O ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΚΑΘΕΨΙΝΗΣ Κ ΚΑΙ ΤΩΝ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΕΙΚΤΩΝ ΟΣΤΙΚΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΣΕ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΕΣ ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ ΓΥΝΑΙΚΕΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΟΦΙΑ ΚΟΥΙ ΟΥ-ΑΝ ΡΕΟΥ Παν. Έτος 2013-2014 Αριθµ.3005 O ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΚΑΘΕΨΙΝΗΣ Κ ΚΑΙ ΤΩΝ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΕΙΚΤΩΝ ΟΣΤΙΚΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΣΕ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΕΣ ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ ΓΥΝΑΙΚΕΣ ΗΜΗΤΡΙΟΥ Β. ΣΠΑΝΟΓΙΑΝΝΗ ΙΑΤΡΟΥ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013 1

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΡΑΜΟΥΖΗΣ ΜΙΧΑΗΛ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) ΠΗ ΩΝΙΑ-ΜΑΝΙΚΑ ΙΦΙΓΕΝΕΙΑ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΡΑΜΟΥΖΗΣ ΜΙΧΑΗΛ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΗ ΩΝΙΑ-ΜΑΝΙΚΑ ΙΦΙΓΕΝΕΙΑ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ ΕΥ ΟΞΙΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΟΛΙΑΚΟΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΖΗΜΑΓΙΩΡΓΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ,ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΜΟΠΟΥΛΟΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 2

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ- ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ 3

4

5 Στους γονείς µου

6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ 11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α ΟΣΤΙΤΗΣ ΙΣΤΟΣ 17 Οστικά κύτταρα 18 Οστεοβλάστες 18 Οστεοκύτταρα 18 Οστεοκλάστες 19 Θεµέλια ουσία 20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β ΟΣΤΙΚΟΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ 23 Φάση ενεργοποίησης 24 Οστεόλυση 26 Φάση της αναστροφής (Reversal Phase) 26 Οστική παραγωγή (Bone Formation) 27 Ορµονική ρύθµιση της οστικής ανακατασκευής 28 Κορυφαία οστική µάζα 34 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗ 37 Ορισµός 37 Επιδηµιολογία 38 Αιτιολογία Παθογένεια 39 7

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ 43 Μέτρηση οστικής πυκνότητας 43 Βιοχηµικοί είκτες Οστικής Εναλλαγής (Β ΟΕ) 47 Βιοχηµικοί είκτες Οστικού Σχηµατισµού 47 Βιοχηµικοί είκτες Οστικής Απορρόφησης 50 Καθεψίνη Κ 54 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ε ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΣ ΕΡΕΥΝΑΣ 61 Υλικό 61 Βιοχηµικές παράµετροι- δείκτες οστικού µεταβολισµού 62 ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΕΙΚΤΩΝ ΟΣΤΙΚΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ 63 Μέθοδος προσδιορισµού της καθεψίνης Κ 63 Μέθοδος προσδιορισµού αµινοτελικού πεπτιδίου του προκολλαγόνου τύπου Ι (PINP) 65 Μέθοδος προσδιορισµού καρβοξυτελικού τελοπεπτιδίου του κολλαγόνου τύπου Ι (CTX) 66 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΤ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 69 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ 84 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ζ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 115 Μεταβολές του CTX 115 8

Μεταβολές του PINP 116 Μεταβολές της Καθεψίνης Κ 117 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Η ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 121 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 123 ABSTRUCT 125 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 127 9

10

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η οστεοπόρωση είναι το συχνότερο από τα µεταβολικά νοσήµατα των οστών και επηρεάζει εκατοµµύρια ανθρώπων σε όλο τον κόσµο µε τεράστιες κοινωνικοοικονοµικές επιπτώσεις. Καθώς αυξάνεται το προσδόκιµο της επιβίωσης αυξάνεται και η επίπτωση των µεταβολικών νοσηµάτων στο γενικό πληθυσµό. Το κάταγµα είναι η τελική έκβαση που προσδίδει το επιδηµιολογικό ενδιαφέρον στην οστεοπόρωση και προκύπτει από φορτίσεις χαµηλής ενέργειας σε οστά µειωµένης αντοχής. Το 50% περίπου των καταγµάτων οδηγούν σε µόνιµη αναπηρία και στο 20% περίπου στο θάνατο τον πρώτο χρόνο µετά το κάταγµα Υπολογίζεται ότι 500.000 ελληνίδες πάσχούν από µετεµµηνοπαυσιακή οστεοπόρωση. Η οστεοπόρωση τύπου Ι ή µετεµµηνοπαυσιακή οστεοπόρωση θεωρείται κατάσταση ταχείας απώλειας οστικής µάζας. Παρουσιάζεται σε σχετικά νέες γυναίκες στα πρώτα 15 χρόνια µετά την εµµηνόπαυση µε ταχύτατο ρυθµό απορρόφησης του οστού µε συνέπεια την σοβαρή και µη αναστρέψιµη βλάβη της µικροαρχιτεκτονικής και αντοχής του οστού. Η µέτρηση της οστικής πυκνότητας είναι θεµελιώδης για τη διάγνωση αλλά και την εκτίµηση της εξέλιξης της νόσου. Η οστική ανακατασκευή έχει σαν συνέπεια την απελευθέρωση ουσιών, των οποίων τα επίπεδα µπορούν να µετρηθούν είτε στον ορό είτε στα ούρα των ασθενών και να ποσοτικοποιήσουν το ποσοστό οστικής απορρόφησης ή παραγωγής. Τα τελευταία χρόνια οι Βιοχηµικοί είκτες Οστικής Εναλλαγής (Β ΟΕ) κερδίζουν διαρκώς έδαφος στην παρακολούθηση της αποτελεσµατικότητας της θεραπείας και της οστικής πυκνότητας. Ενώ οι πρώτες ενδείξεις για ανταπόκριση ή µη στη θεραπεία µε τη µέτρηση της οστικής µάζας γίνονται εµφανείς ένα χρόνο µετά την έναρξη της θεραπείας, στην περίπτωση των Β ΟΕ αυτό συµβαίνει πολύ νωρίτερα προλαµβάνοντας έγκαιρα ενδεχόµενη αποτυχία της θεραπείας. Σηµαντικές µελέτες τεκµηριώνουν ότι τα επίπεδα των Β ΟΕ πριν την έναρξη της αντιοστεοκλαστικής αγωγής, καθώς και η εκατοστιαία µείωση τους στη διάρκεια της θεραπείας, παρουσιάζουν σηµαντική θετική συσχέτιση µε µελλοντική αύξηση της οστικής πυκνότητας όπως αυτή επιβεβαιώνεται µε τη µέθοδο DEXA. Το προκολλαγόνο τύπου Ι περιέχει αµινοτελικά (N-terminal) και καρβοξυτελικά (C-terminal) πεπτίδια τα οποία αποµακρύνονται µε τη δράση ειδικών πρωτεασών κατά τη σύνθεση του κολλαγόνου. Τα αµινοτελικά (PINP) και καρβοξυτελικά (PICP) αυτά πεπτίδια του προκολλαγόνου εισέρχονται στην κυκλοφορία από το εξωκυττάριο υγρό και αντικατοπτρίζουν τις αλλαγές του µεταβολισµού των οστών. 11

Tα αµινοτελικά και καρβοξυτελικά τελοπεπτίδια του κολλαγόνου τύπου Ι αποτελούν προϊόντα καταβολισµού του κολλαγόνου τύπου Ι. Αποτελούν µια σειρά οκτώ αµινοξέων που βρίσκεται στο τελικό άκρο της αλυσίδας α1 του κολλαγόνου τύπου Ι. Τα συνδεµένα πεπτίδια απελευθερώνονται κατά την οστεόλυση και θεωρούνται αξιόπιστοι δείκτες οστεοκλαστικής δραστηριότητας. Η αποδόµηση του οργανικού υποστρώµατος του οστού ως τµήµα της οστικής απορρόφησης υποδηλώνει δραστηριότητα πρωτεάσης. Αυτό οδήγησε στην αναγνώριση και αποµόνωση ενός νέου µέλους της οικογένειας των παπαϊνών που ανήκει στις κυστεϊνικές πρωτεάσες. Η νέα αυτή καθεψίνη ονοµάστηκε καθεψίνη Κ και έρευνες που ακολούθησαν απέδειξαν την αφθονία έκφρασης της στους οστεοκλάστες σε αντίθεση µε πληθώρα άλλων ιστών που ελέγχθησαν Πρόσφατα δηµοσιευµένες µελέτες συσχετίζουν αυξηµένη οστεοκλαστική δραστηριότητα µε τα επίπεδα της καθεψίνης Κ στον ορό ασθενών µε νόσο του οστικού µεταβολισµού ενώ άλλες εξίσου πρόσφατες προτείνουν θεραπευτικά σχήµατα στη βάση της αναστολής της δράσης της καθεψίνης Κ Ο σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η αξιολόγηση των µεταβολών του νέου δείκτη του οστικού µεταβολισµού, της καθεψίνης Κ, και των κλασικών βιοχηµικών δεικτών του οστικού µεταβολισµού PIΝP και CTΧ στις µετεµµηνοπαυσιακές οστεοπορωτικές γυναίκες καθώς και οι µεταβολές αυτών µε την πρόοδο του χρόνου που παρήλθε από την είσοδο τους στην εµµηνόπαυση. Παράλλλα έγινε προσπάθεια συσχέτισης των τιµών των βιοχηµικών δεικτών µε την οστική πυκνότητα των ασθενών, όπως αυτή προσδιορίστηκε µε την µέθοδο DEXA. Η µελέτη αυτή έγινε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χηµείας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ και στη Γ Μαιευτική-Γυναικολογική κλινική του Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου Ιπποκρατείου. Τον Καθηγητή κ. Μιχαήλ Καραµούζη, ιευθυντή του Βιοχηµικού Εργαστηρίου του Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ Θεσσαλονίκης και επιβλέποντα της διατριβής µου, ευχαριστώ θερµά για την ανάθεση του θέµατος, τη συνεχή παρακολούθηση και εποπτεία, την ένθερµη συµπαράσταση και στήριξη σε κάθε στάδιο, χωρίς τις οποίες η εκπόνησης της µελέτης αυτής δεν θα ήταν δυνατή. Τον οµότιµο Καθηγητή κ. Βασίλειο Καραγιάννη, πρώην ιευθυντή της Γ Μαιευτικής-Γυναικολογικής κλινικής του Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου Ιπποκρατείου Θεσσαλονίκης, µέλος της τριµελής συµβουλευτικής επιτροπής, ευχαριστώ θερµά για την παρότρυνση, τις επισηµάνσεις και συµβουλές του καθώς και στη συγκατάθεση στην εκτέλεση της παρούσας µελέτης σε ασθενείς της κλινικής του. 12

Την οµότιµη Καθηγήτρια κα Πηδώνια-Μανίκα Ιφιγένεια, µέλος της τριµελής συµβουλευτικής επιτροπής, ευχαριστώ θερµά για την παρότρυνση, τις επισηµάνσεις και συµβουλές ιδίως στο στάδιο της συγγραφής της µελέτης. Τον επίκουρο Καθηγητή κ. Μαµόπουλο Απόστολο ευχαριστώ θερµά για την ενθάρρυνση και στήριξη του καθώς και τη βοήθεια του στην επιλογή των ασθενών της Γ Μαιευτικής-Γυναικολογικής κλινικής. ηµήτριος Β. Σπανογιάννης 13

14

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 15

16

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α ΟΣΤΙΤΗΣ ΙΣΤΟΣ Ο οστίτης ιστός εξυπηρετεί τρεις βασικές ανάγκες του οργανισµού: τη στήριξη και προστασία διαφόρων ευγενών οργάνων, την κινητικότητα του ατόµου και την οµοιοστασία του ασβεστίου και του φωσφόρου. Υπάρχουν δύο είδη οστίτη ιστού : ο φλοιώδης ή συµπαγής και ο δοκιδώδης ή σπογγώδης. Ο σπογγώδης οστίτης ιστός αποτελεί το κύριο συστατικό των σπονδύλων και των πλατέων οστών της πυέλου τα οποία καλύπτονται στην επιφάνειά τους από στρώµα φλοιώδους ιστού. Αντιθέτως τα µακρά οστά αποτελούνται κυρίως από συµπαγή ιστό, µε τον σπογγώδη να αποτελεί το κεντρικό µέρος των επιφύσεών τους 1. Ο συµπαγής φλοιώδης οστίτης ιστός διακρίνεται από συγκεκριµένη αρχιτεκτονική δοµή. Είναι ιδιαίτερα πυκνός και χαρακτηρίζεται ιστολογικά από την παρουσία των επιµήκων, συνήθως παράλληλα προς τον επιµήκη άξονα των µακρών οστών διατασσοµένων σωλήνων του Havers και των εγκαρσίων σωλήνων του Volkmann οι οποίοι διατρέχονται από τα αγγεία του οστού (αρτηρίδια, φλεβίδια). Ο σωλήνας του Havers και τα κυκλοτερώς πέριξ αυτού διατασσόµενα οστικά πεταλίδια αποτελούν τη βασική µονάδα του ώριµου φλοιώδους οστίτη ιστού 2. Η δοµή του σπογγώδους ιστού χαρακτηρίζεται από δοκίδες οι οποίες διατάσσονται ανάλογα µε τις µηχανικές ανάγκες του οστού προς διάφορες κατευθύνσεις ώστε να δέχονται το βάρος και τις µηχανικές πιέσεις κατά τον καλύτερο τρόπο. εν έχει σωλήνες του Havers, είναι λιγότερο πυκνός και εποµένως πιο ελαφρύς. Η διάταξη αυτή των δοκίδων επιτρέπει τον σχηµατισµό κοιλοτήτων µεταξύ τους δίνοντας την µορφή σπόγγου. Οι κοιλότητες αυτές καταλαµβάνονται από µυελό των οστών ή λιπώδη ιστό 3. Η διαµόρφωση του οστίτη ιστού σε συµπαγή και σπογγώδη αποσκοπεί στην καλύτερη διαχείριση των κατά περίπτωση ασκούµενων δυνάµεων αλλά και τον ίδιο τον µεταβολισµό του οστού, καθώς το σπογγώδες οστούν αν και αποτελεί το 20% µόνο της οστικής µάζας, διαθέτοντας τεράστια επιφάνεια, καλύπτει το 80% του οστικού µεταβολισµού 1. Ο οστίτης ιστός όπως και κάθε άλλος ιστός αποτελείται από κύτταρα και µεσοκυττάρια ή θεµέλια ουσία. 17

Οστικά κύτταρα Ο οστικός µεταβολισµός συντελείται από τα οστικά κύτταρα µε την µεσολάβηση ποικίλων ηλεκτροχηµικών και µηχανικών ερεθισµάτων. Η ύπαρξη ειδικών υποδοχέων στην επιφάνεια αλλά και στο εσωτερικό των κυττάρων συντελεί στην ενεργοποίηση του οστικού µεταβολισµού. Τα ειδικά κύτταρα του οστίτη ιστού είναι οι οστεοβλάστες, τα οστεοκύτταρα και οι οστεοκλάστες. Τα πρώτα δύο είναι φαινοτυπική έκφραση του ιδίου κυττάρου 4. Οστεοβλάστες Οι οστεοβλάστες προέρχονται από αρχέγονα πολυδύναµα µεσεγχυµατικά κύτταρα. Έχουν τη µορφή µικρών (διαµέτρου 10 µm) µονοπύρηνων κυβοειδών οστικών κυττάρων µε βασεόφιλο κυτταρόπλασµα που περιέχει εκτενές ενδοπλασµατικό δίκτυο και σύστηµα Golgi η δε πλασµατική µεµβράνη τους περιέχει αλκαλική φωσφατάση και υποδοχείς παραθορµόνης. Οι οστεοβλάστες παρουσιάζουν επίσης υποδοχείς της καλσιτριόνης, γλυκοκορτικοειδών, οιστρογόνων, αυξητικής ορµόνης, βιταµίνης D, θυρεοειδικών ορµονών, προσταγλανδινών και κυτταροκινών (IL-1, TNF-a, IGF) 5. Οι διαφοροποιηµένοι οστεοβλάστες βρίσκονται στην επιφάνεια της θεµέλιας ουσίας και η βασική τους λειτουργία συνίσταται στην παραγωγή και εναπόθεση κολλαγόνου τύπου I σε µία οστική κοιλότητα την οποία έχουν δηµιουργήσει οι οστεοκλάστες. Ακολουθεί η µετάλλωση του κολλαγόνου µε την µεσολάβηση της αλκαλικής φωσφατάσης που επίσης παράγουν. Καθώς οι οστεοβλάστες σχηµατίζουν αλλεπάλληλα στρώµατα οστίτη ιστού από τον πυθµένα της οστικής κοιλότητας προς την επιφάνεια, αριθµός αυτών παραµένει εγκλωβισµένος σε κοιλότητες του νέου ιστού και µετασχηµατίζεται σε οστεοκύτταρα. Η επικοινωνία των οστεοβλαστών µε τα οστεοκύτταρα αυτά γίνεται µέσω χασµατικών συνδέσεων 6 Οστεοκύτταρα Τα οστεοκύτταρα όπως προαναφέρθηκε προέρχονται από τους οστεοβλάστες κατά τον εγκλωβισµό τους στο νεαρό οστό. Είναι κύτταρα πολυγωνικά µε µακρές αποφυάδες οι οποίες µέσω ειδικών σωληνίσκων φέρουν σε επαφή τα 18

οστεοκύτταρα µεταξύ τους σχηµατίζοντας έτσι µε αυτόν τον τρόπο ένα συγκύτιο καθιστώντας έτσι δυνατή την τροφοδοσία του οστού αλλά και την µεταβίβαση µηνυµάτων. Τα οστεοκύτταρα διαδραµατίζουν σηµαίνοντα ρόλο στην αντίληψη των ασκουµένων δυνάµεων στα οστά κυρίως µέσω της παραγωγής προσταγλανδινών και νιτρικού οξέος (Frost, θεωρία του µηχανοστάτη) δίνοντας έτσι το έναυσµα για την ανακατασκευή του οστού 7. Πρόσφατες έρευνες στηρίζουν την υπόθεση της έκκρισης από τα οστεοκύτταρα ειδικών αντιγόνων και αλκαλικής φωσφατάσης κατά την οστεοβλαστική διαφοροποίηση καθώς και την αναστολή τους κατά την οστεοκυτταρική φάση 2. Οστεοκλάστες Οι οστεοκλάστες είναι κύτταρα ειδικευµένα στην απορρόφηση του οστίτη ιστού, προέρχονται δε από αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα. Τα προγονικά κύτταρα των οστεοκλαστών θεωρούνται ότι είναι µονοπύρηνα κύτταρα του µυελού των οστών ή µονοπύρηνα κυκλοφορούντα στο αίµα. Με την επίδραση χηµειοτακτικών ερεθισµάτων προσελκύονται, πολλαπλασιάζονται και υφίστανται διαφοροποίηση σε προ-οστεοκλάστες 8. Η συνένωση πολλών προ-οστεοκλαστών συντελεί στην παραγωγή των ώριµων πολυπύρηνων οστεοκλαστών (4-20 πυρήνες) µεγέθους 50-100µm µε δοµή χαρακτηριστική καθώς περιέχουν µεγάλο αριθµό µιτοχονδρίων, λυσοσωµάτων και ελεύθερων ριβοσωµατίων. Το κυτταρόπλασµά τους είναι πλούσιο σε ακτίνη γεγονός που διευκολύνει την προσκόλληση στον οστίτη ιστό. Η µία πλευρά της κυτταρικής τους µεµβράνης παρουσιάζει έντονη πτύχωση µε εκκολπώµατα και αναδιπλώσεις η οποία καλείται λαχνωτή επιφάνεια και προσφύεται στερεά στην οστική επιφάνεια προσκολλώµενη σε πρωτεϊνες της θεµέλιας ουσίας µε αλληλουχία αµινοξέων Αrg-Gly-Asp. Σχηµατίζεται κατά αυτόν τον τρόπο µία ερµητικά κλειστή κοιλότητα µεταξύ της οστικής επιφάνειας και της πτυχωτής επιφάνειας του οστεοπλάστη µέσα στην οποία µέσω της απελευθέρωσης πρωτεολυτικών ενζύµων όπως η ανθεκτική στο τριγυκό οξύ όξινη φωσφατάση, η καθεψίνη Κ, η κολλαγενάση ΜΜΡ-1 και σε όξινο περιβάλλον συντελείται η απορρόφηση του οστού. Το όξινο περιβάλλον επιτυγχάνεται µε µία ηλεκτρογεννετική αντλία πρωτονίων παρόµοια µε αυτή των κυττάρων του γαστρικού βλεννογόνου στην οποία σηµαίνοντα ρόλο παίζει το ένζυµο καρβονική ανυδράση II. Η έκκριση ιόντων Η + έχει σαν συνέπεια της διάλυση των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη και την απογύµνωση από τα 19

άλατα του οργανικού κολλαγονικού δικτύου επιτρέποντας έτσι στα πρωτεολυτικά ένζυµα να διασπάσουν την οργανική θεµέλια ουσία 2. Το έναυσµα για την διαφοροποίηση των µακροφάγων κυττάρων προς οστεοκλάστες επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες όπως το σύστηµα RANKL κυτταροκίνες (IL-6, IL-1, M-CSF), προσταγλανδίνη-ε, καλσιτονίνη, ορµόνες (οιστρογόνα) 9,10. Θεµέλια ουσία Η µεσοκυττάρια οστική ουσία αποτελείται από την οργανική θεµέλια ουσία και την ανόργανη φάση αυτής. Η ανόργανη θεµέλια ουσία αποτελεί τα 2/3 περίπου της συνολικής οστικής µάζας. Η ανόργανη φάση της θεµέλιας ουσίας σε ποσοστό 90-95% αποτελείται από τους κρυστάλλους του υδροξυαπατίτη [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ] ενώ το υπόλοιπο 5% από άλλα ιχνοστοιχεία. Η οργανική θεµέλια ουσία αποτελείται από κολλαγονικές και µη πρωτεΐνες. Το 90% της οργανικής θεµέλιας ουσίας των οστών αποτελείται από πρωτεϊνικό κολλαγόνο τύπου I. Οι κολλαγόνες ίνες εκτείνονται προς όλες τις κατευθύνσεις µέσα στο οστό και κυρίως κατά µήκος των γραµµών τάσης, προσδίδοντας στο οστό τη µεγάλη ισχύ που το χαρακτηρίζει. Το κολλαγόνο των οστών αποτελεί το 60% του συνολικού κολλαγόνου στο ανθρώπινο σώµα. Είναι µία πρωτεϊνη χαµηλής διαλυτότητας που προέρχεται από την συνένωση τριών µορίων τροποκολλαγόνου µέσω του σχηµατισµού δακτυλίου πυριδίνης. Άλλοι τύποι κολλαγόνου που συναντούνται στα οστά σε ποσοστό έως 3% είναι οι τύπου ΙΙΙ, V και X. 6 Οι µη κολλαγονικές πρωτεΐνες αποτελούν το 10% του οργανικού τµήµατος του οστού και παράγονται κυρίως από τους οστεοβλάστες. ιακρίνονται σε συγκολλητικές (φιµπρονεκτίνη, θροµβοσπονδίνη, οστεοπονδίνη, οστική σιελοπρωτεΐνη), σε πρωτεογλυκάνες (διγλυκάνη, δεκορίνη), σε γ- καρβοξυλιωµένες πρωτεΐνες (οστεοκαλσίνη BGP), σε γλυκοπρωτεΐνες (οστεονεκτίνη SPARC, BM-40) σε αυξητικούς παράγοντες (IGF-1), ένζυµα (αλκαλική φωσφατάση, κολλαγενάση) και τους αναστολείς τους καθώς και πρωτεϊνες που προσροφώνται από την κυκλοφορία 11. Τα ανόργανα συστατικά του οστίτη ιστού αποτελούνται κατά 90% από ασβέστιο και φώσφορο σε µορφή κρυστάλλων υδροξυαπατίτη [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ] που καθιζάνουν στο οργανικό υπόστρωµα του οστού. Οι κρύσταλλοι του υδροξυαπατίτη βρίσκονται επάνω στα κολλαγόνα ινίδια και στις µεταξύ τους µη κολλαγονικές πρωτεϊνες (γλυκοπρωτεϊνες, πρωτεογλυκάνες), είναι δε µεγέθους 20

