Sample & Assay Technologies

Ιανουάριος 2015 artus C. trachomatis TM PCR Kit Εγχειρίδιο 24 (Aρ. Καταλόγου 4552163) 96 (Aρ. Καταλόγου 4552165) Διαγνωστικό προϊόν in-vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για τη χρήση με τα ΑΒΙ PRISM 7000, 7700 και 7900ΗΤ Sequence Detection Systems Έκδοση 1η 4552163, 4552165 1046950EL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, ΓΕΡΜΑΝΙΑ R3 1046950EL Sample & Assay Technologies

QIAGEN: Sample and Assay Technologies Η QIAGEN ηγείται στο χώρο πρωτοποριακών τεχνολογιών δειγμάτων και προσδιορισμών, παρέχοντας τη δυνατότητα απομόνωσης και ανίχνευσης των περιεχομένων οποιουδήποτε βιολογικού δείγματος. Τα προηγμένα, υψηλής ποιότητας προϊόντα και οι υπηρεσίες μας αποτελούν εγγύηση επιτυχίας - από το δείγμα έως το αποτέλεσμα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα: στον καθαρισμό DNA, RNA και πρωτεϊνών στους προσδιορισμούς νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών στην έρευνα microrna και RNAi στην αυτοματοποίηση τεχνολογιών δειγμάτων και προσδιορισμών Αποστολή μας είναι η διασφάλιση των δικών σας επιτυχιών και επιτευγμάτων. Για περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε μας στη διεύθυνση www.qiagen.com..

Πίνακας περιεχομένων 1. Περιεχόμενο... 6 2. Αποθήκευση... 7 3. Πρόσθετα απαιτούμενα υλικά και συσκευές... 7 4. Γενικά μέτρα ασφάλειας... 8 5. Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες9 6. Αρχή της αντίδρασης Real-Time PCR... 10 7. Περιγραφή προϊόντος... 10 8. Πρωτόκολλο... 11 8.1. Προαναλυτική διαδικασία: λήψη, φύλαξη και μεταφορά των δειγμάτων... 11 8.1.1. Δειγματοληψία... 11 8.1.2. Φύλαξη δειγμάτων... 14 8.1.3. Μεταφορά δειγμάτων... 15 8.2. Απομόνωση DNA... 16 8.2.1. Συστάσεις για τον καθαρισμό των δειγμάτων ούρων και επιχρίσματος με το QIAamp Viral RNA Mini Kit... 18 8.2.2. Συστάσεις για τον καθαρισμό των δειγμάτων επιχρίσματος και σπέρματος με το QIAamp DNA Mini Kit... 20 8.2.3. Συστάσεις για τον καθαρισμό λυοφιλοποιημένων δειγμάτων με το QIAamp DNA Mini Kit... 21 8.3. Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου... 23 8.4. Ποσοτικοποίηση... 24 8.5. Προετοιμασία της PCR... 26 8.6. Προγραμματισμός των ABI PRISM SDS... 31 8.6.1. Προγραμματισμός του ABI PRISM 7000 SDS... 31 8.6.1.1. Προκαταρκτικές ρυθμίσεις για τη δημιουργία νέας διαδικασίας PCR... 31 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 3

8.6.1.2. Δημιουργία/επιλογή των ανιχνευτών... 32 8.6.1.3. Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών... 34 8.6.1.4. Δημιουργία του προφίλ θερμοκρασίας... 35 8.6.1.5. Αποθήκευση της διαδικασίας PCR... 36 8.6.1.6. Έναρξη της διαδικασίας PCR... 37 8.6.2. Προγραμματισμός του ABI PRISM 7700 SDS... 37 8.6.2.1. Προκαταρκτικές ρυθμίσεις για τη δημιουργία μιας νέας διαδικασίας PCR... 37 8.6.2.2. Επιλογή των φθορίζουσων χρωστικών ουσιών και αντιστοίχιση του τύπου δείγματος... 38 8.6.2.3. Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών... 39 8.6.2.4. Δημιουργία του προφίλ θερμοκρασίας... 40 8.6.2.5. Σημαντικές πρόσθετες ρυθμίσεις... 42 8.6.2.6. Αποθήκευση της διαδικασίας PCR... 44 8.6.2.7. Έναρξη της διαδικασίας PCR... 44 8.6.3. Προγραμματισμός του ABI PRISM 7900HT SDS... 44 8.6.3.1. Προκαταρκτικές ρυθμίσεις για τη δημιουργία μιας νέας διαδικασίας PCR... 44 8.6.3.2. Δημιουργία/επιλογή των ανιχνευτών... 45 8.6.3.3. Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών... 47 8.6.3.4. Δημιουργία του προφίλ θερμοκρασίας... 48 8.6.3.5. Αποθήκευση της διαδικασίας PCR... 50 8.6.3.6. Έναρξη της διαδικασίας PCR... 50 9. Αξιολόγηση... 51 10. Αντιμετώπιση προβλημάτων... 56 11. Ειδικά χαρακτηριστικά... 58 11.1. Αναλυτική ευαισθησία... 58 11.2. Ειδικότητα... 59 11.3. Ακρίβεια... 61 4 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

11.4. Ανθεκτικότητα... 63 11.5. Επαναληψιμότητα... 63 11.6. Διαγνωστική αξιόλογηση... 64 12. Ειδικές υποδείξεις για τη χρήση του προϊόντος... 65 13. Πληροφορίες ασφάλειας... 66 14. Ποιοτικός έλεγχος... 66 15. Βιβλιογραφία... 66 16. Ερμηνεία των συμβόλων... 67 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 5

artus C. trachomatis TM PCR Kit Για τη χρήση σε συνδυασμό με το ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT Sequence Detection System. Λάβετε υπόψη: Το artus C. trachomatis TM PCR Kit δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό τόσο με το GeneAmp 5700 SDS όσο και με την πλάκα 384 βοθρίων του ABI PRISM 7900HT SDS. 1. Περιεχόμενο Μπλε Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο Πράσινο Ονομασία και περιεχόμενο C. trachomatis TM Master C. trachomatis TM QS 1 1 x 10 4 cop/μι C. trachomatis TM QS 2 1 x 10 3 cop/μι C. trachomatis TM QS 3 1 x 10 2 cop/μι C. trachomatis TM QS 4 1 x 10 1 cop/μι C. trachomatis TM IC Αρ. είδους 4552163 24 αντιδράσεις Αρ. είδους 4552165 96 αντιδράσεις 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns 1 x 200 μι 1 x 200 μι 1 x 200 μι 1 x 200 μι 1 x 200 μι 1 x 200 μι 1 x 200 μι 1 x 200 μι 1 x 1.000 μι 2 x 1.000 μι Λευκό Water (PCR grade) 1 x 1.000 μι 1 x 1.000 μι QS = Πρότυπο ποσοτικοποίησης IC = Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου 6 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

2. Αποθήκευση Τα υλικά του artus C. trachomatis TM PCR Kit αποθηκεύονται στους 30 C έως 15 C και διατηρούνται μέχρι την ημερομηνία που αναγράφεται στην ετικέτα. Η επαναληπτική ψύξη/απόψυξη (> 2 x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί με αυτό τον τρόπο μειώνεται η ευαισθησία. Για το λόγο αυτό, εάν η χρήση δεν είναι τακτική, θα πρέπει να γίνεται επιμερισμός των αντιδραστηρίων. Εάν παραστεί ανάγκη αποθήκευσης των υλικών στους +4 C, το χρονικό διάστημα αποθήκευσης δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. 3. Πρόσθετα απαιτούμενα υλικά και συσκευές Γάντια εργαστηρίου χωρίς πούδρα Κιτ απομόνωσης DNA (βλέπε 8.2 Απομόνωση DNA) Πιπέτες (ρυθμιζόμενες) Στείρα ρύγχη πιπετών με φίλτρο Αναδευτήρας Vortex Επιτραπέζια φυγόκεντρος με κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Φυγόκεντρος με κεφαλή για πλάκες μικροτιτλοποίησης (προαιρετικά) Πλάκα αντίδρασης 96 βοθρίων/σωληνάρια αντίδρασης για οπτικές μετρήσεις με αντίστοιχα οπτικά υλικά σφράγισης * (βλέπε 8.5 Προετοιμασία της PCR) Πλαίσιο υποστήριξης 96 βοθρίων δύο τεμαχίων για χρήση οπτικών σωληναρίων αντίδρασης (96-Well Tray/Retainer Set, Αρ. κατ. 403 081, Applied Biosystems), βλέπε 8.5 Προετοιμασία της PCR Επιφάνεια συμπίεσης για χρήση σε συνδυασμό με οπτικά αυτοκόλλητα φύλλα (Optical Cover Compression Pads, Αρ. κατ. 4 312 639, Applied Biosystems), βλέπε 8.5 Προετοιμασία της PCR * Η χρήση σωληναρίων για οπτικές μετρήσεις με θολωτά καλύμματα επιτρέπεται μόνο για το ABI PRISM 7700 SDS και απαιτεί τροποποίηση του χρόνου έκθεσης (βλέπε 8.6.2 Προγραμματισμός του ABI PRISM 7700 SDS, 8.6.2.5 Σημαντικές πρόσθετες ρυθμίσεις). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 7

