«Ανάλυση εξαιρετικά ολιγοκυτταρικών δειγμάτων με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής»

i

ii

«Ανάλυση εξαιρετικά ολιγοκυτταρικών δειγμάτων με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής» iii

Στην Εύρη και το Γιώργο, που τους οφείλω πολλά... iv

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε εξ ολοκλήρου στο Εργαστήριο Κυτταρομετρίας Ροής του Ανοσολογικού Τμήματος και Εθνικού Κέντρου Ιστοσυμβατότητας του ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς υπό την επίβλεψη κ. Πατεράκη Γεωργίου, Αιματολόγου, MSc, PhD, Επιμελητή του Εργαστηρίου Κυτταρομετρίας Ροής του Ανοσολογικού Εργαστηρίου και Εθνικού Κέντρου Ιστοσυμβατότητας ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς, στα πλαίσια συνεργασίας με το τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων της Σχολής Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας του Τεχνολογικού Εκπαιδευτικού Ιδρύματος (ΤΕΙ) Αθηνών. Επιθυμία μου θα ήταν πρωτίστως να ευχαριστήσω βαθύτατα τον επιβλέποντα και εισηγητή μου κ. Γεώργιο Πατεράκη για την ευκαιρία που μου έδωσε να συνεργαστώ μαζί του, τον χρόνο που διέθεσε για την εκπαίδευσή μου, τη συνεχή προσφορά γνώσεων, την υπομονή του να απαντήσει σε κάθε μία από τις αμέτρητες ερωτήσεις μου και την υποστήριξη των προσπαθειών μου κατά τη διάρκεια της συνεργασίας μας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους Ταμπάκη Ελένη, Βιολόγο ΜSc, Αναγνωστόπουλο Ιωάννη, Βιοχημικό και Σκουτέλα Κατερίνα, Τεχνολόγο Ιατρικών Εργαστηρίων, προσωπικό του εργαστηρίου Κυτταρομετρίας ροής του ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς, για την υποστήριξη, τις συμβουλές και τη προθυμία που έδειξαν σε οποιαδήποτε βοήθεια χρειάστηκα, αλλά και για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας που επικρατούσε καθ όλη τη διάρκεια παραμονής μου στο εργαστήριο. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τη κα Ινιωτάκη Αλίκη, Συντονίστρια-Διευθύντρια του Ανοσολογικού Τμήματος και Εθνικού Κέντρου Ιστοσυμβατότας ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς για τη βοήθειά της τις στιγμές που χρειάστηκε και την εγκάρδια συναίνεση αποδοχής μου στο Εργαστήριο Κυτταρομετρία Ροής του Ανοσολογικού Τμήματος και Εθνικού Κέντρου Ιστοσυμβατότας του ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς για τη εκπόνηση της πτυχιακής μου εργασίας. Ευχαριστώ ξεχωριστά τον κ. Κριεμπάρδη Αναστάσιο, MSc, PhD, Επίκουρο Καθηγητή Εργαστηριακής Αιματολογίας Αιμοδοσίας του Τμήματος Ιατρικών Εργαστηρίων, Σχολής Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τεχνολογικού v

Εκπαιδευτικού Ιδρύματος (Τ.Ε.Ι.) Αθήνας, για την καταλυτική του βοήθεια στην τελική ευθεία περάτωσης της εργασίας μου, τις πολύτιμες συμβουλές του, την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου δίνοντάς μου τη δυνατότητα να συνεργαστώ μαζί του και να πραγματοποιήσω την πτυχιακή μου εργασία σε έναν πανελλαδικά διακεκριμένο χώρο που μου προσέφερε μοναδικές εμπειρίες και διεύρυνε τις γνώσεις μου στην επιστήμη της Αιματολογίας αλλά και την αγάπη που μου μετέδωσε για την Εργαστηριακή Αιματολογία και την Ανοσοαιματολογία στα πλαίσια των προπτυχιακών μου σπουδών. Τέλος, ευχαριστώ το εκπαιδευτικό προσωπικό του τμήματος Ιατρικών Εργαστηρίων του Τεχνολογικού Εκπαιδευτικού Ιδρύματος Αθηνών, για το υψηλό επίπεδο σπουδών που παρείχε στους φοιτητές σε όλα τα έτη φοίτησης μας, παρά τις δύσκολες εποχές που διανύουμε, δίνοντάς μας την ευκαιρία να γνωρίσουμε πολύπλευρα το αντικείμενο μας και να καταφέρουμε να γίνουμε σωστοί επαγγελματίες, έτοιμοι να προσφέρουν πολλά στη υγεία και την ανθρωπότητα. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την οικογένεια μου για την πολύτιμη υποστήριξή της καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου και την αμέριστη αγάπη που έχω λάβει τόσα χρόνια, αλλά και τους καλούς μου φίλους για την υπομονή, την ανοχή και τη ψυχολογική υποστήριξη τους καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της εν λόγω εργασίας. vi

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Δείγματα όπως ΕΝΥ, υαλοειδές, υδατοειδές υγρό κ.α. συνηθίζεται να αποστέλλονται για ανοσοφαινοτυπική ανάλυση σε περιπτώσεις υποψίας ύπαρξης ή παρακολούθησης ήδη διαγνωσμένης αιματολογικής κακοήθειας. Ωστόσο τα δείγματα αυτά, χαρακτηρίζονται από χαμηλή κυτταροβρίθεια (ολιγοκυτταρικά δείγματα) και η ανοσοφαινοτυπική ανάλυσή τους αποτελεί μια διαγνωστική πρόκληση ενός εργαστηρίου κυτταρομετρίας ροής καθώς η σπανιότητα των κυττάρων περιορίζει τον αριθμό των δοκιμών που μπορούν να εκτελεστούν. ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η χρήση μιας μεθόδου ανάλυσης των ολιγοκυτταρικών δειγμάτων με πολυπαραμετρική κυτταρομετρίας ροής, για τον εντοπισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό των κύριων πληθυσμών λεμφοκυττάρων, καθώς και την διάκριση των φυσιολογικών από των νεοπλασματικών κυττάρων. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Τα δείγματα των ασθενών που βρίσκονταν σε φάση διάγνωσης ή παρακολούθησης, επεξεργάζονταν με συνδυασμό πρωτοκόλλων (panels) ο οποίος περιλάμβανε ειδικούς δείκτες λευκοκυττάρων (CD) και τη SYTO16Green φθοριοχρωστική νουκλεϊκών οξέων. Αρχικά έγινε προσδιορισμός του ακριβή αριθμού των κυττάρων των δειγμάτων σε Truecount (BD) δοκιμαστικούς σωλήνες, με συγκεκριμένο συνδυασμό μονοκλωνικών αντισωμάτων που ήταν αναγκαίος για τον κατατοπιστικό έλεγχο των δειγμάτων (CD235a-PE, CD45-ECD, CD14-PC7, CD16-PC7, SYTO16). Τα δείγματα όπου διαπιστώθηκε η ύπαρξη κάποιου ύποπτου κυτταρικού πληθυσμού, εξετάστηκαν με panel που αφορούσε συγκεκριμένη κυτταρική σειρά (CD235a-PE, CD45-ECD, CD19-PC7, CD20-PC7, SYTO16 για τη διερεύνηση της Β και CD235a-PE, CD45-ECD, CD4-PC5, CD8-PC7, SYTO16 για διερεύνηση της Τ-λεμφικής σειράς). Η μελέτη περιλάμβανε 10 περιπτώσεις ενηλίκων ασθενών, 70% (Ν=7) άντρες με μέση ηλικία τα 41 έτη και 30% (Ν=3) γυναίκες μέσης ηλικίας 65,5 ετών. Στην ανάλυση συμπεριελήφθησαν 2 περιπτώσεις ασθενών με Β-ΟΛΛ (20%), 2 με ΟΜΛ (20%), 4 με Λ. Burkitt (40%), 1 με ενδοφθάλμιο λέμφωμα (10%) και 1 περίπτωση ασθενή με ραγοειδίτιδα και υποψία ενδοφθάλμιου λεμφώματος (10%). Η ανάλυση των δειγμάτων έγινε κατά την αρχική διάγνωση και κατά την υποτροπή, και στη συνέχεια περιοδικά, αναλόγως τη vii

θεραπεία που ακολούθησαν οι ασθενείς ή τη γενικότερη παρακολούθησή τους με σκοπό την ανίχνευση Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου (MRD). Το υλικό μελέτης περιλάμβανε ΕΝΥ (80%, Ν=8), υαλοειδές υγρό (10%, Ν=1), υδατοειδές υγρό (10%, Ν=1). Συνολικά μελετήθηκαν 40 δείγματα ασθενών. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Στο 52,5% (Ν=21) των δειγμάτων ανιχνεύθηκε νόσος ενώ στο 42,5% (Ν=17) όχι. Το 5% (Ν=2) των δειγμάτων δεν ήταν κατάλληλο προς ανάλυση λόγω τραυματικής παρακέντησης ενώ πλειοκυττάρωση παρουσίαζε το 10% (Ν=4). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η αναλύση των ολιγοκυτταρικών δειγμάτων της μελέτης κατάφερε να δώσει χρήσιμες διαγνωστικές πληροφορίες σε περιπτώσεις υποψίας ύπαρξης αιματολογικής κακοήθειας αλλά και παρακολούθησης ασθενών με ήδη διαγνωσμένο ιστορικό αιματολογικής κακοήθειας, παρότι τα δείγματα χαρακτηρίζονταν από χαμηλή κυτταροβρίθεια. Αυτό οφείλεται στο ότι η μέθοδος ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκε, περιλάμβανε την χρήση πολλαπλών μονοκλωνικών αντισωμάτων τα οποία είναι ειδικοί δείκτες για όλες τις κυτταρικές σειρές (μονοκυτταρική, Β και Τ λεμφική σειρά) αλλά και τη φθοριοχρωστική νουκλεϊκών οξέων SYTO16 Green που λειτουργεί ως ειδικός ανιχνευτής των εμπύρηνων αιμοποιητικών κυττάρων και αυξάνει σημαντικά την ευαισθησία ανίχνευσης της μεθόδου. Συνεπώς, η μέθοδος αποτελεί μια αξιόπιστη τεχνική που μπορεί να ανιχνεύσει νεοπλασματικά κύτταρα και να τα ξεχωρίσει από τα φυσιολογικά. Βέβαια, λόγω της ιδιαιτερότητας των δειγμάτων είναι σημαντικό να υπάρχει εξοικείωση με τα προβλήματα που μπορεί να εμφανιστούν κατά την ανοσοφαινοτυπική ανάλυση και να υιοθετηθούν στρατηγικές για την αποφυγή παρερμηνείας της διάγνωσης. viii

ABSTRACT INTRODUCTION: Samples such as CSF, vitreous fluid, aqueous fluid etc. is usual to be sent for flow cytometric immunophenotyping in case of suspicion of hematologic malignancy, or follow up investigation of an already diagnosed hematologic malignancy. These samples, however, may contain a very low number of cells (paucicellular samples) and in this case, the immunophenotyping may represent a diagnostic challenge for the flow cytometry laboratory, as the scarcity of cells limits the number of tests that can be performed. PURPOSE: The purpose of this study is the usage of a flow cytometric method of paucicellular samples immunophenotyping, which combines the use of multiple monoclonal antibodies and the SYTO16 Green (MP) fluorescent nucleic acid stain as a specific probe of nucleated cells of the sample, with a Boolean gating strategy for the identification and quantification of the main lymphocyte populations and the discrimination between normal and neoplastic cells in cases of suspected hematologic malignancy (leukemia, lymphoma), or for monitoring already diagnosed hematologic malignancy. METHOD: The samples of the patients in diagnosis or follow up were treated with a combination of panels which included specific leukocyte markers (CD) and the SYTO16 Green fluorescent nucleic acid stain as a specific probe of nucleated cells. Initially, the exact cell number of samples was determinated with Truecount (BD) tubes with a calibrated number of beads for the ultimate determination of the number of sample cells, and a specific combination of monoclonal antibodies used for the first control of the samples (CD235a -PE, CD45-ECD, CD14-PC7, CD16-PC7, SYTO16). The patient samples that were suitable for further analysis and their findings included a suspicious cell population, examined with a further panel concerning a specific cell line (CD235a-PE, CD45-ECD, CD19-PC7, CD20-PC7, SYTO16 for B cells investigation and CD235a-PE, CD45-ECD, CD4-PC5, CD8-PC7, SYTO16 for T cells investigation). The study includes 10 cases of adult patients. 70 % (N=7) of the patients, were males with 41 years old average age while 30% (N=3) were 65.5 years old average aged women. The analysis included two cases with B-ALL (20%), 2 cases with AML (20 %), 4 cases with Burkitt lymphoma (40%), 1 case with intraocular ix

lymphoma (10%) and one with uveitis and intraocular lymphoma suspicion (10%). The samples analysis was done either at the initial diagnosis or in case of disease relapse, and periodically thereafter, depending on the treatment followed by the patients or their general monitoring for the detection of Minimal Residual Disease (MRD). The material of the study at the initial diagnosis included in the majority of patients CSF (80%, N=8), vitreous fluid (10%, N=1) and aqueous fluid (10%, N=1). The total number of the patient samples analyzed was 40. RESULTS: Hematologic malignancy detected at the 52.5% (N=21) of the samples while the 42.5% (N=17) was clear. 5% (N=2) of the samples was not suitable for further analysis due to traumatic puncture (burrowing vessel). 10% of the samples (N=4) showed pleocytosis. CONCLUSION: The immunophenotyping analysis of the study s paucicellular samples was able to provide useful diagnostic information both in cases of hematological malignancy (leukemia, lymphoma) and in cases of follow up analysis, although the samples were characterized by low cellularity. This happend because the method used, included the use of multiple monoclonal antibodies which are specific markers for all cell lines (monocytes, B and T lymphoid line) and the fruorescent nucleic acid stain SYTO16 Green (MOLECULAR PROBES, Eugene, OR, USA) used as a specific probe of nucleated hematopoietic cells, which significantly increases the detection sensitivity of the method. Therefore, the method is a reliable technique that can detect malignant cells in a sample and distinguish them from normal ones. However, due to the specificity of the samples, it is important to be familiar with the problems that may occur during the immunophenotypic analysis and adopt strategies to avoid misinterpretation. x

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΕΝΥ ΚΝΣ ΟΜΛ (Μ4) Β-ΟΛΛ FSC SSC FL CD FITC PE ECD PC5 PC7 APC BF CSF FNA BAL CNS CNSL PCNSL SCNSL IOL PIOL SIOL NHL B-NHL NH-CNSL DLBCL ALL MRI PBS FBS Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία Β Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία Πρόσθιος Σκεδασμός Πλάγιος Σκεδασμός Φθοριοχρωστική Αντιγόνο Διαφοροποίησης Φλουορεσκίνη Φυκοερυθρίνη Φυκοερυθρίνη Texas Red Φυκοερυθρίνη Κυανίνη-5 Φυκοερυθρίνη Κυανίνη-7 Αλλοφυκοκυανίνη Βιολογικά Υγρά Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό Βιοψία Δια Λεπτής Βελόνης Βρογχοκυψελιδικό Έκπλυμα Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Λέμφωμα Κεντρικού Νευρικού Συστήματος Πρωτοπαθές Λέμφωμα Κεντρικού Νευρικού Συστήματος Δευτεροπαθές Λέμφωμα Κεντρικού Νευρικού Συστήματος Ενδοφθάλμιο Λέμφωμα Πρωτοπαθές Ενδοφθάλμιο Λέμφωμα Δευτεροπαθές Ενδοφθάλμιο Λέμφωμα Μη Hodgkin Λέμφωμα Β - Μη Hodgkin Λέμφωμα Μη Hodgkin Λέμφωμα Κεντρικού Νευρικού Συστήματος Διάχυτο από μεγάλα Β-κύτταρα Λέμφωμα Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία Απεικόνιση Μαγνητικού Συντονισμού Διάλυμα Φωσφορικών Αλάτων Βόειος Ζωμός xi

ABREVIATIONS FSC SSC FL CD FITC PE ECD PC5 PC7 APC BF CSF FNA BAL CNS CNSL PCNSL SCNSL IOL PIOL SIOL NHL B-NHL NH-CNSL DLBCL ALL MRI PBS FBS Foreword Scatter Side Scatter Fluorochrome Clusters of Differentiation Fluorescein Isothyacyanate Phycoerythrin Texas Red Phycoerythrin Phycoerythrin Cyanin-5 Phycoerythrin Cyanin-7 Allophycocyanin Body Fluids Cerebrospinal Fluid Fine Needle Aspirate Bronchoalveolar Lavage Central Nervous System Central Nervous System Lymphoma Primary Central Nervous System Lymphoma Secondary Central Nervous System Lymphoma Intraocular Lymphoma Primary Intraocular Lymphoma Secondary Intraocular Lymphoma Non Hodgkin Lymphoma B cell Non Hodgkin Lymphoma Central Nervous System Non Hodgkin Lymphoma Diffuse large B-cell Lymphoma Acute Lymphoblastic Leukemia Magnetic Resonance Imaging Phosphate Buffer Saline Fetal Bovine Serum xii