300 ο Α. Ο λόγος Ca/P στους κρυστάλλους του υδροξυαπατίτη παρουσιάζει σηµαντική διακύµανση από 1,3 έως 2,0. Μικρότερες ποσότητες αλάτων που εµπεριέχονται στην ανόργανη φάση της θεµέλιας ουσίας περιλαµβάνουν άλατα µαγνησίου, νατρίου, καλίου, διττανθρακικά και κιτρικά τα οποία δεν σχηµατίζουν κρυστάλλους 6. 21

22

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β ΟΣΤΙΚΟΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ Η κατασκευή των οστών, οστέωση ή οστεογένεση (bone modeling) αφορά στη διάπλαση και τελειοποίηση των οστών. Η δηµιουργία νέου οστού σε περιοχές όπου πριν δεν υπήρχε µε αργό ρυθµό ώστε να εξυπηρετεί τη στήριξη αλλά παράλληλα να ακολουθεί την αύξηση του οργανισµού, επιτρέπει όχι µόνο την κανονική αρχιτεκτονική ανάπτυξη του σκελετού άλλα και την προσαρµογή του στην αλλαγή των µηχανικών συνθηκών. ύο είδη οστεογένεσης διακρίνονται, η υµενογενής και η χονδρογενής. Η υµενογενής οστέωση αφορά στην διαµόρφωση των οστών του θόλου του κρανίου, των περισσοτέρων οστών του προσώπου και της κλείδας, ενώ η χονδρογενής στα υπόλοιπα οστά του σκελετού. Η φάση ανάπτυξης των οστών ολοκληρώνεται πριν την ενηλικίωση 1,2. Πριν ακόµη ολοκληρωθεί η ανάπτυξη του σκελετού ξεκινά η διαδικασία ανακατασκευής του οστού (bone remodeling). Είναι µια διαδικασία οστικής αναγέννησης η οποία συνοδεύει τον οστίτη ιστό εφεξής και αποτελεί την κύρια δραστηριότητά του κατά την ενήλικη ζωή. Είναι µια συζευγµένη διαδικασία (coupling) η οποία χαρακτηρίζεται από κύκλους αποµάκρυνσης παλαιού οστού ακολουθούµενους από αντίστοιχους κύκλους αντικατάστασής του από νεοσχηµατιζόµενους. Οι δύο αυτές λειτουργίες επιτελούνται στην ίδια θέση κι η σύζευξή τους έχει σαν σκοπό την ισόποση αποδόµηση και αναγέννηση και την διατήρηση του σχήµατος του οστού. Εξασφαλίζεται έτσι η µορφολογική ακεραιότητα και µηχανική αντοχή του σκελετού µέσα από µια επανορθωτική και προσαρµοστική για τις µηχανικές ανάγκες του διεργασίες 12. Η ειδική αυτή λειτουργία δεν πραγµατοποιείται άναρχα από µεµονωµένους οστεοβλάστες ή οστεοκλάστες. Κυρίαρχο ρόλο στη διαδικασία αυτή διαδραµατίζουν προσωρινές ανατοµικά, αυτόνοµες κυτταρικές δοµές που ονοµάζονται βασικές πολυκυτταρικές µονάδες (Basic Multicellular Units, BMU). Αυτές περιλαµβάνουν οστεοβλάστες και οστεοκλάστες στη συνεργασία των οποίων στηρίζεται το µοντέλο της µονάδος (FROST) 7. Σκοπός κάθε βασικής πολυκυτταρικής µονάδας είναι η αντικατάσταση ενός µικρού τµήµατος οστού το οποίο είναι αρκετά παλιό ώστε να µην φέρει ικανοποιητικά εις πέρας είτε την µηχανική είτε την µεταβολική του λειτουργία. Κάθε βασική πολυκυτταρική µονάδα καταλαµβάνει συγκεκριµένη περιοχή στον οστίτη ιστό ενώ το πλήθος των ενεργών αυτών µονάδων υπολογίζεται σε περίπου ένα εκατοµµύριο αντιστοιχώντας στο 20% της επιφάνειας του σκελετού. Οι µονάδες οστικής ανακατασκευής είναι γεωγραφικά και 23

χρονολογικά αποµονωµένες από τις υπόλοιπες, γεγονός που οδηγεί στη λογική υπόθεση ότι η αλληλουχία των υπεύθυνων για την ανακατασκευή γεγονότων υπόκειται σε τοπικό έλεγχο, µηχανικών κυρίως παραγόντων παρά δευτερευόντως ίσως σε αυτοκρινικούς και παρακρινικούς παράγοντες. Ο µέσος όρος ζωής κάθε µονάδος υπολογίζεται σε 6-9 µήνες. Ο αριθµός των µονάδων ανακατασκευής µαζί µε την ταχύτητα µε την οποία εκτελούνται οι λειτουργίες απορρόφησης - δηµιουργίας οστίτη ιστού, αποτελούν τον ρυθµό οστικού µεταβολισµού (bone turnover rate). Σε κάθε δεδοµένη χρονική στιγµή υπολογίζεται ότι περίπου του 80% του σπογγώδους οστού και το 20% του φλοιώδους υπόκειται σε οστική ανακατασκευή. Το σπογγώδες οστό είναι κυτταροβριθέστερο, σε αυτό συντελείται το 80% του οστικού µεταβολισµού και είναι αυτό που κυρίως προσβάλλεται από την οστεοπόρωση 5. Όπως ήδη αναφέρθηκε υπάρχει στενή σύζευξη µεταξύ οστεοκλαστικής απορρόφησης και οστεοβλαστικού ανασχηµατισµού του οστού. Κατά τη φάση του σχηµατισµού του οστού στην παιδική και εφηβική ηλικία η οστική αναδόµηση υπερτερεί της απορρόφησης ευνοώντας έτσι την αύξηση της οστικής µάζας (θετικό ισοζύγιο) και την επίτευξη κορυφαίας τιµής (Κορυφαία Οστική Πυκνότητα, ΚΟΠ). Στη συνέχεια και κατά την ενήλικη ζωή επέρχεται εξισορρόπηση (µηδενικό ισοζύγιο) εωσότου και περί το 40ο έτος επέρχεται αύξηση της αποδόµησης µε συνεχή απώλεια οστικής µάζας (αρνητικό ισοζύγιο). Στις γυναίκες ιδίως η απώλεια οστικής µάζας επιταχύνεται από την έλλειψη οιστρογόνων κατά τα πρώτα 5-10 χρόνια της εµµηνόπαυσης (fast bone losers) 2. Η οστική ανακατασκευή εξελίσσεται σε 5 φάσεις : ηρεµίας, ενεργοποίησης, οστεόλυσης, αναστροφής και οστεοπαραγωγής. Φάση ενεργοποίησης Η εκκίνηση της οστικής αναδόµησης µπορεί να είναι πολυπαραγοντική, το τελικό αποτέλεσµα όµως αποσκοπεί στη στρατολόγηση πρόδροµων οστεοκλαστών στην αναδοµούµενη οστική περιοχή. Τα αίτια µπορούν να είναι είτε γενικά είτε τοπικά. Το συνηθέστερο των γενικών είναι η υπασβεστιαιµία, η ελάττωση δηλαδή της συγκέντρωσης ασβεστίου στο αίµα και η εξ αυτής έκλυση της παραθορµόνης η οποία µε τη σειρά της επιδρά στα επενδυτικά κύτταρα των βασικών πολυκυτταρικών µονάδων ενεργοποιώντας τις. Τα επενδυτικά κύτταρα αποτελούν παραλλαγή των οστεβλαστών και καλύπτουν επιφανειακά µε την µορφή λεπτότατης στοιβάδας τη θεµέλια ουσία. Στα τοπικά αίτια ενεργοποίησης 24

του µηχανισµού οστικής αναδόµησης αναφέρεται η επίδραση τοπικά παραγόµενων ουσιών συνεπεία τοπικών φλεγµονών ή µικροφθορών. Τέτοιοι µεσολαβητές είναι οι Προσταγλανδίνες της σειράς Ε, οι Ιντερλευκίνες, κυρίως η Ιντερλευκίνη I, άλλες κυτταροκίνες (Osteoclast Differentiation Factor, ODF) και άλλες ουσίες που εκλύονται από τα οστεοκύτταρα ως απάντηση στην επίδραση δυνάµεων που ασκούνται πάνω τους 13. Σχετικές έρευνες απέδειξαν ότι πέραν διαφόρων ορµονικών ελέγχων στους οποίους υπόκειται η οστική αναδόµηση βασικό ρόλο στον έλεγχο της παίζουν οι εξασκούµενες πάνω στον οστίτη ιστό δυνάµεις. Η άσκηση αυτών των δυνάµεων συνεπάγεται µικροπαραµορφώσεις των οστών η ένταση των οποίων κατευθύνει το ισοζύγιο της οστικής αναδόµησης είτε προς αρνητική είτε προς θετική κατεύθυνση. Μικρός αριθµός µικροπαραµορφώσεων συνεπάγεται αρνητικό ισοζύγιο οστικής αναδόµησης και απώλεια οστικής µάζας ενώ αντίθετα αυξηµένος αριθµός µικροπαραµορφώσεων οδηγεί σε αύξηση της οστικής µάζας. Υπεύθυνο κύτταρο για τον µηχανισµό αυτό που ονοµάστηκε από τον Frost µηχανοστάτης θεωρείται το οστεοκύτταρο 7. Η αναφερθείσα ενεργοποίηση των επενδυτικών κυττάρων της βασικής πολυκυτταρικής µονάδας (ΒΜU) συνεπάγεται την έκκριση στο µικροπεριβάλλον του παράγοντα διέγερσης αποικιών µονοκυττάρων (M-CSF) της Ιντερλευκίνης 11 (IL-11), της Ιντερλευκίνης 3 (IL-3) και της Ιντερλευκίνης 6 (IL-3). Ταυτοχρόνως λαµβάνει χώρα η σύνθεση του παράγοντα RΑΝΚ ligand, µόριο που στόχο έχει τον υποδοχέα RΑΝΚ των πρόδροµων οστεοκλαστών. Η παραγωγή των ουσιών αυτών αποσκοπεί στην χηµειοταξία µονοπύρηνων µακροφάγων στην περιοχή, τον πολλαπλασιασµό και την σύντηξή τους στο µεγάλο πολυπύρηνο οστεοκλάστη, ο οποίος θα προσκολληθεί στη θεµέλια ουσία για την έναρξη της επόµενης φάσης της οστεόλυσης. Η έλλειψη οιστρογόνων, όπως αυτή συµβαίνει στην οστεοπόρωση έχει σαν συνέπεια την µη αναστολή της παραγωγής της IL-6 από τους οστεοβλάστες µε συνέπεια η αυξηµένη παραγωγή της να συνεπάγεται αύξηση δηµιουργίας οστεοκλαστών, αύξηση της οστεόλυσης και τελικά οστεοπόρωση 14. Κατά την φάση της ενεργοποίησης τέλος, από τα επενδυτικά κύτταρα παράγονται πρωτεολυτικά ένζυµα (κολλαγενάσες, ζελατινάσες, µετταλοπρωτεϊνάσες) τα οποία απογυµνώνουν την οστική επιφάνεια από το µη ασβεστοποιηµένο οστεοειδές επιτρέποντας την σύνδεση του ώριµου οστεκλάστη µε το µεταλλωµένο οστό 13. 25

Οστεόλυση Στην φάση της οστεόλυσης οι ώριµοι οστεοκλάστες αφού προσκολληθούν στην οστική επιφάνεια αναπτύσσοντας την πτυχωτή τους µεµβράνη ξεκινούν τη διαδικασία οστεόλυσης. Αναγκαία συνθήκη είναι η πλήρης επαφή και δηµιουργία περίκλειστης σφραγισµένης περιοχής που επιτυγχάνεται µέσω ειδικών προσκολλητικών πρωτεϊνών, των ιντεγκρινών. Αυτές συνδέονται µε αντίστοιχες πρωτεΐνες της θεµέλιας ουσίας, η δε αναστολή σύνδεσης τους αναστέλλει της οστεόλυση. Ακολουθεί σε πρώτη φάση η λύση των κρυστάλλων υδροξυαπατίτη και στη συνέχεια η απορρόφηση της οργανικής κολλαγονικής φάσης. Η λύση των κρυστάλλων υδροξυαπατίτη επιτυγχάνεται µε την οξινοποίηση του µικροπεριβάλλοντος της σφραγισµένης περιοχής µέσω µιας αντλίας πρωτονίων, υπεύθυνο ένζυµο της οποίας είναι η καρβονική ανυδράση ΙΙ. Το ph που επιτυγχάνεται τοπικά αγγίζει τα επίπεδα 3-4. Τα ασβέστιο και ο φώσφορος που απελευθερώνονται από τη λύση του υδροξυαπατίτη περνά στη συστηµατική κυκλοφορία για τις ανάγκες του οργανισµού. Ο κατακερµατισµός της απογυµνωθείσας από τον υδροξυαπατίτη οργανικής φάσης γίνεται µε λυσοσωµικές πρωτεϊνάσες του τύπου των µεταλλοπρωτεϊνασών (κολλαγενάση MMP-1), των κυστεϊνικών πρωτεϊνασών (Καθεψίνη K) αλλά και άλλα όπως η ανθεκτική στο τρυγικό οξύ όξινη φωσφατάση (TRAP 5b). Ρόλο σε αυτή τη φάση έχουν και οι ελεύθερες ρίζες Οξυγόνου και ΝΟ. Κατ αυτόν τον τρόπο δηµιουργούνται στο µεν σπογγώδες οστό βοθρία (βοθρία του Howship) στο δε συµπαγές οστό οστεολυτικές σήραγγες παράλληλες στον επιµήκη άξονα του οστού που ξεκινούν από τους σωλήνες του Havers. Η φάση αυτής της οστεόλυσης διαρκεί 2-3 εβδοµάδες 2,5,15. Φάση της αναστροφής (Reversal Phase) Η φάση της αναστροφής αφορά στο διάστηµα µετάπτωσης από την οστεόλυση στην οστεοπαραγωγή. Με την επίτευξη του µέγιστου βάθους στο σηµείο απορρόφησης συνεπεία της δράστης των οστεοκλαστών, ακολουθεί εξαφάνισή τους και αντικατάστασή τους από οστεβλάστες. Η φάση αυτή διαρκεί περίπου 8-11 ηµέρες. Η αναστροφή φαίνεται ότι συµβαίνει για δύο λόγους : ο ένας έχει σχέση µε τον υποδοχέα ασβεστίου που φέρει ο οστεοκλάστης και ο οποίος επιτρέπει την είσοδο ασβεστίου στο κύτταρο. Ο κορεσµός του οστεοκλάστη σε ασβέστιο αναστέλλει την οστεόλυση. Ο δεύτερος λόγος αφορά στον αυξητικό παράγοντα µετασχηµατισµού (TGFβ 1) ο οποίος βρίσκεται στο 26

οργανικό υπόστρωµα του οστού συνδεδεµένος µε το κολλαγόνο και ο οποίος απελευθερούµενος κατά τη φάση της οστεόλυσης ενεργοποιείται προκαλώντας αφενός της αναστολή της λειτουργίας των οστεοκλαστών και την διέγερση της οστεοβλαστικής δραστηριότητας. Επιπροσθέτως οι ίδιοι οι οστεοκλάστες εκκρίνουν ουσίες που διεγείρουν την αύξηση της λειτουργίας των οστεοβλαστών 5,16. Οστική παραγωγή (Bone Formation) Η φάση αυτή χαρακτηρίζεται από µια διαδοχή γεγονότων που περιλαµβάνει τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των αρχέγονων µεσεγχυµατικών κυττάρων µέχρι το στάδιο του ώριµου οστεβλάστη. Ακολουθούν δύο στάδια οστεοπαραγωγής κατά τα οποία στο µεν πρώτο δηµιουργείται το οργανικό υπόστρωµα του οστεοειδούς µε την ανάπτυξη των κολλαγόνων ινών και εν συνεχεία στο δεύτερο η εναπόθεση των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη µε τη βοήθεια µη κολλαγονικών πρωτεϊνών όπως η οστεοκαλσίνη και η οστεονεκτίνη. Η µετάλλωση του οστεοειδούς ξεκινά δύο εβδοµάδες περίπου µετά τη δηµιουργία του µε ρυθµό περίπου 1µm/ηµέρα. Η παραγωγή και µετάλλωση οστεοειδούς διαρκεί µέχρι την πλήρωση του βοθρίου. Οι ώριµοι οστεοβλάστες παγιδεύονται στο νεοσχηµατισθέν οστό και διαφοροποιούνται σε οστεοκύτταρα. Στη φάση της οστικής παραγωγής ιδιαίτερο ρόλο διαδραµατίζουν οι αυξητικοί παράγοντες ινσουλίνης I και II (IGF-I, II), οι οστικές µορφογενετικές πρωτεΐνες (BMPs) και άλλες κυτταροκίνες. Οι IGF-I, II διεγείρουν την οστεοπαραγωγή αυξάνοντας τον πολλαπλασιασµό των οστεοβλαστών και τη σύνθεση του κολλαγόνου Ι. Την παραγωγή των παραπάνω αυξητικών παραγόντων ευοδώνουν ένζυµα όπως το Πλασµινογόνο τύπου Ουροκινάσης που διευκολύνουν την απελευθέρωσή τους από την κυτταρική µεµβράνη. Η αύξηση της έκφρασης του αναστολέα του Πλασµινογόνου του τύπου της Ουροκινάσης συνεπεία της δηµιουργηθείσας οστικής µάζας οδηγεί σε αναστολή της οστεοβλαστικής δραστηριότητας 17. Η φάση της οστικής παραγωγής διαρκεί περίπου 3-5 µήνες. Στο τέλος της φάσης αυτής η επιφανειακοί οστεοβλάστες θα µετατραπούν βαθµιαία σε επίπεδα, ανενεργά κύτταρα, τα επενδυτικά κύτταρα και θα καλύψουν το νέο οστό. Η φάση της οστεοπαραγωγής ακολουθείται από τη φάση Ηρεµίας (Resting Fase) κατά την οποία οι βασικές πολυκυτταρικές µονάδες καθίστανται 27

ανενεργές. Ο ώριµος οστίτης ιστός χαρακτηρίζεται πλέον από λειτουργικές µόνο δράσεις των οστεοκυττάρων και των επενδυτικών κυττάρων επιφανείας. Ο κύκλος της οστικής αναδόµησης όπως περιγράφηκε αφορά στο 25% του σπογγώδους και στο 2-3% του συµπαγούς οστού κάθε χρόνο. Στο σπογγώδες οστό η διαδικασία αυτή διαρκεί 3-4 µήνες ενώ στο συµπαγές διαρκεί έως 7 µήνες. Υπολογίζεται πως ο ανθρώπινος σκελετός ανανεώνεται ολόκληρος 4-5 φορές συνολικά στη διάρκεια της ζωής του 18. Ορµονική ρύθµιση της οστικής ανακατασκευής Παραθορµόνη Η παραθορµόνη είναι ο σηµαντικότερος ρυθµιστής των συγκεντρώσεων του ασβεστίου και του φωσφόρου στο αίµα. Αποτελείται από 84 αµινοξέα και εκκρίνεται από τα δύο ζεύγη παραθυρεοειδών αδένων. Έχει ιδιαίτερα µικρό χρόνο ηµιζωής, µικρότερο των 5 λεπτών οι δράσεις της, άµεσες ή έµµεσες αφορούν στα οστά, στους νεφρούς και στο έντερο. Τα κυκλοφορούντα επίπεδα της παραθορµόνης στο αίµα καθορίζουν τη δράση της. Συγκεκριµένα υψηλά επίπεδα και συνεχής επίδραση της παραθορµόνης σχετίζονται µε αυξηµένη οστική απορρόφηση ενώ αντίθετα χαµηλότερα επίπεδα µε διακεκοµµένη επίδραση αυξάνουν την οστική παραγωγή 2,19,20. Ο λόγος Ca/PTH σχετίζεται αντίστροφα µε τη δραστικότητα της παραθορµόνης. Χαµηλά επίπεδα εξωκυττάριου ιονισµένου ασβεστίου ενεργοποιούν τους παραθυρεοειδείς αδένες µέσω υποδοχέων Ca που διαθέτουν προς παραγωγή και έκκριση παραθορµόνης. Στο πεπτικό η παραθορµόνη αφορά στην απορρόφηση του ασβεστίου ενώ στους νεφρούς προάγει την επαναρρόφηση ασβεστίου και την ενεργοποίηση της 1,25 βιταµίνης D, ενώ αναστέλλει την επαναρρόφηση του φωσφόρου 2. Στα οστά σηµαντικό ρόλο διαδραµατίζει η παραθορµόνη µέσω του υποδοχέα PTH/PTHrP ενεργοποιώντας µεταγραφικούς υποδοχείς (Cbfa1, CREB) 21. Ο υποδοχέας PTH/PTHrP έχει βιολογική δράση παρόµοια µε της παραθορµόνης και επηρεάζεται από κυτταροκίνες, αυξητικούς παράγοντες και ορµόνες του φύλου. Οι λειτουργίες του υποδοχέα αυτού αφορούν στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων, τη µείωση της απόπτωσης, την αναστολή λειτουργίας των οστεοκλαστών και την έκφραση ορµονικών υποδοχέων 22. 28

Βιταµίνη D Η βιταµίνη D ως εργοκαλσιφερόλη D2 προσλαµβάνεται από τα φυτά και ως χοληκαλσιφερόλη D3 παράγεται µέσω της δράσης της υπεριώδους ακτινοβολίας στο δέρµα στην 7-δευδροχοληστερόλη. Ακολουθεί η µετατροπή της σε 25-υδροξυβιταµίνη D στο ήπαρ και σε 1,25 διυδροξυβιταµίνη D στους νεφρούς (καλσιτριόλη, ενεργός µεταβολίτης). Στον εντερικό σωλήνα επάγει την απορρόφηση του ασβεστίου ενώ στους νεφρούς την επαναρρόφηση Ca και P. Η οστική δράση της βιταµίνης D αφορά στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση και στην έκκριση παραγόντων που διεγείρουν παρακρινικά τους οστεοκλάστες 21. Η διέγερση των οστεοβλαστών προς έκκριση του RANKL συνεπάγεται τη διέγερση της ανάπτυξης των οστεοκλαστών και εποµένως την οστική απορρόφηση 23. Εντούτοις ενώ αποτελεί διεγέρτη της οστικής απορρόφησης εµφανίζει συνολικά αναβολική δράση στο οστό µε άγνωστο µηχανισµό 24. Καλστιτονίνη (CT) Η πεπτιδική αλυσίδα της καλσιτονίνης αποτελείται από 32 αµινοξέα και εκκρίνεται από τα κύτταρα του θυρεοειδούς αδένα σε καταστάσεις υπερασβεστιαιµίας. ρά άµεσα στους οστεοκλάστες προκαλώντας συρρίκνωση και απώλεια της λαχνωτής επιφάνειας µε συνέπεια την απόσυρσή τους από την οστική επιφάνεια. Το τελικό αποτέλεσµα συνίσταται στην αναστολή της οστικής απορρόφησης και αύξηση της οστεογένεσης. Η συµµετοχή της πάντως στον οστικό µεταβολισµό θεωρείται µικρή. Η νεφρική δράση της καλσιτονίνης αφορά στη µείωση της σωληναριακής επαναρρόφησης του ασβεστίου και του φωσφόρου 2. Οιστρογόνα Τα κύρια οιστρογόνα είναι η οιστραδιόλη (Ε2), η οιστριόλη (Ε3) και η οιστρόνη (Ε1). Τα κύριο οιστρογόνο στην αναπαραγωγική ηλικία είναι η οιστραδιόλη (Ε2) ενώ µετά την εµµηνόπαυση υπερτερούν η οιστριόλη (Ε3) και η οιστρόνη (Ε1) 19. Αν και η επίδραση των οιστρογόνων φαίνεται να είναι τόσο στο σπογγώδες όσο και στο συµπαγές οστό, ο οιστρογονικός υποδοχέας τύπου α (ERα) υπερτερεί στο συµπαγές οστό ενώ ο οιστρογονικός υποδοχέας τύπου β (ERβ) επικρατεί στο σπογγώδες οστό 25. 29