Εξάρτημα για τη σφράγιση των πλακών αντίδρασης με χρήση οπτικών αυτοκόλλητων φύλλων (Adhesive Seal Applicator Kit, Αρ. κατ. 4 333 183, Applied Biosystems) ABI PRISM 7000, 7700 ή 7900HT SDS Λάβετε υπόψη: Κατά την έναρξη λειτουργίας των συσκευών, απαιτείται οπωσδήποτε μία υπάρχουσα έγκυρη βαθμονόμηση των χρωστικών ουσιών (Pure Spectra Component File) και του υπόβαθρου (Background Component File). 4. Γενικά μέτρα ασφάλειας Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σημεία: Χρησιμοποίηση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Το θετικό υλικό (δείγματα, πρότυπα ελέγχου, προϊόντα πολλαπλασιασμού) πρέπει να καθαρίζεται, αποθηκεύεται και να προστίθεται στην αντίδραση σε διαφορετικό χώρο από τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Πλήρη απόψυξη όλων των υλικών σε θερμοκρασία δωματίου, πριν από τη χρήση τους. Στη συνέχεια καλή ανάμιξη των υλικών και εκτέλεση μιας σύντομης φυγοκέντρησης. H εργασία πρέπει να γίνεται μεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή μονάδα ψύξης. 8 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

5. Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Τα βακτηρίδια του γένους Chlamydia έχουν παγκοσμίους μεγάλη επιδημιολογική σημασία. Το είδος Chlamydia trachomatis (ορότυποι D - L) ανήκει διεθνώς στους συνηθέστερους παθογόνους παράγοντες των σεξουαλικώς μεταδιδόμενων νοσημάτων (STD - sexually transmitted diseases). Οι 16 ορότυποι του C. trachomatis προκαλούν διάφορες ασθένειες: Οι ορότυποι A, B, Ba και C προκαλούν το τράχωμα, μία διαδεδομένη στις τροπικές χώρες χρόνια υποτροπιάζουσα νόσο του επιπεφυκότος και του κερατοειδούς. Οι ορότυποι D - K προκαλούν σεξουαλικώς μεταδιδόμενες λοιμώξεις του ουροποιογεννητικού συστήματος και οφθαλμικές λοιμώξεις καθώς και μολύνσεις των νεογνών μετά από περιγεννητική μετάδοση. Οι ορότυποι LGV I - III προκαλούν το αφροδίσιο λεμφοκοκκίωμα, μία σεξουαλικώς μεταδιδόμενη νόσο, η οποία εμφανίζεται ως επί το πλείστον στις τροπικές χώρες. Το τράχωμα εμφανίζεται σχεδόν αποκλειστικά σε τροπικές χώρες με κακές συνθήκες υγιεινής. Είναι η πιο διαδεδομένη πάθηση των οφθαλμών στον κόσμο και μετά από τον καταρράκτη αποτελεί τη δεύτερη βασικότερη αιτία τύφλωσης. Υπολογίζεται ότι υπάρχουν περίπου 150 εκατομμύρια άτομα που έχουν μολυνθεί. Γύρω στα έξι εκατομμύρια από αυτά έχουν ήδη τυφλωθεί. Στις βιομηχανικές χώρες, τα χλαμύδια αποτελούν τους συχνότερους παθογόνους παράγοντες που προκαλούν λοιμώξεις του ουροποιογεννητικού συστήματος. Στη Γερμανία, ο ετήσιος αριθμός των νέων λοιμώξεων των γεννητικών οργάνων υπολογίζεται σε 300.000 περίπου. Η συχνότητα εμφάνισης του αφροδίσιου λεμφοκοκκιώματος (βουβωνικό λεμφοκοκκίωμα, νόσος Durand-Nicolas-Favre) παρουσιάζει μείωση σε όλο τον κόσμο. Ωστόσο, αυτή η σεξουαλικώς μεταδιδόμενη νόσος είναι ακόμη ενδημική στην Ασία, την Αφρική και τη Νότια Αμερική και σε περιοχές της Καραϊβικής. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 9

6. Αρχή της αντίδρασης Real-Time PCR Η διάγνωση παθογόνων οργανισμών με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στον πολλαπλασιασμό (ενίσχυση) συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου παράγοντα. Στην αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες σε ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι προσκολλώνται ειδικά στο προϊόν του πολλαπλασιασμού της PCR. Η μέτρηση των εντάσεων φθορισμού κατά την εξέλιξη της PCR πραγματικού χρόνου επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων, χωρίς να χρειάζεται να ανοιχθούν και πάλι τα σωληνάρια των δειγμάτων μετά την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR (Mackay, 2004). 7. Περιγραφή προϊόντος Το artus C. trachomatis TM PCR Kit είναι ένα έτοιμο σύστημα προς χρήση για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis, μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) στο ABI PRISM 7000, 7700 και το 7900HT Sequence Detection System. Το C. trachomatis TM Master περιέχει αντιδραστήρια και ένζυμα για τον ειδικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος μεγέθους 100 bp, του γονιδιώματος του C. trachomatis. Η ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασμού επιτυγχάνεται μέσω της μέτρησης φθορισμού FAM στο ABI PRISM SDS. Πέραν αυτού, το artus C. trachomatis ΤΜ PCR Kit περιέχει, για την ανίχνευση μιας πιθανής αναστολής της PCR, ένα δεύτερο ετερόλογο σύστημα πολλαπλασιασμού. Αυτό ανιχνεύεται ως πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (IC) με τη μέτρηση φθορισμού VIC. Επιπλέον δεν επηρεάζεται αρνητικά το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής PCR του C. trachomatis (βλέπε 11.1 Αναλυτική ευαισθησία). Μαζί παρέχονται εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου (C. trachomatis TM QS 1-4), με τη βοήθεια των οποίων μπορεί να πραγματοποιηθεί προσδιορισμός του φορτίου του παθογόνου παράγοντα. Ανατρέξτε σχετικά στην ενότητα 8.4 Ποσοτικοποίηση. 10 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

8. Πρωτόκολλο 8.1. Προαναλυτική διαδικασία: λήψη, φύλαξη και μεταφορά των δειγμάτων Λάβετε υπόψη: Όλα τα δείγματα να χειρίζονται ως δυνητικώς μολυσματικά. Επιτρέπονται μόνο τα ακόλουθα υλικά δειγμάτων, για τα οποία πρέπει να λαμβάνονται οπωσδήποτε υπ' όψιν οι ακόλουθοι επεξηγηματικοί κανόνες και προδιαγραφές για τη λήψη, φύλαξη και μεταφορά τους: 1. Ούρα (Γυναίκες και άνδρες). 2. Επιχρίσματα από τους οφθαλμούς, τον τράχηλο της μήτρας και την ουρήθρα. 3. Σπέρμα. Για να εξασφαλιστεί η υψηλή ποιότητα των δειγμάτων, θα πρέπει η μεταφορά τους στο ερευνητικό εργαστήριο να γίνεται όσο το δυνατόν συντομότερα. Τα δείγματα πρέπει να μεταφέρονται υπό καθορισμένες συνθήκες θερμοκρασίας. 8.1.1. Δειγματοληψία 1. Δείγματα ούρων Ο/Η ασθενής δεν επιτρέπεται να έχει ουρήσει κατά τις προηγούμενες δύο ώρες. Συλλέξτε 10-30 ml από τα αρχικά ούρα σε ένα καθαρό δοχείο από πολυπροπυλένιο χωρίς συντηρητικά. Μη χρησιμοποιείτε δείγματα ούρων που συλλέχθηκαν σε δοχεία με συντηρητικά. Κλείστε τα δοχεία με τα δείγματα και βάλτε τους ετικέτα. Ακολουθήστε τις προδιαγραφές σχετικά με την φύλαξη και τη μεταφορά. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 11

