Καρβέλης Φώτης ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ
Λόγοι για τουσ οποίουσ κάνουμε γονιδιωματικι βιβλιοκικθ Για οργανιςμοφσ που κινδυνεφουν να εξαφανιςτοφν. Για εκπαιδευτικοφσ λόγουσ. Για να κάνουμε μελζτθ ςτθν εξελικτικι Βιολογία. Για να μελετιςουμε ςυγκεκριμζνεσ αλλθλουχίεσ ςτο γονιδίωμα ενόσ οργανιςμοφ.
Βιμα 1 ο : Απομόνωςθ του ςυνολικοφ γονιδιώματοσ του οργανιςμοφ δότθ και ανάμιξι του με μία μόνο περιοριςτικι ενδονουκλεάςθ. Κφτταρο Μονόκλωνα άκρα Δράςθ ενηφμου πυρινασ ινίδιο DNA υνολικό γονιδίωμα
Βιμα 2 ο : Προετοιμαςία του φορζα κλωνοποίθςθσ. Αφαιροφμε όλα τα πλαςμίδια από τα βακτιρια που πρόκειται να χρθςιμοποιιςουμε ωσ φορείσ κλωνοποίθςθσ. Αυτό επιτυγχάνεται κάνοντασ τθ μεμβράνθ του παροδικά διαπερατι με χριςθ δ/τοσ NaCl. Βακτθριακό κφτταρο πλαςμίδιο Δ/μα NαCl Κυρίωσ γενετικό υλικό
Βιμα 3 ο : Ανάμιξθ των φορζων κλωνοποίθςθσ με τθν ίδια περιοριςτικι ενδονουκλεάςθ που χρθςιμοποιιςαμε και ςτο γονιδίωμα του οργανιςμοφ δότθ. Αυτό διότι τα μόρια DNA κζλουμε να ζχουν ςυμπλθρωματικά μονόκλωνα άκρα. Ζτςι είναι δυνατόσ ο αναςυνδυαςμόσ τουσ. Μονόκλωνα ςυμπλθρωματικά άκρα δράςθ ενηφμου
Βιμα 4 ο : Ανάμιξθ των φορζων κλωνοποίθςθσ με τα κομμάτια του DNA του οργανιςμοφ του δότθ. + ΠΡΟΟΧΗ! το ςτάδιο αυτό ειςάγουμε το ζνηυμο δεςμάςθ για να μπορζςουν να αναπτυχκοφν φ.δ μεταξφ διαδοχικών νουκλεοτιδίων που ανικουν αρχικά ςε διαφορετικά μόρια.
Αποτζλεςμα: Θερμοδυναμικά ευνοοφμενθ κυκλοποίθςθ των φορζων κλωνοποίθςθσ που περιζχουν το ξζνο DNA. Α Ν Α Τ Ν Δ Τ Α Μ Ο ΠΡΟΟΧΗ! Ο αναςυνδυαςμόσ αφορά τα μόρια και όχι τουσ οργανιςμοφσ
Βιμα 5 ο : Ειςαγωγι των αναςυνδυαςμζνων μορίων ςτα βακτιρια ξενιςτζσ, αφοφ πρώτα κάνουμε τθ μεμβράνθ τουσ παροδικά διαπερατι. βακτιριο Κυρίωσ γενετικό υλικό Μ Ε Σ Α Χ Η Μ Α Σ Ι Μ Ο ΠΡΟΟΧΗ! Ο μεταςχθματιςμόσ αφορά τουσ οργανιςμοφσ που δζχονται ξζνο DNA.
Βιμα 6 ο : Ειςαγωγι των μεταςχθματιςμζνων βακτθρίων ςε κρεπτικό υλικό για καλλιζργεια. Ζτςι κάκε βακτιριο δθμιουργεί ζνα ςφνολο κυττάρων πανομοιότυπο με το αρχικό: ΚΛΩΝΟ Κάκε κλώνοσ αποτελεί ζναν «τόμο» τθσ γονιδιακισ βιβλιοκικθσ. Σο ςφνολο των κλώνων που περιζχουν το ςυνολικό γονιδίωμα του οργανιςμοφ δότθ ονομάηεται γονιδιωματικι βιβλιοκικθ.