Η σπουδαιότητα της δράσης των οιστρογόνων στον οστικό µεταβολισµό καθώς και η θετική επίδρασή τους στο ισοζύγιο της οστικής ανακατασκευής µέσω της θεραπείας ορµονικής υποκατάστασης (HRT) σε µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες διαπιστώθηκε από πολύ νωρίς. Η αύξηση του πολλαπλασιασµού και της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών προάγουν το σχηµατισµό νέου οστού. Η επίδραση στους οστεοβλάστες συµβαίνει µέσω διέγερσης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) η οποία δρα στο σύστηµα (RANKL-RANK-OPG) ως ανταγωνιστής στους υποδοχείς RANK των οστεοκλαστών εµποδίζοντας τη φυσική τους επαφή µε τους οστεοβλάστες. Αναστέλλεται έτσι η διαφοροποίηση του τελικού σταδίου των οστεοκλαστών µε αποτέλεσµα την απενεργοποίησή τους. Η αναλογία OPG/RANKL έχει κοµβική θέση στη ρύθµιση της ενεργοποίησης και της αναστολής δράσης των οστεοκλαστών και συνεπώς του οστικού µεταβολισµού. Η διέγερση της οστεοπροτεγερίνης OPG συνεπάγεται επίσης µείωση της συγκέντρωσης κυτταροκινών (IL-1, IL-6, TEFα), του M-CSF, προσταγλανδίνης Ε2 που αυξάνουν την οστεοπλαστική δραστηριότητα 26. Γλυκοκορτικοειδή Παράγονται στο φλοιό των επινεφριδίων. Η κορτιζόλη και η κορτικοστερόνη είναι οι πιο γνωστές της κατηγορίας. ρουν άµεσα στους ώριµους οστεοβλάστες οι οποίοι διαθέτουν υποδοχείς γλυκοκορτικοειδών αναστέλλοντάς τους και προάγοντας τη δηµιουργία οστεοκλαστών. Επιδρούν επίσης στους οστεοκλάστες προκαλώντας αύξηση της οστεόλυσης µέσω των οστεοβλαστών : επάγουν τη σύνθεση του RANKL ενώ αναστέλλουν την OPG 27. Στον εντερικό σωλήνα ελαττώνουν την απορρόφηση ασβεστίου καθώς και την επαναρρόφησή του από τους νεφρούς, αυξάνοντας έτσι δευτεροπαθώς την έκκριση της παραθορµόνης ευνοώντας έτσι το αρνητικό ισοζύγιο ασβεστίου 28. Αυξητική ορµόνη (GH) Η αυξητική ορµόνη είναι απαραίτητη για την επίτευξη και την διατήρηση φυσιολογικής οστικής µάζας. Η δράση της στα οστά πραγµατώνεται µε τη µορφή σωµατοµεδινών µε κυριότερη τη σωµατοµεδίνη C, η οποία µέσω της επίδρασης της αυξητικής ορµόνης παράγεται από το ήπαρ. Η αυξητική ορµόνη δρα αναβολικά στον πολλαπλασιασµό των οστικών κυττάρων και τη σύνθεση του κολλαγόνου 29. 30

Θυρεοειδικές ορµόνες Οι θυρεοειδικές ορµόνες, θυροξίνη (Τ4) και τριϊωδοθυρονίνη (Τ3) είναι προϊόντα λειτουργίας του θυρεοειδή αδένα. Η παραγωγή τους υπόκειται στη ρύθµιση της θυρεοειδοτρόπου ορµόνης (TSH) η οποία παράγεται από την υπόφυση. Οι θυρεοειδικές ορµόνες έχουν σηµαίνοντα ρόλο κατά την ανάπτυξη του ανθρώπινου σκελετού µέχρι την ενηλικίωση αλλά και στη συνέχεια 30. Οι οστεοβλάστες εκφράζουν υποδοχείς (TRs) της τριϊωδοθυρονίνης Τ3, η οποία συνιστά τη δραστική µορφή των θυρεοειδικών ορµονών στο κυτταρικό επίπεδο, και συγκεκριµένα τους υποτύπους TRα 1, TRα 2 και TRβ 1. Η σύνδεση της Τ3 µε τους υποδοχείς αυτούς ενεργοποιεί το σύστηµα RANKL-RANK-OPG µέσω της αύξησης της έκφρασης του RANKL. Επίσης συνεπάγεται την ενεργοποίηση παραγωγής ενζύµων (αλκαλική φωσφατάση, κολλαγενάση) και πρωτεϊνών του οργανικού υποστρώµατος του οστού (κολλαγόνο, οστεοκαλσίνη). Παράλληλα αυξάνεται η παραγωγή ιντερλευκίνης -6 και προσταγλανδίνης Ε2 οι οποίες µαζί µε την αύξησης του RANKL επάγουν την οστεοπλαστική δραστηριότητα 31,32. Η δράση των θυρεοειδικών ορµονών στη φάση δηµιουργίας και διάπλασης του σκελετού µέχρι την ενηλικίωση είναι αναβολική συντείνοντας στην επίτευξη κορυφαίας οστικής µάζας. Οι διαταραχές της λειτουργίας του θυρεοειδούς αδένα επιδρούν στον οστικό µεταβολισµό µεταβάλλοντας την ταχύτητα και την ποιότητά του διαφοροποιώντας έτσι την πυκνότητα αλλά και τη δοµή του οστού 30. Ο υπερθυρεοειδισµός, όταν αυτός είναι υποκλινικός δεν φαίνεται να σχετίζεται µε χαµηλή οστική µάζα σε προεµµηνοπαυσιακές γυναίκες ενώ αντίθετα σε µετεµµηνοπαυσιακές θεωρείται παράγοντας κινδύνου για οστεοπόρωση καθώς συσχετίζεται µε απώλεια οστικής µάζας έως 2% κατ έτος 33. Στον κλινικό υπερθυρεοειδισµό η επιτάχυνση της οστικής ανακατασκευής εξαιτίας της οποίας παρατηρείται αδυναµία πλήρους αποκατάστασης της απορροφηθείσας οστικής µάζας, το ισοζύγιο απορρόφησης-ανακατασκευής καθίσταται αρνητικό. Αµφότεροι οι οστεοκλαστικοί και οστεοβλαστικοί µηχανισµοί αυξάνονται, αντανακλώντας σε αύξηση των δεικτών οστικού µεταβολισµού, µε τους πρώτους όµως να υπερισχύουν των δεύτερων. Κατά αυτόν τον τρόπο ο υπερθυρεοειδισµός συνεπάγεται δευτεροπαθή οστεοπόρωση υψηλού ρυθµού οστικής εναλλαγής 34. Ο υποθυρεοειδισµός, όταν αυτός είναι υποκλινικός δεν έχει συσχετιστεί µε σηµαντική επίδραση στον οστικό µεταβολισµό. Αντιθέτως ο κλινικός 31

υποθυρεοειδισµός χαρακτηρίζεται από επιβράδυνση του ρυθµού αλλά και της έκτασης της οστικής ανακατασκευής 34. Η µείωση της οστεοκλαστικής δραστηριότητας έχει σαν συνέπεια την αύξηση του ισοζυγίου οστικής εναπόθεσης και αύξηση της οστικής µάζας. Καθώς όµως µειώνεται και η οστεοβλαστική δραστηριότητα ελαττώνεται η παραγωγή νέου οστού µε ταυτόχρονη αύξηση της αναλογίας σε παλαιό, κατώτερης δοµικά ποιότητας λόγω συσσώρευσης µικροαρχιτεκτονικών βλαβών. Αυξάνεται έτσι ο κίνδυνος καταγµάτων, όχι όµως λόγω της ελάττωσης της οστική µάζας αλλά λόγω της υποβάθµισης της ποιότητάς της 35. Στη σύνθετη διαδικασία της οστικής εναλλαγής ρόλο φαίνεται να έχουν και άλλες ορµόνες όπως η ινσουλίνη, η λεπτίνη, η αµυλίνη, τα ανδρογόνα αλλά και κυτοκίνες έχοντας ποικίλη, είτε ανασταλτική είτε διεγερτική δράση 36. Αυξητικοί παράγοντες Κυτοκίνες Οι κυτοκίνες, πρωτεΐνες µικρού µοριακού βάρους έχουν µικρό χρόνο ηµιζωής, έχουν δε βιολογική δράση αυτοκρινική ή παρακρινική ισχυρότατη, συνδεόµενες µε ειδικούς υποδοχείς υψηλής συγγένειας στις κυτταρικές επιφάνειες. Η δράση των κυτοκινών στον οστικό µεταβολισµό είναι πολυσήµαντη. Σε επίπεδο οστικών κυττάρων εµπλέκονται στις διαδικασίες επιλογής και διαφοροποίησης αρχέγονων κυττάρων σε οστεοβλαστικούς και οστεοκλαστικούς µηχανισµούς. Σε επίπεδο ώριµων κυττάρων δρουν ενεργοποιώντας ή καταστέλλοντας τα. Στενή σχέση εµφανίζουν επίσης οι κυτταροκίνες µε τα ορµονικά συστήµατα ρύθµισης του οστικού µεταβολισµού 37. Οι παράγοντες διέγερσης αποικιών CSFs ρυθµίζουν την στρατολόγηση αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασµό των προοστεοκλαστών και την διαφοροποίηση τους σε ώριµους οστεοκλάστες. Ακόµη µπορούν να δράσουν άµεσα και σε ώριµα οστικά κύτταρα ενεργοποιώντας τα.στους παράγοντες αυτούς συµπεριλαµβάνονται οι GM-CSF, G-CSF, M-CSF και η ιντερλευκίνη-3 38. Στενή σχέση έχουν οι κυτταροκίνες µε τις οστεοτρόπες ορµόνες και ιδιαίτερα µε την παραθορµόνη. Η παραθορµόνη σχετίζεται µε την παραγωγή των TGFβ και IGF-1 από τους οστεοβλάστες. Ο TGFβ έχει την ικανότητα ρύθµισης της έκφρασης του αριθµού των υποδοχέων παραθορµόνης στα οστικά κύτταρα. Έχει βρεθεί ότι επάγει την έκφραση του PTHrP. Επίσης ο TGFβ ενεργοποιεί τους οστεοβλάστες για παραγωγή κολλαγόνου και οστεοποντίνης. Όπως επίσης έχει ήδη αναφερθεί βρίσκεται σε µεγάλες ποσότητες στο οστικό 32

υπόστρωµα και απελευθερούµενος κατά την οστική απορρόφηση δρα σαν φυσικός αναστολέας 39. Οι ινσουλινοµιµητικοί παράγοντες IGF-I και II παράγονται από τους οστεβλάστες. Ονοµάστηκαν έτσι λόγω της οµοιότητας µε το µόριο της ινσουλίνης. Η δράση τους σχετίζεται µε διαταραχές του µεταβολισµού, σχετιζόµενες µε την αυξητική ορµόνη. Ο IGF-I συµµετέχει στο πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και επάγει την οστική απορρόφηση µε την ενεργοποίηση οστεοκλαστών 40,41. Η ιντερφερόνη-γ και ο αυξητικός παράγοντας των αιµοπεταλίων (PDGF) προκαλούν οστική παραγωγή αναστέλλοντας η πρώτη τους οστεοκλάστες και διεγείροντας ο δεύτερος τους οστεοβλάστες. Οι αυξητικοί παράγοντες ινοβλαστών a-fgf και b-fgfφαίνεται ότι συµµετέχουν στην οστεογένεση έχοντας διεγερτική επίδραση στους οστεοβλάστες 42,43. Η ιντερλευκίνη-1 έχει ισχυρή οστεοκλαστική δράση. Φαίνεται ότι προάγει την ωρίµανση των πρόδροµων µορφών των οστεοκλαστών, ενώ η δράση της έχει συνδεθεί και µε µηχανισµούς όπως η ενίσχυση της δράσης της από τις προσταγλανδίνες αλλά και ορµόνες µε τις οποίες παρουσιάζει συνεργική δράση όπως η παραθορµόνη και η βιταµίνη D 44. Η ιντερλευκίνη-6 παίζει σηµαντικό ρόλο δρώντας στους οστεοκλάστες και ιδιαίτερα στις πρόδροµες µορφές τους. Αναστέλλει την παραγωγή οστεοκαλσίνης και µαζί µε την ιντερλευκίνη-1 κινητοποιεί τους οστεοκλάστες. Έχει βρεθεί ότι η ιντερλευκίνη-6 ενισχύει την οστική αναδόµηση µέσω του συστήµατος RANKL/RANK/OPG 45. Πλειάδα επίσης άλλων κυτταροκινών εµπλέκεται στον οστικό µεταβολισµό προάγοντας είτε την οστική απορρόφηση όπως η ιντερλευκίνη-11, η ιντερλευκίνη-7, ο TNFα (Tumor Necrosis Factor), είτε τον οστικό σχηµατισµό όπως η ιντερλευκίνη-10 και ο LIF (Lymphocyte inhibitory factor). 33

Κορυφαία οστική µάζα Κορυφαία οστική µάζα (peak bone mass) είναι η µέγιστη κατά τη διάρκεια της ζωής επιτυγχανόµενη οστική µάζα. Η επίτευξη της κορυφαίας οστικής µάζας είναι διαδικασία διαφορετική από αυτή της σκελετικής ανάπτυξης η οποία ολοκληρώνεται µε το τέλος της εφηβείας και σχετίζεται µε την λειτουργία των συζευκτικών χόνδρων. Μέγιστη οστική µάζα είναι µέγεθος το οποίο εξαρτάται αποκλειστικά από τον οστικό µεταβολισµό και η χρονική περίοδος επίτευξης του εξαρτάται από παράγοντες γενετικούς και ορµονικούς. Μελέτες στον ελληνικό πληθυσµό έδειξαν ότι η κορυφαία οστική µάζα επιτυγχάνεται στο τέλος της τρίτης δεκαετίας της ζωής 46. Η σηµασία της κορυφαίας οστικής µάζας για την οστική αντοχή διαπιστώθηκε από διασταυρούµενες µελέτες οι οποίες ανέδειξαν ότι µε σταθερούς τους υπόλοιπους παράγοντες, το µέγεθος της κορυφαίας οστικής µάζας συνδέεται αντιστρόφως ανάλογα µε την εµφάνιση οστεοπόρωσης. Η επίτευξη πολύ υψηλής κορυφαίας οστικής πυκνότητας καθιστά την πιθανότητα εµφάνισης οστεοπόρωσης µικρή, ενώ αντιθέτως η επίτευξη χαµηλής κορυφαίας οστικής µάζας προδιαθέτει στην εµφάνιση οστεοπόρωσης µετά την τέταρτη δεκαετία της ζωής. Στο στάδιο της εφηβείας η οστική µάζα της σπονδυλικής στήλης διπλασιάζεται. Η αύξηση αυτή στο θήλυ προηγείται κατά δύο έτη, τελικά όµως λόγω της µεγαλύτερης περιόδου αύξησης της οστικής µάζας που οδηγεί σε µεγαλύτερα σε µέγεθος και παχύτερα σε φλοιό οστά, το άρρεν αποκτά τελικά υψηλότερη κορυφαία οστική µάζα. Από την ηλικία 30-35 έως την ηλικία 40-45 µικρές διακυµάνσεις της οστικής µάζας παρατηρούνται. Ακολουθεί µία περίοδος βαθµιαίας απώλειας οστικής µάζας, ο ρυθµός της οποίας στους άνδρες διατηρείται σταθερός µέχρι το γήρας, ενώ οι γυναίκες παρουσιάζουν αυξηµένο ρυθµό απώλειας λόγω και της επερχόµενης εµµηνόπαυσης. Τα πρώτα πέντε χρόνια µετά την εµµηνόπαυση ο ρυθµός οστικής απώλειας ανέρχεται σε 2-4% ετησίως, προοδευτικά όµως µειώνεται για να εξισωθεί µετά τη δεύτερη πενταετία από τη εµµηνόπαυση µε αυτό των ανδρών (0,5-1,0%). Η απώλεια δηλαδή οστικής µάζας στις γυναίκες είναι αποτέλεσµα της αθροιστικής επίδρασης της εµµηνόπαυσης η οποία ευθύνεται για τα 2/3 περίπου της συνολικής απώλειας και της αύξησης της ηλικίας. Μελέτες έχουν δείξει ότι αύξηση της κορυφαίας οστικής µάζας κατά 10% µειώνει τον κίνδυνο µελλοντικού κατάγµατος από οστεοπόρωση κατά 50% 47. 34

Το µέγεθος της κορυφαίας οστικής µάζας που τελικά επιτυγχάνεται υπόκειται στη δράση διαφόρων παραγόντων η πιο σηµαντική από τους οποίους είναι η κληρονοµική προδιάθεση, οι ορµονικοί παράγοντες, η ποιότητα της διατροφής σε ασβέστιο, χρόνιες φλεγµονώδεις ή ενδοκρινικές παθήσεις, χρόνια λήψη φαρµάκων επιδρώντων στον οστικό µεταβολισµό όπως η κορτιζόνη και άλλοι παράγοντες όπως η άσκηση, το κάπνισµα κ.α. Γενετικοί παράγοντες καθορίζουν σε υψηλό ποσοστό την ικανότητα ενός ατόµου για επίτευξη υψηλής κορυφαίας µάζας. Είναι γνωστό ότι η λευκή και η κίτρινη φυλή υπολείπονται έναντι της µαύρης φυλής σε κορυφαία οστική πυκνότητα καθιστώντας την οστεοπόρωση συχνότερη ασθένεια. Ορµονικές διαταραχές όπως η ελάττωση της αυξητικής ορµόνης, ο υποθυρεοειδισµός, ο διαβήτης τύπου I συνοδεύονται από επίτευξη χαµηλής κορυφαίας οστικής πυκνότητας. Οι ορµόνες του φύλου σχετίζονται άµεσα µε την αύξηση της οστικής πυκνότητας. Η ύπαρξη υπογοναδισµού ή καθυστέρησης της λειτουργίας των γονάδων συνεπάγεται χαµηλή κορυφαία οστική πυκνότητα και στα δύο φύλα. Επίσης η τελικά επιτυγχανόµενη κορυφαία οστική πυκνότητα είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την ηλικία έναρξης της εµµηνορρυσίας 48. Η πρόσληψη ασβεστίου κατά την παιδική και εφηβική ηλικία είναι κεφαλαιώδους σηµασίας για την επίτευξη κορυφαίας οστικής πυκνότητας. Η θετική επίδραση της πρόσληψης ασβεστίου επεκτείνεται σε όλη τη διάρκεια της επίτευξης της οστικής πυκνότητας 47. Οι συνιστώµενες ηµερήσιες ποσότητες ασβεστίου δεν διαφέρουν ιδιαίτερα µεταξύ ανδρών και γυναικών και ανέρχονται στα 800 mg κατά την παιδική ηλικία ενώ στην εφηβική ηλικία απαιτούνται 1200 mg 49. Η κύηση και η γαλουχία γυναικών σε ηλικία µικρότερης των 18 ετών είναι δυσµενής παράγοντας για την επίτευξη υψηλής κορυφαίας οστικής πυκνότητας ενώ αντίθετα όταν αυτό γίνεται µετά το 25 έτος της ηλικίας επιτυγχάνεται υψηλότερη κορυφαία οστική µάζα 50. Η άσκηση προσφέρει τα απαραίτητα µηχανικά ερεθίσµατα για τη διέγερση του οστικού αναβολισµού και τη βελτίωση της ποιότητας του οστίτη ιστού. Σειρά µελετών έχουν καταδείξει τη θετική επίδραση της άσκησης στην επίτευξη υψηλής κορυφαίας οστικής µάζας σε ασκούµενους και την υπεροχή αυτών έναντι ατόµων ίδιας ηλικίας που στερούνται την άσκηση 51. 35

36

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗ Ορισµός Τα µεταβολικά νοσήµατα των οστών αποτελούν ένα εντυπωσιακά αναπτυσσόµενο γνωστικό αντικείµενο της ιατρικής. Καθώς αυξάνεται το προσδόκιµο της επιβίωσης αυξάνεται και η επίπτωση των µεταβολικών νοσηµάτων στο γενικό πληθυσµό. Το συχνότερο από αυτά είναι η οστεοπόρωση και επηρεάζει εκατοµµύρια ανθρώπων σε όλο τον κόσµο µε τεράστιες κοινωνικοοικονοµικές επιπτώσεις. Ο ορισµός της οστεοπόρωσης έχει πάψει να είναι µονοσήµαντος και περιλαµβάνει πλέον και ποιοτικές παραµέτρους οι οποίες κυρίως σχετίζονται µε τα κατάγµατα χαµηλής ενέργειας. Όπως ορίστηκε το 1993 µετά από διεθνή συµφωνία (Ιnternasional Concensus Development Conference) 52 πρόκειται για µια νόσο του µεταβολισµού των οστών που προκαλεί βαθµιαία απώλεια οστικής µάζας και διαταραχές της µικροαρχιτεκτονικής του οστού µε αποτέλεσµα τη µειωµένη µηχανική αντοχή των οστών και αυξηµένο κίνδυνο καταγµάτων 53. Το κάταγµα είναι η τελική έκβαση που προσδίδει το επιδηµιολογικό ενδιαφέρον στην οστεοπόρωση και προκύπτει από φορτίσεις χαµηλής ενέργειας σε οστά µειωµένης αντοχής. Σύµφωνα µε τον παγκόσµιο οργανισµό υγείας (W.H.O.) το 1994 η οστεοπόρωση ορίστηκε ως η ελάττωση της οστικής πυκνότητας µεγαλύτερης από 2.5 σταθερές αποκλίσεις (SD) κάτω από τη µέση τιµή της κορυφαίας οστικής πυκνότητας νέων ατόµων (30-35 ετών) του ιδίου φύλου και φυλής (Τscore -2.5 SD). Ο προσδιορισµός της οστικής πυκνότητας αφορά στη µέθοδο DEXA (Dual Energy X-ray Absorptiometry) η οποία έχει επικρατήσει παγκοσµίως ως µέθοδος επιλογής 54.Ελάττωση της οστικής πυκνότητας από -1 έως -2.5 ονοµάζεται οστεοπενία 55. Το κριτήριο προσδιορισµού της οστικής πυκνότητας µε τη µέθοδο DEXA είναι ποσοτικό και δεν αντικατοπτρίζει τη δοµική ποιότητα του οστού. Όπως προκύπτει και από τον ορισµό της οστεοπόρωσης συνυπάρχει διαταραχή της µικροαρχιτεκτονικής του οστού. Το κάταγµα προκύπτει ως η τελική έκβαση της µειωµένης αντοχής του οστού η οποία τελικά εξαρτάται τόσο από την ποσότητα όσο και από την ονοµαζόµενη ποιότητα της. Στην τελευταία συµπυκνώνονται παράµετροι όπως η µικροαρχιτεκτονική του οστού, µικροφλεγµονές και µικροβλάβες, ο βαθµός ωριµότητάς του, ο ρυθµός µεταβολισµού του 56. 37

Η φυσιολογική λειτουργία της αναδόµησης του οστίτη ιστού εξασφαλίζει την ποιότητα του. Η διαταραχή αυτής της λειτουργίας, συνεπεία της εµµηνόπαυσης και της γήρανσης έχει σαν τελικό αποτέλεσµα υποβάθµιση της ποιότητας του οστού και µείωση της αντοχής του 57. Η οστεοπόρωση διακρίνεται σε δύο κύρια είδη, την πρωτοπαθή και την δευτεροπαθή. Η πρωτοπαθής οστεοπόρωση είναι η οστεοπόρωση που δεν προκαλείται δευτεροπαθώς από άλλη νοσολογική οντότητα και ανάλογα µε την ένταση του ρυθµού οστικής ανακατασκευής διακρίνεται στην µετεµµηνοπαυσιακή ή τύπου I οστεοπόρωση και την γεροντική ή τύπου II οστεοπόρωση. Η µετεµµηνοπαυσιακή ή τύπου I οστεοπόρωση σχετίζεται µε την µείωση της παραγωγής των οιστρογόνων και αφορά τα πρώτα 10-15 χρόνια µετά την εµµηνόπαυση, χαρακτηρίζεται δε από ταχύ ρυθµό οστικής απώλειας 58. Η γεροντική ή τύπου ΙΙ οστεοπόρωση, χαρακτηρίζεται από χαµηλό ρυθµό οστικής ανακατασκευής και παρουσιάζεται σε ηλικιωµένους µετά την ηλικία των 65-70 ετών, µε συµµετοχή και των δύο φύλων, υπεροχή όµως των γυναικών σε αναλογία 3 προς 1 59. ευτεροπαθής οστεοπόρωση καλείται η οστεοπόρωση που προκύπτει δευτεροπαθώς ως επιπλοκή άλλης νοσολογικής οντότητας. Επιδηµιολογία Η οστεοπόρωση και τα οστεοπορωτικά κατάγµατα αντιπροσωπεύουν ένα τεράστιο επιδηµιολογικό πρόβληµα και για τα δύο φύλα καθώς σχετίζονται µε τη αύξηση του µέσου όρου ηλικίας. Η µεγαλύτερη επίπτωση οστεοπόρωσης στις γυναίκες έναντι των ανδρών οφείλεται στο ότι οι γυναίκες ζουν κατά µέσο όρο περισσότερο από τους άνδρες, κατά την διάρκεια της ζωής τους υφίστανται µεγαλύτερη οστική απώλεια λόγω της εµµηνόπαυσης, αλλά και εξαρχής (κατασκευαστικά) παρουσιάζουν χαµηλότερη αντοχή των οστών τους λόγω µικρότερης κορυφαίας οστικής µάζας από τους άνδρες. Οι γυναίκες της λευκής φυλής διατρέχουν αθροιστικά διά βίου κίνδυνο 16% να υποστούν ένα τουλάχιστον επώδυνο σπονδυλικό κάταγµα, 15% κάταγµα του περιφερικού άκρου του αντιβραχίου (κάταγµα Colles) και 16% κάταγµα του ισχίου 60,61. Στην Ευρώπη η επίπτωση των µορφοµετρικά διαγιγνωσκοµένων σπονδυλικών καταγµάτων είναι 10,7/1000 γυναίκες ανά έτος ενώ αντίστοιχα η επίπτωση των µη σπονδυλικών καταγµάτων χαµηλής ενέργειας είναι 19/1000 γυναίκες ανά έτος 62. 38