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... v ΠΕΡΙΛΗΨΗ... vii ABSTRACT... ix ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ... xi ABREVIATIONS... xii ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ... xiii Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 1 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ... 1 1.1. ΑΡΧΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ... 1 1.2. ΣΚΕΔΑΣΗ ΚΑΙ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ... 6 1.2.1. Πρόσθια και Πλάγια Σκέδαση... 6 1.2.2. Φθορισμός... 8 1.3. ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ... 13 1.4. ΠΟΛΥΠΑΡΑΜΕΤΡΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ... 16 2 - ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ... 17 2.1. ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ... 17 2.2. ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ... 19 2.2.1. ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ (ΕΝΥ)... 19 2.2.2. ΥΛΙΚΟ ΟΦΘΑΛΜΙΚΗΣ ΒΙΟΨΙΑΣ... 21 2.2.3. ΒΙΟΨΙΑ ΔΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΒΕΛΟΝΗΣ (FNA)... 22 2.2.4. ΆΛΛΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΛΙΚΑ... 22 2.3. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 23 2.4. ΚΡΙΣΙΜΑ ΣΗΜΕΙΑ ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ... 24 2.4.1. ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ... 24 2.4.2. ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ... 25 2.4.3. ΒΕΛΤΙΣΤΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΓΕΓΟΝΟΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗΣ... 25 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 26 xiii

1. ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ... 26 2. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΓΜΑΤΑ... 27 3. ΜΕΘΟΔΟΣ... 29 4. ΟΡΓΑΝΑ... 31 5. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ... 32 5.1. Πρότυπα σφαιρίδια κυτταρομετρίας ροής... 32 5.2. Αντιδραστήρια μελέτης δειγμάτων... 32 5.3. Άλλα διαλύματα... 34 6. ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ ΥΛΙΚΑ... 36 7. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ... 37 7.1. Προσδιορισμός απόλυτου αριθμού κυττάρων δείγματος... 37 7.2. Προσδιορισμός επιφανειακών δεικτών κυττάρων... 38 8. ΈΛΕΓΧΟΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΗΤΗ ΡΟΗΣ... 40 9. ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΤΟΝ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΗΤΗ ΡΟΗΣ... 41 10. ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΤΑΤΟΠΙΣΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ... 42 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 46 1. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΤΥΠΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΜΕΛΕΤΗΣ... 46 1.1. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Β- ΟΞΕΙΑΣ ΛΕΜΦΟΒΛΑΣΤΙΚΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ (Β-ΟΛΛ)... 46 1.2. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΟΞΕΙΑΣ ΜΥΕΛΟΓΕΝΟΥΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ (ΟΜΛ)... 52 1.3. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΛΕΜΦΩΜΑTOΣ ΒURKITT... 59 1.4. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΕΝΔΟΦΘΑΛΜΙΟΥ ΛΕΜΦΩΜΑΤΟΣ (IOL) ΚΑΙ ΡΑΓΟΕΙΔΙΤΙΔΑΣ... 68 2. ΣΥΝΟΛΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ... 75 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 76 Ε. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ... 79 ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.... 80 xiv

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ 1.1. ΑΡΧΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ H κυτταρομετρία ροής είναι μία αυτοματοποιημένη μέθοδος ανάλυσης κυττάρων και σωματιδίων που βρίσκονται σε μορφή εναιωρήματος. Επιτρέπει ταυτόχρονα την πολυπαραμετρική ανάλυση φυσικών και χημικών ιδιοτήτων μοναδιαίων κυττάρων τα οποία ρέουν μέσα σε μία συσκευή ανίχνευσης οπτικών και ηλεκτρονικών σημάτων μέσω της οποίας επιτυγχάνεται η παρατήρηση, η ποσοτικοποίηση και ο διαχωρισμός τους με βάση τα φυσικοχημικά τους χαρακτηριστικά, τη σκέδαση και το φθορισμό. 1-3 Εικόνα 1: Κυτταρομετρητής ροής Navios Flow Cytometer συνδεδεμένος με υπολογιστή [Ανατύπωση από: http://www.galenica.cl/wp-content/uploads/2014/10/navios-brochure.pdf]

Η γενική αρχή λειτουργίας της κυτταρομετρίας ροής στηρίζεται στην κατευθυνόμενη ακτινοβόληση μίας υδροδυναμικά εστιασμένης ροής υγρού στην οποία εμπεριέχονται τα προς μελέτη σωματίδια από μία ακτίνα φωτός και συγκεκριμένα από μια μονοχρωματική ακτίνα λέιζερ. Συνήθως χρησιμοποιούνται λάμπες ξένου ή Μερκουρίου, διοδικά λέιζερ ή λέιζερ αερίων χαμηλής ισχύος (Ιόντων Αργού στα 488 nm ή στα 514,4 nm και Ηλίου-Νέου στα 632,8 nm). Σε όλες τις περιπτώσεις τα ηλεκτρόνια διεγείρονται μέσα στην πηγή φωτός σε υψηλής ενέργειας τροχιακά με τη βοήθεια διαφοράς δυναμικού και κατά την αποδιέγερση τους εκπέμπεται ενέργεια με τη μορφή φωτονίων. Το υδροδυναμικό σύστημα ροής (fluidics) βασίζεται στην αρχή της υδροδυναμικής εστίασης η οποία εξασφαλίζει τη ροή των κυττάρων σε μονήρη διάταξη. Με τη χρήση αδρανούς ρυθμιστικού διαλύματος, ισότονου με τα κύτταρα (συνήθως Phosphate Buffer Saline PBS υγρό περιροής - sheath fluid) δημιουργείται εναιώρημα κυττάρων και με αυτό τον τρόπο τα προς ανάλυση σωματίδια διέρχονται μέσα από την κυψελίδα ροής και διαμέσου της ακτίνας. Το sheath βρίσκεται σε μια δεξαμενή υπό πίεση, ενώνεται με το δείγμα μέσα στην κυψελίδα ροής λίγο πριν το ακροφύσιο και αναμιγνύεται ελάχιστα ή καθόλου με το δείγμα, το οποίο παραμένει σε έναν στενό κεντρικό άξονα ροής ενώ το sheath το περιβάλλει εξωτερικά. Η διάμετρος του sheath είναι τόσο μικρή ώστε να εξασφαλίζεται η ροή ενός και μόνο σωματιδίου κάθε φορά διαμέσου της ακτίνας. Ο λόγος που γίνεται αυτό είναι για να επιτευχθεί μία γρήγορη, στρωτή και όχι τυρβώδης ροή (laminar flow). Η επιτάχυνση των σωματιδίων είναι σημαντική για τη σωστή τους ευθυγράμμιση σε σχέση με την ακτίνα λέιζερ η οποία προσπίπτει κάθετα στη κυψελίδα ροής. Η ακτίνα λέιζερ, πριν προσπέσει στο δείγμα, εστιάζεται από ένα σύστημα φακών έτσι ώστε να γίνεται λεπτή και να προσπίπτει κάθετα πάνω σε ένα μόνο κύτταρο τη φορά. Με το που αυτή προσπίπτει στα κύτταρα, ένα μέρος της ακτινοβολίας απορροφάται ενώ το υπόλοιπο σκεδάζεται προς όλες τις κατευθύνσεις. Η ακτινοβόληση των διερχόμενων σωματιδίων είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία των σημάτων στα οποία βασίζεται η ανάλυση της κυτταρομετρίας ροής. Μία σειρά ανιχνευτών/φωτοπολλαπλασιαστών είναι τοποθετημένοι στο σημείο όπου η ακτίνα φωτός περνάει διαμέσου της ροής. Ο ένας ανιχνευτής

βρίσκεται στην ίδια ευθεία με το λέιζερ και ανιχνεύει την πρόσθια σκέδαση και οι άλλοι βρίσκονται κάθετα στην ακτίνα και ανιχνεύουν την πλάγια σκέδαση. Κάθε αιωρούμενο σωματίδιο διαμέτρου 0,2 μm έως 150 μm το οποίο το διαπερνάει η ακτίνα λέιζερ, σκεδάζει την ακτινοβολία και οι φθορίζουσες χρωστικές οι οποίες υπάρχουν εσωτερικά στο σωματίδιο ή είναι προσκολλημένες στην επιφάνειά του έπειτα από ειδική εργαστηριακή επεξεργασία, διεγείρονται και εκπέμπουν ακτινοβολία σε μήκη κύματος μεγαλύτερα από το μήκος κύματος του λέιζερ. Αυτός ο συνδυασμός του σκεδαζόμενου φωτός και του φθορισμού συλλέγεται από τους φωτοανιχνευτές και με αυτόν τον τρόπο καθίσταται δυνατή η ανάλυση των διακυμάνσεων της έντασης της ακτινοβολίας σε κάθε ανιχνευτή. Σχήμα 1: Σχηματική απεικόνιση της οπτικής διάταξης ενός κυτταρομετρητή ροής. Διαθέτει φωτεινή πηγή laser ιόντων Αργού (488nm) και τέσσερις φωτοπολλαπλασιαστές για την ταυτόχρονη ανίχνευση 4 φθοριοχρωμάτων. [Ανατύπωση από: http://www.exetasis.gr/kuttarometria]

Οι διακυμάνσεις της έντασης μετατρέπονται σε ηλεκτρικά σήματα και διαβάζονται με κατάλληλο λογισμικό ενός υπολογιστή ο οποίος είναι συνδεδεμένος με τον κυτταρομετρητή. Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής συνδυάζει τα δεδομένα των κυττάρων που μελέτησε και τα παρουσιάζει με κατανοητό τρόπο. Τα πιο διαδεδομένα λογισμικά προγράμματα είναι τα winmdi, το FlowJo, το CXP, το Kaluza. Με αυτόν τον τρόπο συλλέγονται πληροφορίες για τις φυσικές και χημικές ιδιότητες του κάθε σωματιδίου. 1,2 Σχήμα 2: Αρχή λειτουργίας του κυτταρομετρητή: Τα σωματίδια περνούν διαμέσου της ακτίνας λέιζερ και η σκεδαζόμενη καθώς και η φθορίζουσα ακτινοβολία συλλέγεται από τους ανιχνευτές και μετατρέπεται σε ηλεκτρικά σήματα. [Ανατύπωση από: http://www.slideshare.net/christinaneofytou/5683-54973063] Οι απεικονίσεις συνδυάζουν την συχνότητα ενός κυτταρικού πληθυσμού με ένα χαρακτηριστικό του (ιστόγραμμα κατανομής συχνοτήτων) όπου στον άξονα y παρουσιάζεται ο αριθμός των κυττάρων και στον άξονα x η ένταση φθορισμού του σήματος του συγκεκριμένου αντιγόνου ή δύο χαρακτηριστικών των κυττάρων (FS και SS ή FS και φθορισμός) όπου γίνεται ταυτόχρονη παρουσίαση και μελέτη δύο παραμέτρων (στικτόγραμμα dot blot). 3

Επίσης οι κυτταρομετρητές δίνουν την δυνατότητα περεταίρω ανάλυσης ενός πληθυσμού οριοθετώντας την περιοχή του παραθύρου. Οριοθετώντας έναν πληθυσμό μπορεί να αναλυθούν όλες οι παράμετροι όλων των κυττάρων που βρίσκονται εντός των ορίων. Η διαδικασία για να γίνει αυτό ονομάζεται gating. Συνήθως η επιλογή του πληθυσμού που θα οριοθετηθεί γίνεται στο νεφελόγραμμα (dot blot) συνδυασμού των FS/SS αλλά μπορεί να γίνει και σε οποιοδήποτε νεφελόγραμμα που εξετάζονται δύο ή και περισσότεροι παράμετροι. Στη συνέχεια αναλύεται ο οριοθετημένος πληθυσμός με βάση πληροφορίες από τον φθορισμό και σε όλα τα διαγράμματα θα εμφανίζονται οι τιμές που θα αφορούν μόνο αυτόν τον πληθυσμό. 5,6 Σχήμα 3: Στρατηγική οριοθέτησης πλυθησμών (gating strategy) [Ανατύπωση από: Αρχείο Εργ. Κυτταρομετρίας Ροής ΓΝΑ Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ -Βασικές αρχές κυτταρομετρίας ροής Γ.Πατεράκης]

1.2. ΣΚΕΔΑΣΗ ΚΑΙ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ 1.2.1. Πρόσθια και Πλάγια Σκέδαση Οι δύο φυσικές ιδιότητες για τις οποίες δίνει πληροφορίες ο κυτταρομετρητής είναι οι ενδείξεις πρόσθια σκέδαση (Forward Scatter, FSC) και πλάγια σκέδαση (Side Scatter, SSC). Το σύστημα συλλογής περιλαμβάνει δύο φωτοδιόδους συλλογής της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας, μια στη προέκταση (2 ο -28 ο ) της προσπίπτουσας δέσμης (πρόσθιος σκεδασμος Forward Light Scater) και μία σε κάθετη διεύθυνση (90 ο ) προς τη προσπίπτουσα δέσμη (πλάγιος σκεδασμός Side Light Scater). 5 Η πρόσθια σκέδαση ορίζεται σαν το φως με το ίδιο μήκος κύματος με αυτό της πηγής το οποίο έχει καμφθεί ελαφρώς από την ευθεία τροχιά εξαιτίας της αλληλεπίδρασης του με τα σωματίδια. Το φως αυτό συλλέγεται από τον ανιχνευτή που είναι απέναντι και στην ίδια ευθεία με το λέιζερ. H τιμή της πρόσθιας σκέδασης σχετίζεται με το μέγεθος των κυττάρων, και συγκεκριμένα με τον άξονα τους κατά μήκος της ακτίνας. Εκτός από τον φωτοανιχνευτή της πρόσθιας σκέδασης οι κυτταρομετρητές ροής έχουν συνήθως τέσσερις, πέντε ή και παραπάνω φωτοανιχνευτές τοποθετημένους έτσι ώστε να ανιχνεύουν ακτινοβολία που είναι κάθετη στην εκπεμπόμενη του λέιζερ. Ο ένας από αυτούς, ο οποίος βρίσκεται και στη μικρότερη απόσταση από την ακτίνα, έχει ένα φίλτρο του ίδιου μήκους κύματος με αυτό του λέιζερ ώστε να ανιχνεύει την ακτινοβολία που σκεδάζεται από τα κύτταρα. Όσο πιο τραχιά είναι η πλασματική μεμβράνη του κυττάρου, και όσο πιο πολύπλοκες οι εσωτερικές του δομές (αυξημένη κοκκίωση), τόσο πιο ισχυρή θα είναι η ακτινοβολία που σκεδάζεται από τα κύτταρα. Η σκεδαζόμενη αυτή ακτινοβολία ορίζεται ως πλάγια σκέδαση Side Scatter (SSC) και είναι η ακτινοβολία με το ίδιο μήκος κύματος με την πηγή, η οποία σκεδάζεται από ένα κύτταρο σε γωνία 90 ο σε σχέση με την ακτίνα λέιζερ. Η SSC αναφέρεται συχνά και ως κοκκιώδες διότι η κυτταρομετρία ροής εφαρμόζεται ιδιαίτερα για μελέτη κυττάρων της αιμοποιητικής σειράς και τα κοκκιοκύτταρα του αίματος έχουν μεγαλύτερη πλάγια σκέδαση από τα υπόλοιπα κυτταρικά συστατικά του αίματος. 1,2

ΣΚΕΔΑΣΜΟΣ Σχήμα 4: Πρόσθιος (FSC) και πλάγιος ( SSC - 90 o ) σκεδασμός φωτός [Ανατύπωση από: Purdue University Cytometry Laboratories Αρχείο Εργ. Κυτταρομετρίας Ροής ΓΝΑ Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ -Βασικές αρχές κυτταρομετρίας ροής. Γ.Πατεράκης] Σχήμα 5: Απεικόνιση ενός τυπικού διαγράμματος κυτταρομετρίας ροής. Στον οριζόντιο άξονα απεικονίζεται η πρόσθια σκέδαση η οποία σχετίζεται με το μέγεθος των κυττάρων, ενώ στον κάθετο άξονα απεικονίζεται η πλάγια σκέδαση η οποία σχετίζεται με την πολυπλοκότητα της δομής / εσωτερική σύσταση του κυττάρου. [Ανατύπωση από Longobardi G. A. Flow cytometry. First principles. 2 nd edition, Willy Liss Inc. 2001, ch 1. p 1-6]

