTR του HIV-1. Προετοιμασία Δείγματος Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 χρησιμοποιεί αυτοματοποιημένη προετοιμασία δείγματος στο COBAS AmpliPrep Όργανο με γενική τεχνική δέσμευσης σε βάση πυριτίου (generic silica-based capture technique). Η διαδικασία επεξεργάζεται 850 µl πλάσματος. Πραγματοποιείται λύση των σωματιδίων του ιού HIV-1 μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει νουκλεϊκά οξέα και προστατεύει το απελευθερωμένο HIV-1 RNA από Rnase στο πλάσμα. Σε κάθε δείγμα εισάγεται πρωτεάση και γνωστός αριθμός μορίων Armored RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 με το αντιδραστήριο λύσης και τα μαγνητικά σωματίδια γυαλιού. Στη συνέχεια, το μίγμα επωάζεται και το HIV-1 RNA και το RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 δεσμεύονται στην επιφάνεια των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού. Οι αδέσμευτες ουσίες όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ακαθαρσίες, απομακρύνονται με την πλύση των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού. Μετά το διαχωρισμό των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού και την ολοκλήρωση των βημάτων πλύσης, τα νουκλεϊκά οξέα που προσροφήθηκαν εκλούονται με υδατικό διάλυμα σε υψηλή θερμοκρασία. Το επεξεργασμένο δείγμα, που περιέχει τα μαγνητικά σωματίδια γυαλιού καθώς και το απελευθερωμένο HIV-1 RNA και το RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1, προστίθεται στο μίγμα ενίσχυσης και μεταφέρεται στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Το RNA στόχος του HIV-1 και το RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 υπόκεινται στη διαδικασία αντίστροφης μεταγραφής, ενίσχυσης και ταυτόχρονης ανίχνευσης με τη σχάση δύο ειδικών για το στόχο και ενός ειδικού για το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης διπλά επισημασμένων ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών. 05447925001-07EL 3 Doc Rev. 8.0

Αντίστροφη Μεταγραφή και Ενίσχυση PCR Η αντίστροφη μεταγραφή και η αντίδραση ενίσχυσης PCR εκτελείται με το θερμοσταθερό ανασυνδυασμένο ένζυμο Thermus specie Z05 DNA Πολυμεράσης (Z05). Παρουσία μαγγανίου (Mn 2+ ) και με κατάλληλες συνθήκες ρυθμιστικού διαλύματος, το Z05 παρουσιάζει δραστηριότητα αντίστροφης τρανσκριπτάσης και DNA πολυμεράσης 30,31. Έτσι, είναι δυνατή η πραγματοποίηση αντίστροφης μεταγραφής και ενίσχυσης PCR παράλληλα με την ανίχνευση του κλώνου (amplicon) σε πραγματικό χρόνο. Τα δείγματα που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης (K-tubes), στα οποία πραγματοποιείται αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση PCR. Το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται για να επιτρέψει στους αντινοηματικούς εκκινητές να υβριδιστούν ειδικά με το RNA-στόχο του HIV-1 και το RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης του HIV-1. Παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps), στους οποίους περιλαμβάνονται η τριφωσφορική δεοξυαδενοσίνη, δεοξυγουανοσίνη, δεοξυκυτιδίνη, δεοξυουριδίνη και δεοξυθυμιδίνη, η πολυμεράση Z05 επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές σχηματίζοντας κλώνους DNA συμπληρωματικούς προς το RNA-στόχο. Ενίσχυση Στόχου Τα δείγματα που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης (Κ-tubes), στα οποία πραγματοποιείται ενίσχυση PCR. Μετά την αντίστροφη μεταγραφή του RNA στόχου του HIV-1 και του RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης του HIV-1 ο Θερμοκυκλοποιητής στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή θερμαίνει το μίγμα αντίδρασης για την αποδιάταξη των υβριδίων RNA:cDNA και την έκθεση των ειδικών αλληλουχιών στόχου εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές υβριδίζονται στο DNA στόχο. Η πολυμεράση Ζ05, παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps), στους οποίους περιλαμβάνονται η τριφωσφορική δεοξυαδενοσίνη, δεοξυγουανοσίνη, δεοξυκυτιδίνη, δεοξυουριδίνη και δεοξυθυμιδίνη, επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος του προτύπου-στόχου σχηματίζοντας μόρια δίκλωνου DNA που ονομάζονται κλώνοι (amplicon). Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους προορίζεται για το διπλασιασμό του DNA κλώνου (amplicon). Ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων προγραμματίζεται εκ των προτέρων στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στις δύο περιοχές του γονιδιώματος HIV-1 μεταξύ των εκκινητών. Δεν πραγματοποιείται ενίσχυση σε ολόκληρο το γονιδίωμα HIV-1. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος-στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται στο COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη-nγλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη 33, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης ως ενός από τα dntps του αντιδραστηρίου Κύριου Μίγματος. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. Επίσης, οποιοδήποτε μη ειδικό προϊόν που σχηματίζεται μετά την αρχική ενεργοποίηση του Κύριου Μίγματος από μαγγάνιο καταστρέφεται από το ένζυμο AmpErase. To ένζυμο AmpErase, που περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος, καταλύει τη σχάση του DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη στα ιζήματα της δεοξυουριδίνης ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase παραμένει αδρανές για παρατεταμένο χρονικό διάστημα μόλις εκτεθεί σε θερμοκρασίες πάνω από 55 C, δηλαδή σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης και για το λόγο αυτόν δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon) στόχο που δημιουργείται κατά την ενίσχυση. 05447925001-07EL 4 Doc Rev. 8.0