Στην Ελλάδα υπολογίζεται ότι 500.000 ελληνίδες πάσχουν από µετεµµηνοπαυσιακή οστεοπόρωση. Για τα σπονδυλικά κατάγµατα και τα κατάγµατα του καρπού τα οποία συµβαίνουν στην Ελλάδα δεν υπάρχουν επαρκή επιδηµιολογικά στοιχεία. Η επίπτωση των καταγµάτων του ισχίου το έτος 1997 σε γυναίκες ηλικίας µεγαλύτερες των πενήντα ετών υπολογίστηκε σε 4,48/1000 πληθυσµού 63. Από τα κατάγµατα τα πιο επικίνδυνα είναι αυτά του ισχίου. Σύµφωνα µε επιδηµιολογικές έρευνες στο 50% περίπου των περιπτώσεων οδηγούν σε µόνιµη αναπηρία και στο 20% περίπου στο θάνατο τον πρώτο χρόνο µετά το κάταγµα 64. Έχει πλέον τεκµηριωθεί ότι εάν µία γυναίκα υποστεί κάταγµα από οστεοπόρωση, οι πιθανότητες να υποστεί δεύτερο σύντοµα είναι 5 φορές περισσότερες από µία γυναίκα που δεν έχει υποστεί. Ο κίνδυνος 12πλασιάζεται σε περίπτωση δύο προηγηθέντων καταγµάτων (domino effect) 65. Σύµφωνα µε µερικούς ερευνητές ο κίνδυνος θανάτου από οστεοπόρωση είναι ίσος µε τον κίνδυνο θανάτου από καρκίνο του µαστού, από καρκίνο των ωοθηκών και από καρκίνο της µήτρας αθροιστικά 66. Τα κατάγµατα επηρεάζουν δραµατικά και την ποιότητα ζωής των ατόµων. Το 80% από αυτά δηλώνουν ότι προτιµούν το θάνατο µετά από ένα κάταγµα του ισχίου παρά το χρόνιο εγκλεισµό τους σε ίδρυµα αποκατάστασης 67. Στην Ευρωπαϊκή Ένωση η δαπάνη για τη νοσηλεία των ασθενών µε οστεοπόρωση υπολογίζεται σε περίπου 4.8 δισεκατοµµύρια ευρώ ετησίως 68. Αντίστοιχα στην Ελλάδα η δαπάνη για τα κατάγµατα του ισχίου κατά το έτος 2002 υπολογίστηκε σε 46.250.000 ευρώ. Αιτιολογία Παθογένεια Η γένεση της οστεοπόρωσης είναι αποτέλεσµα της διαταραχής του φαινοµένου της συζευγµένης δράσης των κυττάρων που λαµβάνουν µέρος στον οστικό µεταβολισµό και η δηµιουργία χρόνιου αρνητικού ισοζυγίου στο οστό. Ανάλογα του ρυθµού οστικής ανακατασκευής η επίτευξη του αρνητικού αυτού ισοζυγίου µπορεί να οφείλεται είτε σε αυξηµένη οστεοκλαστική δραστηριότητα µε φυσιολογική οστεοβλαστική, χαρακτηριστική της οστεοπόρωσης µετεµµηνοπαυσιακού τύπου I, είτε σε φυσιολογική οστεοκλαστική δράση µε µειωµένη όµως οστεοβλαστική δραστηριότητα όπως συµβαίνει στη γεροντική οστεοπόρωση τύπου II 69. 39

Η οστεοπόρωση τύπου Ι χαρακτηρίζεται από έλλειψη οιστρογόνων. Η έλλειψη αυτή έχει επίδραση στις ασβεστιοτρόπες ορµόνες την δράση των οποίων και διαταράσσει. Το εντερικό επιθήλιο διαθέτει υποδοχείς 17β-οιστραδιόλης µία από τις δράσεις της οποίας είναι η αύξηση της απορρόφησης του ασβεστίου. Η έλλειψη εποµένως οιστρογόνων που χαρακτηρίζει τις µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες οδηγεί σε υπασβεστιαιµία 70. Η 17β-οιστραδιόλη δρα στους οστεοκλάστες άµεσα αλλά και έµµεσα µέσω των οστεοβλαστών. Σε επίπεδο τοπικών ρυθµιστικών παραγόντων διαταράσσεται η παρακρινική και αυτοκρινική δράση των παραγόµενων από τους οστεοβλάστες κυτοκινών, ιδίως της ιντερλευκίνης 6 αλλά και του παράγοντα TNF, του παράγοντα TGF-β, της προσταγλανδίνης Ε2 και των παραγόντων IGF-I και ΙΙ. Έχει βρεθεί ότι τα κυκλοφορούντα επίπεδα της IL-1 και IL-6 είναι αυξηµένα στις µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες. Ακόµη η δραστηριότητα των κυτοκινών RANKL/ RANKL είναι αυξηµένη ενώ της OPG ελαττωµένη 70. Η απορύθµιση αυτού του ορµονικού και παρακρινικού συστήµατος γίνεται ιδιαιτέρως φανερή σε περιπτώσεις ωοθηκεκτοµών όπου σηµειώνεται υπερέκκριση αυτών των ιντερλευκινών, προάγοντας έτσι την οστεοπόρωση. Συνέπεια όλων αυτών είναι σε επίπεδο βασικών πολυκυτταρικών µονάδων (BMU) οι ενεργοποιηµένοι οστεοβλάστες να αδυνατούν να αντιρροπήσουν τους υπερδραστήριους οστεοκλάστες. Προκύπτει τελικά έτσι ένα συνεχές έλλειµµα οστικής µάζας το οποίο προοδευτικά αθροιζόµενο οδηγεί αρχικά σε οστεοπενία και τελικά σε οστεοπόρωση. Πρόσφατες σχετικά έρευνες έδειξαν ότι στην µετεµµηνοπαυσιακή οστεοπόρωση εκτός από την αύξηση της ενεργότητας των κυττάρων, αυξάνεται και ο αριθµός των ενεργοποιηµένων βασικών πολυκυτταρικών µονάδων (BMU) ενώ µειώνεται ο χρόνος των κύκλων ανακατασκευής. Ο ρυθµός απορρόφησης του οστού κατ αυτό τον τρόπο καθίσταται ταχύτατος µε συνέπεια την σοβαρή και µη αναστρέψιµη βλάβη της µικροαρχιτεκτονικής και αντοχής του οστού εξαιτίας της λέπτυνσης έως και πλήρους, µερικές φορές, εξαφάνισης των οστικών δοκίδων. Η ταχεία µετεµµηνοπαυσιακή οστική απώλεια είναι εµφανέστερη στα σπογγώδη οστά λόγω της δοκιδώδους δοµής τους οδηγώντας έτσι στην πρόκληση καταγµάτων σε περιοχές όπου κυριαρχεί το σπογγώδες οστό (σπονδυλική στήλη, καρπός). Το γεγονός αυτό καθιστά επιτακτική την άµεση έναρξη της θεραπείας στις περιπτώσεις αυτές 71. Οι µετεµµηνοπαυσιακές οστεοπορωτικές (τύπου I) γυναίκες δύναται να διαχωριστούν επιπλέον σε δύο κατηγορίες : αυτές των οποίων η απώλεια οστικής µάζας υπερβαίνει το 3% ετησίως (fast bone losers) και αποτελούν το 40

1/3 των γυναικών της κατηγορίας και αυτές των οποίων η απώλεια υπολείπεται του 3% (slow bone losers) και αποτελούν τα υπόλοιπα 2/3. Προφανώς ο κίνδυνος των πρώτων για οστικό κάταγµα είναι πολύ υψηλότερος 58. Η οστεοπόρωση τύπου ΙI χαρακτηρίζεται από την αυξηµένη σε σχέση µε την τύπου I απώλεια φλοιώδους συµπαγούς οστού µε συνέπεια τα αυξηµένα σε συχνότητα κατάγµατα µακρών οστών (ισχίο). Στην οστεοπόρωση τύπου ΙI σε επίπεδο βασικών πολυκυτταρικών µονάδων (BMU) οι οστεοβλάστες µειονεκτούν σε παραγωγή οστίτη ιστού ενώ οι οστεοκλάστες παρουσιάζουν αυξηµένη δραστηριότητα λόγω δευτεροπαθούς υπερπαραθυρεοειδισµού. Η γήρανση των οστεοβλαστών έχει σαν συνέπεια την απώλεια αυτοκρινικών και παρακρινικών ιδιοτήτων τους, µε αποτέλεσµα την λειτουργική τους ανεπάρκεια και τη συνεχή δηµιουργία οστικού ελλείµµατος. Η κατάσταση επιδεινώνεται και από την ελαττωµένη παραγωγή της βιταµίνης 1,25(ΟΗ)2D3 που συνεπάγεται µειωµένη εντερική απορρόφηση ασβεστίου και υπασβεστιαιµία. Αυτή είναι που οδηγεί και σε αντιρροπιστικό υπερπαραθυρεοειδισµό 70. Η επίτευξη υψηλής κορυφαίας οστικής µάζας είναι, όπως ήδη έχει αναφερθεί, κεφαλαιώδους σηµασίας προγνωστικός παράγοντας για την αποφυγή εγκατάστασης οστεοπόρωσης. Γυναίκες οι οποίες κατά την είσοδο τους στην εµµηνόπαυση έχουν ήδη χαµηλή οστική µάζα για διάφορους λόγους, µπορούν χάνοντας λιγότερη οστική µάζα αναλογικά µε άλλες που έχουν υψηλότερη οστική µάζα, εγκαθιστώντας οστεοπόρωση να υποστούν τελικά κάταγµα 72. Παράγοντες κινδύνου που παρεµβαίνουν τόσο στη διαµόρφωση της κορυφαίας οστικής µάζας όσο και στη διαδικασία οστεόλυσης µπορούν να αφορούν τόσο σε γενετικές προδιαγραφές του ατόµου όπως το φύλο, η ηλικία, η φυλή, το οικογενειακό ιστορικό όσο και περιβαλλοντικούς παράγοντες ή έξεις του ατόµου όπως οι διατροφικές συνήθειες, η έλλειψη φυσικής δραστηριότητας, το κάπνισµα, η κατάχρηση καφέ και οινοπνεύµατος, η κύηση και η γαλουχία σε ηλικία κάτω των 18 ετών, η µη τεκνοποίηση, η λεπτοφυής σωµατοδοµή (σωµατικό βάρος < 57 κιλά) και η λήψη διαφόρων φαρµάκων 73. 41

42

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ Η κλινική σηµασία της εκτίµησης των οστεοπορωτικών ασθενών αφορά στην εκτίµηση του κινδύνου για ενδεχόµενο µελλοντικό κάταγµα και στη θεραπευτική παρέµβαση µε σκοπό την πρόληψη του. Η αξιολόγηση των οστεοπορωτικών ασθενών βασίζεται στο ιστορικό, την κλινική εξέταση, σε απεικονιστικές µεθόδους καθώς και σε εκτίµηση κλασικών αλλά και νεώτερων βιοχηµικών δεικτών οστικού µεταβολισµού. Από τη λήψη του ιστορικού µπορούν να αποκαλυφθούν παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη της νόσου. Αξιολογούνται προδιαθεσικοί παράγοντες για οστεοπόρωση, η απώλεια ύψους και η ύπαρξη προηγηθέντων καταγµάτων, ασθένειες ή λήψη φαρµάκων που προκαλούν οστεοπόρωση. Ο εργαστηριακός έλεγχος περιλαµβάνει αιµατολογικές, βιοχηµικές και ορµονικές παραµέτρους όπως γενική αίµατος, ασβέστιο, φωσφόρος, λευκώµατα, τρανσαµινάσες, αλκαλική φωσφατάση, κρεατινίνη, ηλεκτρολύτες ορού και ασβέστιο ούρων 24ώρου. Οι ορµονικές εξετάσεις περιλαµβάνουν έλεγχο των TSH, παραθορµόνης, 25(OH)D3, ελεύθερης κορτιζόλης ούρων 24ώρου. Σκοπός της στρατηγικής αυτής είναι να αποκλειστούν παθήσεις οι οποίες δευτεροπαθώς προκαλούν οστεοπόρωση καθώς οι ανωτέρω αναφερθέντες δείκτες συνήθως εµφανίζονται φυσιολογικοί στην πρωτοπαθή οστεοπόρωση. Μεταξύ των προς τον αποκλεισµό παθήσεων είναι ο υπερ- και υποθυρεοειδισµός, ο υπερπαραθυρεοειδισµός, η υπερκορτιζολαιµία, η νεφρική σωληναριακή οξέωση, φλεγµονώδης νόσος του εντέρου κ.α. Ο απεικονιστικός έλεγχος µε τη χρήση απλής ακτινογραφίας έχει πτωχή προγνωστική και διαγνωστική αξία καθώς αναδεικνύει αραίωση της οστικής µάζας αφού έχει πρώτα απολεσθεί το 40% τουλάχιστον αυτής. Η αξία της έγκειται στον αποκλεισµό άλλων παθήσεων που εµπλέκονται στη διαφοροδιάγνωση όπως η σπονδυλαρθρίτιδα, οι µεταστάσεις και άλλες. Η αξία βέβαια της απλής ακτινογραφίας στη διαπίστωση καταγµάτων διατηρείται. Μέτρηση οστικής πυκνότητας Η απώλεια οστικής µάζας αποτελεί τον σηµαντικότερο προγνωστικό παράγοντα εµφάνισης κατάγµατος, υπερτερώντας της διαταραχής της µικροαρχιτεκτονικής του οστού κατά 80%. Εποµένως η µέτρηση της οστικής 43

πυκνότητας είναι θεµελιώδης για τη διάγνωση αλλά και την εκτίµηση της εξέλιξης της νόσου. Η ανάγκη για µεγαλύτερη ευαισθησία και αξιοπιστία οδήγησαν στη µέθοδο DEXA (Dual Energy X-ray Absorptiometry) η οποία έχει πλέον επικρατήσει παγκοσµίως ως µέθοδος εκλογής 54. Η µέθοδος βασίζεται στη λειτουργία συσκευών οι οποίες χρησιµοποιούν λυχνίες διχρωµατικών ακτίνων Χ είτε µε τη βοήθεια κατάλληλων φίλτρων είτε µε τη συνεχή µεταβολή του δυναµικού της λυχνίας. Η µέθοδος DEXA µε ελάχιστη επιβάρυνση ακτινοβολίας είναι ιδιαίτερα ασφαλής και αρκετά ακριβής παρέχοντας σηµαντικά στοιχεία της ποιότητας του σκελετού. Λαµβάνονται µετρήσεις της οσφυϊκής µοίρας, του µηριαίου οστού (αυχένας, τρίγωνο Ward s και µείζονος τροχαντήρας) αλλά και σε ολόκληρο το σώµα. Η οσφυϊκή µοίρα και το µηριαίο οστό αποδείχτηκαν ιδανικές περιοχές µέτρησης καθώς διαθέτουν µεταβολικά ενεργό σπογγώδες οστό. Ειδικά στο µηριαίο το σπογγώδες οστό είναι περίπου 50% (τρίγωνο Ward s) ενώ στον αυχένα του κυριαρχεί το συµπαγές σε ποσοστό έως 75%. Μετρώντας την οστική πυκνότητα των σπονδύλων της οσφυϊκής µοίρας ουσιαστικά µετράµε σπογγώδες οστό, καθώς η αναλογία του στη µάζα των σπονδύλων είναι τουλάχιστον 66% ενώ η µέτρηση του µηριαίου αντικατοπτρίζει καλύτερα το συµπαγές οστό 74. Τα αποτελέσµατα της µεθόδου εκφράζονται σε γραµµάρια αλάτων που περιέχονται στο συγκεκριµένο οστό ή BMC (Bone Mineral Content). Έχει επικρατήσει όµως ο όρος Bone Mineral Density (BMD) και ο οποίος εκφράζεται σε gr/cm 2 που αποτελεί το πηλίκο της BMC προς την επιφάνεια της περιοχής που µετρήθηκε. εν συνιστά δηλαδή πραγµατική οστική πυκνότητα (gr/cm 3 ) αλλά λόγω της ευχρησίας έχει επικρατήσει 75. Το αποτέλεσµα της µέτρησης συγκρίνεται µε βάση δεδοµένων φυσιολογικών ατόµων και εκφράζεται σαν T-score και Z-score 75. Το T-score εκφράζει πόσες σταθερές αποκλίσεις απέχει η µετρηθείσα τιµή από την αντίστοιχη τιµή της κορυφαίας οστικής πυκνότητας νεαρών ατόµων ηλικίας 30-35 ετών του ίδιου φύλου. Το T-score έχει το πλεονέκτηµα ότι στηρίζεται σε µία σταθερή βάση που προκύπτει από τη µέτρηση της κορυφαίας οστικής πυκνότητας µεγάλου αριθµού ατόµων. Το Z-scoreαντιστοιχεί στον αριθµό των σταθερών αποκλίσεων που απέχει η µετρηθείσα τιµή από αντίστοιχες τιµές φυσιολογικών ατόµων ιδίου φύλου αλλά και ηλικίας. Το Z-scoreπαρουσιάζει ιδιαίτερη µεταβλητότητα και δεν καθορίζει µε ακρίβεια τον κίνδυνο κατάγµατος που είναι το επιθυµητό για την προγνωστική αξία της εξέτασης 75. Για τον λόγο αυτό σύµφωνα µε την Παγκόσµια Οργάνωση Υγείας (WHO) πρέπει να αξιολογείται µόνο το T-score για την διάγνωση της οστεοπόρωσης ως ακολούθως : 44

Τιµές του T-score έως 1 SD θεωρούνται φυσιολογικές. Από 1 SD έως 2,5 SD θεωρείται πως το άτοµο παρουσιάζει οστεοπενία ενώ τιµές του T-score < 2,5 SD είναι συνώνυµες της οστεοπόρωσης. Καθιερώθηκε µάλιστα και ο όρος εγκατεστηµένη οστεοπόρωση για τα άτοµα εκείνα που έχοντας T-score < 2,5 SD, έχουν ήδη υποστεί και κάταγµα 76. Οι κατευθυντήριες γραµµές για το χρόνο διενέργειας της DEXA συστήνουν ότι κάθε µετεµµηνοπαυσιακή γυναίκα η οποία παρουσιάζει τουλάχιστον ένα παράγοντα κινδύνου για οστεοπόρωση εκτός της εµµηνόπαυσης πρέπει να υποβάλλεται στην εξέταση. Το ίδιο ισχύει και για κάθε µετεµµηνοπαυσιακή γυναίκα η οποία έχει υποστεί οποιοδήποτε τύπου κατάγµατος ή βρίσκεται σε αντιοστεοπορωτική αγωγή. Τέλος κάθε γυναίκα άνω των 65 ετών ανεξάρτητα λοιπών παραγόντων κινδύνου 77. Η συχνότητα µε την οποία πρέπει να επαναλαµβάνεται η εξέταση, καθώς ο ρυθµός απώλειας οστικής µάζας είναι σηµαντικά αυξηµένος στα πρώτα 5-10 χρόνια από την εµµηνόπαυση, συνιστάται να είναι ετήσια. Ιδιαίτερα για την οµάδα εκείνη των γυναικών που εµφανίζουν ταχεία απώλεια οστικής µάζας, άνω του 3% κατ έτος (fast bone losers), καθίσταται επιτακτική η ετήσια επανάληψη της εξέτασης, καθώς αποκαλύπτει τα άτοµα αυτά και επιτρέπει την έγκαιρη παρέµβαση 78. Συχνά τίθεται το ερώτηµα ποια περιοχή του σκελετού πρέπει να επιλέγεται για τη διενέργεια της εξέτασης. Αναλύσεις µεγάλου αριθµού γυναικών που υποβλήθηκαν σε µικτές µετρήσεις τόσο της οσφυικής µοίρας της σπονδυλικής στήλης όσο και του ισχίουυ αποκάλυψαν ότι η εξέταση µόνο της οσφύος καλύπτει διαγνωστικά την εξεταζόµενη µόνο κατά 59% ενώ η µέτρηση µόνο του ισχίου καλύπτει διαγνωστικά σε ποσοστό 84% 79. Ωστόσο καθώς σηµαντικός αριθµός ασθενών (10%) µπορούν να χαρακτηρισθούν οστεοπορωτικοί µετρώντας µια περιοχή και φυσιολογικοί µετρώντας µια άλλη, θα πρέπει να µετράται τόσο η ΟΜΣΣ όσο και το ισχίο για την επίτευξη µέγιστης κάλυψης των ασθενών 78. Μεταξύ των δύο ισχίων θα πρέπει να προτιµάται το αριστερό στους δεξιόποδες καθώς αυτό έχει θεωρητικά την µικρότερη οστική µάζα και αντιστρόφως. Η οστική πυκνότητα µεταξύ των δύο ισχίων µπορεί να διαφέρει έως και 0,5 SD 80. 45

H χρησιµότητα των βιοχηµικών δεικτών οστικού µεταβολισµού έγκειται όχι τόσο στην διάγνωση της οστεοπόρωσης όσο στην αξιολόγηση του ρυθµού της οστικής αναδόµησης. Προσφέρουν δηλαδή τη δυνατότητα µιας δυναµικής αξιολόγησης της κατάστασης του οστίτη ιστού, σε αντίθεση µε τις απεικονιστικές µεθόδους που δίνουν µια στατική κατάσταση των οστών. Αυτό αξιοποιείται τόσο προγνωστικά στην εκτίµηση του ρυθµού µελλοντικής οστικής απώλειας όσο και στην ταχύτερη διαπίστωση της αποτελεσµατικότητας της εφαρµοζόµενης θεραπευτικής αγωγής. Καθώς η διακριτική ικανότητα της DEXA να διαπιστώσει αξιόπιστη µεταβολή της οστικής πυκνότητας απαιτεί παρέλευση χρονικού διαστήµατος ενός έτους τουλάχιστον, η προτεινόµενη προσέγγιση περιλαµβάνει την µέτρηση της οστικής πυκνότητας και ενός δείκτη οστικής εναλλαγής µε την έναρξη της αγωγής και επανάληψη της µέτρησης του δείκτη 3- µήνες µετά. Βελτιώνεται κατ αυτό τον τρόπο η διαχείριση του ασθενή µε έγκαιρη διαπίστωση τυχόν αποτυχίας της αγωγής και κατάλληλη τροποποίηση της. 46

ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΕΙΚΤΕΣ ΟΣΤΙΚΗΣ ΕΝΑΛΛΑΓΗΣ (Β ΟΕ) Η οστική ανακατασκευή που ήδη περιγράφηκε έχει σαν συνέπεια την απελευθέρωση ουσιών, των οποίων τα επίπεδα µπορούν να µετρηθούν είτε στον ορό είτε στα ούρα των ασθενών και να ποσοτικοποιήσουν το ποσοστό οστικής απορρόφησης ή παραγωγής 81. Οι ουσίες αυτές ονοµάζονται Βιοχηµικοί είκτες Οστικής Εναλλαγής (Β ΟΕ) και είναι κυρίως πεπτίδια που παράγονται από τους οστεοβλάστες ή παράγονται από το µεταβολισµό του κολλαγόνου. ιακρίνονται σε δείκτες οστικού σχηµατισµού στους οποίους περιλαµβάνονται το οστικό ισοένζυµο της αλκαλικής φωσφατάσης, η οστεοκαλσίνη, η οστεονεκτίνη, τα αµινοτελικά και καρβοξυτελικά προπεπτίδια του προκολλαγόνου τύπου Ι (PINP-PICP) και σε δείκτες οστικής απορρόφησης στους οποίους κατατάσονται η υδροξυπρολίνη ούρων, η ανθεκτική στο τρυγικό οξύ όξινη φωσφατάση (TRAP 5b), τα αµινοτελικά και καρβοξυτελικά τελοπεπτίδια του κολλαγόνου τύπου Ι (CTX-NTX), παράγωγα του πυριδινίου (πυριδινόλη-δεοξυπυριδινόλη), οστική σιελοπρωτεΐνη (BSP) καθώς και ένας νέος δείκτης του οστικού µεταβολισµού, η καθεψίνη Κ. Άλλοι από αυτούς τους δείκτες έχουν καθιερωθεί και χρησιµοποιούνται στην κλινική πράξη ενώ άλλοι χρησιµοποιούνται µόνο για ερευνητικούς σκοπούς. Στο παρόν θα παρουσιασθούν οι πλέον χρησιµοποιούµενοι δείκτες του οστικού µεταβολισµού και ενός νέου δείκτη για τον οποίο δεν υπάρχουν πολλές βιβλιογραφικές αναφορές και του οποίου η κλινική αξιολόγηση εκκρεµεί, της καθεψίνης Κ. ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΕΙΚΤΕΣ ΟΣΤΙΚΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ Αλκαλική φωσφατάση (BsALP) Η αλκαλική φωσφατάση είναι µια υδροξυλάση του ορθοφωσφορικού εστέρος µε δράση σε αλκαλικό ph. Εντοπίζεται στις κυτταρικές µεµβράνες σε διάφορους ιστούς καταλύοντας την αλκαλική υδρόλυση των µονοφωσφορικών εστερικών οµάδων. Βρίσκεται σε υψηλή συγκέντρωση µε τη µορφή ισοενζύµων στο έντερο, στο ήπαρ, στους νεφρούς, στο σπλήνα στον πλακούντα και φυσικά στα οστά. Το οστικό ισοένζυµο της αλκαλικής φωσφατάσης Bone Specific Alkaline Phosphatase-BsALP) στην ελεύθερη διαλυτή µορφή του αποτελaεί το 46% της ολικής αλκαλικής φωσφατάσης που κυκλοφορεί στο αίµα των υγιών ατόµων. Είναι ένα µόριο 140 kda το οποίο παράγεται από τους οστεοβλάστες ως τετραµερές και συνδέεται στην εξωτερική επιφάνεια της µεµβράνης τους 82. Μεταβολίζεται στους νεφρούς και τα επίπεδα του δεν επηρρεάζονται από την ηπατική λειτουργία. Στην ιδιότητα του να αδρανοποιείται στους 56 0 C βασίστηκαν οι µέθοδοι θερµικής αδρανοποίησης για το διαχωρισµό του από το ηπατικό ισοένζυµο. Παίζει πρωταρχικό ρόλο στη διαδικασία µετάλλωσης 47

των οστών καταλύοντας την αλκαλική υδρόλυση των µονοφωσφορικών εστερικών οµάδων στην επιφάνεια των οστεοβλαστών και παρέχοντας υψηλή συγκέντρωση φωσφορικού άλατος 83. Το οστικό κλάσµα της αλκαλικής φωσφατάσης είναι αυξηµένο σε περιπτώσεις έντονης οστεοβλαστικής δραστηριότητας. Φυσιολογικά αυξάνεται στην παιδική και εφηβική ηλικία καθώς και στα αρχικά στάδια της εµµηνόπαυσης. Παθολογικές καταστάσεις που συνδέονται µε αυξηµένες τιµές αλκαλικής φωσφατάσης είναι η οστεοµαλακία, η νόσος Paget, η ραχίτιδα, ο υπερπαραθυρεοειδισµός, η µεγαλοβλαστική αναιµία, νεοπλάσµατα, κατάγµατα κ.α. Η χορήγηση αντιοστεοπορωτικών φαρµάκων όπως οιστρογόνων, καλσιτονίνης και διφωσφονικών επαναφέρουν την αλκαλική φωσφατάση σε φυσιολογικά επίπεδα 84,85. Στην προσπάθεια του διαχωρισµού του οστικού κλάσµατος από τα άλλα ισοένζυµα, αναπτύχθηκαν κατά καιρούς διάφορες µέθοδοι προσδιορισµού του όπως αυτές της θερµικής αδρανοποίησης, της ηλεκτροφόρησης σε γέλη αγαρόζης και της υγρής χρωµατογραφίας. Η δυσκολία όµως πρακτικής εφαρµογής τους απέτρεψε την καθιέρωση τους ως εξετάσεων ρουτίνας. Η εξέλιξη ήρθε µε την ανάπτυξη µονοκλωνικών αντισωµάτων έναντι της οστικής αλκαλικής φωσφατάσης και την εφαρµογή ανοσοραδιοµετρικών 86 και ανοσοενζυµικών 87 µεθόδων οι οποίες κατέστησαν τον προσδιορισµό της οστικής αλκαλικής φωσφατάσης ευχερέστερα εφαρµόσιµο. Ωστόσο µε τις µεθόδους αυτές παρατηρούνται χαµηλού αλλά σηµαντικού βαθµού διασταυρούµενες αντιδράσεις µε το ηπατικό ισοένζυµο της τάξης του 8-16% 87. Ο προσδιορισµός του οστικού κλάσµατος της αλκαλικής φωσφατάσης χρησιµοποιείται στη διάκριση ασθενών µε ταχύ ρυθµό οστικής ανακατασκευής, όπως στην µετεµµηνοπαυσιακή οστεοπόρωση (οστεοπόρωση τύπου Ι) και στην αξιολόγηση της ανταπόκρισης στην θεραπευτική αγωγή. Πρέπει να σηµειωθεί ωστόσο ότι η χρήση της οστικής αλκαλικής φωσφατάσης υστερεί έναντι δεικτών οστικού καταβολισµού καθώς οι µεταβολές της µετά από αντιοστεοκλαστική αγωγή γίνονται εµφανείς µετά από αρκετές εβδοµάδες σε αντίθεση µε την πρωιµότερη µεταβολή των δεικτών αυτών. Οστεοκαλσίνη (Bone Gla-protein, BGP) Η οστεοκαλσίνη είναι µια µη κολλαγονική πρωτεΐνη της θεµέλιας ουσίας των οστών η οποία αποτελείται από 49 υπολείµµατα αµινοξέων και έχει µοριακό βάρος 5,8 kda και είναι ειδική για τους οστεοβλάστες, τους οδοντοβλάστες και τους χονδροβλάστες. Είναι η κυριότερη µη κολλαγονική πρωτεΐνη του οστίτη ιστού αποτελόντας το 25% των µη κολλαγονικών πρωτεϊνών του. Συντίθεται κυρίως στους οστεοβλάστες και σε µεγάλο ποσοστό δεσµεύεται στη θεµέλια ουσία του οστού. Ένα µικρό ποσοστό κυκλοφορεί στο αίµα και αυτό είναι που ανιχνεύεται µε τη χρήση µονοκλωνικών ή πολυκλωνικών αντισωµάτων. Ο ρόλος της BGP δεν είναι καλά διευκρινισµένος, αν και είναι γνωστό ότι αυξηµένα επίπεδα της στο αίµα αποτελούν ευαίσθητο δείκτη για την εκτίµηση 48

του αυξηµένου µεταβολισµού των οστών, σε ασθενείς µε οστικές παθήσεις. Υποστηρίζεται ότι η BGP συµµετέχει στην οστεοποίηση, στην οµοιοστασία του Ca, στη χηµειοταξία και τη στρατολόγηση των µακροφάγων που είναι υπεύθυνα για την οστική απορρόφηση. Ακόµη πιστεύεται ότι παίζει ρόλο στην αλάτωση των οστών και ότι η δράση της επηρεάζεται από ορµόνες που ρυθµίζουν την οµοιόσταση του ασβεστίου στα εξωκυττάρια υγρά, όπως είναι η καλσιτονίνη, η παραθορµόνη και η βιταµίνη D 88. Η χρήση της οστεοκαλσίνης ως δείκτη του οστικού αναβολισµού βασίζεται σε µελέτες που αναδεικνύουν καλή συσχέτιση της µε τον οστικό σχηµατισµό, την µετάλλωση και την οστεοβλαστική διαφοροποίηση 89,90. Στην οστεοπόρωση, στη νόσο Paget, στον υπερπαραθυρεοειδισµό αλλά και σε ασθενείς µε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια ή ουραιµικούς αιµοκαθαιρόµενους τα επίπεδα της BGP είναι αυξηµένα. Μάλιστα η αύξηση της BGP στους χρόνιους νεφροπαθείς είναι πολύ µεγαλύτερη από την αύξηση του οστικού ισοενζύµου της αλκαλικής φωσφατάσης και για το λόγο αυτό η BGP θεωρείται καλύτερος δείκτης του οστικού µεταβολισµού στους ασθενείς αυτούς 91. Τα επίπεδα της οστεοκαλσίνης επηρρεάζονται από την επάρκεια βιταµίνης Κ. Η βιταµίνη Κ είναι απαραίτητη για την προσθήκη µιας δεύτερης γ- καρβοξυλικής οµάδας στην πλευρική άλυσο των γλουταµινικών υπολειµµάτων του µορίου της πρωτεΐνης. Η καρβοξυλιωµένη αυτή µορφή είναι και η ενεργός µορφή της οστεοκαλσίνης. Η βαρφαρίνη αναστέλλει την αντίδραση αυτή. Έχει παρατηρηθεί ότι ασθενείς που λαµβάνουν αντιπηκτικά αυτού του τύπου έχουν αυξηµένα επίπεδα της ανενεργού µορφής 92 ενώ η χορήγηση της βιταµίνης Κ έχει βρεθεί να σχετίζεται αντιστρόφως ανάλογα µε τον κίνδυνο κατάγµατος 93. Η οστεοκαλσίνη ακολουθεί κιρκάδιο ρυθµό µε σηµαντική διαφορά µεταξύ µέγιστης και ελάχιστης τιµής της τάξης του 10-20%. Τα υψηλότερα επίπεδα παρατηρούνται τις πρώτες πρωϊνές ώρες και τα χαµηλότερα µετά το µεσηµέρι. Επίσης καθώς η οστεοκαλσίνη διηθείται από τους νεφρούς, νεφρική ανεπάρκεια συνδέεται µε αυξηµένα επίπεδα οστεοκαλσίνης του ορού. Για την ανίχνευση της οστεοκαλσίνης του ορού έχουν αναπτυχθεί ανοσοραδιοµετρικές και ανοσοενζυµικές µέθοδοι που βασίζονται στη χρήση µονοκλωνικών και πολυκλωνικών αντισωµάτων. Το µειονέκτηµα των µεθόδων αυτών σχετίζεται µε την αδυναµία των χρησιµοποιούµενων ειδικών αντισωµάτων να αναγνωρίσουν το άθικτο µόριο της οστεοκαλσίνης και το οποίο εκτιµάται ότι αποτελεί το 1/3 της κυκλοφορούσας πρωτεΐνης. Τα υπόλοιπα 2/3 αποτελούνται από τεµάχια του µορίου της πρωτεΐνης τα οποία παράγονται από την αποδόµηση της κατά την απορρόφηση της θεµέλιας ουσίας του οστού. Αυτό έχει σαν συνέπεια σηµαντική απόκλιση των αποτελεσµάτων των διαφόρων µεθόδων αναλόγως µε το βαθµό ειδικότητας του εκάστοτε χρησιµοποιούµενου αντισώµατος. Η ανάπτυξη ενδεχοµένως αντισωµάτων που θα αναγνωρίζουν µόνο το ακέραιο µόριο της πρωτεΐνης θα επιλύσει το πρόβληµα αυτό 91. 49

Aµινοτελικά και καρβοξυτελικά προπεπτίδια του προκολλαγόνου τύπου Ι (PINP και PICP) Το κολλαγόνο τύπου Ι, το οποίο παράγεται από τους οστεοβλάστες και αποτελεί το 90% της οργανικής θεµέλιας ουσίας των οστών, προέρχεται από το προκολλαγόνο τύπου Ι. Το προκολλαγόνο τύπου Ι περιέχει αµινοτελικά (Nterminal) και καρβοξυτελικά (C-terminal) πεπτίδια τα οποία αποµακρύνονται µε τη δράση ειδικών πρωτεασών κατά τη σύνθεση του κολλαγόνου. Τα αµινοτελικά (PINP) και καρβοξυτελικά (PICP) αυτά πεπτίδια του προκολλαγόνου εισέρχονται στην κυκλοφορία από το εξωκυττάριο υγρό και αντικατοπτρίζουν αλλαγές του µεταβολισµού των οστών 94. Μέθοδοι όπως η ανοσοηλεκτροφόρηση, ανοσοενζυµικές και ανοσοραδιοµετρικές, µε τη χρήση πολυκλωνικών κυρίως αντισωµάτων, αναπτύχθηκαν για τον ποσοτικό προσδιορισµό των πεπτιδίων 95. Σε εµµηνοπαυσιακές γυναίκες εµφανίζεται ήπια αύξηση του PICP η οποία όµως παρουσιάζει πτωχή συσχέτιση µε την απώλεια οστικής µάζας, σε αντίθεση µε την οστεοκαλσίνη και την αλκαλική φωσφατάση. Παρατηρείται όµως µείωση των επιπέδων του όταν οι γυναίκες αυτές τεθούν υπό αντιοστεοπορωτική αγωγή, όπως συµβαίνει και µε τους άλλους δείκτες στις ασθενείς αυτές. Μελέτες έχουν δείξει ότι το PINP πλεονεκτεί σε ευαισθησία έναντι του PICP 96. ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΕΙΚΤΕΣ ΟΣΤΙΚΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ Υδροξυπρολίνη ούρων. Η υδροξυπρολίνη είναι ένας παραδοσιακός δείκτης της οστικής απορρόφησης. Κατά την οστική αποδόµηση ελευθερώνεται στην κυκλοφορία υδροξυπρολίνη σε ελεύθερη µορφή και ως συνδεδεµένη σε µικρά πεπτίδια που την περιέχουν. Η συνδεδεµένη δεν επαναρροφάται από τους νεφρούς, από τους οποίους και απεκκρίνεται στα ούρα. Η υδροξυπρολίνη των ούρων 2 ης πρωϊνής ούρησης, µετά από νηστεία, διορθωµένη προς την κρεατινίνη των ούρων χρησιµοποιείται ως δείκτης οστικής απορρόφησης. Η αξία της όµως αµβλύνεται από παράγοντες που επιδρούν τα επίπεδα της όπως η διατροφική πρόσληψη, η έλλειψη ειδικότητας προς το κολλαγόνο των οστών και ο µεταβολισµός της στο ήπαρ. Ακριβέστερες µέθοδοι προσδιορισµού της όπως η υψηλής απόδοσης υγρή χρωµατογραφία (HPLC) φαίνεται να προσφέρουν µεγαλύτερη ειδικότητα σε σχέση µε τον οστικό µεταβολισµό 97. Ανθεκτική στο άλας του τρυγικού οξέος όξινη φωσφατάση (Tartrate Resistant Acid Phosphatase, TRAP 5b) Η ανθεκτική στο άλας του τρυγικού οξέος όξινη φωσφατάση είναι ένα από τα έξι ισοένζυµα της οικογένειας των όξινων φωσφατασών, οι οποίες καταλύουν ην υδρόλυση των φωσφορικών οµάδων σε όξινο ph. Είναι µία λυσοσωµατική 50

πρωτεΐνη, µοριακού βάρους 33 kda, η οποία παράγεται από τους οστεοκλάστες αλλά και άλλα κύταρα της µονοκυτταρικής σειράς 98. Το ισοένζυµο 5b της TRAP φαίνεται να παρουσιάζει ειδικότητα προς τους οστεοκλάστες 99. Αυτό καθιστά την TRAP 5b δείκτη της οστεοκλαστικής δραστηριότητας. Παλαιότερες αλλά και πρόσφατες µελέτες έχουν προτείνει µοντέλα του τρόπου δράσης της TRAP 5b στη θεµέλια ουσία του οστού 100,101. Αυξηµένα επίπεδα της TRAP 5b έχουν ανιχνευθεί σε καταστάσεις που χαρακτηρίζονται από αυξηµένο οστικό µεταβολισµό όπως η εµµηνόπαυση, η παιδική και εφηβική ηλικία και ασθενείς µε µεταβολικά νοσήµατα των οστών (ν. Paget, υπερπαραθυρεοειδισµός κ.α.). Πλεονεκτήµατα της TRAP 5b ως δείκτη οστικής απορρόφησης είναι ότι δεν παρουσιάζει σηµαντική ηµερήσια διακύµανση ενώ το µόριο της παρουσιάζει σηµαντική σταθερότητα. Η TRAP 5b εκφράζει άµεσα την ενεργότητα των οστεοκλαστών, ως αποτέλεσµα η ίδια της δράσης τους, κι όχι ως προϊόν καταβολισµού του κολλαγόνου 102. Έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζει καλή συσχέτιση µε την απώλεια οστικής µάζας καθώς και αξιόπιστη ελάττωση των επιπέδων της µετά από αντιοστεοπορωτική αγωγή, επιδεικνύοντας αξιόλογη ειδικότητα και ευαισθησία 103. Ο προσδιορισµός των επιπέδων της TRAP 5b γίνεται εύκολα µε ανοσοενζυµικές µεθόδους που χρησιµοποιούν µονοκλωνικά αντισώµατα. Παράγωγα πυριδινίου (πυριδολίνη, δεοξυπυριδολίνη ούρων) Κατά τη διαδικασία σχηµατισµού του κολλαγόνου τύπου Ι, στο στάδιο της δηµιουργίας των ινιδίων κολλαγόνου, οι αλυσίδες τριών µορίων τροποκολλαγόνου συνδέονται µεταξύ τους σχηµατίζοντας ένα δακτύλιο πυριδίνης, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία δεσµών πυριδολίνης. Οι δεσµοί αυτοί χαρακτηρίζονται ως διασταυρούµενοι σταθεροποιητικοί δεσµοί (crosslaps) των αλυσίδων του κολλαγόνου. Οι δεσµοί αυτοί εµφανίζονται µε δύο χηµικές µορφές, της πυριδολίνης (Pyr), για το σχηµατισµό της οποίας συµµετέχουν τρία µόρια υδροξυλυσίνης, και της δεοξυπυριδολίνης (Dpy) για το σχηµατισµό της οποίας συµµετέχουν δύο µόρια υδροξυλυσίνης και ένα µόριο λυσίνης. Η αναλογία πυριδολίνης/δεοξυπυριδολίνης στη θεµέλια ουσία των οστών είναι 2:3. Οι µορφές αυτές αντανακλούν πιθανώς µεταµεταφραστική ετερογένεια στο βαθµό υδροξυλίωσης των υπολειµµάτων της λυσίνης στα σηµεία δηµιουργίας των σταθεροποιητικών δεσµών του κολλαγόνου 104. Οι πυριδολίνες ως σταθεροποιητικοί δεσµοί, συναντώνται στο κολλαγόνο των περισσοτέρων συνδετικών ιστών. Καθώς όµως ο οστίτης ιστός είναι η κύρια θέση εντοπισµού του κολλαγόνου τύπου Ι και χαρακτηρίζεται από σαφώς υψηλότερο ρυθµό µεταβολισµού από τους λοιπούς συνδετικούς ιστούς, είναι λογικό να υποτεθεί ότι οι ανιχνευόµενες στα ούρα πυριδολίνες είναι κυρίως παράγωγα της οστικής αποδόµησης. Αυτό στηρίζεται και από 51

µελέτες που ανέδειξαν οµοιότητα στην αναλογία των δεσµών Pyr/Dpy που ανιχνεύονται στα ούρα µε αυτή που συνανατάται στον οστίτη ιστό, σε αντίθεση µε την αναλογία που αυτοί συναντώνται σε άλλους ιστούς και στους οποίους η Dpy δεν υπερβαίνει το 10% της Pyr 104,105. H τελευταία αυτή διαπίστωση, η οποία επιβεβαιώνεται κι από άλλες µελέτες, καθιερώνει την Dpy ως πιο ειδικό δείκτη του οστικού καταβολισµού έναντι της Pyr 106. Ο προσδιορισµός των πυριδολινών στα ούρα, ιδιαίτερα της Dpy η οποία συναντάται µόνο στο κολλαγόνο τύπου Ι, ως δεικτών οστικής απορρόφησης, πλεονεκτεί έναντι της υδροξυπρονίνης ούρων καθώς µετά την απελευθέρωση τους δεν επαναχρησιµοποιούνται, δεν µεταβολίζονται στο ήπαρ, δεν επηρρεάζονται από διαιτητικές συνήθειες και την εντερική απορρόφηση και αποβάλλονται αναλλοίωτες από τους νεφρούς 107. Tα επίπεδα των πυριδολινών ανιχνεύονται αυξηµένα σε καταστάσεις αυξηµένου οστικού µεταβολισµού όπως στον υπερπαραθυρεοειδισµό, στη νόσο Paget, σε άλλες οστεολυτικές καταστάσεις, στην παιδική και εφηβική ηλικία. Στην οστεοπόρωση είναι τόσο περισσότερα αυξηµένα όσο εγγύτερα βρίσκεται η ασθενής στη έναρξη της εµµηνόπαυσης ενώ η αντιοστεοπορωτική αγωγή τα επαναφέρει σε προεµµηνοπαυσιακές τιµές 108. Για τον προσδιορισµό των πυριδολινών στα ούρα χρησιµοποιείται η υψηλής απόδοσης υγρή χρωµατογραφία (HPLC) µε αξιόπιστα αποτελέσµατα, ενώ έχει αναπτυχθεί και ανοσοενζυµική µέθοδος (ELISA) 109,110. Καρβοξυτελικά και αµινοτελικά τελοπεπτίδια του κολλαγόνου τύπου Ι (CTX, NTX) Tα αµινοτελικά και καρβοξυτελικά τελοπεπτίδια του κολλαγόνου τύπου Ι αποτελούν προϊόντα του καταβολισµού του. Αποτελούνται από µια σειρά οκτώ αµινοξέων που βρίσκονται στα αντίστοιχα καρβοξυτελικά και αµινοτελικά άκρα της αλυσίδας του κολλαγόνου τύπου Ι, κοντά στα σηµείο σύνδεσης µε τις πυριδολίνες αλλά είναι ανεξάρτητα από αυτές. Με την ανάπτυξη ειδικού µονοκλωνικού αντισώµατος αναγνωρίστηκε το αµινοτελικό τελοπεπτίδιο της α2 αλυσίδας του κολλαγόνου τύπου Ι που περιείχε την αλληλουχία QYDGKGVG 111. Αντιστοίχως µε τη χρήση ειδικού πολυκλωνικού αντιορού αναγνωρίστηκε η αλληλουχία του καρβοξυτελικού τελοπεπτιδίου της α1 οµάδος του κολλαγόνου τύπου Ι ως EKAHDGGR 112.Τα τελοπεπτίδια του κολλαγόνου θεωρούνται αξιόπιστοι δείκτες του οστικού καταβολισµού. Έχει βρεθεί ότι εµφανίζουν καλή στατιστική συσχέτιση µε την οστική πυκνότητα, σε διάφορες ηλικιακές οµάδες 113. Μετά από αντιοστεοπορωτική αγωγή εµφανίζουν πτώση 114 ενώ µελέτες έχουν δείξει ότι υπερτερούν άλλων δεικτών στην απεικόνιση της αποτελεσµατικότητας της θεραπείας 115. Σηµαντικές επίσης µελέτες έχουν αναδείξει την αξία τους, ιδιαιτέρως του CTX, ως προγνωστικών δεικτών µελλοντικού καταγµατικού κινδύνου 116,117. Για τον προσδιορισµό των τελοπεπτιδίων πρέπει να λαµβάνεται υπόψη ότι αυτά ακολουθούν κιρκάδιο ρυθµό, µε τις υψηλότερες τιµές νωρίς το πρωΐ και 52

τις χαµηλότερες το απόγευµα, µε σηµαντική διακύµανση. Επίσης καθώς απεκκρίνονται από τους νεφρούς, πρέπει να είναι γνωστή η ποιότητα της νεφρικής λειτουργίας. Η µέτρηση τους γίνεται µε ανοσοενζυµικές µεθόδους 115. 53