2. Δείγματα επιχρίσματος Για τη λήψη δειγμάτων επιχρίσματος από τους οφθαλμούς, τον τράχηλο της μήτρας και την ουρήθρα χρησιμοποιήστε τα ακόλουθα υλικά: Χρησιμοποιήστε μόνο στειλεό επιχρίσματος με κεφαλή από Dacron, rayon ή αλγινικό ασβέστιο και λαβή από συνθετική ύλη. Μην χρησιμοποιείτε στειλεό επιχρίσματος με λαβή από ξύλο ή αλουμίνιο. Δείγματα επιχρίσματος από τον τους οφθαλμούς, τον τράχηλο της μήτρας και την ουρήθρα μπορούν να συλλεχθούν και να μεταφερθούν σε 1-3 ml των ακολούθων υλικών. AMPLICOR STM (Specimen Transportmedium, Roche, Inc.) Swab Specimen Collection Kit (Digene Corporation) Cervical Sampler (Digene Corporation) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) Venturi Transystem (κατάλληλο για αερόβια και αναερόβια), αποστειρωμένα σωληνάρια μεταφοράς για επιχρίσματα (SARSTEDT AG & Co.) SPG CTM (Chlamydia Transport Medium, MicroTest, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Inc.) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ClamTrans CTM (Bartels, Inc.) Στειλεός Chlamydia (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA Chlamydia Specimen Collection Kit Αφήστε τον στειλεό στο υλικό καλλιέργειας μεταφοράς. Κλείστε τα δοχεία με τα δείγματα και βάλτε τους ετικέτα. Προσέξτε τις προδιαγραφές φύλαξης και μεταφοράς *. Χρησιμοποιήστε την προτεινόμενη διαδικασία για λήψη κυλινδρικών και επίπεδων κυττάρων του επιθηλίου, μετά την απομάκρυνση της βλέννας του τραχήλου της μήτρας. * Biosafety in Microbiological Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 12 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

3. Δείγματα σπέρματος * Η λήψη δείγματος πρέπει να γίνεται δύο μέχρι τρεις ημέρες μετά την τελευταία εξπερμάτωση. Το δείγμα του σπέρματος πρέπει να λαμβάνεται την ίδια ημέρα που θα σταλεί στο ερευνητικό εργαστήριο. Η λήψη του δείγματος του σπέρματος μπορεί να γίνει με ένα από τους ακόλουθους τρόπους, σύμφωνα με μεθόδους του εργαστηρίου: με αυνανισμό κατευθείαν σε ένα αποστειρωμένο, καθαρό και στεγνό δοχείο δείγματος. Σιγουρευτείτε ότι όλο το δείγμα παραλαμβάνεται κατευθείαν στο δοχείο. Εάν μία ποσότητα του δείγματος χαθεί, αυτό πρέπει να σημειωθεί στο πρωτόκολλο λήψης δείγματος. με αυνανισμό με τη χρήση προφυλακτικού. Μετά την εξπερμάτωση απομακρύνετε το προφυλακτικό. Είναι σημαντικό να κλείσετε το άνοιγμα του προφυλακτικού με ένα λάστιχο, για την σίγουρη παραμονή του δείγματος εντός του προφυλακτικού. Στο τέλος, τοποθετείστε το προφυλακτικό σε ένα δοχείο μεταφοράς. Σημαντικό: Χρησιμοποιήστε δοχεία δειγμάτων χωρίς συντηρητικά και προφυλακτικά χωρίς αντισπερματικές και μη φυσικές ουσίες (π.χ. χρωστικές ουσίες). Τοποθετήστε το δείγμα σπέρματος σε σκοτεινό μέρος για 30 έως 45 λεπτά (π.χ. σε ένα συρτάρι ή ένα ντουλάπι), μέχρι να ρευστοποιηθεί. Καταψύξτε το δείγμα κατευθείαν μετά τη ρευστοποίηση μέσα σε σωληνάριο κατάψυξης στους -20 C ή σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. * Εισηγήσεις: 1) Andrology Laboratory University of Utah School of Medicine (http://uuhsc.utah.edu/andrology/) 2) Andrology Institute of America (http://www.aia-zavos.com/). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 13

8.1.2. Φύλαξη δειγμάτων Το αποτέλεσμα της εξέτασης μπορεί να επηρεαστεί μέσω μέτριας κατάψυξης ή φύλαξης των δειγμάτων για μεγάλο χρονικό διάστημα. 1. Δείγματα ούρων Εάν η εξέταση των δειγμάτων ούρων γίνει μέσα σε 24 ώρες, αυτά μπορούν να φυλαχθούν σε θερμοκρασία δωματίου (19-23 C). Εάν η εξέταση γίνει μέσα σε επτά ημέρες από τη λήψη, πρέπει τα δείγματα να φυλάγονται στο ψυγείο στους 2-8 C. Δείγματα ούρων, των οποίων η επεξεργασία δεν μπορεί να γίνει μέσα σε επτά ημέρες, μπορούν να φυλαχθούν στους -20 C ή και χαμηλότερη θερμοκρασία, μέχρι 30 ημέρες. 2. Δείγματα επιχρίσματος Η φύλαξη των δειγμάτων γίνεται στους 2-8 C. (Όταν τα δείγματα επιχρίσματος πρέπει να σταλούν σε ερευνητικό εργαστήριο, η αποστολή τους πρέπει να γίνει όσο το δυνατόν συντομότερα μετά τη λήψη, σύμφωνα με τις προδιαγραφές του εργαστηρίου για μεταφορά των δειγμάτων χλαμυδίων). Δείγματα επιχρίσματος που δεν εξετάστηκαν αμέσως μετά την είσοδό τους στο εργαστήριο, πρέπει να φυλαχθούν στους 2-8 C και να γίνει η επεξεργασία τους μέσα σε επτά ημέρες. Δείγματα επιχρίσματος, η επεξεργασία των οποίων δεν είναι δυνατή μέσα σε επτά ημέρες από τη λήψη τους, πρέπει να φυλάσσονται στους -20 C ή χαμηλότερες θερμοκρασίες και να εξετάζονται μέσα σε 30 ημέρες από την ημερομηνία παραλαβής. 3. Δείγματα σπέρματος Η φύλαξη των δειγμάτων γίνεται στους -20 C ή σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. Δείγματα σπέρματος που δεν εξετάστηκαν αμέσως μετά την είσοδό τους στο εργαστήριο, πρέπει να φυλαχθούν στους -20 C ή χαμηλότερες 14 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

θερμοκρασίες και να εξετάζονται μέσα σε 30 ημέρες από την ημερομηνία παραλαβής. 8.1.3. Μεταφορά δειγμάτων 1. Δείγματα ούρων Αποστελλόμενα δείγματα ούρων πρέπει μέχρι την αποστολή τους να φυλάσσονται σε ψυγείο στους 2-8 C. Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά με τη μεταφορά παθογόνου υλικού. 2. Δείγματα επιχρίσματος Δείγματα επιχρίσματος πρέπει να μεταφέρονται υπό ψύξη. Εάν τα δείγματα επιχρίσματος πρέπει να αποσταλλούν σε ερευνητικό εργαστήριο, θα πρέπει να μεταφερθούν υπό ψύξη όσο το δυνατόν συντομότερα μετά τη λήψη, σύμφωνα με τις προδιαγραφές του εργαστηρίου για μεταφορά. Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά με τη μεταφορά ουσιών που προκαλούν ασθένειες *. 3. Δείγματα σπέρματος Εάν τα δείγματα σπέρματος πρέπει να αποσταλλούν σε ερευνητικό εργαστήριο, θα πρέπει να εξετάζονται την ίδια ημέρα με αυτή που έγινε η λήψη τους, σύμφωνα με τις προδιαγραφές του εργαστηρίου σχετικά με τη μεταφορά των δειγμάτων χλαμυδίων. Εκτός αυτού λάβετε υπόψη ότι τα δείγματα σπέρματος πρέπει να μεταφέρονται υπό ψύξη. Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά με τη μεταφορά παθογόνου υλικού *. * International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition, 2000.704. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 15