Ανίχνευση Προϊόντων PCR σε COBAS TaqMan Test Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου (real time PCR) 34,35. Η χρήση ιχνηθετών με διπλή φθορίζουσα επισήμανση επιτρέπει την ανίχνευση της συσσώρευσης προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο παρακολουθώντας την ένταση εκπομπής των φθοριζουσών χρωστικών αναφορέα (reporter) που απελευθερώνονται κατά τη διαδικασία της ενίσχυσης. Οι ιχνηθέτες αποτελούνται από ειδικούς για το HIV-1 και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HIV-1 ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες με χρωστική αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher). Στο COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 οι ιχνηθέτες HIV-1 και Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 επισημαίνονται με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές αναφορέα (reporter). Όταν αυτοί οι ιχνηθέτες είναι ανέπαφοι, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) καταστέλλεται από την εγγύτητα της χρωστικής παρεμποδιστή (quencher), λόγω των φαινομένων μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. Κατά τη διάρκεια της PCR, ο ιχνηθέτης υβριδίζεται σε μια αλληλουχία στόχο και διασπάται από την 5' 3' δραστηριότητα νουκλεάσης της θερμοσταθερής Z05 DNA πολυμεράσης. Μόλις απελευθερωθούν και αποχωριστούν οι χρωστικές αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher), δεν πραγματοποιείται πλέον παρεμπόδιση και η φθορίζουσα δραστηριότητα της χρωστικής αναφορέα (reporter) αυξάνεται. Η ενίσχυση του HIV-1 RNA και του RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 μετρούνται ανεξάρτητα σε διαφορετικά μήκη κύματος. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης εκπομπής των μεμονωμένων χρωστικών αναφορέα (reporter), επιτρέποντας την ξεχωριστή ταυτοποίηση του HIV-1 RNA και του RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1. Ο κύκλος PCR, όπου η αρχή της καμπύλης αύξησης παρουσιάζει εκθετική αύξηση, σχετίζεται με την ποσότητα του υλικού εκκίνησης κατά την έναρξη της PCR. Βασικά στοιχεία Ποσοτικοποίησης του COBAS TaqMan Test Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 αποτελεί από τη φύση του ποσοτική εξέταση με ιδιαίτερα ευρύ δυναμικό εύρος εφόσον η παρακολούθηση του κλώνου (amplicon) διεξάγεται κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της ενίσχυσης. Όσο υψηλότερος είναι ο τίτλος HIV-1 ενός δείγματος, τόσο συντομότερα ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) των ιχνηθετών HIV-1 υπερβαίνει το αρχικό επίπεδο φθορισμού (βλέπε Σχήμα 1). Εφόσον το ποσοστό RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 είναι σταθερό σε όλα τα δείγματα, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) του ιχνηθέτη Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 θα πρέπει να εμφανίζεται στον ίδιο κύκλο για όλα τα δείγματα (βλέπε Σχήμα 2). Σε δείγματα, στα οποία επηρεάζεται ο φθορισμός Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS), η συγκέντρωση ρυθμίζεται ανάλογα. Η εμφάνιση των συγκεκριμένων σημάτων φθορισμού αναφέρεται ως κρίσιμη τιμή κατωφλίου (Ct). Η κρίσιμη τιμή κατωφλίου (Ct) ορίζεται ως ο κλασματικός αριθμός κύκλων, όπου ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) υπερβαίνει την προκαθορισμένη τιμή κατωφλίου (Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού) και ξεκινά τη φάση εκθετικής αύξησης του σήματος αυτού (βλέπε Σχήμα 3). Μια υψηλότερη κρίσιμη τιμή κατωφλίου Ct υποδεικνύει χαμηλότερο τίτλο αρχικού υλικού στόχου HIV-1. Η διπλάσια αύξηση του τίτλου συσχετίζεται με μείωση 1 Ct για το HIV-1 RNA στόχο, ενώ δεκαπλάσια αύξηση του τίτλου συσχετίζεται με μείωση 3,3 Ct. Στο Σχήμα 1 απεικονίζονται οι καμπύλες αύξησης στόχου για μια σειρά αραιώσεων που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του ιού, οι καμπύλες αύξησης μετατοπίζονται σε προηγούμενους κύκλους. Για το λόγο αυτό, η τέρμα αριστερή καμπύλη αύξησης αντιστοιχεί στο υψηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου, ενώ η τέρμα δεξιά καμπύλη αύξησης αντιστοιχεί στο χαμηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου. 05447925001-07EL 5 Doc Rev. 8.0

Σχήμα 1 Καμπύλες αύξησης στόχου για μια σειρά αραιώσεων που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10 Ομαλοποιημένος Φθορισμός 10 5 Υψηλότερος Τίτλος Χαμηλότερος Τίτλος 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Αριθμός Κύκλου Στο Σχήμα 2 απεικονίζονται οι καμπύλες αύξησης Προτύπου Ποσοτικοποίησης για δείγματα ιικής σειράς αραιώσεων που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10. Η ποσότητα του Προτύπου Ποσοτικοποίησης που προστίθεται σε κάθε δείγμα είναι σταθερή για κάθε αντίδραση. Η τιμή κατωφλίου Ct του Προτύπου Ποσοτικοποίησης είναι ίδια, ανεξάρτητα από τον ιικό τίτλο. Σχήμα 2 Καμπύλες αύξησης Προτύπου Ποσοτικοποίησης για μια σειρά αραιώσεων που κυμαίνονται σε εύρος 5-Log 10 50 40 Ομαλοποιημένος Φθορισμός 30 20 10 Χαμηλότερος Τίτλος Υψηλότερος Τίτλος 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Αριθμός Κύκλου Στο Σχήμα 3 απεικονίζεται ένα παράδειγμα του τρόπου ομαλοποίησης των τιμών φθορισμού κάθε κύκλου για κάθε καμπύλη αύξησης. Ο κλασματικός αριθμός κύκλων (Ct) υπολογίζεται στο σημείο τομής του σήματος φθορισμού με το Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού. 05447925001-07EL 6 Doc Rev. 8.0

