-1096-9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΤΡΟΦΙΚΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Α ΣΤΗ ΣΚΕΛΕΤΙΚΗ ΔΙΑΠΛΑΣΗ ΤΟΥ ΛΑΒΡΑΚΙΟΥ [DICENTRARCHUS LABRAX (LINNAEUS 1758)] Καραμάνος Δ. 1, Μπαλτζώης Α. 1, Γεώργα Ι. 1, Γλυνάτση Ν. 1, Mazurais D. 2, Cahu C.L. 2, Zambonino-Infante J.L. 2, Κουμουνδούρος Γ. 1 1 Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών, koumound@upatras.gr 2 Ifremer Marine Fish Nutrition Team, Nutrition Aquaculture & Genomics Research Unit, Plouzane, France Περίληψη Εφαρμόστηκαν 7 διαφορετικά διατροφικά επίπεδα ρετινόλης (0, 5, 10, 15, 25, 35 και 70 mg ρετινόλης ανά Kg ξηράς τροφής), σε 21 νυμφικούς πληθυσμούς λαβρακιού μέχρι την 45 η ημέρα μετά την εκκόλαψη (dph). Για τον έλεγχο της επίδρασης της βιταμίνης Α στο σχήμα του σκελετού των φυσιολογικών ιχθυδίων (100 dph) και στο σχήμα των κοιλιακών πτερυγίων των νυμφών (45 dph), εφαρμόστηκε η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η διατροφή των νυμφών επηρεάζει σημαντικά το σχήμα του σκελετού τόσο των νυμφών (Wilk s λ=0,3087, p<0,001) όσο και των ιχθυδίων (Wilk s λ=0,0579, p<0,001), τροποποιώντας τη σχετική θέση και το μέγεθος των διάφορων σκελετικών στοιχείων. Είναι η πρώτη φορά που αποδεικνύεται ο καθοριστικός ρόλος της διατροφής των νυμφών στη φυσιολογική δομή του σκελετού των ιχθυδίων λαβρακιού. Λέξεις κλειδιά: διατροφή, νύμφες, φαινοτυπική πλαστικότητα, οστεολογία, σχήμα σώματος. EFFECT OF DIETARY VITAMIN A ON THE SKELETAL SHAPE OF EUROPEAN SEA BASS [DICENTRARCHUS LABRAX (LINNAEUS 1758)] Karamanos Δ. 1, Baltzois A. 1*, Georga Ι. 1, Glynatsi Ν. 1, Mazurais D. 2, Cahu C.L. 2, Zambonino- Infante J.L. 2, Koumoundouros G. 1 1 Biology Dpt,University of Patras, koumound@upatras.gr 2 Ifremer Marine Fish Nutrition Team, Nutrition Aquaculture & Genomics Research Unit, Plouzane, France Abstract Seven different dietary levels of retinol (0, 5, 10, 15, 25, 35, 70 mg retinol Kg -1 of dry food) were applied in 21 larval populations of sea bass during the first 45 days post hatching (dph). Geometric morphometrics were used to study the effect of dietary vitamin A on the shape of whole skeleton (normal juveniles, 100 dph) and pelvic fins (larvae, 45 dph). Results demonstrated a significant effect of larval nutrition on both larval (Wilk s λ=0,3087, p<0.001) and juvenile skeleton (Wilk s λ=0,0579, p<0.001). Nutritional effects concerned the position and size of the different skeletal elements. This is the first evidence of the crucial role of larval nutrition for the normal skeletal structure of sea bass juveniles. Keywords: diet, larvae, phenotypic plasticity, osteology, body shape. 