1.2.2. Φθορισμός Τα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος φέρουν στην εξωτερική πλευρά της κυτταρικής τους μεμβράνης ειδικά αντιγόνα (Clusters of Differentiation, CD) τα οποία είναι χαρακτηριστικά για κάθε κυτταρική σειρά και εκφράζονται σε διαφορετική ποσότητα σε κάθε στάδιο ωρίμανσης αυτής. Τα CD συνδέονται με μονοκλωνικά αντισώματα που φέρουν κάποιο φθοριόχρωμα. Η κάθε φθορίζουσα χρωστική έχει την ιδιότητα όταν διεγερθεί από μια πηγή ενέργειας, όπως μια ακτινοβολία laser, να εκπέμπει ενέργεια με τη μορφή μιας νέας ακτινοβολίας μεγαλύτερου μήκους κύματος από αυτή που τη διέγειρε. Σχήμα 6: Εκφραση αντιγόνων επιφανείας στα διάφορα στάδια της φυσιολογικής μυελικής διαφορροποίησης [Ανατύπωση από: Αρχείο Εργ. Κυτταρομετρίας Ροής ΓΝΑ Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ -Βασικές αρχές κυτταρομετρίας ροής Γ.Πατεράκης]

Κάθε φθορίζουσα χρωστική χαρακτηρίζεται από το μήκος κύματος της ακτινοβολίας (excitation wavelength) που μπορεί να τη διεγείρει και από το μήκος κύματος της ακτινοβολίας που εκπέμπει (emission wavelength). Βέβαια, η εκπεμπόμενη ακτινοβολία κάθε φθοριοχρώματος έχει ένα φάσμα μήκους κύματος που χαρακτηρίζεται από μία μέγιστη τιμή. Σύμφωνα με τα παραπάνω το emission wavelength είναι πάντα μεγαλύτερο από το excitation wavelength. Οι πιο κοινές φθορίζουσες χρωστικές που χρησιμοποιούνται στην κυτταρομετρία ροής είναι οι FITC, PE, PerCP-Cy TM 5.5, PE-Cy TM 7, ECD, APC. 6 Σχήμα 7: Φάσματα εκπομπής κάποιων φθοριοχρωμάτων που χρησιμοποιούνται για τη σήμανση μονοκλωνικών αντισωμάτων [Ανατύπωση από: Αρχείο Εργαστηρίου Διαγνωστικής Κυτταρολογίας, ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ», Ε.Κ.Π.Α.] Τα κύτταρα του εναιωρήματος δέχονται φωτεινή ακτινοβολία laser η οποία διεγείρει τις φθορίζουσες ουσίες οι οποίες είναι συνδεδεμένες με τα μονοκλωνικά αντισώματα με τα οποία έχει επεξεργαστεί εργαστηριακά το δείγμα και εκπέμπουν σήμα με συγκεκριμένο μήκος κύματος για κάθε ουσία. 3 Η τιμή του φθορισμού που εκπέμπεται είναι ανάλογη του αριθμού των μορίων χρωστικής που έχουν συνδεθεί στην επιφάνεια του κυττάρου και στην ικανότητα απόδοσης φωτονίων της χρωστικής (συντελεστής κβάντωσης - quantum yield). 5 Οι υπόλοιποι κάθετοι

φωτοανιχνευτές στην πηγή ακτινοβολίας συλλέγουν τον φθορισμό που εκπέμπεται από τις χρωστικές των σωματιδίων. 1,2 Σε ένα δείγμα μπορούν να προστεθούν περισσότερες από μία φθορίζουσες χρωστικές έτσι ώστε να γίνει ταυτόχρονη μέτρηση πολλών παραμέτρων. Στην περίπτωση αυτή οι διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές μπορούν να έχουν το ίδιο excitation wavelength αλλά πρέπει να έχουν διαφορετικό emission wavelength για να μπορεί να γίνει διάκριση του σήματος που στέλνει η κάθε χρωστική. 6 Ωστόσο, όσο περισσότερες είναι οι φθορίζουσες ουσίες που χρησιμοποιούνται, τόσο πολυπλοκότερη γίνεται και η διαδικασία διαχωρισμού και πιθανής επικάλυψης της εκπομπής φθορισμού των χρωστικών. Η αφαίρεση των κοινών τόπων μήκους κύματος εκπομπής μεταξύ των φθοριζουσών ουσιών γίνεται με τη ρύθμιση που είναι γνωστή ως αντιστάθμιση ή χρωματικός διαχωρισμός (compensation). 3 Σχήμα 8: Αλληλοεπικάλυψη φασμάτων εκπομπής φλουορεσκίνης (FITC) και φυκοερυθρίνης (ΡΕ) (spectral overlap) [Ανατύπωση από: Αρχείο Εργαστηρίου Διαγνωστικής Κυτταρολογίας, ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ», Ε.Κ.Π.Α.]

Σχήμα 9: Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος σεσημασμένα με CD8-FITC. A. Χωρίς αντιστάθμιση φθοριοχρωμάτων (Uncompensated). B. Με αντιστάθμιση φθοριοχρωμάτων (Correctly compensated). C. Υποαντιστάθμιση φθοριοχρωμάτων (Under compensated). D. Υπεραντιστάθμιση φθοριοχρωμάτων (Over compensated) Η συνέπεια αυτής της φασματικής αλληλεπικάλυψης είναι ότι τα επισημασμένα με FITC κύτταρα φαίνεται να έχουν και φθορισμό ΡΕ. Για να αποκτήσουμε μια αληθινή αναπαράσταση των δεδομένων, θα πρέπει να εφαρμοστεί μια διόρθωση. Η διόρθωση αυτή ονομάζεται αντιστάθμιση χρώματος. Η φασματική επικάλυψη μπορει να αντισταθμηθει αφαιρώντας ένα κλάσμα από το σήμα της ΡΕ (σχήμα Β). Στο σχήμα C, τα δεδομένα είναι υποαντισταθμησμένα, δηλαδή, έχει αφαιρεθεί από το κανάλι ΡΕ πολύ μικρό μερος του σήματος της ΡΕ. Στο σχήμα D φαίνεται η επίδραση της υπεραντιστάθμησης του φθοριοχρώματος, δηλαδη της αφαίρεσης από το κανάλι ΡΕ πολύ μεγάλου μέρους του σήματος της ΡΕ. [Ανατύπωση από: Graeme Chapman, then at Beckman Coulter, Australia. http://flowbook.denovosoftware.com/flow_book/chapter_5%3a_immunofluorescence_and_colour_ Compensation]

Σχήμα 10: Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος σεσημασμένα με CD4-PE και CD8-ECD. A. Χωρίς αντιστάθμιση φθοριοχρωμάτων B. Με αντιστάθμιση φθοριοχρωμάτων. Υπάρχει επικάλυψη ECD σε ΡΕ και ΡΕ σε ECD. Η αντιστάθμιση πρέπει να εφαρμόζεται και στις δύο κατευθύνσεις για να είναι σωστά τα δεδομένα. (Να σημειωθεί ότι τα CD4 και CD8 αλληλοαναιρούνται επί των Τ κυττάρων περιφερικού αίματος) [Ανατύπωση από: Graeme Chapman, then at Beckman Coulter, Australia. http://flowbook.denovosoftware.com/flow_book/chapter_5%3a_immunofluorescence_and_colour_ Compensation]

1.3. ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Η απεικόνιση των δεδομένων γίνεται με μονοπαραμετρικά, διπαραμετρικά ή τριπαραμετρικά διαγράμματα. Η πιο συχνή απεικόνιση γίνεται με διπαραμετρικά διαγράμματα και οι τύποι των απεικονίσεων είναι το dot plot, density plot, contour plot και 3D plot. Η dot plot απεικόνιση παρουσιάζει τις τιμές δύο διαφορετικών χαρακτηριστικών του κυττάρου, έχει όμως το μειονέκτημα του κορεσμού, δηλαδή όταν υπάρχουν πολλά σημεία σε μία περιοχή δεν είναι δυνατή η διάκριση ποσοτικών διαφορών, ενώ οι υπόλοιπες τρεις απεικονίσεις δείχνουν με ακριβέστερο τρόπο τις αναλογίες των κυτταρικών πληθυσμών. Η density plot απεικόνιση (διάγραμμα πυκνότητας) συγκεκριμένα παρουσιάζει τις τιμές 2 διαφορετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων αλλά παρουσιάζει με διαφορετικό χρώμα κύτταρα με παραπλήσιες τιμές και για τα 2 χαρακτηριστικά. Τέλος η contour plot απεικόνιση (διάγραμμα εμβαδού) παρουσιάζει τις τιμές 2 διαφορετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων αλλά παράλληλα διαχωρίζει σε διαφορετικές περιοχές κύτταρα με παραπλήσιες τιμές και για τα 2 χαρακτηριστικά. 1,2 Σχήμα 11: Στικτογράμματα (Dot Blots) [Ανατύπωση από: Αρχείο Εργ. Κυτταρομετρίας Ροής ΓΝΑ Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ -Βασικές αρχές κυτταρομετρίας ροής Γ.Πατεράκης]

Σχήμα 12: Στικτογράμματα (Density Blots) [Ανατύπωση από: Αρχείο Εργ. Κυτταρομετρίας Ροής ΓΝΑ Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ -Βασικές αρχές κυτταρομετρίας ροής Γ.Πατεράκης] Σχήμα 13: Στικτογράμματα (Αθροίσματα Clusters) [Ανατύπωση από: Αρχείο Εργ. Κυτταρομετρίας Ροής ΓΝΑ Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ -Βασικές αρχές κυτταρομετρίας ροής Γ.Πατεράκης]

Πολύ συχνή είναι και η χρήση ιστογραμμάτων που είναι μονοπαραμετρικά διαγράμματα, παρουσιάζουν δηλαδή τις τιμές ενός χαρακτηριστικού των κυττάρων σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων όταν μελετάται ένα μόνο στοιχείο ανά κυτταρικό πληθυσμό. 6 Σχήμα 14: Διαφορετικές μορφές ιστογραμμάτων (histogram) όσον αφορά την μορφολογία και την ένταση φθορισμού [Ανατύπωση από: Αρχείο Εργ. Κυτταρομετρίας Ροής ΓΝΑ Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ -Βασικές αρχές κυτταρομετρίας ροής Γ.Πατεράκης]

1.4. ΠΟΛΥΠΑΡΑΜΕΤΡΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Βασικό χαρακτηριστικό της κυτταρομετρίας ροής (με φθορισμό) είναι η δυνατότητα σύγχρονης ανάλυσης πολλών κυτταρικών χαρακτηριστικών, γνωστή ως πολυπαραμετρική ανάλυση. 7 Η λογική των πολλών παραμέτρων (>4 παράμετροι) υπόκειται στο πεδίο της πολυπαραμετρικής κυτταρομετρίας ροής και έχει οδηγήσει στη χρήση πολλών χρωμάτων ταυτόχρονα (πολυχρωματική ανάλυση), συντελώντας σε δεκαετίες συνεχούς προόδου της μεθόδου από το 1990 έως σήμερα. 8 Θεωρητικά, η πολυπαραμετρική ανάλυση είναι ιδιαίτερα ισχυρή καθώς παρέχει περισσότερα δεδομένα από λιγότερη ποσότητα δείγματος, γεγονός ιδιαίτερα σημαντικό σε περιπτώσεις που το δείγμα είναι περιορισμένο. Επιτρέπει επιπλέον την ακριβέστερη ταυτοποίηση κυτταρικών πληθυσμών αποκλείοντας ανεπιθύμητα κύτταρα και δίνει τη δυνατότητα ταυτοποίησης κυττάρων με πολύπλοκους φαινοτύπους, όπως αυτοί σε περιπτώσεις κακοηθών αιματολογικών νοσημάτων. 8 Η πολυπαραμετρική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής έχει διάφορες κλινικές και εργαστηριακές εφαρμογές, αλλά και πολλαπλάσιες ερευνητικές εφαρμογές κυρίως στο αντικείμενο της αιματολογίας και της ογκολογίας. Συγκεκριμένα, οι κλινικές/πρακτικές εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής αγγίζουν το ενδιαφέρον πολλών ιατρικών ειδικοτήτων όπως της γενικής παθολογίας και της παιδιατρικής οι οποίες συχνά τη χρησιμοποιούν διαγνωστικά, της παθολογοανατομίας και της κυτταρολογίας οι οποίες βρίσκουν σε αυτήν έναν πολύτιμο συνεργάτη που βοηθάει και επιταχύνει τη διάγνωση αλλά και μιας σειράς άλλων ιατρικών ειδικοτήτων όπως η πνευμονολογία με την ανάλυση του BAL, η νευρολογία με την ανάλυση του ΕΝΥ και η οφθαλμολογία με την ανάλυση του υαλοειδούς και υδατοειδούς υγρού. 7,8

2 - ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 2.1. ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Δείγματα όπως η βιοψία δια λεπτής βελόνας (FNA), το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (CSF), το υαλοειδές ή υδατοειδές οφθαλμικό υγρό (OF) και άλλα βιολογικά υγρά του ανθρωπίνου σώματος (BF), είναι σύνηθες να αποστέλλονται για ανοσοφαινοτυπική διερεύνηση με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής, καθώς με την ανάλυση τους παρέχονται σχετικές πληροφορίες για τη διάγνωση, ταξινόμηση και παρακολούθηση των αιματολογικών κακοηθειών. Ωστόσο, τα εν λόγω δείγματα μπορεί να περιέχουν έναν πολύ χαμηλό αριθμό κυττάρων, γεγονός που πιθανά αποτελεί πρόβλημα ενός εργαστηρίου κυτταρομετρίας ροής ρουτίνας καθώς η σπανιότητα των κυττάρων περιορίζει τον αριθμό των δοκιμών που μπορούν να εκτελεστούν στο δείγμα. Με τον όρο εξαιρετικά ολιγοκυτταρικά (paucicellular), χαρακτηρίζονται τα δείγματα με συνολικό αριθμό κυττάρων χαμηλότερο των 0.3*10 6 κυττάρων ανά μl δείγματος 9 και δεν υπάρχουν πολλά δεδομένα για αυτά στη βιβλιογραφία καθώς η ανάλυσή τους αποτελεί μια διαγνωστική πρόκληση. Σε αυτές τις περιπτώσεις, είναι υποχρεωτικό να ληφθούν όσες δυνατόν περισσότερες πληροφορίες γίνεται από ένα μόνο σωλήνα (single tube assay) 9,10 και η ανάλυση των δειγμάτων αυτών με κυτταρομετρία ροής αποτελεί μία πολλά υποσχόμενη λύση. Παραδοσιακά, η μορφολογία αποτελούσε τη βέλτιστη μέθοδο ανίχνευσης κακοήθων λευκοκυττάρων για διαγνωστικούς σκοπούς στο ENY και το υαλοειδές και υδατοειδές υγρό, τα οποία συνήθως είναι ολιγοκυτταρικά. 11,12 Είναι πλέον γνωστό όμως ότι ο κίνδυνος ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων από τη μορφολογική εκτίμηση είναι υψηλός 13-16 γεγονός που σχετίζεται με την χαμηλή κυτταρική βιωσιμότητα των υλικών, τη συχνά δύσκολη διάκριση μεταξύ καλοηθών και κακοηθών κυττάρων αλλά και λόγω της σπανιότητας των κυττάρων στα δείγματα προς εξέταση. 13,17-19 Γι αυτό το λόγο ο ανοσοφαινότυπος ζητείται όλο και περισσότερο ως συμπλήρωμα της συμβατικής κυτταρολογίας 20-24 στην αξιολόγηση

του ασθενή, καθώς η κυτταρολογική ανάλυση από μόνη της μπορεί να δώσει αμφίβολα αποτελέσματα. 9 Η πολυχρωματική ανάλυση με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής παρέχει την ευκαιρία να αξιολογηθούν πολλαπλά αντιγόνα ταυτόχρονα και αποτελεί μια αρκετά καλή μέθοδο ανίχνευσης και χαρακτηρισμού των κυτταρικών πληθυσμών σε δείγματα περιορισμένου όγκου ή/και χαμηλής κυτταροβρίθειας. 25 Συνδυάζει την υψηλή εξειδίκευση με την καλή κλινική ευαισθησία και αρκετές μελέτες, τονίζουν τη σημασία της κυτταρομετρίας ροής στην αποτελεσματική και αξιόπιστη διάγνωση αλλά και τον αποκλεισμό ύπαρξης λεμφώματος ΚΝΣ ή IOL. 13,14,16,26,27-33 Έτσι, η ικανότητα να αποκτηθούν αξιόπιστες πληροφορίες για την κυτταρική σύνθεση, το μέγεθος και τη μορφολογία των κυττάρων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής μειώνει τον συνολικό αριθμό ύπαρξης μη ανεπαρκών αποτελεσμάτων που λαμβάνονται όταν τα δείγματα αναλύονται βάσει μορφολογίας και μόνο.