Σχήμα 3 Ομαλοποίηση τιμών φθορισμού σε κάθε κύκλο για κάθε καμπύλη αύξησης 1,0 0,8 Ομαλοποιημένος Φθορισμός 0,6 0,4 0,2 0,0 Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού Τιμή Ct = 28,2 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31-0,2 Ποσοτικοποίηση HIV-1 RNA Αριθμός Κύκλου Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 προσδιορίζει ποσοτικά το ιικό RNA του HIV-1 χρησιμοποιώντας μια δεύτερη αλληλουχία στόχου (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HIV-1), η οποία προστίθεται σε κάθε δείγμα εξέτασης σε γνωστή συγκέντρωση. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HIV-1 είναι μια μη μολυσματική σύνθεση Armored RNA που περιέχει τμήματα αλληλουχιών HIV-1 με περιοχές δέσμευσης ιχνηθέτη ίδιες με εκείνες της αλληλουχίας στόχου gag του HIV-1. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HIV-1 περιέχει περιοχές δέσμευσης εκκινητή HIV-1 και δημιουργεί ένα προϊόν ενίσχυσης με ίδιο μήκος και ίδια σύνθεση βάσεων όπως το RNA στόχο gag του HIV-1. Η περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη ανίχνευσης του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 έχει τροποποιηθεί για τη διαφοροποίηση του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 από τον κλώνο (amplicon) στόχου gag του HIV-1. Κατά τη διάρκεια της φάσης υβριδισμού της PCR στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τα δείγματα εκτίθενται σε φως και διεγείρονται από φιλτραρισμένο φως, ενώ συλλέγονται φιλτραρισμένα δεδομένα φθορισμού εκπομπής για κάθε δείγμα. Στη συνέχεια, οι τιμές κάθε δείγματος διορθώνονται για τυχόν διακυμάνσεις που προκύπτουν από το όργανο. Αυτές οι τιμές φθορισμού αποστέλλονται από το όργανο στο AMPLILINK λογισμικό και αποθηκεύονται σε βάση δεδομένων. Εκτελούνται προέλεγχοι για να καθοριστεί αν τα δεδομένα του HIV-1 RNA και του RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1 αντιπροσωπεύουν έγκυρα σετ και το σύστημα δημιουργεί ενδείξεις όταν τα δεδομένα βρίσκονται εκτός των προκαθορισμένων ορίων. Μετά την επιτυχή ολοκλήρωση όλων των προελέγχων, οι τιμές φθορισμού υποβάλλονται σε επεξεργασία για τη δημιουργία κρίσιμων τιμών κατωφλίου (Ct) για το HIV-1 RNA και το RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1. Οι ειδικές για την παρτίδα σταθερές βαθμονόμησης που παρέχονται με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της τιμής τίτλου για τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου με βάση τις κρίσιμες τιμές κατωφλίου (Ct) HIV-1 RNA και RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HIV-1. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 προτυποποιείται με βάση το 1 ο Διεθνές Πρότυπο του ΠΟΥ σχετικά με το HIV-1 RNA για Τεχνικές με Βάση τα Νουκλεϊκά Οξέα (ΝΑΤ) (κωδικός NIBSC 97/656) 36. Τα αποτελέσματα των τίτλων εκφράζονται σε αντίγραφα/ml (cp/ml) ή σε Διεθνείς Μονάδες/mL (IU/mL). Ο συντελεστής μετατροπής μεταξύ των αναφερόμενων HIV-1 RNA αντιγράφων/ml και HIV-1 Διεθνών Μονάδων/mL έχει προσδιοριστεί από την Roche Molecular Systems, Inc. σε 0,6 cp/iu (1,67 IU/cp). 05447925001-07EL 7 Doc Rev. 8.0

ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 (P/N: 05212294 190) HIV-1 v2.0 CS1 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Μαγνητικών Σωματιδίων Γυαλιού HIV-1) Μαγνητικά σωματίδια γυαλιού 93% Ισοπροπανόλη Xi 93% (w/w) Ισοπροπανόλη HI2CAP 48 Εξετάσεις 1 x 48 Εξετάσεις Ερεθιστικό F 93% (w/w) Ισοπροπανόλη Πολύ εύφλεκτο HIV-1 v2.0 CS2 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Λύσης HIV-1) Κιτρικό νάτριο διένυδρο 42,5% Θειοκυανική γουανιδίνη < 14% Πολυδοκανόλη 0,9% Διθειεθρυτόλη Xn 42,5% (w/w) Θειοκυανική γουανιδίνη 1 x 48 Εξετάσεις Επιβλαβές N < 14% (w/w) Πολυδοκανόλη Επικίνδυνο για το περιβάλλον HIV-1 v2.0 CS3 Κασέτα Πολλαπλού Αντιδραστηρίου HIV-1 που περιέχει: Pase (Διάλυμα Πρωτεϊνάσης) Ρυθμιστικό διάλυμα Tris < 0,05% EDTA Χλωριούχο ασβέστιο Οξικό ασβέστιο 7,8% Πρωτεϊνάση Γλυκερόλη Xn 7,8% (w/w) Πρωτεϊνάση 1 x 48 Εξετάσεις 1 x 3,8 ml Επιβλαβές 05447925001-07EL 8 Doc Rev. 8.0