1. Εισαγωγή Η ανάπτυξη του σκελετού των ψαριών επηρεάζεται σημαντικά από το περιβάλλον. Κατά τη διάρκεια των πρώιμων οντογενετικών σταδίων, παράγοντες όπως η θερμοκρασία, η ταχύτητα των ρευμάτων του νερού και η διατροφή έχει δειχθεί ότι μπορούν να τροποποιούν το ρυθμό διαφοροποίησης των σκελετικών δομών ή/και τους μεριστικούς χαρακτήρες (Sfakianakis et al. 2004, Georgakopoulou et al. 2007), καταλήγοντας δε συχνά και στην πρόκληση σκελετικών δυσπλασιών (Koumoundouros et al. 2002, Cahu et al. 2003). Δεδομένης της σημασίας του σκελετικού συστήματος (σχήμα σώματος, πρόσφυση μυών, κολύμβηση, σύλληψη τροφής, κλπ), η μελέτη της πλαστικότητάς του θεωρείται σημαντική, τόσο για το ευρύτερο πεδίο της βιολογίας των ψαριών όσο και για τις ιχθυοκαλλιέργειες, όπου οι σκελετικές αποκλίσεις από το φυσιολογικό πρότυπο αποτελούν κύριο πρόβλημα ποιότητας. Μεταξύ των διατροφικών παραγόντων, τα εκτός φυσιολογικών ορίων
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ διατροφικά επίπεδα βιταμίνης Α έχει αποδειχτεί ότι επηρεάζουν την οστεολογική ανάπτυξη των νυμφών, προκαλώντας εκτεταμένες αναπτυξιακές αποκλίσεις σε όλες σχεδόν τις ανατομικές περιοχές (Cahu et al. 2003, Villeneuve et al. 2006, Γλυνάτση et al. 2009). Άγνωστη παραμένει η επίδραση της βιταμίνης Α στην εντός φυσιολογικών ορίων ανάπτυξη του σκελετού. Το λαβράκι [Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758)] είναι ένα από τα σημαντικότερα είδη της Ευρωπαϊκής ιχθυοκαλλιέργειας. Όπως και στα περισσότερα εκτρεφόμενα είδη, η ανάπτυξη σκελετικών παραμορφώσεων αποτελεί σημαντικό πρόβλημα στην εκτροφή του. Επιπρόσθετα, παρουσιάζει υψηλή φαινοτυπική πλαστικότητα ως απόκριση στο περιβάλλον (Corti et al. 1996, Loy et al. 1999, Koumoundouros et al. 2001), αποτελώντας έτσι αξιόλογο οργανισμό μοντέλο για τη μελέτη της επίδρασης του περιβάλλοντος στην ανάπτυξη του σκελετού. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης των διατροφικών επιπέδων βιταμίνης Α κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου, στο σχήμα του σκελετού των ιχθυδίων. 2. Υλικά και Μέθοδοι Εφαρμόστηκαν επτά διαφορετικά διατροφικά επίπεδα ρετινόλης σε τρεις επαναλήψεις (0, 5, 10, 15, 25, 35 και 70 mg ρετινόλης ανά Kg ξηρής τροφής). Η εφαρμογή των διαφορετικών διατροφικών συνθηκών έγινε σε όλο το νυμφικό στάδιο (9η ημέρα μετά την εκκόλαψη, dph, 20 o C) και μέχρι την ηλικία των 45 dph. Μετά το τέλος εφαρμογής των διαφορετικών συνθηκών, οι 21 πληθυσμοί υποβλήθηκαν σε κοινές διατροφικές συνθήκες μέχρι την ηλικία των 100 dph. Σε όλη τη διάρκεια των πειραμάτων τα άτομα τρέφονταν με ξηρή τροφή. Οι υπόλοιπες πειραματικές συνθήκες αναφέρονται λεπτομερώς από τους Γλυνάτση et al. (2009). Στο τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών συνθηκών (45 dph), από κάθε πληθυσμό λήφθηκαν τυχαία δείγματα 50±5 ατόμων, τα οποία αναισθητοποιήθηκαν και συντηρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5%. Τυχαία δείγματα 50±2 ατόμων ανά πληθυσμό λήφθηκαν επίσης στο στάδιο των ιχθυδίων (35-45mm SL, 100 dph), τα οποία αναισθητοποιήθηκαν και συντηρήθηκαν στους -20 ο C. Τα δείγματα των νυμφών υποβλήθηκαν σε διπλή χρώση με Κυανό της Αλσατίας (Alcian Blue) και Αλιζαρίνη (Alizarin Red S) για την εκλεκτική χρώση των χόνδρων και των οστών αντίστοιχα (Park & Kim 1984), ενώ τα δείγματα των ιχθυδίων ραδιογραφήθηκαν (Koumoundouros