Καθεψίνη Κ Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η θεµέλιος ουσία του οστίτη ιστού αποτελείται από ένα δίκτυο κολλαγονικών και µη πρωτεϊνών και τους κρυστάλλους του υδροξυαπατίτη. Από νωρίς είχε αναγνωριστεί ότι η οστική απορρόφηση απαιτεί τόσο την διάλυση των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη, η οποία επιτυγχάνεται µε την επίτευξη όξινου περιβάλλοντος, όσο και την αποδόµηση του οργανικού εναποµείναντος υποστρώµατος, που υποδηλώνει δραστηριότητα πρωτεάσης. Αυτό οδήγησε σε εκτεταµένες έρευνες για την ταυτοποίηση της υπεύθυνης πρωτεάσης. Ένας σηµαντικός αριθµός ερευνών υποδείκνυε την εµπλοκή µιας κυστεϊνικής πρωτεάσης στην οστική απορρόφηση καθώς και το γεγονός ότι αρκετές γνωστές έως τότε καθεψίνες επεδείκνυαν κολλαγονολυτική δραστηριότητα σε όξινες συνθήκες 118. Επιπροσθέτως κλασσικοί αναστολείς των κυστεϊνικών πρωτεασών (λευπεπτίνη, κυστατίνη, κ.α.) εµφανίζονταν να αναστέλλουν in vitro τον οστικό καταβολισµό 119,120,121,122,123,124. Πρόσφατα ένα νέο µέλος της οικογένειας των παπαϊνών που ανήκει στις κυστεϊνικές πρωτεάσες αναγνωρίστηκε και αποµονώθηκε από οστεοκλάστες κουνελιού αρχικά 125 και κατόπιν ανθρώπου 126,127 υποδεικνύοντας έτσι εκλεκτική έκφραση στους οστεοκλάστες. Η νέα αυτή καθεψίνη ονοµάστηκε καθεψίνη Κ. Ακολούθησαν έρευνες που στόχευαν στην αξιολόγηση της κυτταρικής έκφρασης της καθεψίνης Κ σε διάφορους ιστούς και σύγκριση αυτής µε τις άλλες γνωστές καθεψίνες. Χρησιµοποιήθηκε κυρίως η µέθοδος του in situ υβριδισµού και αποδείχθηκε η σε αφθονία έκφραση της καθεψίνης Κ στους οστεοκλάστες σε αντίθεση µε πληθώρα άλλων ιστών που ελέγχθησαν. Συγκεκριµένα, στο σύνολο των εκφραζόµενων γονιδιακών αλληλουχιών στους οστεοκλάστες, το 4% αφορούσε την καθεψίνη Κ, ποσοστό ιδιαίτερα υψηλό σε σύγκριση µε την έκφραση της καθεψίνης Κ σε άλλους ιστούς (πλακούντας: 0,0016%, αµφιβληστροειδής: 0,06%, κόλον: 0,037%, επιδιδυµίς: 0.09%, χοληδόχος κύστη: 0,03%, όρχεις: 0,006%, αµυγδαλές: 0,009%, χονδροσάρκωµα: 0,13%, καρκίνος ωοθηκών: 0,018%, λέµφωµα Β κυττάρων: 0,015%, καρκίνος παγκρέατος: 0,017%, καρκίνος προστάτου: 0,087%) 111. Αντίθετα προς την αφθονία έκφρασης της καθεψίνης Κ στους οστεοκλάστες, οι υπόλοιπες καθεψίνες εκφράζονταν σε ελάχιστο βαθµό, µε συνέπεια το 98% της έκφρασης των κυστεϊνικών πρωτεασών στους οστεοκλάστες να το αποτελεί η καθεψίνη Κ. Επιπροσθέτως ειδικά αντισώµατα δηµιουργήθηκαν για να καταδείξουν την έκφραση και τον κυτταρικό εντοπισµό του πρωτεϊνικού µορίου της καθεψίνης Κ. Η ανάλυση µε Western blot ανέδειξε µόρια των 38 kda και 27 kda αντιστοιχούντα προφανώς στην πρόδροµη (προκαθεψίνη Κ) και την ώριµη µορφή της καθεψίνης Κ. Η ανοσοκαθήλωση µε το ειδικό αντίσωµα SR1 σε 54

κύτταρα οστεοκλαστώµατος έδειξε άφθονη παρουσία µε κοκκώδη διασπορά, συχνά εντοπισµένη στον ένα πόλο του οστεοκλάστη 128. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την καθεψίνη Κ βρίσκεται στο µακρύ σκέλος του χρωµοσώµατος 1 και στη θέση 1q21 129. Τα µέλη της οικογένειας των παπαϊνών τυπικά αντιγράφονται και µεταφράζονται σαν πρόδροµες ανενεργές µορφές. Η πρόδροµη µορφή της καθεψίνης Κ, η προκαθεψίνη Κ, είναι ένα µόριο 38 kda που αποτελείται από 329 υπολείµατα αµινοξέων. Περιλαµβάνει δύο προπεπτίδια που αποτελούνται από 15 και 99 υπολείµατα αµινοξέων αντίστοιχα. Η αφαίρεση των πεπτιδίων αυτών οδηγεί στο σχηµατισµό της ώριµης καταλυτικά ενεργής πρωτεάσης. Η ώριµη καθεψίνη Κ είναι ένα µόριο 27 kda που αποτελείται από 215 υπολείµατα αµινοξέων 130 Συνθήκες χαµηλού ph και παρουσία κυστεΐνης ευοδώνουν την µετατροπή της προκαθεψίνης Κ σε καθεψίνη Κ. Η ενεργή περιοχή του ενζύµου αποτελείται από την καταλυτικά ενεργή τριάδα κυστεΐνη (Cys 139 ), ιστιδίνη(his 276 ) και ασπαραγίνη(asn 296 ) ενώ η µέγιστη ενζυµική ενεργότητα της καθεψίνης Κ εµφανίζεται σε συνθήκες ph~4,5. In vitro µελέτες κατέδειξαν την αποδόµηση του κολλαγόνου τύπου Ι παρουσία της καθεψίνης Κ. Κλινικές µελέτες που ακολούθησαν απέδειξαν τη δράση της καθεψίνης Κ και in vivo 131,132,133. Πρόσφατα δηµοσιευµένες µελέτες συσχετίζουν αυξηµένη οστεοκλαστική δραστηριότητα µε τα επίπεδα της καθεψίνης Κ στον ορό ασθενών µε νόσο του οστικού µεταβολισµού 134,135,136 ενώ άλλες εξίσου πρόσφατες προτείνουν θεραπευτικά σχήµατα στη βάση της αναστολής της δράσης της καθεψίνης Κ 137,138,139. Μόρια που αναπτύχθηκαν σαν αναστολείς της καθεψίνης Κ ανέστειλαν την παραγωγή της από ανθρώπινους οστεοκλάστες και την από αυτούς µεσολαβούµενη οστική απορρόφηση in situ, ενώ η χορήγηση των αναστολέων αυτών σε πιθήκους που είχαν υποστεί ωοθηκεκτοµή είχε σαν συνέπεια την ταχεία µείωση των επιπέδων των αµινο- και καρβοξυ- τελικών τελοπεπτιδίων του κολλαγόνου τύπου Ι στον ορό 137 Σηµαντικός αριθµός πειραµατικών και κλινικών παρατηρήσεων υποδεικνύουν ότι η οστική απορρόφηση καθώς και η αναστολή της συνδέεται µε αλλαγές στον αριθµό και την δραστικότητα των οστεοκλαστών. Τα κυκλοφορούντα στον ορό επίπεδα της καθεψίνης Κ φαίνεται να είναι αναλογικά αντίστοιχα του αριθµού των οστεοκλαστών και εποµένως να έχουν εφαρµογή ως δείκτες του πλήθους και της ενεργότητας των οστεοκλαστών καθώς και του οστικού καταβολισµού συνολικά 140. Η θεραπευτική προσέγγιση της οστεοπόρωσης επιχειρεί να µετατοπίσει την ισορροπία οστικού αναβολισµού και αποδόµησης προς την κατεύθυνση του πρώτου. Η αντιαπορροφητική θεραπεία περιορίζει την οστική απώλεια, παράλληλα όµως εµποδίζει και τον οστικό σχηµατισµό. Πρόσφατες προκαταρκτικές ανακοινώσεις σχετικές µε αναστολείς της δραστικότητας της καθεψίνης Κ υποδεικνύουν ότι η αναστολή της οστικής απορρόφησης µε την 55

χρήση των αναστολέων αυτών συνοδεύεται από αύξηση του οστικού σχηµατισµού 141. Ακόµη νεότερες µελέτες προτείνουν την αναστολή της καθεψίνης Κ ως µια νέα στρατηγική θεραπευτικής προσέγγισης της οστεοπόρωσης εν αναµονή νεότερων κλινικών δεδοµένων 142. Απαιτείται ωστόσο περαιτέρω έρευνα για την αξιολόγηση της καθεψίνης Κ ως αξιόπιστου δείκτη της οστικής απορρόφησης και της κλινικής ανταπόκρισης στην αντιοστεοκλαστική αγωγή καθώς και αξιολογική συσχέτιση της µε τους λοιπούς δείκτες οστικού µεταβολισµού 140. 56

57

58

ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 59

60

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ε ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Υλικό Το υλικό µας το αποτέλεσαν 99 µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες µέσης ηλικίας 57+8 έτη και 20 φυσιολογικές προεµµηνοπαυσιακές γυναίκες µέσης ηλικίας 31+5 έτη οι οποίες χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρες. Οι µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες διαχωρίσθηκαν µε βάση την οστική πυκνότητα όπως αυτή µετρήθηκε µε τη µέθοδο DEXA καθώς και µε βάση τα έτη από την είσοδο στην εµµηνόπαυση. Με βάση την οστική πυκνότητα οι µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες διακρίθηκαν σε υγιείς(t-score >-1 SD, n=30) και παθολογικές (T-score <-1 SD, n=69). H οµάδα των παθολογικών διαχωρίσθηκε περαιτέρω σε οστεοπενικές (T-score <-1 SD και >-2,5, n=46) και οστεοπορωτικές (T-score <-2,5 SD n=23). Με βάση τα έτη από την είσοδο στην εµµηνόπαυση διαχωρίσθηκαν σε τρεις οµάδες ανά πενταετία: 1-5 έτη από την εµµηνόπαυση (n=29), 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση (n=43) και >11 έτη από την εµµηνόπαυση (n=27). Στη συνέχεια έγινε διαχωρισµός των ανά πενταετία από την εµµηνόπαυση γυναικών σε υγιείς και παθολογικές, οστεοπενικές και οστεοπορωτικές, ως ακολούθως: 1-5 έτη από την εµµηνόπαυση υγιείς (n=18), 1-5 έτη από την εµµηνόπαυση παθολογικές (n=11), 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση υγιείς (n=9), 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση παθολογικές (n=34), 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση οστεοπενικές (n=22), 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση οστεοπορωτικές (n=12), >11 έτη από την εµµηνόπαυση υγιείς (n=3), >11 έτη από την εµµηνόπαυση παθολογικές (n=24), >11 έτη από την εµµηνόπαυση οστεοπενικές (n=14) και >11 έτη από την εµµηνόπαυση οστεοπορωτικές (n=10.) 19 από τις µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες είχαν τεθεί σε κάποιας µορφή αντιοστεοπορωτικής αγωγής και αποτέλεσαν ξεχωριστή οµάδα µελέτης ενώ 66 µετεµµηνοπαυσιακές που δεν είχαν δεχθεί οποιασδήποτε µορφής αντιοστεοπορωτική αγωγή αποτέλεσαν επίσης ξεχωριστή οµάδα η οποία στη συνέχεια διαχωρίσθηκε σε τρείς υποοµάδες ανά πενταετία από την εµµηνόπαυση (n=23, n=33 και n=10 αντίστοιχα). Οι 99 µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες προήλθαν από τα εξωτερικά ιατρεία της Γ Μαιευτικής Κλινικής του Ιπποκρατείου ΠΓΝΘ. Κατά τη λήψη του ιστορικού αποκλείσθηκαν από τη συµµετοχή στη µελέτη ατόµων µε γνωστή ηπατική, νεφρική ή ενδοκρινολογική νόσο. Οι 20 φυσιολογικές προεµµηνοπαυσιακές γυναίκες µέσης ηλικίας 35+3 έτη προήλθαν επίσης από τα εξωτερικά ιατρεία της Γ Μαιευτικής Κλινικής του Ιπποκρατείου ΠΓΝΘ και είχαν ελεύθερο ιατρικό ιστορικό. 61

Βιοχηµικές παράµετροι- δείκτες οστικού µεταβολισµού Σε αµφότερες τις 99 µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες, υγιείς και µη, και τις 20 φυσιολογικές προεµµηνοπαυσιακές γυναίκες προσδιορίστηκαν ποσοτικά στον ορό αίµατος τους τα επίπεδα των δεικτών οστικού µεταβολισµού αµινοτελικού πεπτιδίου του προκολλαγόνου τύπου Ι (PINP) και καρβοξυτελικού τελοπεπτιδίου του κολλαγόνου τύπου Ι (CTX) καθώς και της καθεψίνης Κ. Απεικονιστικές παράµετροι Επιπρόσθετα στις 99 µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες έγινε µέτρηση της οστικής πυκνότητας µε τη µέθοδο DEXA (Dual Energy X-ray Absorptiometry). Το αποτέλεσµα της µεθόδου αναφέρθηκε ως Bone Mineral Density (BMD, gr/cm2) και εκφράσθηκε σαν σταθερή απόκλιση T-score. Συλλογή δειγµάτων αίµατος Η αιµοληψία γινόταν τις πρωινές ώρες, πριν τη λήψη πρωινού και µε τους εξεταζόµενους σε καλή γενική κατάσταση. Για την µέτρηση των δεικτών οστικού µεταβολισµού χρησιµοποιήθηκε ορός αίµατος. Για τη λήψη του ορού το αίµα των ασθενών τοποθετούνταν σε ξηρά σωληνάρια χωρίς αντιπηκτικό. Μετά την πήξη φυγοκεντρούνταν στις 3500 στροφές /min για 10 λεπτά. Στη συνέχεια ο ορός διαχωρίζονταν και φυλάσσονταν σε βαθειά ψύξη (-70 οc) έως τον προσδιορισµό των βιοχηµικών δεικτών του οστικού µεταβολισµού. 62

ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΕΙΚΤΩΝ ΟΣΤΙΚΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ Μέθοδος προσδιορισµού της καθεψίνης Κ Ο ποσοτικός προσδιορισµός της καθεψίνης Κ στον ορό αίµατος έγινε µε ανοσοενζυµική µέθοδο ΕLΙSΑ τύπου sandwich µε τη χρήση αντιδραστηρίων της εταιρίας Βiomedica Gruppe (Wien,Austria). α) Αρχή της µεθόδου H µέθοδος χρησιµοποιεί µια στερεά φάση πάνω στην οποία προσκολλάται το αντίσωµα που θα αποσπάσει µε προσρόφηση την προς µέτρηση καθεψίνη Κ. Τη στερεά φάση παριστούν µικροφρεάτια ειδικής πλάκας (microelisa) προεπικαλυµµένα µε τα ειδικά έναντι της καθεψίνης Κ πολυκλωνικά αντισώµατα (precoated Ab). Η περιεχόµενη στον εξεταζόµενο ορό αίµατος καθεψίνη Κ προσροφήθηκε στη στερεά φάση συνδεόµενη µε τα εν λόγω αντισώµατα. Στη συνέχεια ένα δεύτερο ειδικό πολυκλωνικό αντίσωµα συνδέθηκε µε το ελεύθερο µη συνδεδεµένο τµήµα της καθεψίνης Κ (conjugate). Το δεύτερο αυτό αντίσωµα σηµάνθηκε οµοιοπολικά µε ένζυµο (substrate), η µέτρηση της δραστικότητας του οποίου προσδιόρισε τελικά την συγκέντρωση της καθεψίνης Κ. β) Αντιδραστήρια 1) ειδική πλάκα (microelisa) µε προεπικαλυµµένα µικροφρεάτια µε ειδικά έναντι της καθεψίνης Κ πολυκλωνικά αντισώµατα προβάτου έναντι ανθρώπινης καθεψίνης Κ (precoated Ab), 2) διάλυµα πολυκλωνικού αντισώµατος προβάτου έναντι ανθρώπινης καθεψίνης Κ (conjugate), 3) πρότυπα διαλύµατα γνωστών συγκεντρώσεων καθεψίνης Κ για την κατασκευή της καµπύλης αναφοράς (standard), 4) πρότυπο διάλυµα ελέγχου της εξέτασης (control), 5) ρυθµιστικό διάλυµα (assay buffer), 6) διάλυµα πλύσεως (wash buffer), 7) διάλυµα χρωµογόνου υποστρώµατος Tetramethylbenzidine (ΤΜΒ, substrate), 8) διάλυµα αναστολής της ενζυµικής αντίδρασης (stop solution). 63

γ) ιαδικασία της εξέτασης 1. όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγµατα ορού αίµατος µεταφέθηκαν σε θερµοκρασία περιβάλλοντος πριν τη χρήση τους, 2. έγινε ανασύσταση των προτύπων διαλυµάτων γνωστών συγκεντρώσεων καθεψίνης Κ για την κατασκευή της καµπύλης αναφοράς (standard) και του πρότυπου διαλύµατος ελέγχου της εξέτασης (control) µε τη χρήση 1ml ρυθµιστικoύ διαλύµατος (assay buffer), 3. σύµφωνα µε τις οδηγίες δεσµεύτηκε ένα µικροφρεάτιο για µηδενική συγκέντρωση καθεψίνης Κ (τυφλό,blank), 5 ζεύγη για τα πρότυπα διαλύµατα της καµπύλης αναφοράς (standard), 1 ζεύγος για το πρότυπο διάλυµα ελέγχου της εξέτασης (control) και από ένα µικροφρεάτιο για κάθε δείγµα ορού αίµατος. Σε κάθε µικροφρεάτιο, πλην αυτού της µηδενικής συγκέντρωσης, προστέθηκαν 50 µl αντιστοίχου δείγµατος. 4. προστέθηκαν 200 µl διαλύµατος πολυκλωνικού αντισώµατος προβάτου έναντι ανθρώπινης καθεψίνης Κ (conjugate) σε κάθε µικροφρεάτιο πλην του τυφλού και ακολούθησε ήπια ανάδευση. 5. η ειδική πλάκα (microelisa) των µικροφρεατίων καλύφθηκε και ακολούθησε επώαση 24 ωρών σε θερµοκρασία περιβάλλοντος (18-26οC) στο σκοτάδι. 6. έγινε αναρρόφηση του περιεχοµένου των µικροφρεατίων, προσθήκη 300 µl διάλυµα πλύσεως (wash buffer) σε κάθε µικροφρεάτιο και κατόπιν πάλι αναρρόφηση. Η διαδικασία επαναλήφθηκε 5 φορές σύµφωνα µε τις οδηγίες. 7. προστέθηκαν 200 µl διαλύµατος χρωµογόνου υποστρώµατος Tetramethylbenzidine (substrate) σε κάθε µικροφρεάτιο και ακολούθησε επώαση 30 λεπτών σε θερµοκρασία περιβάλλοντος (18-26οC) στο σκοτάδι. 8. προστέθηκαν 50 µl διαλύµατος αναστολής της ενζυµικής αντίδρασης (stop solution) σε κάθε µικροφρεάτιο. 9. Μετρήθηκε άµεσα η απορροφητικότητα των µικροφρεατίων στα 450 nm. 10. Κατασκευάστηκε η καµπύλη αναφοράς και υπολογίστηκε η συγκέντρωση της καθεψίνης Κ κάθε δείγµατος. δ) Χαρακτηριστικά της µεθόδου 1) ευαισθησία (sensitivity) Η ευαισθησία της µεθόδου ήταν καλή 1,1 pmol/l. 2) επαναληψιµότητα (precision) Η επαναληψιµότητα της µεθόδου ήταν πολύ καλή. Συγκεκριµένα o συντελεστής µεταβλητότητας CV ήταν 4,0%. 3) Ειδικότητα της µεθόδου (specificity) Τα πολυκλωνικά αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν στη µέθοδο ήταν ειδικά έναντι των αλληλουχιών αµινοξέων 1-20 και 196-210 της ανθρώπινης καθεψίνης Κ. 64

Μέθοδος προσδιορισµού αµινοτελικού πεπτιδίου του προκολλαγόνου τύπου Ι (PINP) α) Αρχή της µεθόδου Τα επίπεδα του PΙNP στον ορό του αίµατος µετρήθηκαν µε ανοσοενζυµική µέθοδο ηλεκτροχηµειοφωταύγειας (ECLIA) τύπου sandwich µε τη χρήση δύο µονοκλωνικών αντισωµάτων. Τα δείγµατα ορού αίµατος των εξεταζοµένων (20 µl) επωάστηκαν µε επισηµασµένα µε βιοτίνη ειδικά για PINP µονοκλωνικά αντισώµατα. Μετά την προσθήκη επισηµασµένων µε στρεπταβιδίνη µικροσωµατιδίων και ενός ειδικού µονοκλωνικού για το PΙNP αντισώµατος επισηµασµένου µε σύµπλοκο ρουθηνίου, σχηµατίστηκε ένα σύµπλοκο τύπου sandwich το οποίο δεσµεύτηκε στη στερεά φάση (µικροσωµατίδια) λόγω της αλληλεπίδρασης µεταξύ βιοτίνης και στρεπταβιδίνης. Το µίγµα της αντίδρασης στη συνέχεια αναρροφήθηκε εντός του θαλάµου µέτρησης όπου τα µικροσωµατίδια δεσµεύτηκαν στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, ενώ τα αδέσµευτα σωµατίδια εκπλύθηκαν µε τη χρήση του διαλύµατος ProCell. Η τάση που εφαρµόστηκε στο ηλεκτρόδιο προκάλεσε µεταφορά ηλεκτρονίων και εκποµπή χηµειοφωταύγειας από το σύµπλοκο ρουθηνίου, το σήµα του οποίου προσδιορίστηκε φωτοµετρικά. Όλες οι παραπάνω διαδικασίες καθώς και οι δοκιµές βαθµονόµησης (calibration) έγιναν αυτόµατα στον αναλυτή Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Η ανάλυση διήρκησε 18 λεπτά. β) Χαρακτηριστικά της µεθόδου 1) ευαισθησία (sensitivity) Η ευαισθησία της µεθόδου ήταν πολύ καλή < 5 ng/ml. 2) επαναληψιµότητα (precision) Η επαναληψιµότητα της µεθόδου ήταν πολύ καλή. Συγκεκριµένα o συντελεστής µεταβλητότητας CV ήταν 3,7% σε δείγµατα ορού ασθενών και 2,9% σε πρότυπους ορούς ελέγχου (controls). 3) Ειδικότητα της µεθόδου (specificity) Η ειδικότητα της µεθόδου είναι πολύ υψηλή. ιασταυρούµενες αντιδράσεις παρατηρήθηκαν σε ποσοστό <1% µε βιολογικούς παράγοντες όπως CTX, οστεοκαλσίνη, παραθορµόνη και 25-ΟΗ βιταµίνη D. 65

Μέθοδος προσδιορισµού καρβοξυτελικού τελοπεπτιδίου του κολλαγόνου τύπου Ι (CTX) α) Αρχή της µεθόδου Τα καρβοξυτελικά τελοπεπτίδια του κολλαγόνου τύπου Ι περιέχουν την α- ισοµερή µορφή του ασπαρτικού, το οποίο συνεπεία της γήρανσης του οστού µετατρέπεται σε β-ισοµερές. είγµα ορού αίµατος ασθενούς, βιοτινυλιωµένο µονοκλωνικό β-cτχ ειδικό αντίσωµα, και µονοκλωνικά β-cτχ ειδικά αντισώµατα επισηµασµένα µε ρουθήνιο αντέδρασαν για να σχηµατίσουν ένα σύµπλοκο. Επικαλυµµένα µε στρεπταβιδίνη µικροσωµατίδια λειτούργησαν ως στερεά φάση στην οποία το σύµπλοκο προσδέθηκε σε αυτά. Τάση εφαρµόστηκε στο ηλεκτρόδιο, επάγοντας εκποµπή χηµειοφωταύγειας από το ρουθήνιο, η οποία στη συνέχεια µετρήθηκε έναντι µιας καµπύλης βαθµονόµησης για να προσδιοριστεί το ποσό του β-cτχ στο δείγµα του ασθενούς. Αυτή η δοκιµασία είναι ειδική για σταυροειδείς δεσµούς β-ισοµερισµένων θραυσµάτων κολλαγόνου τύπου Ι. Την ειδικότητα της εξέτασης εγγυάται η χρήση των δύο µονοκλωνικών αντισωµάτων, καθένα από τα οποία αναγνωρίζει τη γραµµική αλληλουχία των β-8αα οκταπεπτιδίων (EKAHD-β- GGR). Η δοκιµασία εποµένως υπολογίζει ποσοτικά, όλα τα θραύσµατα αποδόµησης του κολλαγόνου τύπου Ι που περιέχουν το β-ισοµερισµένο 8ΑΑ οκταπεπτίδιο δύο φορές. Οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν µε τη χρήση του αναλυτή Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). β) Χαρακτηριστικά της µεθόδου 1) ευαισθησία (sensitivity) Η αναλυτική ευαισθησία της µεθόδου ήταν πολύ καλή 0,01 ng/ml. 2) επαναληψιµότητα (precision) Η επαναληψιµότητα της µεθόδου ήταν πολύ καλή. Συγκεκριµένα o συντελεστής µεταβλητότητας CV ήταν 4,3% σε δείγµατα ορού ασθενών και 2,5% σε πρότυπους ορούς ελέγχου (controls). 3) Ειδικότητα της µεθόδου (specificity) Τα µονοκλωνικά αντισώµατα αναγνωρίζουν τα θραύσµατα κολλαγόνου που περιέχουν τη γραµµική αλληλουχία των β-8αα οκταπεπτιδίων (EKAHD-β- GGR). Ως εκ τούτου η ειδικότητα της µεθόδου είναι πολύ υψηλή. εν παρουσιάστηκαν διασταυρούµενες αντιδράσεις µε βιολογικούς παράγοντες 66