EB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης) Ρυθμιστικό διάλυμα με βάση tris 0,2% Μεθυλπαραμπένη HIV-1 v2.0 CS4 Κασέτα Αντιδραστηρίου ειδική για την εξέταση HIV-1 που περιέχει: HIV-1 QS (Πρότυπο ποσοτικοποίησης HIV-1) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) < 0,001% Σύνθεση Armored HIV-1 RNA που περιέχει αλληλουχίες δέσμευσης εκκινητή HIV-1 και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη (μη μολυσματικό RNA σε βακτηριοφάγο MS2) 0,05% Αζίδιο του νατρίου HIV-1 MMX (HIV-1 Κύριο Μίγμα) Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine Οξικό κάλιο Υδροξείδιο του καλίου 20% Διμεθυλοσουλφοξείδιο Γλυκερόλη < 0,04% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,003% Νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές στην περιοχή gag και LTR του HIV-1 < 0,003% Ολιγονουκλεοτιδική απταμέρη < 0,003% Ειδικοί για το HIV-1 και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HIV-1 ολιγονουκλεοτιδικοί ιχνηθέτες με φθορίζουσα επισήμανση < 0,05% Z05 DNA Πολυμεράσης (μικροβιακό) < 0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) 0,09% Αζίδιο του νατρίου CAP/CTM Mn 2+ (CAP/CTM Διάλυμα Μαγγανίου) < 0,5% Οξικό μαγγάνιο Παγόμορφο οξικό οξύ 0,09% Αζίδιο του νατρίου HIV-1 H(+)C, v2.0 (Θετικός Ορός Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης HIV-1, v2.0) < 0,001% Σύνθεση Armored HIV-1 RNA που περιέχει αλληλουχίες HIV-1 (μη μολυσματικό RNA σε βακτηριοφάγο MS2) Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης 1 x 7,0 ml 1 x 48 Εξετάσεις 1 x 3,6 ml 1 x 2,5 ml 1 x 19,8 ml 4 x 1,0 ml Ερεθιστικό R36/38: Ερεθίζει τα μάτια και το δέρμα. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρμα. 05447925001-07EL 9 Doc Rev. 8.0

HIV-1 L(+)C, v2.0 (Θετικός Ορός Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης HIV-1, v2.0) < 0,001% Σύνθεση Armored HIV-1 RNA που περιέχει αλληλουχίες HIV-1 (μη μολυσματικό RNA σε βακτηριοφάγο MS2) Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης 4 x 1,0 ml Ερεθιστικό R36/38: Ερεθίζει τα μάτια και το δέρμα. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρμα. CTM ( ) C [COBAS TaqMan Αρνητικός Ορός Ελέγχου (Ανθρώπινο Πλάσμα)] Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης 4 x 1,0 ml Ερεθιστικό R36/38: Ερεθίζει τα μάτια και το δέρμα. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρμα. HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης HIV-1, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης HIV-1, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Αρνητικού Ορού Ελέγχου HIV-1, v2.0) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης (P/N: 03587797 190) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης) Κιτρικό νάτριο διένυδρο < 0,1% N-μεθυλισοθειαζολόνη-HCl PG WR 1 x 4 Κλιπ 1 x 4 Κλιπ 1 x 4 Κλιπ 1 x 5,1 L 05447925001-07EL 10 Doc Rev. 8.0

ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. B. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση με ανθρώπινο πλάσμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA. C. Μην εκτελείτε αναρρόφηση με πιπέτα από το στόμα. D. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια μίας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγματα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. E. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και ριβονουκλεάση όταν αφαιρείτε τα κλάσματα δείγματος από τις φιάλες ορών ελέγχου. F. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μίας χρήσης με ακροφύσια χωρίς RNase. G. Μη συγκεντρώνετε ορούς ελέγχου από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικές φιάλες της ίδιας παρτίδας. H. Μην αναμιγνύετε κασέτες αντιδραστηρίων ή ορούς ελέγχου από διαφορετικά κιτ. I. Μην ανοίγετε τις κασέτες COBAS AmpliPrep και μην αλλάζετε, αναμιγνύετε, αφαιρείτε ή προσθέτετε φιάλες. J. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριμμάτων και των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. K. Μη χρησιμοποιείτε κιτ μετά την ημερομηνία λήξης τους. L. Διατίθενται Δελτία Δεδομένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) κατόπιν ζήτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche. M. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να πραγματοποιείται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως εκείνες που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 38. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. Σημείωση: Τα οικιακά υγρά λευκαντικά που διατίθενται στο εμπόριο περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Με την αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγεται διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. N. ΠΡΟΣΟΧΗ: Τα CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 και HIV-1 H(+)C, v2.0 περιέχουν Ανθρώπινο Πλάσμα που προέρχεται από ανθρώπινο αίμα. Το υλικό προέλευσης έχει ελεγχθεί και έχει βρεθεί ότι δεν αντιδρά υπό την παρουσία αντιγόνου επιφανείας ηπατίτιδας Β (HBsAg), αντισωμάτων HIV-1/2 και HCV και HIV p24 αντιγόνου. Η εξέταση του αρνητικού ανθρώπινου πλάσματος με τις μεθόδους PCR δεν έδειξε ανιχνεύσιμο HIV-1 RNA, HCV RNA ή HBV DNA. Καμία γνωστή μέθοδος εξέτασης δεν διασφαλίζει απόλυτα ότι τα παράγωγα που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα δεν μεταδίδουν μολυσματικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό, όλα τα υλικά ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρούνται εν δυνάμει μολυσματικά. Τα CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 και HIV-1 H(+)C, v2.0 πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να πραγματοποιείται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως εκείνες που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 38. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. 05447925001-07EL 11 Doc Rev. 8.0