et al. 2000). Εφαρμόστηκε η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας για τον έλεγχο της επίδρασης της βιταμίνης Α α) στο σχήμα του σώματος των φυσιολογικών ιχθυδίων, και β) στην ανατομία των κοιλιακών πτερυγίων των νυμφών ηλικίας 45 dph. Η ανάλυση του σχήματος έγινε σε 21 μορφομετρικά σημεία που τοποθετήθηκαν στις φωτογραφίες των ακτινογραφιών (tpsdig 1.37) (Εικ. 1Α) και σε 11 μορφομετρικά σημεία που τοποθετήθηκαν στις φωτογραφίες των κοιλιακών πτερυγίων των νυμφικών δειγμάτων (Εικ. 1Β). Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έγινε σύμφωνα με τους Georgakopoulou et al. (2007). Για τον έλεγχο των διαφορών σχήματος μεταξύ των υπό εξέταση πληθυσμών εφαρμόστηκε ανάλυση κανονικών συνιστωσών (Statistica 6.0). Τα πλέγματα παραμόρφωσης, βάσει των οποίων παρουσιάζονται οι διαφορές σχήματος μεταξύ των πληθυσμών, υπολογίστηκαν μετά από ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης των ομοιόμορφων και μη ομοιόμορφων συνιστωσών του σχήματος, με τις μεταβλητές της ανάλυσης κανονικών συνιστωσών (tpsregr 1.07) (Georgakopoulou et al. 2007). -1097-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 1: Μορφομετρικά σημεία που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση του σχήματος των ιχθυδίων (Α) και των κοιλιακών πτερυγίων των νυμφών. Α. 1, πρόσθιο όριο προγναθικών. 2, πρόσθιο όριο του υπερινιακού, 3, 5, πρόσθιο και οπίσθιο ραχιαίο πτερυγιοφόρο. 4, οπίσθιο ραχιαίο πτερυγιοφόρο με σκληρή άκανθα. 6, μέσο 2 ου και 3 ου υπουραίου. 7, 8, οπίσθιο και πρόσθιο εδρικό πτερυγιοφόρο. 9, οπίσθιο όριο βασιπτερυγίου. 10, κοιλιακό όριο κλείθρου. 11, οπίσθιο όριο αρθρικού. 12, 13, 14, 15, 16, πρόσθιο όριο του 1 ου, 5 ου, 10 ου, 15 ου και 20 ου σπονδύλου. 17, πρόσθιο όριο ουρόστυλου. 18, 19, άνω και κάτω όριο του ουραίου μίσχου, στο επίπεδο του 3 ου προ-ουραίου κέντρου. 20, 21, άπω όριο της νευρικής και αιματικής άκανθας του 15 ου σπονδύλου. Β. 1, κοιλιακό σημείο επαφής του αριστερού και δεξιού κλείθρου. 2, 5, εγγύς γωνία αριστερού και δεξιού επικορακοειδούς οστού. 3, 4, κοιλιακό όριο του αριστερού και δεξιού κάτω μετακλείθρου. 6, 11, πρόσθιο όριο αριστερού και δεξιού βασιπτερυγίου. 7, 10, άπω πλευρικό όριο του αριστερού και δεξιού βασιπτερυγίου. 8, 9, οπίσθια όριο αριστερού και δεξιού βασιπτερυγίου. 3. Αποτελέσματα Τα διατροφικά επίπεδα βιταμίνης Α κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου, επηρέασαν σημαντικά το σχήμα του σώματος των ιχθυδίων 55 μέρες μετά την εφαρμογή των διαφορετικών συνθηκών (Wilk s λ=0,0579, p<0,001). Οι διαφορές σχήματος εκφράστηκαν κυρίως κατά μήκος της πρώτης κανονικής μεταβλητής (CV1), διαχωρίζοντας πλήρως τα άτομα της μηδενικής συγκέντρωσης βιταμίνης Α από εκείνα των συγκεντρώσεων 10, 25, 35 και 70 mg/κg. Τα άτομα των συνθηκών 5 και 15 mg/κg εμφάνισαν ενδιάμεσο σχήμα (Εικ. 2). Τα πλέγματα παραμόρφωσης έδειξαν ότι συγκρινόμενα με τους υπόλοιπους πληθυσμούς, τα άτομα της συνθήκης 0 mg/κg παρουσίασαν πρόσθια μετατόπιση του πρόσθιου ραχιαίου και εδρικού