Καλλιέργεια βακτηριακών κλώνων-τόμων
Βιμα 7 ο : Χρθςιμοποιοφμε ςυγκεκριμζνο αντιβιοτικό για να διαπιςτώςουμε ποφ πζτυχε ο μεταςχθματιςμόσ και ποφ όχι. Τπάρχουν 3 τφποι βακτθρίων μετά τισ παραπάνω διαδικαςίεσ Βακτιρια ςτα οποία δεν ζχει ειςαχκεί πλαςμίδιο Βακτιριο ςτο οποίο ζχει μθ αναςυνδιαςμζνο πλαςμίδιο Βακτιριο ςτο οποίο ζχει ειςαχκεί αναςυνδυαςμζνο πλαςμίδιο.
Βιμα 8 ο : Πώσ διαχωρίηουμε τα βακτιρια ςτα οποία πζτυχε ο μεταςχθματιςμόσ και ο αναςυνδυαςμόσ από εκείνα ςτα οποία δεν πζτυχε ζνα από τα δφο ι και τα δφο. Οι φορείσ κλωνοποίθςθσ που ζχουμε επιλζξει φζρουν ζνα γονίδιο ανκεκτικότθτασ ςε αντιβιοτικό. Ζτςι τα βακτιρια που ζχουν πλαςμίδιο κα είναι ανκεκτικά ςτο αντιβιοτικό αυτό. Χορθγοφμε λοιπόν ςτθν καλλιζργειά μασ το ςυγκεκριμζνο αντιβιοτικό και τα βακτιρια που δεν ζχουν πλαςμίδιο πεκαίνουν.
Βιμα 9 ο : Επιλογι βακτθρίων τα οποία ζχουν δεχκεί αναςυνδυαςμζνο DNA. Η επιλογι γίνεται με τθ βοικεια ενόσ ακόμθ γονιδίου ανκεκτικότθτασ ςε αντιβιοτικό (ζςτω Β) που διακζτουν τα πλαςμίδια που επιλζχκθκαν. Η περιοριςτικι που χρθςιμοποιείται τζμνει το πλαςμίδιο ςτο εςωτερικό του γονιδίου αυτοφ. υνεπώσ ςε όςα πλαςμίδια ςυνζβθ ο αναςυνδυαςμόσ με DNA του οργανιςμοφ, το γονίδιο αυτό δεν είναι λειτουργικό και τα βακτιρια που κα μεταςχθματιςτοφν με αυτά κα είναι ευαίςκθτα ςτο αντιβιοτικό Β.Πριν από τθν κλωνοποίθςθ των βακτθρίων, δθμιουργείται ζνα αντίγραφο καλλιζργειασ και προςτίκεται ςε αυτό το αντιβιοτικό Β, οπότε και καταςτρζφονται τα βακτιρια που ζχουν το επικυμθτό τμιμα. Αυτό όμωσ παρζχει τθ δυνατότθτα να γνωρίηουν οι επιςτιμονεσ ποια είναι τα χριςιμα και ποια τα άχρθςτα βακτιρια ςτθν αρχικι τουσ καλλιζργεια!
Γονιδιωματικι βιβλιοκικθ με χριςθ φάγου
Γονιδιωματικι βιβλιοκικθ με χριςθ τεχνθτοφ χρωμοςώματοσ
Γονιδιωματικι βιβλιοκικθ με χριςθ πλαςμιδίων
Βιμα 10 ο : Χριςθ ανιχνευτοφ με ςκοπό να δοφμε ςε ποιόν κλώνο βρίςκεται το τμιμα DNA που μασ ενδιαφζρει.