O. Τα HIV-1 QS, CAP/CTM Mn 2+ και HIV-1 MMX περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Κατά την απόρριψη διαλυμάτων που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφευχθεί ο σχηματισμός αζιδίου. P. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Αποφεύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Αν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Αν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε με νερό πριν τις σκουπίσετε. Q. Μην επιτρέπετε την επαφή του HIV-1 v2.0 CS2 και των υγρών αποβλήτων από το COBAS AmpliPrep Όργανο που περιέχουν θειοκυανική γουανιδίνη, με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικού). Τα μίγματα αυτά μπορεί να παράγουν ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. R. Κατά την απόρριψη χρησιμοποιημένων Μονάδων Επεξεργασίας Δειγμάτων (SPUs) του COBAS AmpliPrep που περιέχουν θειοκυανική γουανιδίνη, αποφεύγετε οποιαδήποτε επαφή με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικό). Τα μίγματα αυτά μπορεί να παράγουν ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ A. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια ή τους ορούς ελέγχου. B. Αποθηκεύετε τα HIV-1 v2.0 CS1, HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 και HIV-1 v2.0 CS4 στους 2-8 C. Τα αντιδραστήρια που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά για 28 ημέρες στους 2-8 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. Τα HIV-1 v2.0 CS1, HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 και HIV-1 v2.0 CS4 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για έως και 4 κύκλους οργάνου, έως και 64 ώρες συνολικά μετά την τοποθέτησή τους στο COBAS AmpliPrep Όργανο. Τα αντιδραστήρια πρέπει να αποθηκεύονται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων των οργάνων. C. Αποθηκεύετε τα HIV-1 H(+)C, v2.0, HIV-1 L(+)C, v2.0 και CTM ( ) C στους 2-8 C. Οι οροί ελέγχου παραμένουν σταθεροί μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. D. Αποθηκεύστε τα κλιπ Γραμμωτού κώδικα [HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip, HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip και HIV-1 ( ) C Clip] στους 2-30 C. E. Αποθηκεύστε το PG WR στους 2-30 C. Το PG WR παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, το αντιδραστήριο αυτό παραμένει σταθερό για 28 ημέρες στους 2-30 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα παρέλθει πρώτη. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 (P/N: 05212294 190) HI2CAP HIV-1 v2.0 CS1 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Μαγνητικών Σωματιδίων Γυαλιού HIV-1) HIV-1 v2.0 CS2 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Λύσης HIV-1) HIV-1 v2.0 CS3 (Κασέτα Πολλαπλού Αντιδραστηρίου HIV-1) HIV-1 v2.0 CS4 (Κασέτα Αντιδραστηρίου ειδική για την εξέταση HIV-1) 05447925001-07EL 12 Doc Rev. 8.0

HIV-1 H(+)C, v2.0 (Θετικός Ορός Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης HIV-1, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 (Θετικός Ορός Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης HIV-1, v2.0) CTM ( ) C [COBAS TaqMan Αρνητικός Ορός Ελέγχου (Ανθρώπινο Πλάσμα)] HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης HIV-1, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης HIV-1, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Αρνητικού Ορού Ελέγχου HIV-1) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης (P/N: 03587797 190) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης) ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Όργανα και Λογισμικό COBAS AmpliPrep Όργανο COBAS TaqMan Αναλυτής ή COBAS TaqMan 48 Αναλυτής Προαιρετικά: cobas p 630 όργανο Προαιρετικά: Docking Station AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.2 ή 3.3 Σταθμός Δεδομένων για το AMPLILINK λογισμικό, με εκτυπωτή Εγχειρίδια AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2 ή 3.3: Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS AmpliPrep οργάνου για χρήση με τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή ή το cobas p 630 όργανο και το AMPLILINK λογισμικό, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan αναλυτή (και του προαιρετικού docking station), για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2. και 3.3 Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή, για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2 για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή 05447925001-07EL 13 Doc Rev. 8.0

ή Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3 για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο Προαιρετικά: Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου, Έκδοση Λογισμικού 2.2 Υλικά μίας χρήσης Μονάδες επεξεργασίας δειγμάτων: SPUs Σωληνάρια δειγμάτων εισόδου (S-tubes) με κλιπ γραμμωτού κώδικα Υποδοχείς K-tips Κιβώτιο των 12 x 96 K-tube ΑΛΛΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Υποδοχέας Δειγμάτων (υποδοχέας SK 24) Υποδοχέας Αντιδραστηρίων Υποδοχέας SPU Πωματιστής K-tube, μηχανοκίνητος Πωματιστής K-tube K-carrier Σύστημα μεταφοράς K-carrier Υποδοχέας K-carrier Συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς RΝase (χωρητικότητα 1000 μl)* Γάντια μίας χρήσης, χωρίς πούδρα Αναδευτήρας τύπου Vortex * Οι συσκευές πιπέτας πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ακροφύσια με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση χωρίς RNase πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου ορίζεται, για την αποφυγή της διασταυρούμενης μόλυνσης των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon). 05447925001-07EL 14 Doc Rev. 8.0

ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Σημείωση: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Σημείωση: Η παρούσα εξέταση έχει εγκριθεί μόνο για χρήση με ανθρώπινο πλάσμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA. Η εξέταση άλλων τύπων δειγμάτων μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. A. Συλλογή Δείγματος Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 προορίζεται για χρήση με δείγματα πλάσματος. Το αίμα πρέπει να συλλέγεται σε αποστειρωμένα σωληνάρια με χρήση αντιπηκτικού EDTA (μοβ πώμα) και να αναμιγνύεται επαρκώς σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αποθηκεύετε το ολικό αίμα στους 2-25 C για διάστημα 24 ωρών το μέγιστο. Διαχωρίστε το πλάσμα από το ολικό αίμα εντός 24 ωρών από τη συλλογή, με φυγοκέντριση στα 800-1600 x g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταφέρετε το πλάσμα σε αποστειρωμένο σωληνάριο πολυπροπυλενίου. Στο Σχήμα 4 απεικονίζονται τα δεδομένα σταθερότητας δείγματος από μελέτες σταθερότητας δείγματος που διεξήχθησαν με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test (P/N: 03543005 190). Σχήμα 4 Σταθερότητα HIV-1 σε Ολικό Αίμα (που έχει συλλεχθεί σε σωληνάρια με πλάσμα EDTΑ) Μέσο αποτέλεσμα HIV-1 RNA (n=4) log 10 HIV-1 RNA cp/ml 5.0 5,0 4.0 4,0 3.0 3,0 2.0 2,0 1.0 1,0 0.0 0,0 Δότης P1 Δότης P2 Δότης P3 Ταυτότητα δείγματος B. Μεταφορά Δειγμάτων < 1 ώρα (T0) 24 ώρες, 25-30 C 24 ώρες, 2-8 C Η μεταφορά του ολικού αίματος ή του πλάσματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς που αφορούν τη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 39. Το ολικό αίμα πρέπει να μεταφέρεται στους 2-25 C και να υποβάλλεται σε φυγοκέντριση εντός 24 ωρών από τη συλλογή. Το πλάσμα πρέπει να μεταφέρεται σε θερμοκρασία 2-8 C ή κατεψυγμένο σε θερμοκρασία -20 C έως -80 C. C. Αποθήκευση Δειγμάτων Τα δείγματα πλάσματος μπορούν να αποθηκευτούν σε θερμοκρασία δωματίου (25-30 C) για έως και 1 ημέρα ή σε θερμοκρασία 2-8 C για έως και 6 ημέρες. Τα δείγματα πλάσματος αποδείχθηκε ότι παραμείνουν σταθερά για έξι εβδομάδες αν καταψυχθούν στους -20 C έως -80 C. Συνιστάται η αποθήκευση των δειγμάτων σε κλάσματα των 1100-1200 µl σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 2,0 ml με βιδωτό πώμα (όπως Sarstedt 72.694.006). Στο Σχήμα 5 απεικονίζονται τα δεδομένα σταθερότητας δείγματος από μελέτες αποθήκευσης δείγματος που διεξήχθησαν με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test (P/N: 03543005 190). 05447925001-07EL 15 Doc Rev. 8.0

Σχήμα 5 Σταθερότητα HIV-1 σε Πλάσμα EDTA Μέσο αποτέλεσμα HIV-1 RNA (n=4) log 10 HIV-1 RNA cp/ml 5.0 5,0 4.0 4,0 3.0 3,0 2.0 2,0 1.0 1,0 0.0 0,0 Δότης P4 Δότης P5 Δότης P6 Ταυτότητα δείγματος T=0 24 ώρες, 28 C 6 ημέρες, 2-8 C 6 εβδομάδες, -20 C 6 εβδομάδες, -80 C Τα δείγματα πλάσματος μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως και πέντε φορές χωρίς σημαντική απώλεια του HIV-1 RNA. Στο Σχήμα 6 απεικονίζονται τα δεδομένα από μια μελέτη κατάψυξης-απόψυξης που διεξήχθηκε με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test (P/N: 03543005 190). Σχήμα 6 Αποτελέσματα HIV-1 μετά από πέντε κύκλους κατάψυξης-απόψυξης (κ-α) (Πλάσμα EDTA) 5.0 5,0 Μέσο αποτέλεσμα HIV-1 RNA (n=4) log 10 HIV-1 RNA cp/ml 4.0 4,0 3.0 3,0 2.0 2,0 1.0 1,0 0.0 0,0 Δότης P10 Δότης P11 Δότης P12 Ταυτότητα δείγματος Ορός Ελέγχου 3 κ-α 5 κ-α 05447925001-07EL 16 Doc Rev. 8.0

ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Σημείωση: Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, λεπτομερή περιγραφή των πιθανών διευθετήσεων, εκτύπωση αποτελεσμάτων και ερμηνεία ενδείξεων, σχολίων και μηνυμάτων σφάλματος, ανατρέξτε (1) στο Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS AmpliPrep οργάνου για χρήση με τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή ή το cobas p 630 όργανο και το AMPLILINK λογισμικό, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3, (2) στο Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan αναλυτή (και του προαιρετικού docking station) για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3, (3) στο Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3, (4) στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή ή στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3 για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο, (5) Προαιρετικά: Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου, Έκδοση Λογισμικού 2.2. Μέγεθος Παρτίδας Κάθε κιτ περιέχει αντιδραστήρια για 48 εξετάσεις, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν σε παρτίδες των 12 έως 24 εξετάσεων. Τουλάχιστον ένας ορός ελέγχου [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 και HIV-1 H(+)C, v2.0] πρέπει να περιλαμβάνεται σε κάθε παρτίδα (βλέπε ενότητα «Ποιοτικός Έλεγχος»). Ροή Εργασιών Η ανάλυση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή πρέπει να ξεκινήσει εντός 120 λεπτών μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου. Σημείωση: Μην καταψύχετε ή αποθηκεύετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία στους 2-8 C. Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου Σημείωση: Αν χρησιμοποιείτε κατεψυγμένα δείγματα, τοποθετήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου έως την πλήρη απόψυξή τους και στροβιλίστε για 3-5 δευτερόλεπτα πριν από τη χρήση. Οι οροί ελέγχου θα πρέπει να απομακρύνονται από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C και να περιέρχονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. 05447925001-07EL 17 Doc Rev. 8.0