8.2. Απομόνωση DNA Κιτ απομόνωσης DNA διατίθενται από διάφορους κατασκευαστές. Ανάλογα με το πρωτόκολλο του επιλεγμένου κατασκευαστή, τοποθετήστε την καθορισμένη ποσότητα δείγματος για απομόνωση και εκτελέστε την απομόνωση DNA σύμφωνα με τις οδηγίες. Συνιστώνται τα ακόλουθα κιτ απομόνωσης: Υλικό δείγματος Κιτ απομόνωσης Αρ. καταλόγου Κατασκευαστής Φορέας RNA Ούρα, επιχρίσματα Σπέρμα, επιχρίσματα QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) QIAamp DNA Mini Kit (50) 52 904 QIAGEN περιέχεται 51 304 QIAGEN δεν περιέχεται Η προσθήκη του φορέα RNA έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα της απομόνωσης και επομένως για την παραλαβή του DNA/RNA. Σε περίπτωση που το χρησιμοποιούμενο κιτ απομόνωσης δεν περιέχει φορέα RNA, παρακαλούμε λάβετε υπόψη ότι για την απομόνωση νουκλεϊκών οξέων από σωματικά υγρά χωρίς κύτταρα ή υλικά με μικρή περιεκτικότητα σε DNA/RNA (π.χ. Εγκεφαλονωτιαίο υγρό), συνιστάται ιδιαίτερα η προσθήκη φορέα RNA (RNA-Homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, Αρ. κατ. 27-4110-01). Παρακαλούμε συνεχίστε κατά τον ακόλουθο τρόπο: a) Αναμίξτε το λυοφιλοποιημένο φορέα RNA με το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης (όχι με το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης) του κιτ απομόνωσης (π.χ. ρυθμιστικό διάλυμα AE του QIAamp DNA Mini Kit) και παρασκευάστε μία αραίωση με συγκέντρωση 1 μg/μι. Διαμοιράστε το διάλυμα αυτό του φορέα RNA στον ανάλογο αριθμό ποσοτήτων που αντιστοιχεί στις ανάγκες σας και φυλάξτε αυτές στους -20 C. Αποφύγετε την επαναληπτική απόψυξη (> 2 x) των ποσοτήτων του φορέα RNA. b) Πριν από κάθε απομόνωση προσθέστε 1 μg φορέα RNA ανά 100 μι ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Εάν π.χ. το πρωτόκολλο εκχύλισης προβλέπει 200 μι ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ανά δείγμα, τότε 16 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

προσθέστε 2 μι φορέα RNA (1 μg/μl) κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Πριν από την έναρξη κάθε απομόνωσης πρέπει να παρασκευασθεί ένα πρόσφατο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA (και εάν είναι απαραίτητο προτύπου εσωτερικού ελέγχου, βλέπε 8.3 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου) σύμφωνα με το ακόλουθο σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα. Αριθμός δειγμάτων 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης π.χ. 200 μι π.χ. 2.400 μι Φορέας RNA (1 μg/μι) 2 μι 24 μι Συνολικός όγκος 202 μι 2.424 μι Όγκος για την απομόνωση 200 μι ανά 200 μι c) Για την απομόνωση χρησιμοποιήστε το πρόσφατα παρασκευασμένο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA αμέσως. Αποθήκευση του μίγματος δεν είναι δυνατή. Η προσθήκη του φορέα RNA έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα της απομόνωσης και επομένως για την παραλαβή του DNA/RNA. Για να επιτύχουμε μία υψηλότερη σταθερότητα του φορέα RNA, ο οποίος παρέχεται μαζί με το QIAamp Viral RNA Mini Kit, προτείνουμε την ακόλουθη παραλλακτική διαδικασία σύμφωνα με τα δεδομένα του εγχειριδίου του κιτ απομόνωσης: a. Αναμίξτε το λυοφιλοποιημένο φορέα RNA πριν από την πρώτη χρήση του κιτ απομόνωσης με 310 μι ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης που περιέχεται στο κιτ (τελική συγκέντρωση 1 μg/μι, μη χρησιμοποιείτε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης). Διαμοιράστε το διάλυμα αυτό του φορέα RNA στον ανάλογο αριθμό ποσοτήτων που αντιστοιχεί στις ανάγκες σας και φυλάξτε αυτές στους -20 C. Αποφύγετε την επαναληπτική απόψυξη (> 2 x) των ποσοτήτων του φορέα RNA. b. Πριν από την έναρξη κάθε απομόνωσης πρέπει να παρασκευασθεί ένα πρόσφατο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA (και εάν είναι απαραίτητο προτύπου εσωτερικού ελέγχου, βλέπε 8.3 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου) σύμφωνα με το ακόλουθο σχήμα επεξεργασίας artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 17

με πιπέτα. Αριθμός δειγμάτων 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης AVL 560 μι 6.720 μι Φορέας RNA (1 μg/μl) 5,6 μι 67,2 μι Συνολικός όγκος 565,6 μι 6.787,2 μι Όγκος για την απομόνωση 560 μι ανά 560 μι c. Για την απομόνωση χρησιμοποιήστε το πρόσφατα παρασκευασμένο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA αμέσως. Αποθήκευση του μίγματος δεν είναι δυνατή. Σε περίπτωση αυτόματου καθαρισμού, συνιστάται το ακόλουθο σύστημα. Υλικό δείγματος Σύστημα απομόνωσης Κιτ απομόνωσης Κατασκευαστής Ούρα, επιχρίσματα ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation Για την παραλαβή ενός καταλόγου των απαραιτήτων υλικών και του έγκυρου πρωτοκόλλου καθαρισμού, επικοινωνήστε με την τεχνική μας εξυπηρέτηση. Applied Biosystems, Foster City, U.S.A. Σε διαδικασίες απομόνωσης, στις οποίες χρησιμοποιείται ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης που περιέχει αιθανόλη, βεβαιωθείτε οπωσδήποτε ότι πριν από την εκχύλιση εκτελείται ένα επιπλέον βήμα φυγοκέντρησης (3 λεπτά, 13.000 στρ./λεπτό) για την απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Αυτό εμποδίζει πιθανές αναστολές της PCR. Το artus C. trachomatis TM PCR Kit δεν είναι κατάλληλο για διαδικασίες απομόνωσης που λειτουργούν με βάση τη φαινόλη. Σημαντικό: Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου του artus C. trachomatis ΤΜ PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία της απομόνωσης (βλέπε 8.3 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου). 8.2.1. Συστάσεις για τον καθαρισμό των δειγμάτων ούρων και επιχρίσματος με το QIAamp Viral RNA Mini Kit Το ρυθμιστικό διάλυμα AVL, που περιέχεται στο QIAamp Viral 18 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

RNA Mini Kit, παρήχθηκε ειδικά για την αδρανοποίηση των αναστολέων που υπάρχουν σε μεγάλο αριθμό στα ούρα. Για το λόγο αυτό προτείνουμε ρητά την χρήση του πρωτοκόλλου του QIAamp Viral RNA Mini Kit, για την εκχύλιση του κυτταρικού, βακτηριακού και ιικού DNA από τα ούρα. Αφήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου (19-23 C). Επειδή στα δείγματα ούρων περιέχονται συχνά πολύ μικρές ποσότητες βακτηρίων, προτείνουμε τη συμπύκνωση του εξεταστικού υλικού. Για τον λόγο αυτό τα εξεταζόμενα δείγματα ούρων (10-30 ml) φυγοκεντρούνται για 15-20 λεπτά στις 10.000 x g (εναλλακτικά: 30 λεπτά στις 3.000 x g). Το υπερκείμενο υγρό χύνεται και το ίζημα αναμειγνύεται πλήρως ξανά, μέσω επαναλαμβανομένων αναδεύσεων (15-30 δευτ.) με 300-900 μl 1 x PBS. Ο όγκος του αιωρήματος εξαρτάται από την χρησιμοποιούμενη ποσότητα. Κατά την χρησιμοποίηση αποξηραμένων στειλεών, αναμίξτε αυτά με 500 μl 1 x PBS τουλάχιστον για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Δείγματα επιχρίσματος, τα οποία διατηρούνται σε υλικό μεταφοράς, πρέπει να αναμειχθούν πλήρως με τον αναδευτήρα Vortex. Ανοίξτε προσεκτικά το καπάκι των σωληναρίων που περιέχουν τα δείγματα και προσέξτε να μην μολυνθούν τα γάντια. Μολυσμένα γάντια πρέπει να αντικαθίστανται με καινούργια πριν από την επεξεργασία του επομένου δείγματος. Πιέστε τον στειλεό κατά του τοιχώματος του δοχείου για να εξέλθει το υγρό. Παραλάβετε με τον στειλεό πιθανά υπάρχοντα υπόλοιπα βλέννας. Πιέστε από τον στειλεό το υπόλοιπο υγρό της βλέννας κατά του τοιχώματος του δοχείου. Απομακρύνετε και καταστρέψετε το στειλεό με τα υπόλοιπα βλέννας. Για την απομόνωση DNA θα πρέπει να χρησιμοποιήσετε 140 μl του προϋπάρχοντος δείγματος. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 19