2.2. ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 2.2.1. ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ (ΕΝΥ) Ο εντοπισμός νόσου στο κεντρικό νευρικό σύστημα (CNS) αποτελεί μία σχετικά σπάνια επιπλοκή σε έδαφος μη Hodgkin λεμφώματος (NHL-CNSL) που συνδέεται με δυσμενή πρόγνωση. 13,27 Η ακριβής συχνότητα ποικίλλει ανά ιστολογικό υπότυπο (από <5% σε χαμηλού βαθμού λεμφώματα Β-κυττάρων έως 20% σε επιθετικά λεμφώματα Β-κυττάρων) 13,14,26,34-36 και είναι συχνό μερικοί ασθενείς να παρουσιάζουν νευρολογικά συμπτώματα που θα μπορούσαν να είναι συμβατά με λέμφωμα ΚΝΣ, αλλά χωρίς αποδεικτικά στοιχεία για παρουσία λεμφώματος σε άλλες περιοχές του σώματος. Οι περιπτώσεις πρωτογενούς λεμφώματος ΚΝΣ (PCNSL) δε, είναι ακόμη λιγότερο συχνές από ότι ο δευτερογενής εντοπισμός λεμφώματος ΚΝΣ (SCNSL), και έχουν παρόμοια κακή κλινική πορεία. Η σημαντικότερη κλινική εφαρμογή της ανοσοφαινοτυπικής μελέτης του ΕΝΥ με ΚΡ είναι η ανίχνευση μηνιγγικής προσβολής σε ασθενείς με κακοήθη αιματολογικά νοσήματα, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις μυελικών ή Β-λεμφοκυτταρικών νεοπλασιών. Παραδοσιακά, η ανίχνευση της διήθησης των μηνιγγών ασθενών με συμβατή νευρολογική συμπτωματολογία ή νεοδιανωσθέντων ασθενών με υψηλό κίνδυνο προσβολής του ΚΝΣ, γίνεται με μορφολογική εξέταση του ΕΝΥ δεδομένου ότι οι απεικονιστικές τεχνικές όπως η MRI, έχουν χαμηλή ευαισθησία. 37 Έχει αποδειχθεί όμως ότι η πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής (χρήση 4-6 χρωμάτων) έχει ευαισθησία τουλάχιστον 2-3 φορές υψηλότερη από ότι η κυτταρομορφολογία στην ανίχνευση λεπτομηνιγγικής νόσου σε δείγματα εγκεφαλονωτιαίου υγρού ασθενών με επιθετικό Β-NHL υπερτερώντας σημαντικά σε δείγματα με συγκέντρωση κυττάρων <60 /κκχ. 13,14,26,37,38 Επιπλέον, η κυτταρομετρία ροής είναι εξαιρετικά σημαντική σε περιπτώσεις νεοπλασματικής νόσου του ΚΝΣ όταν η εγκεφαλική βιοψία του όγκου δεν είναι δυνατή, καθώς και σε πρόδρομες οξείες λευχαιμίες (precursor ALLs) όταν είναι ύποπτη η υποτροπή νόσου στο ΚΝΣ αλλά στη κυτταρομορφολογική μελέτη του ΕΝΥ δεν υπάρχουν παθολογικά ευρήματα. Στις περιπτώσεις αυτές μάλιστα, ένα

δείγμα ΕΝΥ μπορεί να χαρακτηριστεί ως θετικό ακόμη και αν είναι υποκυτταρικό και τα αντιδραστικά κύτταρα είναι πιο συχνά από τα κακοήθη. 39 Τέλος, μελέτες λευκοκυτταρικών πληθυσμών με κυτταρομετρία ροής στο ΕΝΥ πραγματοποιούνται και στη προσπάθεια κατανόησης της παθοφυσιολογίας νευρολογικών νοσημάτων όπως η πολλαπλή σκλήρυνση 40 και η νόσος Alzheimer 41, όπως επίσης και σε έναν μεγάλο κατάλογο διαφόρων παθολογικών καταστάσεων που προκαλούν πλειοκυττάρωση στο ΕΝΥ. 37 Λεμφοκυτταρικός Πληθυσμός Μέση τιμή (κύτταρα/μl) 5 η και 95 η εκατοστιαία θέση (κύτταρα/μl) Τ- Λεμφοκύτταρα 0,46 0,2-2,02 CD4+ Τ- Λεμφοκύτταρα 0,34 0,12-1,36 CD8+ Τ- Λεμφοκύτταρα 0,13 0,06-1 Β-Λεμφοκύτταρα 0,005 0-0,034 ΝΚ- Κύτταρα 0,011 0,002-0,058 Πίνακας 1: Φυσιολογικές τιμές λεμφοκυτταρικών πληθυσμών στο ΕΝΥ ενηλίκων 42

2.2.2. ΥΛΙΚΟ ΟΦΘΑΛΜΙΚΗΣ ΒΙΟΨΙΑΣ Τα ενδοφθάλμια λεμφώματα (IOL) μπορεί είτε να εκδηλωθούν πρωταρχικά στο μάτι (PIOL), είτε να παρουσιαστούν ως κλινική εκδήλωση παράλληλα με λέμφωμα του ΚΝΣ. 43,44 Η πλειοψηφία (60-85%) των ασθενών με PIOL μάλιστα, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία παρουσιάζει λέμφωμα ΚΝΣ εντός 2-2,5 ετών μετά την αρχική διάγνωση. 44 Οι δύο τύποι λεμφώματος σχηματίζουν έτσι ένα φάσμα της ίδιας νόσου που ονομάζεται οφθαλμο-εγκεφαλικό λέμφωμα (PIOL/PCNSL). Μπορεί επίσης να παρουσιαστεί IOL και δευτερογενώς (SIOL). Τα PIOL εκτιμάται ότι αντιπροσωπεύουν έως και 1-2% του συνόλου των εξωλεμφαδενικών λεμφωμάτων 44 και ως επί το πλείστον προέρχονται από την Β κυτταρική σειρά (τύπου DLBCL) 45 ενώ τα τύπου Τ-κυττάρων IOL συνδέονται συχνά με δερματικά λεμφώματα Τ-κυττάρων ή άλλα συστηματικά λεμφώματα Τ-κυττάρων. 44 Κατά τις τελευταίες δεκαετίες αύξηση των PCNSL, και ενδεχομένως επίσης των PIOL, έχει παρατηρηθεί σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς. Γενικά από PIOL νοσούν συνήθως ενήλικα άτομα (μέσης ηλικίας 50-60 ετών) και τυπικά τα PIOL παρουσιάζονται ως χρόνιες, συχνά ανθεκτικές, ραγοειδίτιδες ή φλεγμονές του υαλοειδούς σώματος του ματιού (σύνδρομο μεταμφίεσης) 43,44 γεγονός που αποτελεί και το λόγο μιας σημαντικής καθυστέρηση (8-21 μηνών) της σωστή διάγνωσης της νόσου. 10,44 Σε οφθαλμικά δείγματα (υαλοειδές και υδατοειδές υγρό) η κυτταρομετρία ροής έχει πρόσφατα χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό αντιδραστικών Τ- λεμφοκυττάρων σε περιπτώσεις ραγοειδίτιδας και για τη διάγνωση ενδοφθάλμιων λεμφωμάτων. 46-48

2.2.3. ΒΙΟΨΙΑ ΔΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΒΕΛΟΝΗΣ (FNA) Σε βιοψίες δια λεπτής βελόνης (FNA), η ανάλυση με κυτταρομετρία ροής αποτελεί διαδικασία επιλογής για τη διάγνωση και σταδιοποίηση διαφόρων κακοηθειών του γαστρεντερικού συστήματος, της μεσοθωρακικής περιοχής καθώς και σε τοποθεσίες που μπορεί να είναι δύσκολο να αποκτηθεί πρόσβαση από άλλες μεθόδους (βιοψία θυρεοειδή αδένα και λεμφαδενών). Αποτελεί τεχνική ανάλυσης που έχει εφαρμοστεί με επιτυχία στην ανίχνευση λεμφωμάτων. 49-52 Γενικά τα περισσότερα δείγματα FNA δεν είναι ολιγοκυτταρικά και η επεξεργασία τους δεν διαφέρει από αυτή των προηγούμενων βιολογικών υγρών. Περιλαμβάνει τη δημιουργία εναιωρήματος κυττάρων προς ανάλυση με τη χρήση (συνήθως) θρεπτικού υλικού RPMI και σε περιπτώσεις ύπαρξης συσσωματωμάτων κυττάρων (aggregates) το δείγμα περνάται από ειδικό φίλτρο ή βελόνα 25-G, δύο με τρείς φορές, για να εξασφαλιστεί η απόκτηση των κυττάρων προς ανάλυση από το υλικό βιοψίας. 9 2.2.4. ΆΛΛΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Κάθε βιολογικό υλικό απ το οποίο μπορεί να δημιουργηθεί εναιώρημα κυττάρων είναι κατάλληλο για ανοσοφαινοτυπική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. 1,2 Σε δείγματα όπως το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) καθώς και άλλα ορώδη υγρά όπως το πλευριτικό, το περικαρδιακό και το περιτοναικό υγρό (διιδρώματα και εξιδρώματα) είναι πιθανό να ζητηθεί ανοσοφαινοτυπική ανάλυση σε ποικιλία παθολογικών καταστάσεων. 53,54 Γενικότερα όμως, οι όγκοι των εν λόγω συλλογών είναι μεγάλοι και τα δείγματα σπάνια ολιγοκυτταρικά, οπότε σε αντίθεση με τα άλλα βιολογικά υλικά συνίσταται συμπύκνωση των δειγμάτων πριν την διαδικασία παρασκευής. 9

2.3. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Η επιλογή του καταλληλότερου συνδυασμού δεικτών για ανοσοφαινοτυπική ανάλυση πρέπει να επιλέγεται με βάση την εμπειρία και ανάλογα του ιστορικού του ασθενή. Ο σημαντικότερος δείκτης αναγνώρισης των λευκών αιμοσφαιρίων είναι το πανλευκοκυτταρικό αντιγόνο CD45, ειδικά σε ιστούς εξωλεμφαδενικής προέλευσης (π.χ. δείγματα μαστού, πνεύμονα, θυρεοειδούς αδένα κλπ) όπου μπορεί να βρεθούν και μη αιμοποιητικά κύτταρα στα δείγματα. 55,56 Για τον προσδιορισμό των κύριων πληθυσμών λεμφοκυττάρων, χρησιμοποιούνται τα παν-t και παν-β αντισώματα επιτρέποντας μάλιστα και την αναγνώριση της αντιδραστικής ή νεοπλασματικής φύσης της βλάβης. Ο δείκτης CD5 είναι χρήσιμος για τον εντοπισμό των Τ κυττάρων και των φυσιολογικών Β υποπληθυσμών και αναγκαίος για την ανίχνευση μικρών νεοπλασματικών Β κυττάρων στην περίπτωση των CD5+ Β λεμφοϋπερπλαστικών διαταραχών. 57 Παρομοίως, ο δείκτης CD10 είναι χρήσιμος στην ανίχνευση νεοπλασματικών Β κυττάρων 57 ή Τ κυττάρων στην περίπτωση του αγγειοανοσοβλαστικού λεμφώματος. 58 Τέλος, ο δείκτης CD19 σχετίζεται με την ανίχνευση νόσου στο ΚΝΣ σε περιπτώσεις DLBCL και λεμφωμάτων burkitt 59 ενώ σε συνδυασμό με τo δείκτη CD20 μπορεί να συμβάλει στη διάγνωση πρωτοπαθούς ενδοφθάλμιου λεμφώματος (PIOL). 60 Ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα για την ανίχνευση του πληθυσμού των ΝΚ κυττάρων δεν υπάρχουν και σπάνια ανιχνεύονται σε FNA και BF από ασθενείς που έχουν προσβληθεί από λέμφωμα. Παρ 'όλα αυτά, τα ΝΚ κύτταρα αναγνωρίζονται έμμεσα ως μη Β / μη Τ κύτταρα. 9

2.4. ΚΡΙΣΙΜΑ ΣΗΜΕΙΑ ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΟΛΙΓΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 2.4.1. ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ Η βιωσιμότητα των κυττάρων είναι συνήθως υψηλή (> 95%) σε φρέσκα δείγματα. Οι FNA και τα ορώδη υγρά μπορεί ωστόσο να περιέχουν μεγάλη ποσότητα νεκρών κυττάρων ή σκουπίδια (debris), λόγω κυτταρικής απόπτωσης, γι αυτό το λόγο είναι αναγκαίο τα δείγματα να επεξεργάζονται σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά τη συλλογή τους για την ελαχιστοποίηση των επιπτώσεων του κυτταρικού θανάτου (αυτόλυση) και να διατηρούνται σε θρεπτικό υλικό κατά τη μεταφορά και αποθήκευσή τους (RPMI). 9,10,26 Επιπλέον, αν η ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης έχει καταστραφεί, μερικά αντισώματα μπορεί να περάσουν μέσα στα νεκρά ή κατεστραμμένα κύτταρα με αποτέλεσμα την μη ειδική σήμανση και κατ επέκταση φθορισμό τους κατά την ανάλυση, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένη ερμηνεία των δεδομένων. Γι' αυτό το λόγο, δείγματα με βιωσιμότητα χαμηλότερη από 50 % συνήθως πρέπει να απορρίπτονται ή να επεξεργάζονται με ειδικές τεχνικές (πχ σήμανση με χρωστικές απόπτωσης βλ.syto16 ΜΡ) έτσι ώστε τα νεκρά κύτταρα να είναι δυνατόν να εξαιρεθούν της ανάλυσης 9 και τυχόν σήματα λόγω μη ειδικών συνδέσεων και χρώσης του υποβάθρου (background staining) να μπορούν να εντοπιστούν και να εξαιρεθούν. Πέρα από τον γρήγορο κυτταρικό θάνατο, ένα ακόμα πρόβλημα που συχνά παρουσιάζεται αποτελεί η πρόσμιξη των δειγμάτων με περιφερικό αίμα κατά τη λήψη τους. Το γεγονός αυτό κάνει ακόμα δυσκολότερη την απομόνωση και ανίχνευση του παθολογικού πληθυσμού που πιθανά υπάρχει στο δείγμα και η ανάλυση χρήζει ιδιαίτερης προσοχής. Γενικά για την απομάκρυνση των ερυθροκυττάρων το δείγμα επεξεργάζεται με χλωριούχο αμμώνιο (λύση) 1,2 και έπειτα κατά την ανάλυση, αξιολογείται το ποσοστό των κυτταρικών πληθυσμών του δείγματος κατά περίπτωση και με βάσει την εμπειρία. Προσοχή αντίστοιχα πρέπει να δίνεται και σε περιπτώσεις ύπαρξης αντιδραστικής λεμφοκυττάρωσης και