Ρύθμιση του COBAS AmpliPrep Οργάνου Μέρος A. Συντήρηση και Εκκίνηση A1. Το COBAS AmpliPrep Όργανο είναι έτοιμο για λειτουργία στον τρόπο λειτουργίας αναμονής. A2. Ενεργοποιήστε το Σταθμό Δεδομένων για το AMPLILINK λογισμικό (ON). Προετοιμάστε το Σταθμό Δεδομένων ως εξής: a. Συνδεθείτε στο λειτουργικό σύστημα Windows XP. b. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο του AMPLILINK λογισμικού. c. Συνδεθείτε στο AMPLILINK λογισμικό εισάγοντας τον καθορισμένο Κωδικό Χειριστή και τον κωδικό πρόσβασης. A3. Ελέγξτε την παροχή του PG WR χρησιμοποιώντας την Οθόνη Status και αντικαταστήστε αν χρειάζεται. A4. Διεξάγετε όλες τις εργασίες συντήρησης που αναφέρονται στον πίνακα Due. Το COBAS AmpliPrep Όργανο θα πραγματοποιήσει αυτόματη εκκίνηση στο σύστημα. Μέρος B. Φόρτωση Κασετών Αντιδραστηρίου Σημείωση: Όλες οι κασέτες αντιδραστηρίου θα πρέπει να απομακρύνονται από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C, να φορτώνονται αμέσως στο COBAS AmpliPrep Όργανο και να περιέρχονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος στο όργανο για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την επεξεργασία του πρώτου δείγματος. Μην αφήσετε τις κασέτες αντιδραστηρίου να αποκτήσουν θερμοκρασία περιβάλλοντος εκτός οργάνου, καθώς ενδέχεται να σχηματιστεί υγρασία στις ετικέτες γραμμωτού κώδικα. Μη σκουπίζετε την υγρασία από τις ετικέτες γραμμωτού κώδικα. B1. Τοποθετήστε το HIV-1 v2.0 CS1 σε έναν υποδοχέα αντιδραστηρίων. Τοποθετήστε τα HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 και HIV-1 v2.0 CS4 σε ξεχωριστό υποδοχέα αντιδραστηρίων. B2. Φορτώστε τον υποδοχέα αντιδραστηρίων που περιέχει το HIV-1 v2.0 CS1 στη θέση υποδοχέα Α του COBAS AmpliPrep Οργάνου. B3. Φορτώστε τον υποδοχέα αντιδραστηρίων που περιέχει τα HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 και HIV-1 v2.0 CS4 στις θέσεις υποδοχέα B, C, D ή E του COBAS AmpliPrep Οργάνου. (Βλέπε Πίνακα 1 για περισσότερες πληροφορίες.) 05447925001-07EL 18 Doc Rev. 8.0

Μέρος Γ. Φόρτωση Υλικών μίας Χρήσης Σημείωση: Καθορίστε τον αριθμό των COBAS AmpliPrep κασετών αντιδραστηρίου, τις Μονάδες Επεξεργασίας Δειγμάτων (SPUs), τα σωληνάρια Δειγμάτων Εισόδου (S-tubes), τα K-tips και τα K-tubes που απαιτούνται. Απαιτείται μία μονάδα επεξεργασίας δειγμάτων, ένα S-tube εισόδου, ένα K-tip και ένα K-tube για κάθε δείγμα ή ορό ελέγχου. Υπάρχει δυνατότητα πολλαπλών ροών εργασιών για χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου με τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Για αναφορά, βλέπε τον παρακάτω Πίνακα 1. Ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται, φορτώστε τον κατάλληλο αριθμό υποδοχέων κασετών αντιδραστηρίων, υποδοχέων δειγμάτων με S-tubes εισόδου, υποδοχέων SPU, υποδοχέων K-tip, υποδοχέων K-tube και K-carriers σε υποδοχείς K-carrier στις αντίστοιχες θέσεις υποδοχέων του COBAS AmpliPrep Οργάνου (βλέπε Πίνακα 1 για περισσότερες πληροφορίες). Γ1. Τοποθετήστε τις μονάδες επεξεργασίας δειγμάτων (SPU) στους υποδοχείς SPU και φορτώστε τους υποδοχείς στις θέσεις υποδοχέα J, K ή L του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ2. Ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται, φορτώστε τους γεμάτους υποδοχείς K-tube στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ3. Φορτώστε τους γεμάτους υποδοχείς K-tip στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ4. Για τη ροή εργασιών 3 που χρησιμοποιεί τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, φορτώστε τους K-carriers στους υποδοχείς K-carrier στις θέσεις υποδοχέα M & N ή O & P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. 05447925001-07EL 19 Doc Rev. 8.0