Ακολουθήστε τις οδηγίες του πρωτοκόλλου του QIAamp Viral RNA Mini Spin (QIAamp Viral RNA Mini Kit Handbook, 01/99) από το βήμα 1. Βεβαιωθείτε ότι έχει εκτελεσθεί το προαιρετικό βήμα φυγοκέντρησης 9α του πρωτοκόλλου (13.000 στρ./λεπτό, 3 λεπτά), για την απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Συνιστάται ένας όγκος εκχύλισης 60 μι. 8.2.2. Συστάσεις για τον καθαρισμό των δειγμάτων επιχρίσματος και σπέρματος με το QIAamp DNA Mini Kit Αφήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου (19-23 C). Δείγματα επιχρίσματος, τα οποία διατηρούνται σε υλικό μεταφοράς, πρέπει να αναμειχθούν πλήρως με τον αναδευτήρα Vortex. Ανοίξτε προσεκτικά το καπάκι των σωληναρίων που περιέχουν τα δείγματα και προσέξτε να μην μολυνθούν τα γάντια. Μολυσμένα γάντια πρέπει να αντικαθίστανται με καινούργια πριν από την επεξεργασία του επομένου δείγματος. Πιέστε τον στειλεό κατά του τοιχώματος του δοχείου για να εξέλθει το υγρό. Παραλάβετε με τον στειλεό πιθανά υπάρχοντα υπόλοιπα βλέννας. Πιέστε από τον στειλεό το υπόλοιπο υγρό της βλέννας κατά του τοιχώματος του δοχείου. Απομακρύνετε και καταστρέψετε το στειλεό με τα υπόλοιπα βλέννας. Ιζηματοποιήστε τα βακτήρια μέσω φυγοκέντρησης για 10 λεπτά στις 5.000 x g (7.500 στρ./λεπτό). Αναμίξτε το βακτηριακό ίζημα με 180 μι ρυθμιστικού διαλύματος ATL (QIAamp DNA Mini Kit). Αποξηραμένοι στειλεοί τοποθετούνται κατευθείαν σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml και αναμειγνύονται με 180 μι ρυθμιστικού διαλύματος ATL για 15 δευτ. Για την παραλαβή του DNA από τα δείγματα σπέρματος αραιώστε 60 μι δείγματος με 80 μι 1 x PBS σε ένα σωληνάριο 20 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

μικροφυγοκέντρησης1,5 ml. Μετά από μία πλήρη ανάμιξη με τον αναδευτήρα Vortex, μεταφέρετε με την πιπέτα 100 μι του αραιωμένου δείγματος σε 180 μι ρυθμιστικού διαλύματος ATL. Αναμίξτε το διάλυμα με τον αναδευτήρα Vortex επανειλημμένα για 15-30 δευτ. Προσθέστε στο δείγμα 20 μι πρωτεϊνάσης K. Αναμείξτε τα με τον αναδευτήρα Vortex και επωάσετε το διάλυμα στους 56 C για 1-12 ώρες. Αναδεύσετε κατά διαστήματα το δείγμα κατά την διάρκεια της επωάσεως ή τοποθετήστε το σε θερμομίξερ. Λάβετε υπόψη ότι πρέπει να χρησιμοποιηθεί πρωτεϊνάση K. Η πρωτεάση QIAGEN παρουσιάζει μειωμένη δραστικότητα υπό την παρουσία του ρυθμιστικού διαλύματος ATL. Κατά την χρησιμοποίηση αποξηραμένων στειλεών προσέξτε να εξάγετε το υγρό από το στειλεό πιέζοντάς το κατά του τοιχώματος του δοχείου. Τελικά απομακρύνετε και καταστρέψετε το στειλεό. Ακολουθήστε το Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit και QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, σελίδα 34) από το βήμα 3. Βεβαιωθείτε ότι έχει εκτελεσθεί το προαιρετικό βήμα 7α του πρωτοκόλλου (13.000 στρ./λεπτό, 3 λεπτά), για την απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Συνιστάται ένας όγκος εκχύλισης 50 μι ρυθμιστικού διαλύματος AE. 8.2.3. Συστάσεις για τον καθαρισμό λυοφιλοποιημένων δειγμάτων με το QIAamp DNA Mini Kit Αφήνετε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου (19-23 C). Αναμίξτε το λυοφιλοποιημένο δείγμα ακριβώς με 500 μι 1 x PBS με προσεκτικές κινήσεις με το χέρι. Τελικά αναμίξτε το δείγμα τουλάχιστον 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, για να διαλυθεί τελείως. Εισάγετε με πιπέτα 200 μι του διαλυμένου δείγματος σε 360 μι artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 21

ρυθμιστικού διαλύματος ATL σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml και αναμίξτε το διάλυμα με τον αναδευτήρα Vortex. Προσθέστε στο δείγμα 20 μι πρωτεϊνάσης K, αναμίξτε τα με τον αναδευτήρα Vortex και επωάσετε το διάλυμα στους 56 C για 1-12 ώρες. Αναδεύσετε κατά καιρούς το δείγμα κατά την διάρκεια της επωάσεως ή τοποθετήστε το σε θερμομίξερ. Λάβετε υπόψη ότι πρέπει να χρησιμοποιηθεί πρωτεϊνάση K. Η πρωτεάση QIAGEN παρουσιάζει μειωμένη δραστικότητα υπό την παρουσία του ρυθμιστικού διαλύματος ATL. Φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια 1,5 ml για μικρό χρονικό διάστημα, για να αποφύγετε διασταυρωμένες επιμολύνσεις μέσω των σταγονιδίων του υγρού δείγματος στο εσωτερικό του καλύμματος, κατά το άνοιγμα των σωληναρίων. Προσθέστε 400 μι ρυθμιστικού διαλύματος AL στο δείγμα, αναμίξτε πλήρως για 15 δευτ. με τον αναδευτήρα Vortex και επωάσετε το δείγμα για 10 λεπτά στους 70 C. Προσθέστε στο δείγμα 400 μι αιθανόλης (96-100 %) και αναμίξτε πάλι με ένα αναδευτήρα Vortex για 15 δευτ. Μεταφέρετε προσεκτικά το μίγμα (μαζί με το ίζημα) - χωρίς να έρθει σε επαφή με τα χείλη - στην στήλη QIAamp. Κλείστε το καπάκι και φυγοκεντρήστε για ένα λεπτό στους 6.000 x g (8.000 στρ./λεπτό). Στο τέλος τοποθετήστε την στήλη QIAamp σε ένα καθαρό 2 ml Collection Tube (περιέχεται στο κιτ) και καταστρέψτε το χρησιμοποιημένο Collection Tube μαζί με το διήθημα. Επαναλάβετε αυτό το βήμα, μεταφέρoντας το υπόλοιπο διάλυμα του μίγματος του δείγματος στην στήλη. Ακολουθήστε το Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit και QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, σελίδα 35) από το βήμα 6. Βεβαιωθείτε ότι έχει εκτελεσθεί το προαιρετικό βήμα 7α της φυγοκέντρησης (13.000 στρ./λεπτό, 3 λεπτά), για την 22 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Συνιστάται ένας όγκος εκχύλισης 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος AE. 8.3. Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Μαζί παραδίδεται και ένα πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (C. trachomatis ΤΜ IC). Με αυτό έχετε τη δυνατότητα να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του DNA, όσο και μία ενδεχομένη αναστολή της PCR (βλέπε Εικ. 1). Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου στη διαδικασία απομόνωσης σε αναλογία 0,1 μι ανά 1 μι όγκου εκχύλισης. Χρησιμοποιήστε, για παράδειγμα, το QIAamp DNA Mini Kit και εκτελέστε την εκχύλιση του DNA σε 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος AE και στη συνέχεια προσθέστε 20 μι του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Εάν π.χ. η εκχύλιση γίνεται σε 100 μι, τότε προσθέστε αντίστοιχα 10 μι. Η ποσότητα του προστιθέμενου προτύπου εσωτερικού ελέγχου εξαρτάται μόνο από τον όγκο εκχύλισης Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και εάν είναι απαραίτητο ο φορέας RNA (βλέπε 8.2 Απομόνωση DNA) επιτρέπεται να προστεθούν μόνο στο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και υλικού δείγματος ή κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου δεν επιτρέπεται να προστεθεί απευθείας στο υλικό δείγματος. Κατά την προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης λάβετε υπόψη ότι το μίγμα προτύπου εσωτερικού ελέγχου και ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/φορέα RNA πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως μετά την παρασκευή του (αποθήκευση του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου ή στο ψυγείο μπορεί να οδηγήσει, μετά από μερικές ώρες, σε απώλεια του προτύπου εσωτερικού ελέγχου και μείωση της αποτελεσματικότητας της απομόνωσης). Μην εισάγετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και το φορέα RNA με την πιπέτα απευθείας στο υλικό δείγματος. Για μία επιτυχή αξιολόγηση της απομόνωσης, πρέπει η τιμή του Ct του προτύπου εσωτερικού ελέγχου να κυμαίνεται στο ABI PRISM 7000, 7700 και artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 23