μονοκυττάρωσης του δείγματος, όπου η αναζήτηση συγκεκριμένου πληθυσμού γίνεται σύμφωνα με τα εκάστοτε κλινικά δεδομένα. 54 2.4.2. ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Η ύπαρξη ελεύθερων ανοσοσφαιρινών στα δείγματα είναι αρκετά συχνή. Γενικά, σε περιπτώσεις ανίχνευσης έκφρασης ελαφριάς αλυσίδας κ, λ στην επιφάνεια των Β κυττάρων απαιτείται η απομάκρυνση των ελεύθερων ανοσοσφαιρινών για την αποφυγή των μη ειδικών συνδέσεων. Αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί με πλύσιμο του δείγματος με 3 έως 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος (PBS/FBS) μετά τη πρώτη φυγοκέντριση του δείγματος (βήμα συμπύκνωσης), ή με πλύση μετά το στάδιο λύσης των ερυθροκυττάρων με χλωριούχο αμμώνιο. 1,2 Γενικά βέβαια, οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι πλυσίματος θα πρέπει να αποφεύγονται, διότι αυτό οδηγεί σε υπερβολική απώλεια κυττάρων. 9 2.4.3. ΒΕΛΤΙΣΤΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΓΕΓΟΝΟΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗΣ Δεδομένης της χαμηλής κυτταροβρίθειας των ολιγοκυτταρικών δειγμάτων, είναι σημαντικό να εξεταστεί πόσα γεγονότα είναι επαρκή για να καθοριστεί ένας πληθυσμός και να εξαχθεί η διάγνωση. Γενικά, πολλές μελέτες έχουν ασχοληθεί με το συγκεκριμένο θέμα, και δεν υπάρχει γενική συναίνεση σχετικά με τον ελάχιστο αριθμό των γεγονότων (events) που πρέπει να χαρακτηριστούν ως θετικά για την ανίχνευση κακοήθειας. Συνήθως ένα ομοιογενές σύνολο (cluster) από 25 έως 30 κύτταρα που πληρούν τα κριτήρια των νεοπλασματικών/κακοηθών κυττάρων ή ένας διακριτός πληθυσμός κυττάρων με φαινότυπο χαρακτηριστικό μιας νοσολογικής οντότητας, μπορεί να θεωρείται ως θετικό αποτέλεσμα. 16,46,61 Μάλιστα, οι τελευταίες οδηγίες της ICSH/ICCS υποστηρίζουν ότι για την ακριβή ταυτοποίηση κλώνου ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου απαιτείται αναγνώριση ενός συνόλου 10 κυττάρων, αλλά αυτή η λεπτομέρεια πρέπει να προσδιορίζεται και να επαληθεύεται ειδικά και εξατομικευμένα για τη κάθε περίπτωση ασθενή. 62

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Κυτταρομετρίας Ροής του Ανοσολογικού τμήματος και Εθνικού Κέντρου Ιστοσυμβατότας ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς, το χρονικό διάστημα από τον Φεβρουάριο 2015 έως τον Δεκέμβριο του 2015. Από το σύνολο των βιολογικών υλικών που έφτασαν στο εργαστήριο προς ανάλυση, επιλέχθησαν δείγματα πέραν μυελού και αίματος όπως ΕΝΥ, υαλοειδές και υδατοειδές υγρό, τα οποία θεωρούνται κατά βάση ολιγοκυτταρικά. Τα δείγματα αυτά επεξεργάστηκαν με μία ειδική διαδικασία και αναλύθηκαν με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής άμεσα μετά τη παραλαβή τους. Γενικά η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής δειγμάτων πολύ χαμηλού αριθμού κυττάρων, αποτελεί πρόκληση ενός εργαστηρίου κυτταρομετρίας ροής ρουτίνας καθώς η σπανιότητα των κυττάρων περιορίζει τον αριθμό των δοκιμών που μπορούν να εκτελεστούν στο δείγμα και η διάγνωση πολλές φορές είναι επισφαλής. Σκοπός της εργασίας ήταν η χρήση μιας μεθόδου ανάλυσης των ολιγοκυτταρικών δειγμάτων με κυτταρομετρίας ροής, η οποία συνδυάζει την χρήση πολλαπλών μονοκλωνικών αντισωμάτων και της ειδικής φθοριοχρωστικής νουκλεϊκών οξέων syto16 ως ειδικό ανιχνευτή των εμπύρηνων κυττάρων των δειγμάτων, με μια Boolean gating στρατηγική για τον εντοπισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό των κύριων πληθυσμών λεμφοκυττάρων, καθώς και την διάκριση των φυσιολογικών από των νεοπλασματικών κυττάρων σε περιπτώσεις υποψίας ύπαρξης αιματολογικής κακοήθειας (λευχαιμία, λέμφωμα), ή για την παρακολούθηση ήδη διαγνωσμένων αιματολογικών κακοηθειών των ασθενών. 26

2. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΓΜΑΤΑ Η μελέτη περιλάμβανε (10) περιπτώσεις ενηλίκων ασθενών οι οποίες παραπέμφθηκαν για ανοσοφαινοτυπική μελέτη στο εργαστήριο Κυτταρομετρίας Ροής του Ανοσολογικού Τμήματος και Εθνικού Κέντρου Ιστοσυμβατότητας του Γ.Ν.Α. «Γ. Γεννηματάς», από τον Φεβρουάριο 2015 έως τον Δεκέμβριο του 2015. Από τους 10 ασθενείς το 70% (Ν= 7) ήταν άντρες με μέση ηλικία τα 41 έτη και το 30% (Ν= 3) ήταν γυναίκες μέσης ηλικίας 65,5 έτη. Η μέση ηλικία συνολικά των ατόμων ήταν τα 55,3 έτη. Η λήψη των δειγμάτων έγινε κατά την αρχική διάγνωση και κατά την υποτροπή, και στη συνέχεια περιοδικά, ανάλογα με τη θεραπεία που ακολούθησαν οι ασθενείς ή τη γενικότερη παρακολούθησή τους με σκοπό την ανίχνευση της Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου (MRD). Το υλικό της μελέτης κατά την αρχική διάγνωση περιλάμβανε στη πλειονότητα των ασθενών Εγκεφαλονωτιαίο υγρό (80%, Ν=8),Υαλοειδές υγρό (10%, Ν=1), Υδατοειδές υγρό (10%, Ν=1). Συνολικά μελετήθηκαν 40 δείγματα ασθενών. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν σε χρονικό διάστημα 2-3 ωρών από τη λήψη τους. 27

ΑΣΘΕΝΗ Σ Α/Α ΦΥΛΟ ΗΛΙΚΙΑ ΝΟΣΗΜΑ ΔΕΙΓΜΑ ΑΡ. ΔΕΙΓΜΑ ΤΩΝ ΔΙΑΣΤΗΜΑ ΠΑΡΑΚΟΛΟ ΥΘΗΣΗΣ 1 Α 69 Β ΟΛΛ ΕΝΥ 1 22/4 2 Α 29 Β ΟΛΛ ΕΝΥ 5 24/2 8/4 3 A 70 ΟΜΛ (Μ4) ΕΝΥ 11 20/4 17/12 4 Α 53 ΟΜΛ (Μ4) Λευχαιμική Μηνιγγίτιδα ΕΝΥ 4 22/4 1/9 5 Α 43 Λέμφωμα Burkitt ΕΝΥ 7 5/5 28/9 6 Α 47 Λέμφωμα Burkitt ΕΝΥ 7 24/3 30/10 7 Θ 61 Λέμφωμα Burkitt ΕΝΥ 2 17/6 17/7 8 Α 41 Λέμφωμα Burkitt ΕΝΥ 1 2/9 9 Θ 70 Ενδοφθάλμιο Λέμφωμα Υδατοειδές Υγρό 1 23/4 10 Θ 70 Ραγοειδίτιδα Υαλοειδές Υγρό 1 17/4 Πίνακας 2: Στοιχεία ασθενών μελέτης 28

3. ΜΕΘΟΔΟΣ Τα δείγματα των ασθενών που βρίσκοταν σε φάση διάγνωσης ή παρακολούθησης, επεξεργάζονταν με συνδυασμό πρωτοκόλλων (panels) ο οποίος περιλάμβανε μονοκλωνικά αντισώματα για τη μονοκυτταρική και τις Β και Τ λεμφικές σειρές. Για τη μονοκυτταρική σειρά και τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν τα μονοκλωνικά αντισώματα CD14 και CD16 (μακροφάγα), για τη Β λεμφική σειρά τα μονοκλωνικά αντισώματα CD19 και CD20 και για τη Τ λεμφική σειρά τα μονοκλωνικά αντισώματα CD4 και CD8. Επίσης χρησιμοποιήθηκε το πανλευκοκυτταρικό αντιγόνο CD45 και ο δείκτης CD235a (γλυκοφορίνη α) ως ειδικός ανιχνευτής των ερυθρών αιμοσφαιρίων για τη διερεύνηση πρόσμιξης περιφερικού αίματος στα δείγματα των ασθενών σε περιπτώσεις τραυματικής παρακέντησης κατά τη λήψη του δείγματος. Τέλος, χρησιμοποιήθηκε η νουκλεϊκή φθοριοχρωστική SYTO16 Green (MOLECULAR PROBES, Eugene, OR, USA) ως ειδικός ανιχνευτής ώστε να αυξηθεί η ευαισθησία ανίχνευσης της ανάλυσης. Αρχικά έγινε προσδιορισμός του ακριβή αριθμού των κυττάρων των δειγμάτων σε Truecount (BD) δοκιμαστικούς σωλήνες με βαθμονομημένο αριθμό σφαιριδίων για τον απόλυτο προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων των δειγμάτων, και συγκεκριμένο συνδυασμό μονοκλωνικών αντισωμάτων που ήταν αναγκαίος για τον πρώτο, κατατοπιστικό έλεγχο των δειγμάτων. Το πρώτο κατατοπιστικό panel αποτελούσε έναν τετραπλό συνδυασμό χρωμάτων (τετραχρωμία) που περιλάμβανε τα μονοκλωνικά αντισώματα CD235a, CD45, CD14, CD16 και τη χρωστική νουκλεϊκών οξέων SYTO16 (MP). Με το συγκεκριμένο panel μελέτης καθορίζεται ο ακριβής αριθμός κυττάρων του δείγματος και το ποσοστό πρόσμιξης του με περιφερικό αίμα και να αξιολογηθεί συνεπώς η καταλληλότητα του για τη συνέχεια της ανάλυσης. Τα δείγματα ασθενών που ήταν κατάλληλα προς ανάλυση και στα οποία διαπιστώθηκε η ύπαρξη κάποιου άγνωστου, ύποπτου κυτταρικού πληθυσμού, εξετάστηκαν με panel που αφορούσε συγκεκριμένη κυτταρική σειρά. Το panel διερεύνησης της Β λεμφικής σειράς αποτελούσε έναν τετραπλό συνδυασμό 29

χρωμάτων (τετραχρωμία) που περιλάμβανε τα μονοκλωνικά αντισώματα CD235a, CD45, CD19, CD20 και τη χρωστική νουκλεϊικών οξέων SYTO16 (MP), ενώ το panel διερεύνησης της Τ λεμφικής σειράς αποτελούσε έναν τετραπλό συνδυασμό χρωμάτων (τετραχρωμία) που περιλάμβανε τα μονοκλωνικά αντισώματα CD235a, CD45, CD4, CD8 και τη χρωστική νουκλεϊκών οξέων SYTO16 (MP). 30

4. ΟΡΓΑΝΑ Ο προσδιορισμός του ανοσοφαινότυπου των δειγμάτων έγινε με τον κυτταρομετρητή ροής FC-500 Beckman Coulter Cytomics (Florida USA). Τα αποτελέσματα των μετρήσεων αποθηκεύονταν σε listmode (LMD) αρχεία και η περαιτέρω επεξεργασία των αποθηκευμένων αρχείων διεξήχθη με το λογισμικό ανάλυσης CXP (Beckman Coulter). Επίσης χρησιμοποιήθηκαν αυτόματες πιπέτες ακριβείας ρυθμιζόμενου όγκου 10μl, 100μl, 1000μl (Finnpippette, Pippetteman) και 50ml (Eppendorf), μηχανικός αναδευτήρας (vortex - KMS1 Minishaker IKA R ) και φυγόκεντρος (Hettich Zentrifugen) σε πρόγραμμα ήπιας φυγοκέντρισης 1260 RPM για t = 5min. Η θερμοκρασία του ψυγείων συντήρησης του stock των μονοκλωνικών αντισωμάτων (Sanyo Labcool) ήταν 3 o C και των λοιπών αντιδραστηρίων ρουτίνας 5 o C (fiocetti scientific refrigerators). Όλα τα δείγματα και αντιδραστήρια χειρίστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου καθ όλα τα στάδια της επεξεργασίας και ανάλυσής τους. Οι γενικές εξετάσεις των δειγμάτων προς ανάλυση για τον υπολογισμό κατά προσέγγιση του αριθμού των κυττάρων του εκάστοτε δείγματος πραγματοποιήθηκαν στους αιματολογικούς αναλυτές ADVIA 2120 (Siemens) και Sappire Cell-Dyn (ABBOTT). 31

5. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ 5.1. Πρότυπα σφαιρίδια κυτταρομετρίας ροής Ποιοτικός Έλεγχος Οργάνου Χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο λειτουργίας του κυτταρομετρητή ροής. Flowcount TM Fluorosperes (Beckman Coulter): Φθορίζοντα μικροσφαιρίδια πολυστυρένιου μεγέθους 10μm σε εναιώρημα υδατικής φύσης που περιέχει 1% φορμαλδεΰδη και επιφανειοδραστικό παράγοντα. Τα σφαιρίδια αυτά χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο μέτρησης του προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού κυττάρων των δειγμάτων στον κυτταρομετρητή ροής. Διεγείρονται σε μήκος κύματος 488 nm και εκπέμπουν σε εύρος 525-700 nm. 63 Flowcheck TM 770 Fluorosperes (Beckman Coulter): Φθορίζοντα μικροσφαιρίδια πολυστυρένιου σε εναιώρημα υδατικής φύσης που περιέχει απορρυπαντικά και συντηρητικά σε συγκέντρωση 10 6 fluorosperes/ml. Τα σφαιρίδια αυτά παρέχουν τη δυνατότητα ρύθμισης της κυψελίδας ροής σε σχέση με τα τμήματα του οπτικού συστήματος και εξασφαλίζουν τη βέλτιστη απόδοση των ανιχνευτών σκέδασης και φθορισμού της ακτίνας laser. Διεγείρονται σε μήκος κύματος 488 nm και εκπέμπουν σε εύρος 525-700 nm. 64 5.2. Αντιδραστήρια μελέτης δειγμάτων Μονοκλωνικά αντισώματα συνδεδεμένα με φθορίζουσες ουσίες: Στη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα συνδεδεμένα με φθορίζουσες ουσίες της εταιρείας Beckman Coulter. (Πίνακας 3) 32

Α Μονοκλωνικά Αντισώματα / Α Ανοσοφαινοτυπικός δείκτης Κλώνος Ανοσοφαινοτυπική έκφραση 1 CD235a D2.10 Ερυθροκύτταρα και ερυθροκυτταρικές προβαθμίδες 2 CD45 J33 Αιμοποιητικά κύτταρα 3 CD8 B9.11 Τ-κύτταρα MHC-I (Τ-κυτταροτοξικά), μερικά θυμοκύτταρα 4 CD4 SFC112T4D1 Τ-κύτταρα MHC-II 1(T4) (Τ-βοηθητικά), μερικά θυμοκύτταρα 5 CD14 RMO52 Μονοκύτταρα, μακροφάγα, κοκκιοκύτταρα (ασθενής έκφραση) 6 CD16 3G8 Μακροφάγα, ΝΚ κύτταρα, ουδετερόφιλα 7 CD19 J4119 Β-κύτταρα από τις πιο πρώιμα αναγνωρίσιμες Β- σειρές κατά την ανάπτυξη των Β κυτταρικών βλαστών, θυλακιακά δενδριτικά κύτταρα 8 CD20 B9E9- Β-λεμφοκύτταρα (HRC20) (ώριμα) Φθορίζουσα Ουσία PE ECD PC5 PC7 PC7 PC7 PC7 PC7 Εταιρεία Beckman Coulter Πίνακας 3: Μονοκλωνικά αντισώματα και φθορίζουσες ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν. 33

Χρωστική νουκλεικών οξέων SYTO16 Green (MOLECULAR PROBES, Eugene, OR, USA): Η Syto16 Green είναι μια πράσινη, κυτταρικά διαπερατή φθοριοχρωστική νουκλεϊκών οξέων. Μπορεί να διεγείρεται στα 488 nm και έχει μεγάλη ενίσχυση του φθορισμού της κατά τη σύνδεση της με νουκλεϊκά οξέα, επιτρέποντας έτσι τη χρήση χαμηλών, μη τοξικών (< 10 nμ) συγκεντρώσεων της στα δείγματα. 65 Χρησιμοποιείται σε αραίωση 1:10 (5μl 1mΜ Stock Solution + 1000μl NS 0,9%). Αποτελεί χρωστική διερεύνησης της απόπτωσης 66-68 των κυττάρων και ειδικό ανιχνευτή των εμπύρηνων κυττάρων (λευκών αιμοσφαιρίων) ώστε να αυξηθεί η ευαισθησία της ανάλυσης. 65,69 Αντιδραστήριο λύσης ερυθρών αιμοσφαιρίων FACS TM Lysing Solution 10x (Becton Dickinson, BD ): Χρησιμοποιήθηκε για τη λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων των δειγμάτων σε αραίωση 1:10 με αποσταγμένο νερό. Μονιμοποιητικό διάλυμα Fixative IOTest3 TM Solution 10x (Beckman Coulter): Χρησιμοποιήθηκε ως μονιμοποιητικό των κυττάρων των δειγμάτων σε αραίωση 1:10 με PBS. Έχει βάση τη φορμαλδεΰδη και προκαλεί την ομοιοπολική σύνδεση των ελεύθερων αμινομάδων των πρωτεϊνών των κυττάρων. 5.3. Άλλα διαλύματα: PBS - Phosphate Buffered Saline (Biosera): Χρησιμοποιήθηκε ως μέσο αραίωσης των διαλυμάτων εργασίας. 34