όπως οστεοκαλσίνη, παραθορµόνη ή οστικής προέλευσης αλκαλική φωσφατάση. 67

68

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΤ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων των βιοχηµικών δεικτών οστικού µεταβολισµού καθεψίνης Κ, αµινοτελικού πεπτιδίου του προκολλαγόνου τύπου Ι (PINP) και καρβοξυτελικού τελοπεπτιδίου του κολλαγόνου τύπου Ι (CTX) καθώς και η οστική πυκνότητα όπως αυτή µετρήθηκε µε τη µέθοδο DEXA αναγράφονται στους πίνακες 1-12 και παρουσιάζονται στα γραφήµατα 1-27. Στους πίνακες αναγράφονται επίσης η ηλικία και τα έτη στην εµµηνόπαυση των εξεταζοµένων. Όπως προκύπτει από τους παραπάνω πίνακες οι τιµές των παραµέτρων της µελέτης µας στις διάφορες οµάδες εξεταζοµένων ήταν οι εξής: Α. Στις φυσιολογικές προεµµηνοπαυσιακές γυναίκες τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 1). 1. της καθεψίνης Κ 3,469 + 1,403 pmol/l ορού 2. του CTX 0,273 + 0,112 pg/ml ορού 3. του PINP 30,13 + 8,68 pg/ml ορού Β. Στις 99 µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 4,1 + 3,897 pmol/l ορού 2. του CTX 0,39 + 0,101 pg/ml ορού 3. του PINP 38,32 + 9.97 pg/ml ορού Γ. Στις 30 υγιείς µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 4,757 + 2,541 pmol/l ορού 2. του CTX 0,354 + 0,098 pg/ml ορού 3. του PINP 36,77 + 10,52 pg/ml ορού 69

. Στις 69 παθολογικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 4,93 + 4,37 pmol/l ορού 2. του CTX 0,366 + 0,102 pg/ml ορού 3. του PINP 37,74 + 9,789 pg/ml ορού Ε. Στις 46 οστεοπενικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 4,79 + 4,954 pmol/l ορού 2. του CTX 0,358 + 0,108 pg/ml ορού 3. του PINP 37,82 + 9,54 pg/ml ορού ΣΤ. Στις 23 οστεοπορωτικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 5,21 + 2,96pmol/l ορού 2. του CTX 0,382 + 0,089 pg/ml ορού 3. του PINP 37,58 + 10,47 pg/ml ορού Ζ. Στις 29 µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες 1-5 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 4,676 + 4,146 pmol/l ορού 2. του CTX 0,37 + 0,097 pg/ml ορού 3. του PINP 33,6 + 9,897 pg/ml ορού Η. Στις 43 µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 4,1 + 2,216 pmol/l ορού 2. του CTX 0,4 + 0,091 pg/ml ορού 3. του PINP 42,77 + 8,507 pg/ml ορού 70

Θ. Στις 27 µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες >11 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 3,485 + 5,480 pmol/l ορού 2. του CTX 0,38 + 0,115 pg/ml ορού 3. του PINP 30,97 + 9,06 pg/ml ορού Ι. Στις 18 υγιείς µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες 1-5 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 2). 1. της καθεψίνης Κ 4,545 + 2,312 pmol/l ορού 2. του CTX 0,39 + 0,059 pg/ml ορού 3. του PINP 32,775 + 6,254 pg/ml ορού Κ. Στις 11 παθολογικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες 1-5 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 3). 1. της καθεψίνης Κ 5,3861 + 6,01 pmol/l ορού 2. του CTX 0,23 + 0,093 pg/ml ορού 3. του PINP 38,95 + 12,92 pg/ml ορού Λ. Στις 9 υγιείς µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 4). 1. της καθεψίνης Κ 5,203 + 1,3941 pmol/l ορού 2. του CTX 0,425 + 0,104 pg/ml ορού 3. του PINP 49,45 + 9,61 pg/ml ορού Μ. Στις 34 παθολογικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 3,617 + 2,388 pmol/l ορού 2. του CTX 0,399 + 0,089 pg/ml ορού 71

3. του PINP 41,7 + 7,59 pg/ml ορού Ν. Στις 22 οστεοπενικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 5). 1. της καθεψίνης Κ 3,2 + 2,045 pmol/l ορού 2. του CTX 0,394 + 0,089 pg/ml ορού 3. του PINP 38,81 + 7,110 pg/ml ορού Ξ. Στις 12 οστεοπορωτικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες 6-10 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 6). 1. της καθεψίνης Κ 4,287 + 2,682 pmol/l ορού 2. του CTX 0,425 + 0,091 pg/ml ορού 3. του PINP 42,79 + 6,965 pg/ml ορού Ο. Στις 3 υγιείς µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες >11 έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 7). 1. της καθεψίνης Κ 1,1 + 6,351 pmol/l ορού 2. του CTX 0,162 + 0,07 pg/ml ορού 3. του PINP 27,1 + 7,23 pg/ml ορού Π. Στις 24 παθολογικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες >11έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος. 1. της καθεψίνης Κ 3,56 + 5,517pmol/l ορού 2. του CTX 0,4025 + 0,088 pg/ml ορού 3. του PINP 32,045 + 9,21 pg/ml ορού 72

Ρ. Στις 14 οστεοπενικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες >11έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 8). 1. της καθεψίνης Κ 3,56 + 6,757 pmol/l ορού 2. του CTX 0,419 + 0,097pg/ml ορού 3. του PINP 35,64 + 9,506pg/ml ορού Σ. Στις 10 οστεοπορωτικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες >11έτη από την εµµηνόπαυση τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 9). 1. της καθεψίνης Κ 3,408 + 3,429 pmol/l ορού 2. του CTX 0,383 + 0,075 pg/ml ορού 3. του PINP 28,085 + 7,98 pg/ml ορού Τ. Στις 19 µετεµµηνοπαυσιακές οστεοπορωτικές που είχαν τεθεί σε αντιοστεοπορωτική αγωγή τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 10). 1. της καθεψίνης Κ 3,4851 + 3,050 pmol/l ορού 2. του CTX 0, 409 + 0,115 pg/ml ορού 3. του PINP 37,87 + 11,32 pg/ml ορο Υ. Στις 66 µετεµµηνοπαυσιακές οστεοπορωτικές που δεν είχαν τεθεί σε αντιοστεοπορωτική αγωγή τα επίπεδα των δεικτών στον ορό αίµατος (πίνακας 11). 1. της καθεψίνης Κ 4,521 + 4,359 pmol/l ορού 2. του CTX 0,38 + 0,098 pg/ml ορού 3. του PINP 37,1 + 10,312 pg/ml ορού 73

ΠΙΝΑΚΑΣ 1 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε υγιείς προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 31+4,87 ετών (μάρτυρες) ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Α.Μ. 33 2,47 0,147 15,8 2 Λ.Η 34 6 0,415 30,13 3 Γ.Ε. 31 6,09 0,435 30,21 4 Σ.Ρ. 31 2,76 0,117 44,4 5 Ρ.Γ. 29 1,33 0,133 42,8 6 Κ.Ι. 27 3,58 0,419 31,62 7 Β.Ξ. 27 2,34 0,403 28,61 8 Η.Λ. 29 1,51 0,149 17,45 9 Α.Τ. 32 4,08 0,155 19,01 10 Ο.Π. 32 3,79 0,387 41,24 11 Β.Γ. 38 5,24 0,371 33,21 12 Ε.Γ. 40 1,92 0,171 27,03 13 Δ.Γ. 40 4,53 0,187 25,41 14 Ν.Λ. 31 1,64 0,355 34,87 15 Ζ.Μ. 30 4,62 0,203 39,63 16 Θ.Η. 30 4,38 0,339 20,61 17 Α.Κ. 30 3,37 0,219 22,21 18 Μ.Ο. 32 3,09 0,307 38,17 19 Α.Ω. 30 3,79 0,323 36,42 20 Α.Ν. 31 2,91 0,226 23,87 31 + 4,87 3,469 + 1,403 0,273 + 0,112 30,13 + 8,68 74

ΠΙΝΑΚΑΣ 2 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε υγιείς μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 51+3,84 ετών, 1-5 έτη από ΤΕΡ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Φ.Η. 55 2-0,8 10,6769 0,398 39,46 2 Α.Τ. 47 1-0,6 4,812 0,38 32,8 3 Ρ.Ξ. 52 1-0,4 4,5217 0,376 32,72 4 Π.Τ. 49 1 0,3 1,1 0,28 23,76 5 Ι.Ν. 54 2-0,95 3,6354 0,358 26,06 6 Δ.Ε. 43 1 0,1 7,8851 0,476 41,76 7 Ζ.Λ. 54 2-0,7 6,19 0,41 39,4 8 Ε.Φ. 46 1-0,7 4,712 0,4 33 9 Μ.Δ. 53 1-0,5 4,57 0,38 32,75 10 Α.Γ. 50 1 0,2 1,51 0,29 24,7 11 Χ.Ν. 53 2-0,85 3,8 0,37 27,16 12 Μ.Κ. 44 1 0,1 6,51 0,48 40,36 13 Ε.Κ. 56 2-0,75 4,6769 0,39 38,95 14 Χ.Π. 48 1-0,6 4,45 0,4 33,6 15 Ε.Κ. 51 1-0,45 4,5217 0,39 32,52 16 Α.Λ. 50 1 0,3 1,21 0,27 24,46 17 Β.Γ. 53 2-0,9 3,77 0,395 25,9 18 Μ.Π. 45 1 0,1 5,81 0,47 40,5 51+ 3,84 4,545 + 2,312 0,39 + 0,059 32,775 + 6,254 75

ΠΙΝΑΚΑΣ 3 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε οστεοπενικέςπαθολογικές μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 54,5+4,03 ετών, 1-5 έτη από ΤΕΡ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Ε.Θ 55 4-2,5 5,3861 0,31 43,3 2 Χ.Τ. 54 3-1,3 1,1 0,21 37,6 3 Ρ.Λ 59 5-2 4,9564 0,29 41,95 4 Θ.Α. 57 5-2,1 1,1 0,17 27,85 5 Ο.Θ. 53 2-1,1 21,4737 0,35 53,05 6 Μ.Φ. 53 5-2,3 2,875 0,26 40,45 7 Χ.Ε. 45 1-1,3 1,1 0,23 38,95 8 Ζ.Γ. 53 3-1,71 8,9616 0,442 70,99 9 Α.Σ. 56 4-1,47 11,1974 0,098 28,04 10 Σ.Β. 59 5-3,03 7,6131 0,201 38,32 11 Φ.Δ. 55 3-1,7 8,56 0,214 24,91 54,5+ 4,03 5,3861 + 6,01 0,23 + 0,093 38,95 + 12,92 ΠΙΝΑΚΑΣ 4 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε υγιείς μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 52+6,23 ετών, 6-10 έτη από ΤΕΡ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Ξ.Ο. 52 6-0,4 3,1819 0,216 36,03 2 Γ.Θ. 45 9 0,5 6,7893 0,436 58,03 3 Φ.Τ. 60 10-0,26 5,5284 0,425 49,45 4 Δ.Ρ. 52 6-0,4 3,13 0,223 36,43 5 Σ.Ε. 45 9 0,5 6,124 0,429 58,13 6 Α.Α. 60 10-0,27 5,203 0,431 49,65 7 Ζ.Σ. 52 6-0,4 3,152 0,226 36,53 8 Χ.Γ. 45 9 0,5 5,8 0,437 59,03 9 Β.Π. 60 10-0,29 5,14 0,419 48,85 52 + 6,23 5,203 + 1,3941 0,425 + 0,104 49,45 + 9,61 76

ΠΙΝΑΚΑΣ 5 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε οστεοπενικές μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 60+3,689 ετών, 6-10 έτη από ΤΕΡ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Π.Ρ. 60 10-1,7 1,1 0,351 24,52 2 Λ.Φ. 62 10-1,2 5,2434 0,447 46,52 3 Μ.Ω. 61 9-1,1 6,3 0,399 34,52 4 Ι.Β. 64 8-1,6 1,1 0,379 30,52 5 Ξ.Ν. 61 7-1,2 2,4065 0,419 40,52 6 Ν.Μ. 56 9-2 2,2477 0,399 36,52 7 Β.Κ. 55 8-2,1 1,1 0,389 32,52 8 Η.Π. 62 10-1,8 3,4851 0,409 38,52 9 Η.Θ. 60 8-1 4,9564 0,399 43,37 10 Μ.Ι. 55 7-1,85 1,1 0,281 48,26 11 Η.Λ. 52 6-1,66 7,4766 0,072 44,61 12 Β.Χ. 60 10-1,7 2,5 0,37 24,6 13 Γ.Σ. 62 10-1,2 5,25 0,46 46,7 14 Τ.Ρ. 61 9-1,1 6,43 0,37 34,7 15 Ρ.Η. 64 8-1,6 2,8 0,39 31,2 16 Φ.Γ. 61 7-1,2 2,45 0,42 39,7 17 Χ.Ο. 56 9-2 2,87 0,41 37,1 18 Μ.Σ. 55 8-2,1 3,1 0,379 32,8 19 Α.Ψ. 62 10-1,8 3,75 0,423 39,1 20 Α.Σ. 60 8-1 5,1 0,4 43,54 21 Ζ.Φ. 55 7-1,85 3,3 0,292 48,15 22 Ε.Γ. 52 6-1,69 7,6 0,182 44,84 60+ 3,689 3,2 + 2,045 0,394 + 0,089 38,81 + 7,110 77

ΠΙΝΑΚΑΣ 6 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε οστεοπορωτικές μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 57+4,66 ετών, 6-10 έτη από ΤΕΡ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Χ.Η. 60 10-3,6 10,4155 0,554 66,55 2 Δ.Κ. 61 7-3,1 4,3757 0,246 43,63 3 Σ.Λ 57 10-2,8 8,1 0,4 41,65 4 ΑΟ. 50 8-4,01 2,5638 0,433 42,79 5 Ζ.Π. 61 8-3,1 4,1 0,267 43,67 6 Χ.Υ. 57 10-2,7 8,31 0,43 41,75 7 Μ.Τ 50 8-4,01 2,59 0,45 42,81 8 Ν.Φ. 61 9-3,1 4,2 0,264 43,67 9 Κ.Ε. 57 10-2,7 7,1 0,42 41,35 10 Ι.Ρ. 50 8-4,01 2,8 0,44 42,79 11 Ρ.Δ. 57 9-2,7 6,9 0,41 41,65 12 Ε.Κ. 50 8-4,01 2,9 0,437 42,77 57+ 4,66 4,287 + 2,682 0,425 + 0,091 42,79 + 6,965 ΠΙΝΑΚΑΣ 7 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε υγιείς μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 70+6,50 ετών, >10 έτη από ΤΕΡ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Μ.Λ. 63 11-0,7 1,1 0,162 27,1 2 Κ.Π. 76 21 0,8 12,1008 0,232 34,33 3 Π.Γ. 70 22-0,6 1,1 0,092 19,87 70+ 6,50 1,1 + 6,351 0,162 + 0,07 27,1 + 7,23 78

ΠΙΝΑΚΑΣ 8 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε οστεοπενικές μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 64,5+8,939 ετών, >10 έτη από ΤΕΡ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Δ.Ε. 52 14-1,5 1,1 0,348 33,12 2 Γ.Ρ. 82 42-1,5 3,6354 0,348 37,87 3 Β.Φ. 59 18-1,5 27,5747 0,359 48,52 4 Χ.Δ. 53 15-2 2,5638 0,48 23,76 5 Ζ.Σ. 66 16-1,9 3,4851 0,491 39,37 6 Α.Χ. 59 16-1,5 1,7622 0,419 21,33 7 Σ.Ψ. 64 14-2,4 2,5638 0,485 26,91 8 Ε.Β. 64 14-1,3 1,1 0,234 23,41 9 Τ.Ν. 68 20-2,4 4,0817 0,604 40,96 10 Θ.Μ. 66 19-2,2 5,7 0,344 33,41 11 Κ.Η. 65 12-2,1 1,1 0,329 25,82 12 Μ.Ξ. 81 29-2 5,1001 0,494 45,41 13 Γ.Κ. 74 15-2,2 4,0817 0,419 42,61 14 Γ.Τ. 61 13-1,5 8,1559 0,509 47,63 64,5+ 8,939 3,56 + 6,757 0,419 + 0,097 35,64 + 9,506pg ΠΙΝΑΚΑΣ 9 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε οστεοπορωτικές μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 67+7,36 ετών, >10 έτη από ΤΕΡ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Κ.Ρ. 76 26-4 9,4936 0,446 34,75 2 Μ.Φ. 55 14-3 1,5967 0,298 22,6 3 Ν.Ω. 81 25-3,1 9,7581 0,468 26,8 4 Β.Κ. 64 16-4,2 3,6354 0,38 18,55 5 Χ.Η. 73 20-2,8 3,1819 0,34 26,5 6 Δ.Ο. 66 13-3,2 7,4766 0,386 34,75 7 Σ.Μ. 66 33-3,1 1,1 0,291 21,11 8 Α.Ν. 62 18-2,9 1,7622 0,298 29,37 9 Ζ.Ν. 68 16-2,6 7,7 0,468 45,73 10 Δ.Σ. 69 15-2,8 2,2477 0,475 30,97 67+ 7,36 3,408 + 3,429 0,383 + 0,075 28,085 + 7,98 79

ΠΙΝΑΚΑΣ 10 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 61+10,85 ετών, υπό αγωγή ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Π.Ρ. 52 14-1,5 1,1 0,348 33,12 2 Κ.Ρ. 76 26-4 9,4936 0,446 34,75 3 Μ.Φ. 55 14-3 1,5967 0,298 22,6 4 Γ.Ρ. 82 42-1,5 3,6354 0,348 37,87 5 Χ.Δ. 53 15-2 2,5638 0,48 23,76 6 Μ.Φ. 53 5-2,3 2,875 0,26 40,45 7 Κ.Π. 76 21 0,8 12,1008 0,232 34,33 8 Π.Γ. 70 22-0,6 1,1 0,092 19,87 9 Μ.Σ. 55 8-2,1 1,1 0,389 32,52 10 Ζ.Σ. 66 16-1,9 3,4851 0,491 39,37 11 Η.Π. 62 10-1,8 3,4851 0,409 38,52 12 Σ.Ε. 45 9 0,5 6,7893 0,436 58,03 13 Τ.Ν. 68 20-2,4 4,0817 0,604 40,96 14 Α.Ν. 62 18-2,9 1,7622 0,298 29,37 15 Γ.Τ. 61 13-1,5 8,1559 0,509 47,63 16 Σ.Ε. 45 9 0,5 6,124 0,429 58,13 17 Γ.Χ. 45 9 0,5 5,8 0,437 59,03 18 Β.Κ. 55 8-2,1 3,1 0,379 32,8 19 Α.Ψ. 62 10-1,8 3,75 0,423 39,1 61+ 10,85 3,4851 + 3,050 0, 409 + 0,115 37,87 + 11,32 80

ΠΙΝΑΚΑΣ 11 Επιμέρους τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μέσης ηλικίας 56+5,99 ετών, χωρίς αγωγή ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΗΛΙΚΙΑ ΤΕΡ T-SCORE CATH K pmol/l CTX pg/ml PINP pg/ml 1 Β.Χ. 60 10-1,7 1,1 0,351 24,52 2 Λ.Φ. 62 10-1,2 5,2434 0,447 46,52 3 Ε.Θ. 55 4-2,5 5,3861 0,31 43,3 4 Ξ.Ο. 52 6-0,4 3,1819 0,216 36,03 5 Μ.Ω. 61 9-1,1 6,3 0,399 34,52 6 Ι.Β. 64 8-1,6 1,1 0,379 30,52 7 Ξ.Ν. 61 7-1,2 2,4065 0,419 40,52 8 Β.Κ. 64 16-4,2 3,6354 0,38 18,55 9 Α.Τ. 47 1-0,6 4,812 0,38 32,8 10 Ρ.Ξ. 52 1-0,4 4,5217 0,376 32,72 11 Π.Τ. 49 1 0,3 1,1 0,28 23,76 12 Μ.Λ. 63 11-0,7 1,1 0,162 27,1 13 Χ.Η. 60 10-3,6 10,4155 0,554 66,55 14 Β.Φ. 59 18-1,5 27,5747 0,359 48,52 15 Θ.Α. 57 5-2,1 1,1 0,17 27,85 16 Ι.Ν. 54 2-0,95 3,6354 0,358 26,06 17 Ο.Θ. 53 2-1,1 21,4737 0,35 53,05 18 Ν.Μ. 56 9-2 2,2477 0,399 36,52 19 Δ.Ε. 43 0 0,1 7,8851 0,476 41,76 20 Α.Χ. 59 16-1,5 1,7622 0,419 21,33 21 Χ.Ε. 45 1-1,3 1,1 0,23 38,95 22 Ε.Β. 64 14-1,3 1,1 0,234 23,41 23 Θ.Μ. 66 19-2,2 5,7 0,344 33,41 24 Σ.Μ. 66 33-3,1 1,1 0,291 21,11 25 Κ.Η. 65 12-2,1 1,1 0,329 25,82 26 Ζ.Ν. 68 16-2,6 7,7 0,468 45,73 27 Η.Θ. 60 8-1 4,9564 0,399 43,37 28 Σ.Λ. 57 10-2,7 8,1 0,4 41,65 29 Μ.Ι. 55 7-1,85 1,1 0,281 48,26 30 Ζ.Γ. 53 3-1,71 8,9616 0,442 70,99 31 Μ.Τ. 50 8-4,01 2,5638 0,433 42,79 32 Α.Α. 60 10-0,26 5,5284 0,425 49,45 33 Α.Σ. 56 4-1,47 11,1974 0,098 28,04 34 Σ.Β. 59 5-3,03 7,6131 0,201 38,32 35 Η.Λ. 52 6-1,66 7,4766 0,072 44,61 36 Φ.Δ. 55 3-1,7 8,56 0,214 24,91 37 Ε.Φ. 46 1-0,7 4,712 0,4 33 38 Μ.Δ. 53 1-0,5 4,57 0,38 32,75 81

39 Α.Γ. 50 1 0,2 1,51 0,29 24,7 40 Χ.Ν. 53 2-0,85 3,8 0,37 27,16 41 Μ.Κ. 44 1 0,1 6,51 0,48 40,36 42 Χ.Π. 48 1-0,6 4,45 0,4 33,6 43 Ε.Κ. 51 1-0,45 4,5217 0,39 32,52 44 Α.Λ. 50 1 0,3 1,21 0,27 24,46 45 Β.Γ. 53 2-0,9 3,77 0,395 25,9 46 Μ.Π. 45 1 0,1 5,81 0,47 40,5 47 Ξ.Ο. 52 6-0,4 3,13 0,223 36,43 48 Α.Α. 60 10-0,27 5,203 0,431 49,65 49 Ζ.Σ. 52 6-0,4 3,152 0,226 36,53 50 Β.Π 60 10-0,29 5,14 0,419 48,85 51 Σ.Λ. 57 10-2,8 8,31 0,43 41,75 52 Ι.Ρ. 50 8-4,01 2,59 0,45 42,81 53 Κ.Ε. 57 10-2,7 7,1 0,42 41,35 54 Ε.Κ. 50 8-4,01 2,8 0,44 42,79 55 Ρ.Δ. 57 9-2,7 6,9 0,41 41,65 56 Μ.Τ. 50 8-4,01 2,9 0,437 42,77 57 Π.Ρ. 60 10-1,7 2,5 0,37 24,6 58 Λ.Φ. 62 10-1,2 5,25 0,46 46,7 59 Τ.Ρ. 61 9-1,1 6,43 0,37 34,7 60 Ρ.Η. 64 8-1,6 2,8 0,39 31,2 61 Φ.Γ. 61 7-1,2 2,45 0,42 39,7 62 Χ.Ο. 56 9-2 2,87 0,41 37,1 63 Α.Σ 60 8-1 5,1 0,4 43,54 64 Ζ.Φ. 55 7-1,85 3,3 0,292 48,15 65 Ε.Γ. 52 6-1,69 7,6 0,182 44,84 56+ 5,99 4,521 + 4,359 0,38 + 0,098 37,1 + 10,312 82