7900ΗΤ SDS στους Ct = 22 ± 3 (threshold: 0,05). Η αναφερόμενη διασπορά από τρεις τιμές Ct κατά ανώτερο όριο οφείλεται σε διακύμανση μεταξύ μηχανημάτων και της απομόνωσης. Μία υψηλότερη απόκλιση υποδεικνύει την παρουσία προβλημάτων κατά την απομόνωση. Σε αυτή την περίπτωση, η απομόνωση πρέπει να ελεγχθεί και εάν είναι απαραίτητο να επικυρωθεί εκ νέου. Στην περίπτωση που προκύψουν άλλα ερωτήματα ή προβλήματα, παρακαλούμε επικοινωνήστε με την τεχνική μας εξυπηρέτηση. Προαιρετικά το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο μιας ενδεχομένης αναστολής της PCR (βλέπε Εικ. 2). Για το σκοπό αυτό, προσθέστε για κάθε αντίδραση 0,5 μι του προτύπου εσωτερικού ελέγχου απευθείας σε 15 μι C. trachomatis TM Master. Χρησιμοποιήστε για κάθε αντίδραση της PCR 15 μι του όπως αναφέρεται παρασκευαζόμενου Master Mix * και στη συνέχεια προσθέστε 10 μι του καθαρισμένου δείγματος. Εάν θέλετε να εκτελέσετε μία διαδικασία για πολλά δείγματα, αυξήστε τις απαραίτητες ποσότητες του C. trachomatis TM Master και του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, ανάλογα με τον αριθμό δειγμάτων (βλέπε 8.5 Προετοιμασία της PCR). 8.4. Ποσοτικοποίηση Τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (C. trachomatis TM QS 1-4) χρησιμοποιούνται όπως τα δείγματα που έχουν ήδη υποστεί καθαρισμό και προστίθενται στον ίδιο όγκο (10 μι). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης σε ένα ABI PRISM Sequence Detection System, τοποθετήστε και τα τέσσερα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης και ορίστε τα ως πρότυπα, σύμφωνα με τα στοιχεία των αντίστοιχων συγκεντρώσεων (βλέπε 8.6 Προγραμματισμός των ABI PRISM SDS). Δεν είναι εφικτή η εισαγωγή πρότυπων καμπυλών με βάση προηγούμενες διαδικασίες από το λογισμικό ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS. * Η αύξηση όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 24 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

Λάβετε υπόψη: Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως αντίγραφα/μι. Για τη μετατροπή των τιμών, που έχουν καθοριστεί με βάση την πρότυπη καμπύλη, σε αντίγραφα/mι υλικού δείγματος, πρέπει να εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος: Αποτέλεσμα (αντίγρ/ml) = Αποτέλεσμα (αντίγρ/μι) x Όγκος εκχύλισης (μι) Όγκος δείγματος (ml) Παρακαλούμε προσέξτε ότι στον παραπάνω αναφερόμενο τύπο, κατά κανόνα, τοποθετείται ο αρχικός όγκος δείγματος. Αυτό λαμβάνεται υπόψη όταν ο όγκος δείγματος μεταβάλλεται πριν την απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων (π.χ. μείωση λόγω φυγοκέντρησης ή αύξηση λόγω συμπληρώματος για τον απαιτούμενο όγκο προς απομόνωση). Σημαντικό: Για την απλούστευση της ποσοτικής αξιολόγησης συστημάτων artus στο όργανο ABI PRISM 7000 SDS θα βρείτε σχετικές οδηγίες στην ιστοσελίδα www.qiagen.com/products/bylabfocus/mdx (Technical Note for quantitation on the ABI PRISM 7000 SDS). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 25

8.5. Προετοιμασία της PCR Προετοιμάστε, για τις προγραμματισμένες αντιδράσεις, τον απαιτούμενο αριθμό σωληναρίων αντίδρασης ή μία πλάκα αντίδρασης 96 βοθρίων. Στον ακόλουθο πίνακα παρατίθενται τα συνιστώμενα υλικά: Είδος Οπτική πλάκα αντίδρασης 96 βοθρίων Οπτικά αυτοκόλλητα φύλλα Οπτικά σωληνάρια αντίδρασης Οπτικά σωληνάρια αντίδρασης Οπτικά καλύμματα (επίπεδα) Χαρακτηρισμός 96-Well Optical Reaction Plate Optical Adhesive Covers ABI PRISM Optical Tubes, 8 Tubes/Strip MicroAmp Optical Tubes ABI PRISM Optical Caps, 8 Caps/Strip Αρ. καταλόγου Κατασκευαστής 4 306 737 4 311 971 4 316 567 N8010933 4 323 032 Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems Πλαίσιο υποστήριξης * Επιφάνεια συμπίεσης όχι - - ναι ναι - ναι - - όχι Λάβετε υπόψη: Η χρήση σωληναρίων αντίδρασης, για οπτικές μετρήσεις με θολωτά καλύμματα, είναι επιτρεπτή μόνο για το όργανο ABI PRISM 7700 SDS και προϋποθέτει τροποποίηση του χρόνου έκθεσης (βλέπε 8.6.2 Προγραμματισμός του ABI PRISM 7700 SDS, 8.6.2.5 Σημαντικές πρόσθετες ρυθμίσεις). Φροντίστε, κατά τη προετοιμασία της PCR, ώστε σε κάθε διαδικασία PCR να υπάρχει τουλάχιστον ένα πρότυπο ποσοτικοποίησης και ένα αρνητικό πρότυπο ελέγχου (Water, PCR grade). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης, χρησιμοποιήστε για κάθε διαδικασία PCR όλα τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (C. trachomatis TM QS 1-4). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως πριν από την έναρξη της εξέτασης σε θερμοκρασία * Κατά τη χρήση του πλαισίου υποστήριξης δύο τεμαχίων πρέπει να ανοίγετε τα σωληνάρια κατά την εισαγωγή και την εξαγωγή. Για την αποφυγή των μολύνσεων χρησιμοποιείτε αποκλειστικά το κάτω μέρος του πλαισίου υποστήριξης. 26 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

δωματίου, να αναμειγνύονται καλά (με επαναληπτική αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα ή με σύντομο στροβιλισμό) και στη συνέχεια να φυγοκεντρούνται για σύντομο χρονικό διάστημα. Για την περίπτωση που με το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου θέλετε να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του DNA, όσο και μία ενδεχομένη αναστολή της PCR, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου πρέπει ήδη να έχει προστεθεί για την απομόνωση (βλέπε 8.3 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου). Στην περίπτωση αυτή, χρησιμοποιήστε το ακόλουθο σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε επίσης σχηματική επισκόπηση στην Εικ. 1): 1. Προετοιμασία του Master Mix 2. Προετοιμασία της αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 C. trachomatis TM Master 15 μι 180 μι C. trachomatis TM IC 0 μι 0 μι Συνολικός όγκος 15 μι 180 μι Master Mix 15 μι ανά 15 μι Δείγμα 10 μι ανά 10 μl Συνολικός όγκος 25 μι ανά 25 μι Εάν θέλετε να χρησιμοποιήσετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου αποκλειστικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, θα πρέπει αυτό να προστεθεί απ' ευθείας στο C. trachomatis TM Master. Στην περίπτωση αυτή, χρησιμοποιήστε το ακόλουθο σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε επίσης και τη σχηματική επισκόπηση στην Εικ. 2): 1. Προετοιμασία του Master Mix 2. Προετοιμασία της αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 C. trachomatis TM Master 15 μι 180 μι C. trachomatis TM IC 0,5 μι 6 μι Συνολικός όγκος 15,5 μι * 186 μι * Master Mix 15 μι * ανά 15 μι * Δείγμα 10 μι ανά 10 μι Συνολικός όγκος 25 μι ανά 25 μι * Η αύξηση όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 27