RPMI 1640 (Life Technologies): Χρησιμοποιήθηκε ως συντηρητικό των δειγμάτων κατά την αποθήκευση τους πριν ή κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας τους. Φυσιολογικός ορός (Normal Human Serum NHS) 0,9 % ( Ενέσιμη αμπούλα 10ml - ΒΙΟΣΕΡ ΕΛΛΑΣ): Χρησιμοποιήθηκε ως μέσο αραίωσης της χρωστικής νουκλεϊκών οξέων SYTO16 Green (MOLECULAR PROBES, Eugene, OR, USA). Στείρος Διαλύτης H2O Water For Injection W.F.I. (DEMO ABEE) 1000ml: Χρησιμοποιήθηκε ως μέσο αραίωσης των διαλυμάτων εργασίας καθώς και για τη πλύση του κυτταρομετρητή ροής μετά το πέρας της ανάλυσης. Χλωρίνη: Χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:4 με W.F.I. για τη πλύση του κυτταρομετρητή ροής μετά το πέρας της ανάλυσης. 35

6. ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ ΥΛΙΚΑ Πλαστικές πιπέτες τύπου Pasteur. Ρύγχη για πιπέτες όγκου 250 μl και 1000μl (Finntip). Δοκιμαστικοί σωλήνες από πολυστυρένιο όγκου 5ml (Bioanalytica). Μικροί κωνικοί δοκιμαστικοί σωλήνες όγκου 1,40ml από πολυπροπυλένιο (Micronic) για ελάττωση του νεκρού όγκου κατά την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. TrueCount σωληνάρια απόλυτης κυτταρικής μέτρησης, με βαθμονομημένο αριθμό σφαιριδίων (Becton Dickinson BD, California). 36

7. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Η επεξεργασία των δειγμάτων πραγματοποιούταν άμεσα και ολοκληρωνόταν μέσα στο πρώτο δίωρο από τη παραλαβή τους. 7.1. Προσδιορισμός απόλυτου αριθμού κυττάρων δείγματος Για τον προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού των κυττάρων του δείγματος χρησιμοποιήθηκαν TrueCount σωληνάρια απόλυτης κυτταρικής μέτρησης, με βαθμονομημένο αριθμό σφαιριδίων (Becton Dickinson BD, California) και ένα κατατοπιστικό panel μελέτης των δειγμάτων (Πίνακας 4) όπου εφαρμόστηκε σε όλα ανεξαιρέτως τα δείγματα της μελέτης. Περιλάμβανε ως ειδικό ανιχνευτή νουκλεϊκών οξέων τη χρωστική Syto16 (MP), τη Γλυκοφορίνη Α (CD235a) συνδεδεμένη με το φθοριόχρωμα ΡΕ, μονοκλωνικά αντισώματα που αφορούν την μονοκυτταρική σειρά και τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα (CD14, CD16) συνδεδεμένα με το φθοριόχρωμα PC7 καθώς και το πανλευκοκυτταρικό αντιγόνο CD45 συνδεδεμένο με το φθοριόχρωμα ECD. Να σημειωθεί εδώ ότι με τη χρήση της Γλυκοφορίνης Α υπολογιζόταν ο αριθμός των ερυθρών αιμοσφαιρίων του δείγματος και μπορούσε να αξιολογηθεί αν το δείγμα είναι κατάλληλο για περεταίρω μελέτη ή αν λόγω τραυματικής παρακέντησης κατά τη λήψη του, υπάρχει μεγάλη πρόσμιξη περιφερικού αίματος σε αυτό και πρέπει να απορριφθεί. FL-1 PE ECD PC5 PC7 SYTO16 GLY-A CD45 CD14 CD16 Πίνακας 4: Panel μελέτης επιφανειακών δεικτών δειγμάτων Σε TrueCount (BD) σωληνάρια προστέθηκε ο κατάλληλος όγκος των παραπάνω μονοκλωνικών αντισωμάτων έπειτα από τιτλοποίησή τους και κατά προτίμηση 350 μl δείγματος. Ακολούθησε ανάδευση του μίγματος σε συσκευή vortex και επώαση 37

σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 15 λεπτών. Σε περιπτώσεις που η ποσότητα του δείγματος δεν ήταν επαρκής, χρησιμοποιήθηκε μικρότερη ποσότητα δείγματος και μετά την επώαση προστέθηκε RPMI μέχρι τελικού όγκου 350 μl, σημειώνοντας όμως στο σωληνάκι την ακριβή ποσότητα δείγματος που έχει χρησιμοποιηθεί. Η διαδικασία ολοκληρώθηκε με μετάγγιση του μίγματος σε κωνικό σωλήνα Micronics όγκου 1,4 ml και άμεση μέτρηση του αριθμού των κυττάρων του δείγματος στον κυτταρομετρητή. 7.2. Προσδιορισμός επιφανειακών δεικτών κυττάρων Για τον προσδιορισμό των επιφανειακών δεικτών των κυττάρων του δείγματος χρησιμοποιήθηκαν δυο panels μελέτης δειγμάτων (Πίνακας 5) όπου εφαρμόστηκαν κατ επιλογήν, σε κάποια από τα δείγματα της μελέτης. Περιλάμβαναν ως ειδικό ανιχνευτή νουκλεϊκών οξέων τη χρωστική Syto16 (MP), ως ανιχνευτή των ερυθρών αιμοσφαιρίων τη Γλυκοφορίνη Α (CD235a) συνδεδεμένη με το φθοριόχρωμα ΡΕ, το πανλευκοκυτταρικό αντιγόνο CD45 συνδεδεμένο με το φθοριόχρωμα ECD και τέλος, μονοκλωνικά αντισώματα που αφορούν την Β λεμφική σειρά (CD19, CD20 συνδεδεμένα με το φθοριόχρωμα PC7) και τη Τ λεμφική σειρά (CD8, CD4 συνδεδεμένα με τα φθοριοχρώματα PC5 και PC7 αντίστοιχα). FL-1 PE ECD PC5 PC7 SYTO16 GLY-A CD45 CD19 CD20 SYTO16 GLY-A CD45 CD8 CD4 Πίνακας 5: Panel μελέτης επιφανειακών δεικτών δειγμάτων Σε δοκιμαστικά σωληνάρια των 5ml προστέθηκε ο κατάλληλος όγκος των παραπάνω μονοκλωνικών αντισωμάτων έπειτα από τιτλοποίησή τους και κατά προτίμηση 350 μl δείγματος. Ακολούθησε ανάδευση του μίγματος σε συσκευή vortex και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 15 λεπτών. Στις περιπτώσεις που το δείγμα προερχόταν από τραυματική παρακέντηση, προστέθηκε σε αυτό 2ml λυτικού διαλύματος FACS TM Lysing Solution (Becton 38

Dickinson, BD) και το μίγμα αφέθηκε σε επώαση 10 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά ακολούθησε φυγοκέντριση για 5 λεπτά στις 1260 στροφές (φυγόκεντρος Hettrich Zentrifugen) και με προσοχή απότομη απόχυση του υπερκειμένου με το πέρας της φυγοκέντρισης. Το ίζημα ανασυστάθηκε σε 350 μl λυτικό διάλυμα FACS TM Lysing Solution (Becton Dickinson, BD) και μετά από μετάγγιση του σε κωνικό Micronics με πιπέτα μίας χρήσης τύπου Pasteur, αναλύθηκε αμέσως στον κυτταρομετρητή. Στις περιπτώσεις που το δείγμα δεν είχε μεγάλη πρόσμιξη περιφερικού αίματος, μετά την 15 λεπτών επώασή του με τα παραπάνω μονοκλωνικά αντισώματα (Πίνακας ), προστέθηκαν 2ml RPMI και το μίγμα μετά από ανάδευση με vortex, φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 1260 στροφές (φυγόκεντρος Hettrich Zentrifugen) και με προσοχή ακολούθησε απότομη απόχυση του υπερκειμένου μετά το πέρας της φυγοκέντρισης. Το ίζημα ανασυστάθηκε σε 350 μl RPMI και μετά από μετάγγιση του σε κωνικό Micronics με πιπέτα μίας χρήσης τύπου Pasteur, τοποθετήθηκε αμέσως για ανάλυση στον κυτταρομετρητή. 39

8. ΈΛΕΓΧΟΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΗΤΗ ΡΟΗΣ Για τη διασφάλιση της καλής λειτουργίας του κυτταρομετρητή ροής πραγματοποιούταν έλεγχος όλων των επιμέρους συστημάτων του οργάνου (υδροδυναμικό, οπτικό και ηλεκτρονικό σύστημα) με τη χρήση πρότυπων σφαιριδίων. Ο έλεγχος του οπτικού και υδροδυναμικού συστήματος (έλεγχος ευθυγράμμισης) γινόταν με τα φθορίζοντα σφαιρία Flowcheck TM 770 Fluorosperes (Beckman Coulter). Η ευθυγράμμιση πραγματοποιείται γιατί αυξάνει τα σήματα φθορισμού και σκέδασης του φωτός καθώς και τη μέση τιμή αριθμού καναλιών και ταυτόχρονα ελαχιστοποιεί το συντελεστή διακύμανσης και κατ επέκταση τη διακύμανση του σήματος αυτή καθ αυτή. Ο έλεγχος της σωστής μέτρησης κυττάρων του κυτταρομετρητή ροής γινόταν με τα φθορίζοντα σφαιρία Flowcount TM Fluorosperes (Beckman Coulter). Τα Flowcount TM Fluorosperes (Beckman Coulter) αποτελούν ένα εναιώρημα φθοριζόντων σφαιριδίων που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των απόλυτων αριθμών μέτρησης στον κυτταρομετρητή ροής. Κάθε φθορίζον σφαιρίδιο περιέχει μια χρωστική που έχει φάσμα εκπομπής 525 nm έως 700 nm όταν διεγείρεται στα 488 nm. Η μέθοδος στηρίζεται στην ανάμειξη γνωστών πανομοιότυπων όγκων Flowcount TM Fluorosperes (Beckman Coulter) και βιολογικού δείγματος και τη μεταξύ τους σύγκριση καθώς τα φθορίζοντα σφαιρίδια έχουν ομοιόμορφο μέγεθος και ένταση φθορισμού, όπως και καθορισμένη συγκέντρωση που επιτρέπει τον άμεσο προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού των κυττάρων που αναλύονται. 63 40

9. ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΤΟΝ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΗΤΗ ΡΟΗΣ Μετά το πέρας του παρασκευαστικού μέρους ακολούθησε η μέτρηση των δειγμάτων η οποία πραγματοποιούταν το πολύ εντός δύο ωρών από τη παραλαβή του δείγματος για αποφυγή της απόπτωσης των κυττάρων. Κατά περίπτωση και με βάση την εμπειρία, προσδιορίστηκε η ασθενώς θετική, ενδιάμεση και έντονη ένταση έκφρασης κάθε δείκτη. Αρχικά και πριν την ανάλυση λάμβανε χώρα ο καθαρισμός του κυτταρομετρητή με αραιωμένη χλωρίνη (1:4 με στείρο διαλύτη) και στείρο διαλύτη για να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος επιμόλυνσης από προηγούμενη ανάλυση και η εμφάνιση ψευδώς θετικών σημάτων κατά την ανάλυση. Στη συνέχεια, λόγω του ότι τα εναιωρήματα ήταν υποκυτταρικά, η μέτρηση των δειγμάτων διαρκούσε μέχρι εξαντλήσεως του δείγματος. Πάντα δινόταν ιδιαίτερη προσοχή στην αποφυγή δημιουργίας φυσαλίδων αέρα όταν το δείγμα ήταν σχεδόν έτοιμο να εξαντληθεί. 41

10. ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΤΑΤΟΠΙΣΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Τα ολιγοκυτταρικά δείγματα παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό απόπτωσης, γι αυτό και η οριοθέτηση των ζώντων κυττάρων είναι απαραίτητη προκειμένου οι μετρήσεις να γίνονται μόνο επί ζώντων κυττάρων. Το σχήμα 15Α αποτελεί διάγραμμα σκέδασης δύο μεταβλητών, της γλυκοφορίνης (GLY-PE) έναντι του φθοριοχρώματος SYTO16. Σε αυτό απεικονίζεται η θέση των ερυθροκυττάρων (RBC), των σφαιρίων απόλυτης κυτταρικής μέτρησης (BEADS) και στο σύνολο (Α) τα εμπύρηνα κύτταρα του δείγματος, τα οποία επιλέγονται με βάση την εμπειρία και κατά περίπτωση, ανάλογα την έντασης του φθοριοχρώματος SYTO16. Να σημειωθεί επίσης εδώ, ότι από τον αριθμό των ερυθροκυττάρων στο συγκεκριμένο διάγραμμα είμαστε σε θέση να αξιολογήσουμε τη παρουσία αιματηρού δείγματος το οποίο μπορεί να προέρχεται από τραυματική παρακέντηση (τρώση αγγείου) και δεν αποτελεί αξιόπιστο δείγμα ανάλυσης. Σχήμα 15Α: Διάγραμμα σκέδασης γλυκοφορίνης (GLY-PE) έναντι του φθοριοχρώματος SYTO16 42

Στη συνέχεια, αφού εξαιρεθεί όλος ο θόρυβος και τα debris (διπλέτες, μη λευκοκυτταρικά σήματα, αποπτωτικά κύτταρα, σήματα ευτελούς σημασίας ανάλυσης κλπ), σε στικτόγραμμα πρόσθιου σκεδασμού (FSLin) έναντι CD45-ECD, στο σύνολο (Β) επιλέγονται όλα τα CD45+ κύτταρα. (Σχ. 15Β) Σχήμα 15Β: Στικτόγραμμα πρόσθιου σκεδασμού (FSLin) έναντι CD45-ECD Στο επόμενο διάγραμμα (Σχ.15C) πρόσθιου (FSLin) έναντι πλάγιου (SSLin) σκεδασμού επιλέγονται τα μη αποπτωτικά λευκοκύτταρα (WBC). Σχήμα 15C: Στικτόγραμμα Πρόσθιου (FSLin) έναντι Πλάγιου (SSLin) Σκεδασμού Σε στικτόγραμμα πλάγιου σκεδασμού (SSLin) έναντι CD14+CD16 PC7 (Σχ.15D) επιλέγονται μονοκύτταρα (μακροφάγα) και ουδετερόφιλα 43

πολυμορφοπύρηνα τα οποία είναι έντονα θετικά στους δείκτες CD14, CD16 και έχουν χαμηλό πλάγιο σκεδασμό. Σχήμα 15D: Στικτόγραμμα Πλάγιου Σκεδασμού (SSLin) έναντι CD14+CD16 PC7 Τέλος σε στικτόγραμμα πλάγιου σκεδασμού (SSLin) έναντι CD45-ECD (Σχ.15E) διαχωρίζονται οι λευκοκυτταρικοί πληθυσμοί σε ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα, λεμφοκύτταρα, ηωσινόφιλα και βλαστικά κύτταρα με βάση τη πλάγια σκέδαση (εάν και εφόσον υπάρχουν οι αντίστοιχοι πληθυσμοί). Σχήμα 15Ε: Στικτόγραμμα Πλάγιου Σκεδασμού (SSLin) έναντι CD45-ECD 44

Για την αναζήτηση των Β λεμφοκυτταρικών πληθυσμών, χρησιμοποιείται στικτόγραμμα CD19+CD20 PC7 έναντι CD45-ECD (Σχ.15F) στο οποίο επιλέγονται τα άτυπα (Ζ-Χ) και τυπικά Β κύτταρα (Ζ-Β), αν και εφόσον υπάρχουν στο δείγμα. Ο καταλληλότερος δείκτης για την ανίχνευση κυττάρων Β λεμφικής σειράς είναι το CD20, ο οποίος σε συνδυασμό με τα CD19 και CD45 διακρίνει τα Β λεμφοκύτταρα από τα υπόλοιπα κύτταρα του δείγματος. Σχήμα 15F : Στικτόγραμμα CD19 + CD20 PC7 έναντι CD45-ECD Στην ανάλυση χρησιμοποιήθηκε και ένα διάγραμμα CD19 + CD20 PC7/ΝΟΝΕ για την ανίχνευση ψευδώς θετικών σημάτων (αυτοφθορισμός, θόρυβος κλπ) στο αχρησιμοποίητο κανάλι φθορισμού FL4 (Σχ.15G). Σχήμα 15G : Διάγραμμα CD19 + CD20 PC7 στο αχρησιμοποίητο κανάλι φθορισμού FL4 45

Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΤΥΠΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΜΕΛΕΤΗΣ 1.1. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Β- ΟΞΕΙΑΣ ΛΕΜΦΟΒΛΑΣΤΙΚΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ (Β-ΟΛΛ) Η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει δύο περιπτώσεις ασθενών με Β-ΟΛΛ (common Β-ΟΛΛ). Τα στοιχεία των ασθενών φαίνονται στον επόμενο πίνακα. (Πίνακας 6) Α/Α ΑΣΘΕΝΗ ΦΥΛΟ ΗΛΙΚΙΑ ΝΟΣΗΜΑ ΔΕΙΓΜΑ ΑΡ. ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΔΙΑΣΤΗΜΑ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ (ΈΤΟΣ 2015) 1 Α 69 Β-ΟΛΛ ΕΝΥ 1 22/4 2 Α 29 Β-ΟΛΛ ΕΝΥ 5 24/2 8/4 Πίνακας 6 : Στοιχεία ασθενών με Β-ΟΛΛ Και για τις δύο περιπτώσεις ασθενών ακολουθήθηκε η ίδια στρατηγική ανάλυσης για τον πρώτο, κατατοπιστικό έλεγχο των ασθενών, όπως αυτή περιγράφηκε στο κεφάλαιο Β.10. Ενδεικτικά, παρουσιάζεται αναλυτικά η διαδικασία πρωτοδιάγνωσης ελάχιστης υπολειμματικής νόσου Β-ΟΛΛ στο ΕΝΥ του ασθενή Α/Α: 1. 46

1.1.1. Στρατηγική ανάλυσης της Β-ΟΛΛ Αρχικά, σε στικτόγραμμα GLY-Α/SYTO16 οριοθετήθηκε η περιοχή των εμπύρηνων κυττάρων (gate A) του δείγματος. (Σχήμα 16Α) Σχήμα 16Α: Στικτόγραμμα σκέδασης γλυκοφορίνης (GLY-PE) έναντι του φθοριοχρώματος SYTO16. Στη συνέχεια, σε στικτογράμμα FS/SS έγινε επιλογή των μη αποπτωτικών κυττάρων τα οποία κατά κανόνα έχουν υψηλό σκεδασμό και σε στικτόγραμμα FS/CD45 οριοθετήθηκε η περιοχή όλων των ζώντων, μη αποπτωτικών κυττάρων του δείγματος (gate B). (Εικόνες 16Β a και 16Β b αντίστοιχα) Σχήμα 16Β a : Στικτόγραμμα Πρόσθιου (FSLin) έναντι Πλάγιου (SSLin) Σκεδασμού Σχήμα 16Β b : Στικτόγραμμα πρόσθιου σκεδασμού (FSLin) έναντι CD45-ECD 47

Έπειτα σε στικτόγραμμα SS/CD14+CD16 έγινε επιλογή των κυττάρων της μονοκυτταρικής σειράς τα οποία είναι θετικά στους δείκτες CD14, CD16 (μακροφάγα) και έχουν χαμηλό πλάγιο σκεδασμό (σύνολο MO). (Σχήμα 16C) Σχήμα 16C: Στικτόγραμμα Πλάγιου Σκεδασμού (SSLin) έναντι CD14+CD16 PC7 Τέλος, για την αναζήτηση των κυττάρων της Β λεμφικής σειράς, σε στικτόγραμμα CD19+CD20/CD45 (Σχήμα 16D a ) έγινε επιλογή των τυπικών Β κυττάρων (gate Ζ-Β). Επικουρικά στην ανάλυση λειτουργεί και το στικτόγραμμα SS/CD19+CD20. (Σχήμα 16D b ) Σχήμα 16D a : Στικτόγραμμα CD19+CD20 PC7 έναντι CD45-ECD Σχήμα 16D b : Στικτόγραμμα Πλάγιου Σκεδσμού (SSLin) έναντι CD19+CD20 PC7 48

Κατά περίπτωση, λόγω του ιστορικού του ασθενή και του υψηλού αριθμού λεμφοκυττάρων του δείγματος (υποψία ύπαρξης ελάχιστης υπολειμματικής νόσου), από το δείγμα που περίσσεψε ελέγθηκε και ο δείκτης CD10 σε συνδυασμό με τους δείκτες CD45 και CD20. (Σχήμα 17) Σχήμα 17: Στικτογράμματα μελέτης δεικτών αωρότητας CD20 και CD10. Ύπαρξη CD10+ /CD20+ πληθυσμού σε ποσοστό 9,8% (τεταρτημόριο Μ2). Εικόνα συμβατή με παρουσία άτυπων κυττάρων και υποψία Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου. 49

1.1.2. Αποτελέσματα ανοσοφαινοτυπικής ανάλυσης ασθενών με Β-ΟΛΛ. Η τελικές τιμές των ανοσοφαινοτυπικών δεικτών για τον ασθενή Α/Α: 1 παρουσιάζονται στον επόμενο πίνακα. ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 1 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΕΝΥ Παράμετροι % Απόλυτοι αρ. Σχόλια Φυσ. Τιμές ΕΝΥ Αριθμός Λευκών 2,3 0-5/κκχ Λεμφοκύτταρα (% επί 9,0 0,2 0-5/κκχ λευκών) Μακροφάγα CD14+CD16 81,2 1,9 H 0-1/κκχ (% επί λευκών) Ουδετερόφιλα (% επί 0,0 0,0 0-1/κκχ λευκών) B (% λευκών) 0,9 0,0 NK (% λευκών) 0,0 0,0 Άτυπα Β CD20+CD10+ Βλαστικό παράθυρο 8,9 0,2 Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος Αριθμός Ερυθρών 169 H 0-25/κκχ Πίνακας 7: Ανοσοφαινότυπος ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 1 50

Βλαστικό Παράθυρο (CD19+, CD45low /μl) Για τον ασθενή Α/Α:2 στον επόμενο πίνακα (πίνακας 8) παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινοτύπου του καθ όλο το διάστημα παρακολούθησής του, ανά ακριβή ημερομηνία εξέτασης (follow up). ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 2 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΕΝΥ ΗΜ/ΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Αριθμός Λευκών (Απόλυτος αρ.) Αριθμός Ερυθρών (Απόλυτος αρ.) ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ Λεμφοκύτταρ α (% επί λευκών) Μονοκύτταρ α (% επί λευκών) Βλαστικό παράθυρ ο (% επί λευκών) Βλαστικό παράθυρο (Απόλυτος αρ.) 24/02/2015 1,3 51,0 34,8 47,8 16,3 0,1 03/03/2015 12,5 3,0 13,8 84,8 1,1 0,3 09/03/2015 19,9 26,0 3,2 96,6 0,0 0,0 24/03/2015 0,5 3,0 34,7 65,3 0,0 0,0 08/04/2015 0,3 3 42 48 0,0 0,0 Πίνακας 8: Ανοσοφαινοτυπική παρακολούθηση ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 2 για το χρονικό διάστημα 24/2/15-8/4/15 Η ελάχιστη υπολειμματική νόσος του ασθενή Α/Α: 2 όπως αυτή προσδιορίστηκε με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής, παρουσιάζεται στο επόμενο διάγραμμα διασποράς. (Σχήμα 18) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 Ασθενής Α/Α : 2 (Β-ΟΛΛ) 3/1; 0,1 24/2; 0,3 Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος 0,05 0-0,05 24/3; 0 9/3; 0 8/4; 0 Ημερομηνίες Εξέτασης ('Ετος: 2015) 26/5; 0 Σχήμα 18: Παρακολούθηση Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου ασθενή Α/Α: 2 για το χρονικό διάστημα 3/1/15-26/5/15 51

1.2. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΟΞΕΙΑΣ ΜΥΕΛΟΓΕΝΟΥΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ (ΟΜΛ) Η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει δύο περιπτώσεις ασθενών με ΟΜΛ (Μ4). Τα στοιχεία των ασθενών φαίνονται στον επόμενο πίνακα. (Πίνακας 9) ΔΙΑΣΤΗΜΑ Α/Α ΑΡ. ΦΥΛΟ ΗΛΙΚΙΑ ΝΟΣΗΜΑ ΔΕΙΓΜΑ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ ΑΣΘΕΝΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ (ΈΤΟΣ 2015) 3 A 70 ΟΜΛ (Μ4) ΕΝΥ 11 20/4 19/11 4 Α 53 ΟΜΛ (Μ4) ΕΝΥ 4 22/4 1/9 Πίνακας 9 : Στοιχεία ασθενών με Β-ΟΛΛ Και για τις δύο περιπτώσεις ασθενών ακολουθήθηκε η ίδια στρατηγική ανάλυσης, όπως αυτή περιγράφηκε στο κεφάλαιο Β.10. Ενδεικτικά, θα παρουσιαστεί αναλυτικά η διαδικασία διερεύνησης ελάχιστης υπολειμματικής νόσου ΟΜΛ στο ΕΝΥ του ασθενή Α/Α: 3 την 23/06/2015. 52

1.2.1. Στρατηγική ανάλυσης της ΟΜΛ Για τον ασθενή Α/Α: 3 ακολουθήθηκε η ίδια στρατηγική ανάλυσης για τον πρώτο, κατατοπιστικό έλεγχο των ασθενών, όπως αυτή περιγράφηκε στο Υλικά και Μέθοδοι. (Σχήμα 19) Σχήμα 19: Ανίχνευση μεγάλου αριθμού μακροφάγων CD16+ κυττάρων (καφέ χρώμα) όπως επίσης και ύποπτου πληθυσμού CD45dim, χαμηλού πλάγιου σκεδασμού (SSc) ο οποίος βρίσκεται στη περιοχή του βλαστικού παραθύρου (μπλέ χρώμα). Εικόνα συμβατή με υποψία παρουσίας Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου. 53

Κατά περίπτωση, από το δείγμα που περίσσεψε ελέχθησαν και οι δείκτες CD33 και CD25 (Σχ. 20), όπως επίσης και οι δείκτες CD64 και DR (Σχ. 21), σε συνδυασμό με το δείκτη CD45, λόγω του ιστορικού του ασθενή, ο οποίος παρουσίαζε εικόνα λευχαιμικής μηνιγγίτιδας CD33+/CD25+/CD64+/DR+ την 20/04/2015. Σχήμα 20: Στικτογράμματα μελέτης δεικτών CD25 και CD33. Ύπαρξη CD25++ /CD33+ πληθυσμού (τεταρτημόριο Μ2). Εικόνα συμβατή με παρουσία Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου. 54

Σχήμα 21: Στικτογράμματα μελέτης δεικτών CD64 και DR. Ύπαρξη CD64+ /DR+ πληθυσμού (τεταρτημόριο J2). Εικόνα συμβατή με παρουσία Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου. 55

1.2.2. Αποτελέσματα ανοσοφαινοτυπικής ανάλυσης ασθενών με ΟΜΛ Για τον ασθενή Α/Α:3, στον επόμενο πίνακα (πίνακας 10) παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινότυπου του καθ όλο το διάστημα παρακολούθησής του, ανά ακριβή ημερομηνία εξέτασης (follow up). ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 3 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΕΝΥ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΗΜ/ΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Αριθμός Λευκών (Απόλυτος αρ.) Αριθμός Ερυθρών (Απόλυτος αρ.) Λεμφοκύτταρ α (% επί λευκών) Μονοκύτταρ α (% επί λευκών) Βλαστικό παράθυρ ο (% επί λευκών) Βλαστικό παράθυρο (Απόλυτος αρ.) 20/04/2015 433,0 87 1,6 0,0 90,7 420,0 29/04/2015 1,0 859 46,3 0,2 0,0 0,0 23/06/2015 1,3 1 24,5 50,0 25,0 0,3 ΣΧΟΛΙΑ ΠΛΕΙΟΚΥΤΤ ΑΡΩΣΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΚΉ ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΑ ΤΡΩΣΗ ΑΓΓΕΙΟΥ (31,4% NEUT) 16/07/2015 0,6 106 17,0 62,0 21,0 0,1 23/07/2015 0,2 56 35 66 0 0 25/08/2015 0,8 1 36 64 6,5 0,1 15/09/2015 1,1 4 57 39 0 0 13/10/2015 1 89 38 59 0 0 19/11/2015 0,9 87 19,5 39,1 0 0 3/12/2015 0,2 1 70 30 0 0 17/12/2015 1,3 1 25,1 76,3 0 0 Πίνακας 10: Ανοσοφαινοτυπική παρακολούθηση ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 3 για το χρονικό διάστημα 24/2/15-17/12/15 56

Βλαστικό παράθυρο (CD33+,CD25+ /μl) Η ελάχιστη υπολειμματική νόσος του ασθενή Α/Α: 3 όπως αυτή προσδιορίστηκε με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής, παρουσιάζεται στο επόμενο διάγραμμα διασποράς. (Σχ.22) 500 Α/Α : 3 (ΟΜΛ-Μ4) 400 20/4; 420,3 300 200 Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος Γραμμική (Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος) 100 0-100 29/4; 0 23/6; 0,3 16/7; 0,1 23/7; 0 25/8; 0,1 15/9; 0 Ημερομηνίες Εξέτασης (Έτος: 2015) 29/9; 0 13/10; 0 19/11; 0 3/12; 0 17/12; 0 Σχήμα 22 : Παρακολούθηση Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου ασθενή Α/Α: 3 για το χρονικό διάστημα 3/1/15-17/12/15 57

Βλαστικό Παράθυρο Για τον ασθενή Α/Α: 4 στον επόμενο πίνακα (πίνακας 11) παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινότυπου του καθ όλο το διάστημα παρακολούθησής του ανά ακριβή ημερομηνία εξέτασης (follow up), καθώς επίσης και η πορεία της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου του, όπως αυτή προσδιορίστηκε με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής. (Σχ. 23) ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 4 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΕΝΥ ΗΜ/ΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Αριθμός Λευκών (Απόλυτος αρ.) Αριθμός Ερυθρών (Απόλυτος αρ.) ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ Λεμφοκύτταρ α (% επί λευκών) Μονοκύτταρ α (% επί λευκών) Βλαστικό παράθυρ ο (% επί λευκών) Βλαστικό παράθυρο (Απόλυτος αρ.) 22/04/2015 314,6 8,0 1,3 20,7 72,8 229,0 27/04/2015 50,8 87,0 90,7 41,0 55,9 28,4 13/07/2015 2,6 0,0 27,5 14,3 54,0 1,4 01/09/2015 128,3 30,0 4,9 18,5 72,9 93,5 Πίνακας 11: Ανοσοφαινοτυπική παρακολούθηση ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 3 για το χρονικό διάστημα 24/2/15-01/09/15 ΣΧΟΛΙΑ ΠΛΕΙΟΚΥΤΤ ΑΡΩΣΗ ΠΛΕΙΟΚΥΤΤ ΑΡΩΣΗ Α/Α: 4 (ΟΜΛ-Μ4) 250 200 150 22/4; 229 Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος Γραμμική (Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος) 100 1/9; 93,5 50 0-50 27/4; 28,4 13/7; 1,4 Ημερομηνίες Εξέτασης (Έτος: 2015) Σχήμα 23: Παρακολούθηση Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου ασθενή Α/Α: 3 για το χρονικό διάστημα 3/1/15-01/09/15 58

1.3. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΛΕΜΦΩΜΑTOΣ ΒURKITT Η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει τέσσερις περιπτώσεις ασθενών με Λέμφωμα Burkitt. Τα στοιχεία των ασθενών φαίνονται στον επόμενο πίνακα. (Πίνακας 12) Α/Α ΑΣΘΕΝΗ ΦΥΛΟ ΗΛΙΚΙΑ ΝΟΣΗΜΑ ΔΕΙΓΜΑ 5 Α 43 Λέμφωμα Burkitt ΑΡ. ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΔΙΑΣΤΗΜΑ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ (ΈΤΟΣ 2015) ΕΝΥ 7 5/5 28/9 6 Α 47 7 Θ 61 8 Α 41 Λέμφωμα Burkitt Λέμφωμα Burkitt Λέμφωμα Burkitt ΕΝΥ 7 24/3 30/10 ΕΝΥ 2 17/6 17/7 ΕΝΥ 1 2/9 Πίνακας 12: Στοιχεία ασθενών με Λέμφωμα Burkitt. Σε όλες τις περιπτώσεις ασθενών ακολουθήθηκε η ίδια στρατηγική ανάλυσης για τον πρώτο, κατατοπιστικό έλεγχο των ασθενών, όπως αυτή περιγράφηκε στο κεφάλαιο Β.10. Ενδεικτικά, θα παρουσιαστεί η διαδικασία διερεύνησης υπολειμματικής νόσου λεμφώματος Burkitt στο ΕΝΥ του ασθενή Α/Α: 5, την 5/5/15. 59