Πίνακας 1 Πιθανές ροές εργασιών για χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου με τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή 1 2 3 Ροή Εργασιών COBAS AmpliPrep Όργανο, Docking Station και COBAS TaqMan Αναλυτής COBAS AmpliPrep Όργανο και COBAS TaqMan Αναλυτής COBAS AmpliPrep Όργανο και COBAS TaqMan 48 Αναλυτές Τρόπος μεταφοράς στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Αυτόματη μεταφορά K-carrier Χειροκίνητη μεταφορά των K-tubes μέσω υποδοχέων δειγμάτων στον COBAS TaqMan Αναλυτή Χειροκίνητη μεταφορά του K-carrier μέσω υποδοχέων K-carrier στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Υποδοχείς, φορείς και υλικά μίας χρήσης K-tubes σε γεμάτους υποδοχείς K-tube K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων Μονάδες Επεξεργασίας Δειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU CS1 σε υποδοχέα κασετών CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών K-tubes σε γεμάτους υποδοχείς K-tube K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων Μονάδες Επεξεργασίας Δειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU CS1 σε υποδοχέα κασετών CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών Μετά την ολοκλήρωση της επεξεργασίας δειγμάτων: K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων (έτοιμα για χειροκίνητη μεταφορά) K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων Μονάδες Επεξεργασίας Δειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU CS1 σε υποδοχέα κασετών CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών Άδειο K-carrier με γραμμωτό κώδικα σε υποδοχέα K-carrier Μετά την ολοκλήρωση της επεξεργασίας δειγμάτων: K-tubes σε K-carrier σε υποδοχέα K-carrier Θέση στο COBAS AmpliPrep Όργανο M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Όπως παραπάνω (F H) F H M P F - H J L A B E M P Όπως παραπάνω (M P) 05447925001-07EL 20 Doc Rev. 8.0

Μέρος Δ. Εντολή και Φόρτωση Δειγμάτων Δ1. Προετοιμάστε τους υποδοχείς δειγμάτων ως εξής: Προσαρμόστε ένα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα σε κάθε θέση υποδοχέα δειγμάτων όπου πρόκειται να τοποθετηθεί δείγμα (S-tube). Προσαρμόστε ένα από τα ειδικά για τους ορούς ελέγχου κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 και HIV-1 H(+)C, v2.0] σε κάθε θέση υποδοχέα δειγμάτων όπου πρόκειται να τοποθετηθούν οροί ελέγχου (S-tube). Τα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα για τους ορούς ελέγχου θα πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό παρτίδας ορού ελέγχου με τον αριθμό παρτίδας που υπάρχει στα φιαλίδια ορού ελέγχου του κιτ. Φροντίστε να τοποθετήσετε το σωστό ορό ελέγχου στη θέση με το κατάλληλο κλιπ γραμμωτού κώδικα ορού ελέγχου. Τοποθετήστε ένα S-tube Εισόδου σε κάθε θέση που περιλαμβάνει ένα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα. Δ2. Χρησιμοποιώντας το AMPLILINK λογισμικό, δημιουργήστε εντολές δείγματος για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου στο φάκελο Sample του παραθύρου Orders. Επιλέξτε το κατάλληλο αρχείο εξέτασης και ολοκληρώστε τη διαδικασία με αποθήκευση. Δ3. Αντιστοιχίστε τις εντολές δειγμάτων και ορών ελέγχου στις θέσεις υποδοχέα δειγμάτων, στο φάκελο Sample Rack του παραθύρου Orders. Ο αριθμός υποδοχέα δειγμάτων πρέπει να προορίζεται για τον υποδοχέα που προετοιμάστηκε στο Βήμα Δ1. Δ4. Εκτυπώστε την αναφορά Sample Rack Order για να τη χρησιμοποιήσετε ως φύλλο εργασίας. Δ5. Προετοιμάστε υποδοχείς δειγμάτων και ορών ελέγχου στην καθορισμένη περιοχή για προσθήκη δειγμάτων και ορών ελέγχου ως εξής: Στροβιλίστε κάθε δείγμα και ορό ελέγχου [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 και HIV-1 H(+)C, v2.0] για 3 έως 5 δευτερόλεπτα. Φροντίστε να μην μολυνθούν τα γάντια κατά το χειρισμό των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Δ6. Μεταφέρετε 1000 έως 1050 µl κάθε δείγματος και ορού ελέγχου [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 και HIV-1 H(+)C, v2.0] στο αντίστοιχο S-tube Εισόδου με επισήμανση γραμμωτού κώδικα χρησιμοποιώντας μια μικροπιπέτα με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς RNase. Αποφεύγετε τη μεταφορά σωματιδίων και/ ή θρόμβων ινώδους από το αρχικό δείγμα στο S-tube Εισόδου. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να μεταφέρονται σε θέσεις σωληναρίων όπως καθορίζεται και καταγράφεται στο φύλλο εργασίας στο βήμα Δ4. Τα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα για τους ορούς ελέγχου πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό παρτίδας ορού ελέγχου με τον αριθμό παρτίδας που υπάρχει στα φιαλίδια ορού ελέγχου του κιτ. Τοποθετήστε το σωστό ορό ελέγχου στη θέση με το κατάλληλο κλιπ γραμμωτού κώδικα ορού ελέγχου. Αποφεύγετε την επιμόλυνση του επάνω μέρους των S-tubes με δείγματα ή ορούς ελέγχου. Αν χρησιμοποιείτε το cobas p 630 όργανο για την προετοιμασία δειγμάτων, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου. Δ7. Για τις ροές εργασιών 1 και 2, φορτώστε τους υποδοχείς δειγμάτων που είναι γεμάτοι με S-tubes Εισόδου στις θέσεις υποδοχέα F, G ή H του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Δ8. Για τη ροή εργασιών 3, χρησιμοποιώντας τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, φορτώστε τους υποδοχείς δειγμάτων με S-tubes Εισόδου και K-tubes (ένα για κάθε S-tube Εισόδου, φορτωμένο στη σωστή θέση δίπλα στα S-tubes Εισόδου) στις θέσεις υποδοχέα F, G ή H του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Μέρος E. Έναρξη ανάλυσης στο COBAS AmpliPrep Όργανο E1. Θέστε σε λειτουργία το COBAS AmpliPrep Όργανο χρησιμοποιώντας το AMPLILINK λογισμικό. 05447925001-07EL 21 Doc Rev. 8.0