Εισάγετε με πιπέτα, σε κάθε σωληνάριο αντίδρασης ή σε κάθε απαιτούμενη κοιλότητα της πλάκας αντίδρασης 96 βοθρίων, 15 μι του Master Mix. Στη συνέχεια προσθέστε 10 μι από το εκχύλισμα του απομονωμένου DNA. Φροντίστε να αναμειγνύονται καλά και τα δύο διαλύματα, με επαναληπτική αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα. Σφραγίστε τα σωληνάρια με τα αντίστοιχα καλύμματα ή εναλλακτικά, κατά τη χρήση μιας πλάκας αντίδρασης 96 βοθρίων, μέσω ενός οπτικού αυτοκόλλητου φύλλου (Optical Adhesive Covers). Για τη συλλογή του όγκου αντίδρασης στον πυθμένα των σωληναρίων ή πλακών, φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια (στον υποδοχέα φύλαξης που προβλέπεται για τα σωληνάρια της PCR) ή την πλάκα αντίδρασης 96 βοθρίων σε συσκευή φυγοκέντρησης με κεφαλή πλάκας μικροτιτλοποίησης, για 30 δευτερόλεπτα σε 1.780 x g (4.000 στρ./λεπτό). Σε περίπτωση που δεν διαθέτετε μία τέτοια συσκευή φυγοκέντρησης, τότε φροντίστε κατά τη προετοιμασία των αντιδράσεων της PCR να εισάγετε με πιπέτα τόσο το Master Mix, όσο και τον όγκο δειγμάτων στον πυθμένα των σωληναρίων ή των βοθρίων. Αποθηκεύστε τα μίγματα αντίδρασης στους +4 C, μέχρι να προγραμματιστεί το όργανο ABI PRISM SDS (βλέπε 8.6 Προγραμματισμός του ABI PRISM SDS) και μεταφέρετέ τα στη συνέχεια στη συσκευή. Λάβετε υπόψη: Κατά τη χρήση οπτικών σωληναρίων αντίδρασης σε συνδυασμό με οπτικά καλύμματα, να τοποθετείτε πάντα ένα πλαίσιο υποστήριξης (96- Well Tray/Retainer Set) στο όργανο (ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS). Κατά τη χρήση του πλαισίου υποστήριξης δύο τεμαχίων, είναι απαραίτητο να ανοίγετε τα σωληνάρια, κατά την εισαγωγή και την εξαγωγή. Για την αποφυγή μολύνσεων, χρησιμοποιείτε αποκλειστικά το κάτω μέρος του πλαισίου υποστήριξης. Η χρήση οπτικών πλακών αντίδρασης 96 βοθρίων σε συνδυασμό με οπτικά αυτοκόλλητα φύλλα, απαιτεί την τοποθέτηση μιας επιφάνειας συμπίεσης (Optical Cover Compression Pads). 28 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

Προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στην απομόνωση καθαρισμός μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/υλικού δείγματος + 0,1 μι IC* ανά 1 μι όγκου εκχύλισης 10 μι καθαρού δείγματος* 15 μι artus Master* οπτικές/ά πλάκες/σωληνάρια αντίδρασης ABI PRISM SDS Εικ. 1: Σχηματική απεικόνιση της ροής εργασιών για τον έλεγχο της απομόνωσης και της αναστολής της PCR. * Σε κάθε βήμα επεξεργασίας με πιπέτα πρέπει οπωσδήποτε να φροντίσετε για την πλήρη απόψυξη, την καλή ανάμιξη και τη σύντομη φυγοκέντρηση των διαλυμάτων που θα χρησιμοποιηθούν. artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 29

Προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο artus Master 0,5 μι IC* 15 μι artus Master* καθαρισμός 15,5 μι Master Mix* 10 μι καθαρού δείγματος* 15 μι Master Mix* οπτικές/ά πλάκες/σωληνάρια αντίδρασης ABI PRISM SDS Εικ. 2: Σχηματική απεικόνιση της ροής εργασιών για τον έλεγχο της αναστολής της PCR. * Σε κάθε βήμα επεξεργασίας με πιπέτα πρέπει οπωσδήποτε να φροντίσετε για την πλήρη απόψυξη, την καλή ανάμιξη και τη σύντομη φυγοκέντρηση των διαλυμάτων που θα χρησιμοποιηθούν. 30 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

8.6. Προγραμματισμός των ABI PRISM SDS Το λογισμικό του ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT Sequence Detection System (SDS) απαιτεί, πριν από την έναρξη της διαδικασίας PCR, ορισμένες πρόσθετες πληροφορίες. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές αποκλίσεις στους τρόπους διαδικασίας κατά τον προγραμματισμό των συσκευών, για τους οποίους ακουλουθεί περιγραφή σε ξεχωριστά κεφάλαια. 8.6.1. Προγραμματισμός του ABI PRISM 7000 SDS Για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis δημιουργήστε στο ABI PRISM 7000 SDS ένα προφίλ, σύμφωνα με τα ακόλουθα έξι στάδια εργασίας (8.6.1.1-8.6.1.6). Όλα τα στοιχεία αναφέρονται στην ABI PRISM 7000 SDS έκδοση λογισμικού 1.0.1. Λεπτομέρειες για τον προγραμματισμό του ABI PRISM 7000 SDS μπορείτε να βρείτε στο εγχειρίδιο ABI PRISM 7000 SDS User Guide. Για την καλύτερη επισκόπηση, οι απαραίτητες ρυθμίσεις επισημαίνονται στις απεικονίσεις με μαύρα πλαίσια. 8.6.1.1. Προκαταρκτικές ρυθμίσεις για τη δημιουργία νέας διαδικασίας PCR Επιλέξτε, στο ABI PRISM 7000 SDS, από το File (Αρχείο) την επιλογή μενού New (Νέο) και ορίστε τις ακόλουθες βασικές ρυθμίσεις για το νέο έγγραφο (βλέπε Εικ. 3). Στη διάθεσή σας υπάρχει ένα ήδη αποθηκευμένο πρότυπο, (SDS Template [*.sdt]) το οποίο θα βρείτε στη λίστα Template (Πρότυπο) ή επιλέγοντάς το με τη λειτουργία Browse (Αναζήτηση) (βλέπε 8.6.1.5 Αποθήκευση της διαδικασίας PCR). Επιβεβαιώστε την ενέργειά σας (OK). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 31

Εικ. 3: Προκαταρκτικές ρυθμίσεις για τη δημιουργία μιας νέας διαδικασίας PCR (New Document). 8.6.1.2. Δημιουργία/επιλογή των ανιχνευτών Με τη βοήθεα του υπομενού Detector Manager (Διαχειριστής ανιχνευτών), που βρίσκεται στην επιλογή Tools (Εργαλεία), αντιστοιχίστε στο έγγραφο τις κατάλληλες χρωστικές ουσίες ανιχνευτών. Για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis καθώς και του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, μέσω του artus C. trachomatis TM PCR Kit, πρέπει να προσδιορίζονται οι Reporter/Quencher (Ανιχνευτής φθορισμού/αναστολέας φθορισμού) που παρατίθενται στον ακόλουθο πίνακα: Ανίχνευση Reporter Quencher DNA C. trachomatis FAM TAMRA Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (C. trachomatis TM IC) VIC none Για τη δημιουργία αυτών των ανιχνευτών, επιλέξτε από το Detector Manager κάτω αριστερά την προσαρμοσμένη επιλογή File και στη συνέχεια την επιλογή New. 32 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

Εικ. 4: Δημιουργία του ειδικού ανιχνευτή του C. trachomatis (Detector Manager). Εικ. 5: Δημιουργία του ειδικού ανιχνευτή του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (Detector Manager). Στο παράθυρο που εμφανίζεται τώρα ορίστε (σύμφωνα με τις Εικ. 4 και Εικ. 5), για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis, το συνδυασμό Reporter/Quencher FAM/TAMRA, ενώ για την ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου επιλέξτε το συνδυασμό VIC/none. Με την επιβεβαίωση της ενέργειας (OK) επιστρέφετε στο Detector Manager. Επισημάνετε τους ανιχνευτές που δημιουργήθηκαν και μεταφέρετε αυτό που επιλέξατε με την επιλογή Add to Plate Document (Προσθήκη στο έγγραφο πλάκας) στην επιλογή Well Inspector (Ελεγκτής βοθρίου) (βλέπε Εικ. 6). Κλείστε το παράθυρο (Done). Εικ. 6: Επιλογή των ανιχνευτών (Detector Manager). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 33