1.3.1. Στρατηγική ανάλυσης λεμφώματος Βurkitt Για τον ασθενή Α/Α: 5 ακολουθήθηκε η ίδια στρατηγική ανάλυσης για τον πρώτο, κατατοπιστικό έλεγχο των ασθενών, όπως αυτή περιγράφηκε στο Υλικά και μέθοδοι. (Σχήμα 24) Σχήμα 24: Ανίχνευση ύποπτου πληθυσμού άτυπων Β κυττάρων (πράσινο χρώμα). Εικόνα συμβατή με παρουσία Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου. 60

Ακολούθησε έλεγχος και της Τ λεμφικής σειράς για ολοκληρωμένη εικόνα των λεμφοκυτταρικών πληθυσμών του δείγματος. (Σχ. 25) Σχήμα 25: Παρουσία 31,9% CD4 (πράσινο χρώμα) και 17,7% CD8 (κόκκκινο χρώμα) Τ λεμφοκυττάρων. (Λόγος T4/T8: 2,2). Παρουσία 51,7% διπλά αρνητικών, CD45+κυττάρων (λαδί χρώμα). Εικόνα συμβατή με παρουσία άτυπων κυττάρων και υποψία Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου. 61

1.3.2. Αποτελέσματα ανοσοφαινοτυπικής ανάλυσης ασθενών με λέμφωμα Βurkitt Για τον ασθενή Α/Α: 5, στον επόμενο πίνακα (πίνακας 13) παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινότυπου του καθ όλο το διάστημα παρακολούθησής του ανά ακριβή ημερομηνία εξέτασης (follow up). ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 5 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΕΝΥ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΗΜ/ΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Αριθμός Λευκών (Απόλυτος αρ.) Αριθμός Ερυθρών (Απόλυτος αρ.) Λεμφοκύτταρ α (% επί λευκών) Μονοκύτταρ α (% επί λευκών) Άτυπα Β (% επί λευκών) Άτυπα Β (Απόλυτος αρ.) 05/05/2015 1,3 5,0 43,7 0,0 42,4 0,6 07/05/2015 9,8 2,0 36,5 62,6 0,0 0,0 14/05/2015 2,3 0,0 25,6 73,8 0,0 0,0 12/06/2015 0,4 0,3 47,2 52,8 3,3 0,010 16/06/2015 0,5 5,0 69,6 30,4 0,0 0,0 13/07/2015 3 5 43 57 0,0 0,0 28/09/2015 1,4 1 78 22 0 0 ΣΧΟΛΙΑ Πίνακας 13: Ανοσοφαινοτυπική παρακολούθηση ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 5 για το χρονικό διάστημα 05/05/15-28/09/15 62

Άτυπα Β κύτταρα /μl Η ελάχιστη υπολειμματική νόσος του ασθενή Α/Α: 5 όπως αυτή προσδιορίστηκε με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής, παρουσιάζεται στο επόμενο διάγραμμα διασποράς. (Σχ. 26) 0,7 0,6 0,5 0,4 5/5; 0,6 A/A: 5 (Λ. BURKITT) Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος Γραμμική (Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος) 0,3 0,2 0,1 0-0,1 7/5; 0 16/6; 0,01 14/5; 0 12/6; 0 13/7; 0 28/9; 0-0,2 Ημερομηνίες Εξέτασης Σχήμα 26: Παρακολούθηση Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου ασθενή Α/Α: 5 για το χρονικό διάστημα 05/05/15-28/09/15 Για τον ασθενή Α/Α: 6, στον επόμενο πίνακα (πίνακας 14) παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινότυπου του καθ όλο το διάστημα παρακολούθησής του ανά ακριβή ημερομηνία εξέτασης (follow up), καθώς επίσης και η πορεία της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου του, όπως αυτή προσδιορίστηκε με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής. (Σχ. 27) 63

Άτυπα Β κύτταρα /μl ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 6 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΕΝΥ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΗΜ/ΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Αριθμός Λευκών (Απόλυτος αρ.) Αριθμός Ερυθρών (Απόλυτος αρ.) Λεμφοκύτταρ α (% επί λευκών) Μονοκύτταρ α (% επί λευκών) Άτυπα Β (% επί λευκών) Άτυπα Β (Απόλυτος αρ.) 24/03/2015 5,5 1,0 96,8 3,1 74,2 4,0 31/03/2015 6,1 22,0 90,7 8,8 0,3 0,020 20/04/2015 1,0 2,0 99,0 1,0 1,5 0,016 28/05/2015 0,4 1,0 68,3 28,6 9,6 0,038 15/07/2015 0,6 0,2 37 62 5,8 0,033 10/09/2015 0,2 7 52 48 22,7 0,050 30/10/2015 1,5 23 75 13 0 0,00 ΣΧΟΛΙΑ Πίνακας 14: Ανοσοφαινοτυπική παρακολούθηση ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 6 για το χρονικό διάστημα 24/03/15-30/10/15 0,06 Α/Α: 6 (Λ. BURKITT) 0,05 0,04 0,03 28/5; 0,038 15/7; 0,033 9/9; 0,05 Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος Γραμμική (Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος) 0,02 0,01 31/3; 0,02 20/4; 0,016 0 Ημερομηνίες Εξέτασης (Έτος: 2015) 30/10; 0 Σχήμα 27: Παρακολούθηση Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου ασθενή Α/Α: 6 για το χρονικό διάστημα 24/03/15-30/10/15 64

Άτυπα Β κύτταρα /μl Για την ασθενή Α/Α: 7, στον επόμενο πίνακα (πίνακας 15) παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινότυπου της καθ όλο το διάστημα παρακολούθησής του ανά ακριβή ημερομηνία εξέτασης (follow up), καθώς επίσης και η πορεία της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου, όπως αυτή προσδιορίστηκε με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής, σε διάγραμμα διασποράς. (Σχ. 28) ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 7 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΕΝΥ ΗΜ/ΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Αριθμός Λευκών (Απόλυτος αρ.) Αριθμός Ερυθρών (Απόλυτος αρ.) ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ Λεμφοκύτταρ α (% επί λευκών) Μονοκύτταρ α (% επί λευκών) Άτυπα Β (% επί λευκών) Άτυπα Β (Απόλυτος αρ.) 17/6/2015 2037 17 99,5 0,5 98,1 1999 17/7/2015 1,0 4 65,1 34,9 0 0 ΣΧΟΛΙΑ ΠΛΕΙΟΚΥΤΤ ΑΡΩΣΗ Πίνακας 15: Ανοσοφαινοτυπική παρακολούθηση ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 7 για το χρονικό διάστημα 17/6/15-17/7/15 Α/Α: 7 (Λ. BURKITT) 2500 2000 1500 1000 17/6; 1999 Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος Γραμμική (Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος) 500 17/7; 0 0-500 Ημερομηνίες Εξέτασης (Έτος: 2015) Σχήμα 28: Παρακολούθηση Ελάχιστης Υπολειμματικής Νόσου ασθενή Α/Α: 7 για το χρονικό διάστημα 17/6/15-17/7/15 65

Όσον αφορά τον ασθενή Α/Α: 8, το δείγμα ΕΝΥ που ήρθε προς ανάλυση δεν αποτέλεσε αξιολογήσιμο δείγμα, λόγω τραυματικής παρακέντησης. Στον επόμενο πίνακα παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινοτύπου του ασθενή, όπως αυτές προέκυψαν μετά από ανάλυση με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής. (Πίνακας 16) ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 8 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΕΝΥ Παράμετροι % Απόλυτοι αρ. Φυσ. Τιμές ΕΝΥ Αριθμός Λευκών 9,0 H 0-5/κκχ Λεμφοκύτταρα (% επί λευκών) 25,1 2,3 0-5/κκχ Ουδετερόφιλα (% επί λευκών) 74,7 6,7 H 0-1/κκχ Βλαστικό παράθυρο 0,0 0,0 Αριθμός Ερυθρών 4347 H 0-25/κκχ Πίνακας 16: Ανοσοφαινότυπος ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 8. Εικόνα τραυματικής παρακέντισης με 4347/κκχ ερυθροκύτταρα, 9 λευκά/κκχ με 74,7% πολυμορφοπύρηνα. Δείγμα μη αξιολογήσιμο. 66

Σχήμα 29: Ανοσοφαινότυπος ΕΝΥ ασθενή Α/Α: 8. Εικόνα τραυματικής παρακέντησης με πολύ αυξημένο αριθμό ερυθροκυττάρων (κόκκινο χρώμα), μονοκυττάρων (καφέ χρώμα) και ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων κυττάρων (πράσινο χρώμα) στο δείγμα. Στο στικτόγραμμα SS/CD45 διακρίνονται οι διάφοροι κυτταρικοί πληθυσμοί του δείγματος. 67

1.4. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΕΝΔΟΦΘΑΛΜΙΟΥ ΛΕΜΦΩΜΑΤΟΣ (IOL) ΚΑΙ ΡΑΓΟΕΙΔΙΤΙΔΑΣ Η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει δύο περιπτώσεις ασθενών με οφθαλμικές παθήσεις, μία με ενδοφθάλμιο λέμφωμα και μία με ραγοειδίτιδα και υποψία ύπαρξης ενδοφθάλμιου λεμφώματος. Τα στοιχεία των ασθενών φαίνονται στον επόμενο πίνακα. (Πίνακας 17) Α/Α ΑΣΘΕΝΗ ΦΥΛΟ ΗΛΙΚΙΑ ΝΟΣΗΜΑ ΔΕΙΓΜΑ 9 Θ 70 Ενδοφθάλμιο Λέμφωμα Υδατοειδές Υγρό ΑΡ. ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΗΜ/ΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ (2015) 1 23/4 10 Θ 70 Ραγοειδίτιδα Υαλοειδές Υγρό 1 17/4 Πίνακας 17: Στοιχεία ασθενών με οφθαλμικά νοσήματα 68

1.4.1. Αποτελέσματα ανοσοφαινοτυπικής ανάλυσης ασθενών Για την ασθενή Α/Α: 9 ακολουθήθηκε η ίδια στρατηγική ανάλυσης για τον πρώτο, κατατοπιστικό έλεγχο των ασθενών, όπως αυτή περιγράφηκε στο κεφάλαιο Β.10. Επικουρικά διενεργήθηκε και επιπλέον ανοσοφαινοτυπικός έλεγχος με επιπλέον λεμφοκυτταρικούς δείκτες (CD3, CD4, CD8, CD19) λόγω του αυξημένου αριθμού λεμφοκυττάρων στο δείγμα. (Σχ. 30) Στον επόμενο πίνακα παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινοτύπου της ασθενούς Α/Α: 9, όπως αυτές προέκυψαν μετά από ανάλυση με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής. (Πίνακας 18) ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 9 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΥΔΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΥΓΡΟΥ Παράμετροι % Απόλυτοι αρ. Φυσ. Τιμές Αριθμός Λευκών 31,9 H 0-5/κκχ Λεμφοκύτταρα (% επί λευκών) 60,0 19,1 H 0-5/κκχ Μονοκύτταρα (% επί λευκών) 28,2 9,0 H 0-1/κκχ Ουδετερόφιλα (% επί λευκών) 0,5 0,2 0-1/κκχ T4 (% λευκών) 29,8 9,5 H 0-5/κκχ T8 (% λευκών) 25,9 8,3 H 0-3/κκχ T4/T8 1,1 L 1,2-1,6 B (% λευκών) 0,0 0,0 0/κκχ Άτυπα Β 0,0 0,0 0/κκχ Βλαστικό παράθυρο 0,0 0,0 0/κκχ Διπλά Αρνητικά 0,0 0,0 0/κκχ Αριθμός Ερυθρών 0 0-25/κκχ Πίνακας 18: Ανοσοφαινότυπος Υδατοειδούς Υγρού ασθενή Α/Α: 9 69

Σχήμα 30: Ανοσοφαινότυπος υδατοειδούς υγρού ασθενή Α/Α: 9. Μέτρια αύξηση αριθμού κυττάρων, τα οποία είναι λεμφοκύτταρα (μπλε χρώμα) και μονοκύτταρα (καφέ χρώμα). Δεν ανιχνεύεται Β λεμφικό στοιχείο. Τα ευρήματα είναι αρνητικά για άτυπα κύτταρα. Επί υψηλής κλινικής υπόνοιας IOL. 70

Σχήμα 31: Ανοσοφαινότυπος υδατοειδούς υγρού ασθενή Α/Α: 9. Ύπαρξη T4 (πράσινο χρώμα) και T8 (κόκκινο χρώμα) λεμφοκυττάρων στο δείγμα. Δεν ανιχνεύονται διπλά αρνητικά κύτταρα. Τα ευρήματα είναι αρνητικά για άτυπα κύτταρα. 71

Για την ασθενή Α/Α: 10 ακολουθήθηκε η ίδια στρατηγική ανάλυσης για τον πρώτο, κατατοπιστικό έλεγχο των ασθενών, όπως αυτή περιγράφηκε στο κεφάλαιο Β.10. (Σχήμα 32) Σχήμα 32: Ανοσοφαινότυπος υαλοειδούς υγρού ασθενή Α/Α: 10. Υψηλός αριθμός λεμφοκυττάρων (μπλε χρώμα) στο δείγμα. Ανιχνεύεται Β λεμφικό στοιχείο και άτυπα κύτταρα (κόκκινο χρώμα). Επί υψηλής κλινικής υπόνοιας IOL. 72

Λόγω της ύπαρξης άτυπων Β κυττάρων στο δείγμα, κλωνικότητας. (Σχήμα 33) ακολούθησε έλεγχος Σχήμα 33: Ύπαρξη άτυπων Β στοιχείων τα οποία είναι κάππα κλωνικά (μπλε χρώμα). Επί υψηλής κλινικής υπόνοιας IOL. 73

Στον επόμενο πίνακα παρουσιάζονται οι τιμές του ανοσοφαινοτύπου της ασθενούς Α/Α: 10, όπως αυτές προέκυψαν μετά από τη πολυπαραμετρική ανάλυση κυτταρομετρία ροής. (Πίνακας 19) ΑΣΘΕΝΗΣ Α/Α: 10 ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΥΑΛΟΕΙΔΟΥΣ ΥΓΡΟΥ Παράμετροι % Απόλυτοι αρ. Φυσ. Τιμές Αριθμός Λευκών 2,8 H 0-5/κκχ Λεμφοκύτταρα (% επί λευκών) 100 2,8 H 0-5/κκχ Μονοκύτταρα (% επί λευκών) 0,0 0-1/κκχ Ουδετερόφιλα (% επί λευκών) 0,0 0-1/κκχ B (% λευκών) 0,0 NK (% λευκών) 0,0 Άτυπα Β 68,8 1,9 Λόγος κ/λ (Β λεμφοκύττρα) 126 Η 0,33<κ/λ<6 Βλαστικό παράθυρο 0,0 Αριθμός Ερυθρών 25 H 0-25/κκχ Πίνακας 19: Ανοσοφαινότυπος Υαλοειδούς Υγρού ασθενή Α/Α: 10 74

2. ΣΥΝΟΛΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Συνολικά μελετήθηκαν 40 δείγματα ασθενών. Η κατανομή των νοσημάτων παρουσιάζεται στο επόμενο διάγραμμα. (Σχήμα 34) Νοσήματα Ραγοειδίτιδα 10% Ενδοφθάλμιο Λέμφωμα 10% ΟΜΛ (Μ4) 20% Β - ΟΛΛ 20% Λέμφωμα Burkitt 40% Σχήμα 34: Κατανομή νοσημάτων μελέτης Στο 52,5% (Ν=21) των δειγμάτων ανιχνεύθηκε νόσος ενώ στο 42,5% (Ν=17) όχι. Το 5% (Ν=2) των δειγμάτων λόγω τραυματικής παρακέντησης (τρώση αγγείου) δεν ήταν κατάλληλο προς ανάλυση. Πλειοκυττάρωση παρουσίαζε το 10% των δειγμάτων (Ν=4). (Σχήμα 35) Αποτελέσματα διάγνωσης δειγμάτων 2 21 Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος Απουσία νόσου 17 Μη αξιολογήσιμο Σχήμα 35: Αποτελέσματα διάγνωσης δειγμάτων 75