ΠΙΝΑΚΑΣ 12 Συγκεντρωτικός πίνακας των μέσων τιμών τιμές της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP στις επιμέρους ομάδες των εξετασθέντων Cathepsin K CTX PINP ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ n=99 4,1 pmol/l + 3,897 0,39 pg/ml + 0,101 38,32 pg/ml + 9.97 ΜΑΡΤΥΡΕΣ n=20 3,469 pmol/l + 1,403 0,273 pg/ml + 0,112 30,13 pg/ml + 8,68 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ ΥΓΙΕΙΣ n=30 4,757 pmol/l + 2,541 0,354 pg/ml + 0,098 36,77 pg/ml + 10,52 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ n=69 4,931 pmol/l + 4,37 0,366 pg/ml + 0,102 37,47 pg/ml + 9,789 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 4,79 pmol/l + 4,954 0,358 pg/ml + 0,108 37,82 pg/ml + 9,54 ΟΣΤΕΟΠΕΝΙΚΕΣ n=46 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 5,21 pmol/l + 2,96 0,382 pg/ml 1 + 0,089 37,58 pg/ml + 10,47 ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΕΣ n=23 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 1-5 ΕΤΗ n=29 4,676 pmol/l + 4,146 0,3 pg/ml 7 + 0,097 33,6 pg/ml + 9,897 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 6-10 ΕΤΗ n=43 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ >11 ΕΤΗ n=27 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 1-5 ΕΤΗ ΥΓΙΕΙΣ n=18 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 1-5 ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ n=11 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 6-10 ΕΤΗ ΥΓΙΕΙΣ n=9 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 6-10 ΕΤΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ n=34 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 6-10 ΕΤΗ ΟΣΤΕΟΠΕΝΙΚΕΣ n=22 4,1 pmol/l + 2,216 0,4 pg/ml + 0,091 42,77 pg/ml + 8,507 3,485 pmol/l + 5,480 0,38 pg/ml + 0,115 30,97 pg/ml + 9,06 4,545 pmol/l + 2,312 0,39 pg/ml + 0,059 32,775 pg/ml + 6,254 5,3861 pmol/l + 6,01 0,23 pg/ml + 0,093 38,95 pg/ml + 12,92 5,203 pmol/l + 1,394 0,425 pg/ml + 0,104 49,45 pg/ml + 9,61 3,617 pmol/l + 2,388 0,399 pg/ml + 0,089 41,7 pg/ml + 7,59 3,2 pmol/l + 2,045 0,394 pg/ml + 0,089 38,81 pg/ml + 7,110 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 6-10 ΕΤΗ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΕΣ 4,287 pmol/l + 2,682 0,425 pg/ml + 0,091 42,79 pg/ml + 6,965 n=12 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 1,1 pmol/l + 6,351 0,162 pg/ml + 0,07 27,1 pg/ml + 7,23 >11 ΕΤΗ ΥΓΙΕΙΣ n=3 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 3,56 pmol/l + 5,517 0,4025 pg/ml + 0,088 32,045 pg/ml + 9,21 >11 ΕΤΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ n=24 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 3,56 pmol/l + 6,757 0,419 pg/ml + 0,097 35,64 pg/ml + 9,506 >11 ΕΤΗ ΟΣΤΕΟΠΕΝΙΚΕΣ n=14 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 3,408 pmol/l + 3,429 0,383 pg/ml + 0,075 28,085 pg/ml + 7,98 >11 ΕΤΗ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΕΣ n=10 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ ΥΠΟ ΑΓΩΓΗ n=19 3,485 pmol/l + 3,050 0,409 pg/ml + 0,115 37,8 pg/ml 7+ 11,32 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ 4,521 pmol/l + 4,359 0,38 pg/ml + 0,098 37,1 pg/ml + 10,312 ΧΩΡΙΣ ΑΓΩΓΗ n=66 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ ΧΩΡΙΣ ΑΓΩΓΗ 1-5 ΕΤΗ n=23 4,57 pmol/l + 4,404 0,37 pg/ml + 0,102 32,75 pg/ml + 10,90 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ ΧΩΡΙΣ ΑΓΩΓΗ 6-10 ΕΤΗ 3,3 pmol/l + 2,382 0,4 pg/ml + 0,096 41,75 pg/ml + 7,92 ΥΓΙΕΙΣ n=33 ΜΕΤΕΜΜΗΝΟΠΑΥΣΙΑΚΕΣ ΧΩΡΙΣ ΑΓΩΓΗ 11- ΕΤΗ n=9 1,7622 pmol/l+ 8,565 0,344 pg/ml + 0,093 25,82 pg/ml + 10,92 83

ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ Χρησιµοποιήθηκε διαδικασία one-way ANOVA (απλής ανάλυσης διακύµανσης) µε τον post-hoc έλεγχο κατά Tukey για τη σύγκριση µέσων τιµών ποσοτικών µεταβλητών. Με τη βοήθεια του γενικού γραµµικού µοντέλου µελετήθηκε η συσχέτιση µεταξύ ποσοτικών µεταβλητών και η επίδραση ποιοτικών και ποσοτικών µετρήσεων στους µεταβολικούς δείκτες της µελέτης. Εφαρµόστηκε ανάλυση καµπύλων ROC για την αξιολόγηση της διαγνωστικής ακρίβειας των µεταβολικών δεικτών. Η εκτίµηση του βέλτιστου σηµείου απόφασης έγινε µε τον δείκτη του Youden. Εφαρµόστηκαν δίπλευροι στατιστικοί έλεγχοι µε επίπεδο σηµαντικότητας το 0.05. Χρησιµοποιήθηκαν τα λογισµικά JMP 8.0 (SAS Inst., Cary, NC) και Stata 11.2 (StataCorp., College Station, TX) για τη διενέργεια της στατιστικής ανάλυσης. Στη βασική ανάλυση έγινε αξιολόγηση των παραγόντων που επηρεάζουν τους δείκτες ενδιαφέροντος (CATH K, CTX, PINP) και στοιχειώδεις συγκρίσεις και συσχετίσεις τους. 84

Γράφηµα 1: Σύγκριση της ηλικίας των υγιών µαρτύρων, των µετεµµηνοπαυσιακών υγιών και των µετεµµηνοπαυσιακών παθολογικών γυναικών. Οι ηλικίες των γυναικών στις συγκεκριµένες οµάδες µελέτης διαφέρουν στατιστικά σηµαντικά (p<0.001). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares D 2 12353.504 6176.75 123.1662 <.0001* Error 116 5817.370 50.15 C. Total 118 18170.874 Means and Std Deviations: Περιγραφικά µέτρα Level Number Mean Std Dev Μάρτυρες 20 32.1000 4.36373 Μετεµ. υγιείς 30 52.7667 7.58257 Μετεµ. παθολ. 69 60.2899 7.46384 Means Comparisons: Οι οµάδες διαφέρουν µεταξύ τους ανά 2 ως προς την ηλικία. Level - Level Difference p-value Μετεµ. παθολ. Μάρτυρες 28.18986 0.0000* Μετεµ. υγιείς Μάρτυρες 20.66667 0.0000* Μετεµ. παθολ. Μετεµ. υγιείς 7.52319 <.0001* 85

Γράφηµα 2: Σύγκριση των επιπέδων της Καθεψίνης Κ των υγιών µαρτύρων, των µετεµµηνοπαυσιακών υγιών και των µετεµµηνοπαυσιακών παθολογικών γυναικών. εν υπάρχουν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των 3 οµάδων ως προς την Καθεψίνη K (p=0.282). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares D 2 33.6907 16.8454 1.2813 0.2816 Error 116 1525.0838 13.1473 C. Total 118 1558.7745 Means and Std Deviations Level Number Mean Std Dev Μάρτυρες 20 3.46950 1.40361 Μετεµ. υγιείς 30 4.75704 2.54188 Μετεµ. παθολ. 69 4.93189 4.37284 εν χρειάζονται συγκρίσεις των οµάδων ανά 2. 86

Γράφηµα 3: Σύγκριση των επιπέδων του β-ctx των υγιών µαρτύρων, των µετεµµηνοπαυσιακών υγιών και των µετεµµηνοπαυσιακών παθολογικών γυναικών. Υπάρχουν στατιστικά σηµαντικές διαφορές για τo CTX (p=0.002). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares D 2 0.1369537 0.068477 6.4117 0.0023* Error 116 1.2388692 0.010680 C. Total 118 1.3758229 Means and Std Deviations Level Number Mean Std Dev Μάρτυρες 20 0.273050 0.112132 Μετεµ. υγιείς 30 0.354700 0.098948 Μετεµ. παθολ. 69 0.366362 0.102616 Means Comparisons Συγκεκριµένα οι µετεµµηνοπαυσιακές διαφέρουν από τους µάρτυρες. Level - Level Difference p-value Μετεµ. παθολ. Μάρτυρες 0.0933123 0.0016* Μετεµ. υγιείς Μάρτυρες 0.0816500 0.0195* Μετεµ. παθολ. Μετεµ. υγιείς 0.0116623 0.8637 87

Γράφηµα 4: Σύγκριση των επιπέδων του PINP των υγιών µαρτύρων, των µετεµµηνοπαυσιακών υγιών και των µετεµµηνοπαυσιακών παθολογικών γυναικών. Υπάρχουν στατιστικά σηµαντικές διαφορές για την PINP (p=0.011). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares D 2 910.831 455.415 4.7318 0.0106* Error 116 11164.539 96.246 C. Total 118 12075.370 Means and Std Deviations Level Number Mean Std Dev Μάρτυρες 20 30.1350 8.6838 Μετεµ. υγιείς 30 36.7763 10.5293 Μετεµ. παθολ. 69 37.7475 9.7895 Means Comparisons Συγκεκριµένα οι παθολογικές διαφέρουν σηµαντικά από τους µάρτυρες: Level - Level Difference p-value Μετεµ. παθολ. Μάρτυρες 7.612536 0.0078* Μετεµ. υγιείς Μάρτυρες 6.641333 0.0537 Μετεµ. παθολ. Μετεµ. υγιείς 0.971203 0.8933 88

Συγκρίσεις στις µετεµµηνοπαυσιακές. Γράφηµα 5: Σύγκριση της ηλικίας των µετεµµηνοπαυσιακών υγιών, οστεοπενικών και οστεοπορωτικών γυναικών. Σηµαντικές διαφορές ως προς την ηλικία (p<0.001). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares Condition 2 1218.9276 609.464 10.7948 <.0001* Error 96 5420.0623 56.459 C. Total 98 6638.9899 Means and Std Deviations Level Number Mean Std Dev Υγιείς 30 52.7667 7.58257 Οστεοπενία 46 59.7826 7.02982 Οστεοπόρωση 23 61.3043 8.33631 Means Comparisons Οι υγιείς διαφέρουν από τις 2 παθολογικές οµάδες: Level - Level Difference pvalue Οστεοπόρωση Υγιείς 8.537681 0.0003* Οστεοπενία Υγιείς 7.015942 0.0004* Οστεοπόρωση Οστεοπενία 1.521739 0.7082 89

Γράφηµα 6: Σύγκριση των επιπέδων της Καθεψίνης Κ των υγιών, οστεοπενικών και οστεοπορωτικών µετεµµηνοπαυσιακών γυναικών. Χωρίς σηµαντικές διαφορές (p=0.899). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares Condition 2 3.3835 1.6918 0.1094 0.8965 Error 96 1484.9070 15.4678 C. Total 98 1488.2906 Means and Std Deviations Level Number Mean Std Dev Υγιείς 30 4.75704 2.54188 Οστεοπενία 46 4.79088 4.95477 Οστεοπόρωση 23 5.21393 2.96032 90

Γράφηµα 7: Σύγκριση των επιπέδων του β-ctx των υγιών, οστεοπενικών και οστεοπορωτικών µετεµµηνοπαυσιακών γυναικών Χωρίς σηµαντικές διαφορές (p=0.560). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares Condition 2 0.0120477 0.006024 0.5837 0.5598 Error 96 0.9907684 0.010321 C. Total 98 1.0028161 Means and Std Deviations Level Number Mean Std Dev Υγιείς 30 0.354700 0.098948 Οστεοπενία 46 0.358196 0.108390 Οστεοπόρωση 23 0.382696 0.089991 91

Γράφηµα 8: Σύγκριση των επιπέδων του PINP των υγιών, οστεοπενικών και οστεοπορωτικών µετεµµηνοπαυσιακών γυναικών. Χωρίς σηµαντικές διαφορές (p=0.904). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares Condition 2 20.5974 10.299 0.1016 0.9035 Error 96 9730.9052 101.364 C. Total 98 9751.5026 Means and Std Deviations Level Number Mean Std Dev Υγιείς 30 36.7763 10.5293 Οστεοπενία 46 37.8272 9.5471 Οστεοπόρωση 23 37.5883 10.4755 92

Γράφηµα 9: Σύγκριση οστικής απώλειας µε τα έτη στην εµµηνόπαυση Υπάρχουν σηµαντικές διαφορές (p<0.001). Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Prob > F Squares Condition 2 946.6480 473.324 10.1905 <.0001* Error 96 4458.9884 46.448 C. Total 98 5405.6364 Means and Std Deviations Number Mean Std Dev Level Υγιείς 30 5.0333 5.78633 Οστεοπενία 46 10.3261 7.24509 Οστεοπόρωση 23 13.2174 7.15387 Means Comparisons Oι παθολογικές οµάδες διαφέρουν από τις υγιείς: Level - Level Difference p-value Οστεοπόρωση Υγιείς 8.184058 0.0001* Οστεοπενία Υγιείς 5.292754 0.0037* Οστεοπόρωση Οστεοπενία 2.891304 0.2254 93

Γράφηµα 10: Συσχέτιση της εξέλιξης της Καθεψίνης Κ µε τα χρόνια σε εµµηνόπαυση. εν υπάρχει συσχέτιση (p=0.832), κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Linear Fit CATH K = 4.7724435 + 0.0113331*TEP Summary of Fit RSquare 0.000467 RSquare Adj -0.00984 Root Mean Square Error 3.916126 Mean of Response 4.878906 Observations (or Sum Wgts) 99 Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Squares Model 1 0.6943 0.6943 0.0453 Error 97 1487.5963 15.3360 Prob > F C. Total 98 1488.2906 0.8320 Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 4.7724435 0.636607 7.50 <.0001* TEP 0.0113331 0.053264 0.21 0.8320 94

Γράφηµα 11: Συσχέτιση της εξέλιξης του β- CTX µε τα χρόνια σε εµµηνόπαυση. εν υπάρχει σηµαντική συσχέτιση (p=0.152), κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Linear Fit CTX = 0.3442447 + 0.0019782*TEP Summary of Fit RSquare 0.021095 RSquare Adj 0.011004 Root Mean Square Error 0.100599 Mean of Response 0.362828 Observations (or Sum Wgts) 99 Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Squares Model 1 0.0211548 0.021155 2.0903 Error 97 0.9816613 0.010120 Prob > F C. Total 98 1.0028161 0.1515 Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 0.3442447 0.016353 21.05 <.0001* TEP 0.0019782 0.001368 1.45 0.1515 95

Γράφηµα 12: Συσχέτιση της εξέλιξης του PINP µε τα χρόνια σε εµµηνόπαυση. εν υπάρχει συσχέτιση (p=0.200), κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Linear Fit PINP = 39.093609-0.1746207*TEP Summary of Fit RSquare 0.016903 RSquare Adj 0.006768 Root Mean Square Error 9.941412 Mean of Response 37.45323 Observations (or Sum Wgts) 99 Analysis of Variance Source DF Sum of Mean Square F Ratio Squares Model 1 164.8308 164.831 1.6678 Error 97 9586.6718 98.832 Prob > F C. Total 98 9751.5026 0.1996 Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 39.093609 1.616079 24.19 <.0001* TEP -0.174621 0.135215-1.29 0.1996 96

Γράφηµα 13: Επίδραση των ετών από την εµµηνόπαυση στην Καθεψίνη K σε σχέση µε τις οµάδες της εµµηνόπαυσης. εν υπάρχει επίδραση σύµφωνα µε τον πίνακα Effect Tests, κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 4.8786714 0.699428 6.98 <.0001* TEP 0.004403 0.059205 0.07 0.9409 Condition[Υγιείς] -0.143797 0.644629-0.22 0.8240 Condition[Οστεοπενία] -0.133261 0.535398-0.25 0.8040 Effect Tests Source Nparm DF Sum of F Ratio Prob > F Squares TEP 1 1 0.0864452 0.0055 0.9409 Condition 2 2 2.7756636 0.0888 0.9151 97

Γράφηµα 14: Επίδραση των ετών από την εµµηνόπαυση στο β-ctx σε σχέση µε τις οµάδες της εµµηνόπαυσης. εν υπάρχει επίδραση σύµφωνα µε τον πίνακα Effect Tests, κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 0.347932 0.017933 19.40 <.0001* TEP 0.0018125 0.001518 1.19 0.2355 Condition[Υγιείς] -0.002355 0.016528-0.14 0.8870 Condition[Οστεοπενία] -0.008452 0.013727-0.62 0.5396 Effect Tests Source Nparm DF Sum of F Ratio Prob > F Squares TEP 1 1 0.01464837 1.4256 0.2355 Condition 2 2 0.00554124 0.2696 0.7642 98

Γράφηµα 15: Επίδραση των ετών από την εµµηνόπαυση στο PINP σε σχέση µε τις οµάδες της εµµηνόπαυσης. εν υπάρχει στατιστικά σηµαντική επίδραση σύµφωνα µε τον πίνακα Effect Tests, κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 39.662547 1.767181 22.44 <.0001* TEP -0.237811 0.149587-1.59 0.1152 Condition[Υγιείς] -1.689233 1.628726-1.04 0.3023 Condition[Οστεοπενία] 0.6202813 1.352742 0.46 0.6476 Effect Tests Source Nparm DF Sum of F Ratio Prob > F Squares TEP 1 1 252.17336 2.5274 0.1152 Condition 2 2 107.93998 0.5409 0.5840 99

Γράφηµα 16: Επίδραση των ετών από την εµµηνόπαυση στην Καθεψίνη K σε σχέση µε τη λήψη φαρµακευτικής αγωγής. εν υπάρχει επίδραση σύµφωνα µε τον πίνακα Effect Tests, κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 4.4213497 0.819467 5.40 <.0001* Drugs[Χωρίς αγωγή] 0.3680052 0.604339 0.61 0.5440 Drugs[?] 0.2101117 0.760296 0.28 0.7829 TEP 0.0314089 0.05918 0.53 0.5968 Effect Tests Source Nparm DF Sum of F Ratio Prob > F Squares Drugs 2 2 11.022184 0.3546 0.7024 TEP 1 1 4.378114 0.2817 0.5968 100

Γράφηµα 17: Επίδραση των ετών από την εµµηνόπαυση στο CTX σε σχέση µε τη λήψη φαρµακευτικής αγωγής. εν υπάρχει επίδραση σύµφωνα µε τον πίνακα Effect Tests, κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 0.351901 0.021088 16.69 <.0001* Drugs[Χωρίς αγωγή] -0.008579 0.015552-0.55 0.5825 Drugs[?] -3.43e-6 0.019566-0.00 0.9999 TEP 0.0015876 0.001523 1.04 0.2999 Effect Tests Source Nparm DF Sum of F Ratio Prob > F Squares Drugs 2 2 0.00378582 0.1839 0.8323 TEP 1 1 0.01118531 1.0866 0.2999 101

Γράφηµα 18: Επίδραση των ετών από την εµµηνόπαυση στο PINP σε σχέση µε τη λήψη φαρµακευτικής αγωγής. εν υπάρχει επίδραση σύµφωνα µε τον πίνακα Effect Tests, κατά συνέπεια είναι περιττή η σύγκριση µετά από κατηγοριοποίηση ανάλογα µε τα έτη σε εµµηνόπαυση. Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob> t Intercept 40.190039 2.079107 19.33 <.0001* Drugs[Χωρίς αγωγή] -1.212044 1.533295-0.79 0.4312 Drugs[?] -0.13748 1.928982-0.07 0.9433 TEP -0.231978 0.150148-1.54 0.1257 Effect Tests Source Nparm DF Sum of F Ratio Prob > F Squares Drugs 2 2 81.80827 0.4088 0.6656 TEP 1 1 238.82275 2.3870 0.1257 102

Αξιολόγηση διαγνωστικής αξίας των CATH K, CTX, PINP. Χρησιµοποιήθηκε µεθοδολογία καµπύλων ROC. Οι διαγνωστικοί έλεγχοι µε εµβαδόν κάτω από την καµπύλη στατιστικά σηµαντικά µεγαλύτερο του 0.5 διαχωρίζουν ικανοποιητικά ασθενείς και υγιείς (ή γενικότερα τις 2 οµάδες διάγνωσης). Καµπύλες που περνούν κοντά στο σηµείο (0,1) είναι ενδεικτικές σηµαντικών διαγνωστικών ελέγχων. Ταυτόχρονα οι δείκτες συγκρίθηκαν µεταξύ τους για την εύρεση του καλύτερου. Για δείκτες µε σηµαντική διαγνωστική αξία υπολογίστηκε το βέλτιστο σηµείο απόφασης εκεί που µεγιστοποιείται η ακρίβεια του ελέγχου (κριτήριο Youden). 103

Γράφηµα 19: Καµπύλη του ROCγια τη διαγνωστική αξία της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP στη διάγνωση υγιών από παθολογικές στις µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες. Οι δείκτες δεν έχουν στατιστικά σηµαντική διαγνωστική αξία (p>0.05) καθώς το 95% διάστηµα εµπιστοσύνης για το εµβαδόν κάτω από την καµπύλη ROC περιλαµβάνει το 0.5: ROC -Asymptotic Normal-- Obs Area Std. Err. [95% Conf. Interval] ---------------------------------------------------------------------------------------- cathk 99 0.4464 0.0606 0.32752 0.56524 ctx 99 0.5285 0.0625 0.40596 0.65104 pinp 99 0.5560 0.0656 0.42747 0.68461 ---------------------------------------------------------------------------------------- Ho: area(cathk) = area(ctx) = area(pinp) chi2(2) = 3.32 Prob>chi2 = 0.1906 104

Γράφηµα 20: Καµπύλη του ROCγια τη διαγνωστική αξία της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP στη διάγνωση οστεοπενικών από οστεοπορωτικές µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες. Όµοια οι δείκτες δεν έχουν στατιστικά σηµαντική διαγνωστική αξία (p>0.05). Σηµειώνεται ότι η CATH K θα µπορούσε να δειχθεί στατιστικά σηµαντική σε µεγαλύτερο µέγεθος δείγµατος (π.χ. 100 γυναίκες µε οστεοπενία ή οστεοπόρωση) αλλά χωρίς να είναι ικανοποιητικός δείκτης (εµβαδόν µεγαλύτερο του 0.7). ROC -Asymptotic Normal-- Obs Area Std. Err. [95% Conf. Interval] ----------------------------------------------------------------------------------------------- cathk 69 0.6063 0.0722 0.46483 0.74784 ctx 69 0.5799 0.0750 0.43279 0.72695 pinp 69 0.4976 0.0762 0.34836 0.64691 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Ho: area(cathk) = area(ctx) = area(pinp) chi2(2) = 2.14 Prob>chi2 = 0.3437 105

Γράφηµα 21: Καµπύλη του ROCγια τη διαγνωστική αξία της Καθεψίνης Κ, του β-ctx και του PINP στη διάγνωση υγιών από οστεοπενικές στις µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες. Όµοια οι δείκτες δεν έχουν στατιστικά σηµαντική διαγνωστική αξία (p>0.05). ROC -Asymptotic Normal-- Obs Area Std. Err. [95% Conf. Interval] --------------------------------------------------------------------------------------------------- cathk 76 0.4083 0.0664 0.27824 0.53843 ctx 76 0.4935 0.0685 0.35918 0.62778 pinp 76 0.5500 0.0703 0.41213 0.68787 --------------------------------------------------------------------------------------------------- Ho: area(cathk) = area(ctx) = area(pinp) chi2(2) = 4.99 Prob>chi2 = 0.0824 106