πτερυγιοφόρου (σημείο 3 και σημείο 8), του ουραίου μίσχου (σημεία 6, 17-19), οπίσθια μετατόπιση του 5 ου, 10 ου, 15 ου και 20 ου σπονδύλου (σημεία 12-15) και οπίσθια-νωτιαία μετατόπιση του οπίσθιου κοιλιακού πτερυγιοφόρου (σημείο 7) (Εικ. 3). Η σημαντική επίδραση των διατροφικών επιπέδων βιταμίνης Α επιβεβαιώθηκε και με την εξέταση της ανατομίας των κοιλιακών πτερυγίων στα δείγματα των νυμφών (Wilk s λ=0,3087, p<0,001). Σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση, τα άτομα των διαφορετικών πληθυσμών διαβαθμίσθηκαν κατά μήκος της πρώτης κανονικής μεταβλητής (Εικ. 4). Τα πλέγματα παραμόρφωσης έδειξαν ότι συγκρινόμενα με τους υπόλοιπους πληθυσμούς, τα άτομα της συνθήκης 0 mg/κg παρουσίασαν πρόσθια μετατόπιση του κλείθρου (σημείο 1), πλευρική μετατόπιση των υπόλοιπων οστών της θωρακικής ζώνης (σημεία 2-5), καθώς και μείωση του μεγέθους των βασιπτερυγίων με προς τα έσω μετατόπιση του πρόσθιου (σημεία 6, 11) και οπίσθιου (σημεία 8, 9) ορίου τους (Εικ. 5). -1098-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Εικ. 2: Διασπορά των διαφορετικών πληθυσμών ιχθυδίων κατά μήκος των κανονικών μεταβλητών CV1, CV2, CV3 βάσει της συγκέντρωσης ρετινόλης στη διατροφή των νυμφών. Δίνεται ο μέσος όρος (±2SE) και -εντός παρένθεσης- ο αριθμός των ατόμων κάθε ομάδας. Εικ. 3: Πλέγματα παραμόρφωσης των ακραίων τιμών (-, +) των κανονικών μεταβλητών (CV1-CV3) για την ανάλυση του σχήματος των ιχθυδίων. Εικ 4: Διασπορά των διαφορετικών νυμφικών πληθυσμών κατά μήκος των κανονικών μεταβλητών CV1 και CV2, βάσει της συγκέντρωσης ρετινόλης στη διατροφή των νυμφών. Δίνεται ο μέσος όρος (±2SE) και -εντός παρένθεσης- ο αριθμός των ατόμων κάθε ομάδας. -1099-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 5: Πλέγματα παραμόρφωσης των ακραίων τιμών (-, +) των κανονικών μεταβλητών (CV1, CV2) για την ανάλυση του σχήματος των κοιλιακών πτερυγίων. 4. Συζήτηση Ο ρόλος της διατροφής των νυμφών στο σχήμα του σκελετού των ιχθυδίων δεν είχε μέχρι σήμερα μελετηθεί, μια και οι σχετικές εργασίες περιορίζονταν στον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών για την αποφυγή της ανάπτυξης σκελετικών δυσπλασιών (ανασκόπηση από Cahu et al. 2003). Από την άλλη, η μόνη μέχρι σήμερα εργασία που εξετάζει την επίδραση του περιβάλλοντος ανάπτυξης των νυμφών στο σχήμα του σώματος των φυσιολογικών ιχθυδίων, αφορά στη θερμοκρασία και στο λαβράκι (Georgakopoulou et al. 2007). Με την παρούσα εργασία εξετάστηκε για πρώτη φορά η επίδραση του περιβάλλοντος ανάπτυξης (διατροφικά επίπεδα βιταμίνης Α) των νυμφών στο σχήμα του σκελετού φυσιολογικών ιχθυδίων, 55 ημέρες δηλαδή μετά την εφαρμογή των διαφορετικών συνθηκών. Όπως και στην περίπτωση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (Georgakopoulou et al. 2007), τα αποτελέσματα έδειξαν τον καθοριστικό ρόλο του νυμφικού περιβάλλοντος στη διαμόρφωση του φαινοτύπου των ψαριών. Από την άλλη υποδεικνύουν την εφαρμογή της γεωμετρικής ανάλυσης τους σχήματος των οστών ως κατάλληλη μέθοδο για τη μελέτη των μηχανισμών διαμόρφωσης των σκελετικών δυσπλασιών. 