8.6.1.3. Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών Από το μενού View (Προβολή) ανοίξτε τώρα την επιλογή Well Inspector, για να βρείτε εκεί ξανά τους ανιχνευτές που έχετε επιλέξει από το 8.6.1.2 (βλέπε Εικ. 7). Εικ. 7: Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών (Well Inspector). Επισημάνετε τις ενδεικτικές θέσεις πλάκας, για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis. Αντιστοιχίστε στις θέσεις αυτές τους επιλεγμένους ανιχνευτές, ενεργοποιώντας την επιλογή Use (Χρήση) και των δύο ανιχνευτών. Εμφανίζεται ένα άγκιστρο. Για την ονομασία των επιμέρους μιγμάτων αντίδρασης επιλέξτε την αντίστοιχη θέση από την πλάκα και καταχωρήστε το όνομα στην επιλογή Sample Name (Όνομα δείγματος). Λάβετε υπόψη σας ότι τα μίγματα με ίδιο Sample Name και ίδια αντιστοίχιση ανιχνευτών αναγνωρίζονται από το λογισμικό ως επαναλήψεις και προσδιορίζονται αναφορικά με το ποσοτικοποιημένο φορτίο του παθογόνου παράγοντά τους. Επιλέξτε τότε για κάθε τύπο δείγματος την ανάλογη λειτουργία (Task), σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα: 34 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

Τύπος δείγματος Λειτουργία (Task) Συγκέντρωση (Quantity) Reporter Quencher Δείγμα Unknown - FAM TAMRA Αρνητικό πρότυπο ελέγχου Πρότυπο NTC - FAM TAMRA Standard Βλέπε 1. Περιεχόμενο FAM TAMRA Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης χρησιμοποιήστε, σε κάθε διαδικασία PCR, όλα τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (C. trachomatis TM QS 1-4) και καταχωρήστε τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις (βλέπε 1. Περιεχόμενο) για κάθε επιμέρους πρότυπο (Quantity). Λάβετε υπόψη σας ότι για μία διαδικασία PCR με το artus C. trachomatis TM PCR Kit, η ένδειξη ROX πρέπει να ρυθμίζεται ως αναφορά παθητικού (Passive Reference). Η ομοιόμορφη κατανομή της χρωστικής ουσίας ROX σε όλα τα μίγματα PCR μιας παρτίδας, μέσω της ανάμιξης του C. trachomatis TM Master, διασφαλίζει την αναγνώριση και τον υπολογισμό των tube-to-tube (σωλήνα προς σωλήνα) αποκλίσεων (διαφορές φθορισμού μεταξύ διαφόρων μιγμάτων PCR), με βάση το Sequence Detection Software (Κανονικοποίηση). 8.6.1.4. Δημιουργία του προφίλ θερμοκρασίας Για την καταχώρηση του προφίλ θερμοκρασίας, μεταβείτε από το επίπεδο Setup (Ρύθμιση) στο επίπεδο Instrument (Όργανο) του λογισμικού. Καταχωρήστε το ειδικό προφίλ θερμοκρασίας, για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis, σύμφωνα με την Εικ. 8. Για την απομάκρυνση του σταδίου 50 C, που αποθηκεύτηκε στις προκαταρκτικές ρυθμίσεις, επισημάνετε αυτό με το αριστερό πλήκτρο του ποντικιού κρατώντας παράλληλα πατημένο το πλήκτρο Shift και στη συνέχεια διαγράψτε το, χρησιμοποιώντας το πλήκτρο Backspace. Ελέγξτε αν ο όγκος αντίδρασης είναι ρυθμισμένος σε 25 μι. Η επιλογή 9600 Emulation πρέπει να είναι ενεργοποιημένη και οι προκαταρκτικές ρυθμίσεις του Auto Increment (Αυτόματη επαύξηση) να παραμένουν αμετάβλητες (Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 35

Εικ. 8: Δημιουργία του προφίλ θερμοκρασίας. 8.6.1.5. Αποθήκευση της διαδικασίας PCR Στη θέση αυτή μπορείτε να αποθηκεύσετε τις ήδη καταχωρημένες ρυθμίσεις (Setup) ως πρότυπο, για να τις χρησιμοποιήσετε εκ νέου σε επόμενες εφαρμογές σε τροποποιημένη ή μη τροποποιημένη μορφή. Με την αποθήκευση των ρυθμίσεων ως SDS Template (*.sdt) στον κατάλογο Template Directory (Κατάλογος προτύπου) (Local Disk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, του λογισμικού Applied Biosystems), το αρχείο αυτό μπορεί να επιλέγεται απευθείας από την αναπτυσσόμενη λίστα Template στο παράθυρο New Document (Νέο έγγραφο). Τα πρότυπα που είναι αποθηκευμένα σε άλλους καταλόγους πρέπει να επιλέγονται μέσω της επιλογής Browse. Πριν από την έναρξη της διαδικασίας PCR, φροντίστε να αποθηκεύσετε αυτή εκ νέου ως SDS Document (*.sds). Έτσι διασφαλίζετε την αποθήκευση των δεδομένων που συλλέγονται κατά την εξέλιξη της PCR. 36 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015

8.6.1.6. Έναρξη της διαδικασίας PCR Ξεκινήστε τη διαδικασία PCR, διαλέγοντας την επιλογή Start (Έναρξη) από την επιλογή μενού Instrument ή το πεδίο Start στο επίπεδο Instrument. 8.6.2. Προγραμματισμός του ABI PRISM 7700 SDS Για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis, δημιουργήστε στο ABI PRISM 7700 SDS ένα προφίλ, σύμφωνα με τα ακόλουθα επτά στάδια εργασίας (8.6.2.1-8.6.2.7). Όλα τα στοιχεία αναφέρονται στην ABI PRISM 7700 SDS έκδοση λογισμικού 1.9.1. Λεπτομέρειες για τον προγραμματισμό του ABI PRISM 7700 SDS, μπορείτε να βρείτε στο εγχειρίδιο ABI PRISM 7700 SDS User s Manual. Για την καλύτερη επισκόπηση, οι απαραίτητες ρυθμίσεις επισημαίνονται στις απεικονίσεις με μαύρα πλαίσια. 8.6.2.1. Προκαταρκτικές ρυθμίσεις για τη δημιουργία μιας νέας διαδικασίας PCR Επιλέξτε στο ABI PRISM 7700 SDS από το File (Αρχείο) την επιλογή μενού New Plate (Νέα πλάκα) και ορίστε τις ακόλουθες βασικές ρυθμίσεις για το νέο έγγραφο (βλέπε Εικ. 9). Επιβεβαιώστε την ενέργειά σας (OK). Εικ. 9: Προκαταρκτικές ρυθμίσεις για τη δημιουργία μιας νέας διαδικασίας PCR (New Plate). artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015 37

8.6.2.2. Επιλογή των φθορίζουσων χρωστικών ουσιών και αντιστοίχιση του τύπου δείγματος Μέσω του Sample Type Setup (Setup: Sample Type/Sample Type Setup, Εγκατάσταση: Τύπος δείγματος/εγκατάσταση τύπου δείγματος) αντιστοιχίστε στο έγγραφο τις κατάλληλες χρωστικές ουσίες ανιχνευτών και τον κατάλληλο τύπο δείγματος. Για την ανίχνευση του DNA του C. trachomatis καθώς και του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, μέσω του artus C. trachomatis TM PCR Kit, πρέπει να προσδιορίζονται οι Reporter/Quencher (Ανιχνευτής φθορισμού/αναστολέας φθορισμού) που παρατίθενται στον ακόλουθο πίνακα: Ανίχνευση Reporter Quencher DNA C. trachomatis FAM TAMRA Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (C. trachomatis TM lc) VIC TAMRA Για τη μέτρηση του DNA του C. trachomatis, μέσω του artus C. trachomatis TM PCR Kit, επιλέξτε αναλογικά προς τον πίνακα τη χρωστική ουσία του Reporter FAM. Αυτό ισχύει τόσο για τα πρότυπα (STND), τα δείγματα (UNKN) όσο και για τα αρνητικά πρότυπα ελέγχου (UNKN). Για τη μέτρηση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IPC+) ορίστε ως Reporter το VIC. Ως Quencher ορίστε το TAMRA. Η αντιστοίχιση των χρωστικών ουσιών και των τύπων δειγμάτων στο παράθυρο Sample Type Setup εμφανίζεται στην Εικ. 10. 38 artus C. trachomatis TM PCR Kit 01/2015