5. Ευχαριστίες Η εργασία χρηματοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό Ερευνητικό Πρόγραμμα FineFish (COLL- CT-2005-012451). 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Cahu, C., Zambonino Infante, J. & Takeuchi, T., 2003. Nutritional components affecting skeletal development in fish larvae. Aquaculture 227 (1-4): 245-258. Corti, M., Loy, A. & Cataudella, S., 1996. Form changes in the sea bass, Dicentrarchus labrax (Moronidae: Teleostei), after acclimation to freshwater: An analysis using shape coordinates. Environmental Biology of Fishes, 47 (2): 165-175. Georgakopoulou, E., Sfakianakis, D.G., Kouttouki, S., Divanach, P., Kentouri, M. & Koumoundouros, G. 2007. The influ- -1100-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ence of temperature during early life on phenotypic expression at later ontogenetic stages in sea bass. Journal of Fish Biology 70 (1): 278-291. Koumoundouros, G., Divanach, P., Savaki, A. & Kentouri, M., 2000. Effects of three preservation methods on the evolution of swimbladder radiographic appearance in sea bass and sea bream juveniles. Aquaculture, 182 (1-2): 17-25. Koumoundouros, G., Divanach, P., Anezaki, L. & Kentouri, M., 2001. Temperature-induced ontogenetic plasticity in sea bass (Dicentrarchus labrax). Marine Biology, 139 (5): 817-830. Koumoundouros, G., Maingot, E., Divanach, P.& Kentouri, M., 2002. Kyphosis in reared sea bass: ontogeny and effects on mortality. Aquaculture, 209 (1-4): 49-58. Loy, A., Corti, M. & Cataudella, S., 1999. Variation in gillraker number during growth of the sea bass, Dicentrarchus labrax (Perciformes: Moronidae), reared at different salinities. Environmental Biology of Fishes, 55 (4): 391-398. Park, E.H. & Kim, D.S., 1984. A procedure for staining cartilage and bone of whole vertebrate larvae while rendering all other tissues transparent. Stain Τechnology, 59 (5): 269 272. Sfakianakis, D.G., Koumoundouros, G., Divanach, P. & Kentouri, M., 2004. Osteological development of the vertebral column and of the fins of Pagellus erytrinus (L. 1758). Temperature effect on the developmental plasticity and morphoanatomical abnormalities. Aquaculture, 232 (1-4): 407-424. Villeneuve, L., Gisbert, E., Moriceau, J., Cahu, C.L. & Zambonino-Infante, J.L., 2006. Intake of high levels of vitamin A and polyunsaturated fatty acids during different developmental periods modifies the expression of morphogenesis genes in European sea bass (Dicentrarchus labrax). British Journal of Nutrition 95 (4): 677-687. Γλυνάτση, Ν., Mazurais, D., Χριστοδουλοπούλου, Σ., Γεωργακοπούλου, Ε., Καραμάνος, Δ., Darias, M.J., Cahu, C. L., Zambonino-Infante, J.L. & Κουμουνδούρος, Γ., 2009. Επίδραση των διατροφικών επιπέδων βιταμίνης A στην οστεολογική ανάπτυξη του λαυρακιού, Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758). 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας. Υποβεβλημένη εργασία. -1101-