6. МОДЕРНА ФИЗИКА И ОПТИКА

6. МОДЕРНА ФИЗИКА И ОПТИКА У оквиру овог поглавља, обрадичемо поред основа квантне и атомске физике и основе оптичке геометрије. Оптичка геометрија је потребна ради бољег разумевања рада оптичког микроскопа. Рад електронског микроскопа базира се на познавањурада оптичког микроскопа и особина понашања електрона у спољашњем магнетном пољу. Оптичка сочива Оптичка сочива су оптичке средине са две сферне или равне и сферне граничне површине Врсте сочива Сабирна сочива Конвексна или сабирна сочива после преламања сабирају светлост па се због тога зову и конвергентна сочива. Расипна сочива Конкавна или расипна сочива расипају светлост после преламања па се због тога зову дивергентна сочива. Елементи сочива Врсте сочива Уводе се елементи који карактеришу свако сочиво у смислу природе преламања зракова са одређеног предмета. Елементи сочива се виде на слици 98: Оса симетрије сочива дели сочиво на два дела О Центар соћива Оптичка оса је замишљена линија која пролази кроз центре сфера и фокусе сочива. F- фокуси или жиже (има их 2) су тачке на оптичкој оси у којима се секу преломљени зраци

C- Центар сфере сочива је центар сфере чији је сочиво исечак. F Имагинарни фокус се јавља код расипних сочива у пресеку продужетака преломљених зрака (Види се на слици са расипним сочивом) Жижна даљина сочива зависи од дебљине сочива Слика 98. Основни елемен Карактеристични зраци за сабирна и расипна сочива Са предмета или светлосног извора на сочиво долазе упадни зраци из различитих праваца. Карактеристични зраци су зраци који се простиру увек на исти начин. 1. Упадни зрак који долази са предмета креће се паралелно са оптичком осом. Преломни зрак који одговара овом зраку пролази кроз фокус. 2. Упадни зрак који долази са предмета пролази кроз фокус. Преломни зрак који одговара овом зраку креће се паралелно са оптичком осом. 3. Упадни зрак који долази са предмета и пролази кроз центар сочива се не прелама. Сви преломљени зраци пролазе кроз једну тачку. У тој тачки или у пресеку преломљених зрака се формира лик предмета. Slika 99. Сабирно сочиво. Расипно сочиво.

L- представља величину лика P-представља величину предмета Лик предмета који се добија расипним сочивом настаје у пресеку продужетка карактеристичних зрака, увек је имагинаран, усправан и умањен (Слика 99б) Konstrukcija likova kod sabirnih sočiva Слика 100. Предмет се налази иза центра кривине. Лик се ствара између фокуса и центра кривине Слика101 Предмет се налази у центру кривине. Лик се ствара у центру криви

Слика 102. Предмет се налази између фокуса и центра кривине. Лик се формира иза центра кривине Слика103. Предмет се налази у фокусу. Лик се формира у бесконачности Слика 104. Предмет се налази између сочива и фокуса. Лик се формира иза сочива у пресеку продужетака преломљених зракова Једначина сочива 1/f = 1/l ± 1/p

Одређује однос даљине предмета, даљине лика и жижне даљине. Реципрочна вредност жижне даљине једнака је збиру реципрочних вредности удаљености лика и предмета од центра сочива. То важи у случају сабирног сочива. Реципрочна вредност жижне даљине једнака је разлици реципрочних вредности удаљености лика и предмета од центра сочива у случају расипног сочива. Увећање сочива u = l/p u = L/P u Увећање сочива l даљина лика p daljina predmeta L величина лика P величина предмета Увечање сочива представља количник даљине лика и даљине предмета односно количник величине лика и величине предмета. Оптичка јачина сочива ω = 1/ f Оптичка јачина сочива је бројно једнака реципрочној вредности жижне даљине Диоптрија - D D = 1/m Реципрочна вредност жижне даљине сочива изражене метрима

МИКРОСКОПИ Основна подела Светлосни микроскоп Флуоресцентни микроскоп Фазно-контрастни микроскоп Електронски микроскоп Микроскоп, као оптички инструмент, функционише на принципу сочива. Она увеличавају слику за око невидљивог објекта и омогућавају уочавање облика, величине, распореда и структуре ћелија микроорганизама.електронски микроскоп једини нема сочива у класичном смислу те речи. У даљем тексту,биће описан сваки од наведених микроскопа. На сваком микроскопу основни делови су објектив и окулар Светлосни микроскоп Светлосни микроскоп је оптички уређај који омогућава увећање објекта до око 1000 пута.на сваком светлосном микроскопу разликујемо механичке и оптичке делове. Механички делови Постоље обезбеђује стабилност микроскопа и носи остале делове. Статив омогућава лакше руковање микроскопом и зупчасто је зглобљен с постољем. Сточић микроскопа налази се на стативу и служи за постављање препарата. У средишњем делу има отвор за пролаз светлости, као и специфичан механизам за учвршћивање и покретање препарата (окретањем доњег завртња механизма лево/десно померамо препарат у истом правцу, а окретањем горњег померамо препарат горе/доле). Тубус служи за ношење оптичких делова микроскопа. У горњем делу извучен је у цев која носи окулар, а у доњем делу чини колено, које омогућује окретање тубуса око своје осе. На колено се наставља револвер. Револвер представља носећи део за објективе и може се окретати око осе, при чему се чује пуцање када објектив заузме одговарајући положај. Макрометарски завртањ смештен је на стативу и служи за грубље подешавање слике при употреби објектива сувог система. Његовим окретањем ка себи тубус се помера на горе, а окретањем од себе на доле. Микрометарски завртањ налази се испод макрометарског или је у склопу с њим и служи за финије подешавање слике при употреби објектива уљане имерзије.

Слика105.a) Делови светлосног микроскопа b) флуоресцентни микроскоп- Фармацеутски факултет Хомогена имерзија Имерзија значи потапање (у течност). Код оптичког микроскопа имерзија значи потапање најнижег сочива микроскопског објектива или кондензатора у имерзијску течност. Имерзијска течност испуњава простор између најнижег сочива у објективу и покровног стакла тј. објектног стакла. Индекс преламања имерзијске течности приближно је једнак индексу преламања објектива. На тај начин се знатно појачава моћ разлучивања објектива. Често се користи за имерзију смеша воде или кедрова уља као и монобромнафталин.

Оптички делови (Слика 105) Оптички делови микроскопа се могу поделити на делове за осветљавање објекта и делове за увећавање објекта. Делови за осветљавање објекта Извор светлости код модерних микроскопа извор светлости је обично сијалица, а код примитивнијих је то сунчева светлост, која се усмерава на објекат помоћу огледала. Кондензатор налази се испод сточића, а састоји се од низа сочива, који служе да сакупе светлосне зраке и усмере их на објекат, тј. препарат. Подизањем (помоћу посебног завртња) повећавамо интензитет осветљења. Дијафрагма налази се између извора светлости и кондензатора. Састоји се из полукружних љуспица, које се померањем одговарајуће полуге скупљају или шире, правећи у централном делу мањи или већи отвор за пролаз светлости. Рам за светлосни филтар у њега се према потреби ставља одговарајући филтар. Делови за увећавање објекта Објектив је најбитнији део микроскопа и састоји се од низа слепљених сочива смештених у цилиндрични оквир. Најбитније је фронтално сочиво, које је најближе препарату. Што је сочиво мањег дијаметра, већа је моћ увећања. Објектив је помоћу навртња повезан са револвером и на њему су увек уписане вредности нумеричке апертуре, жижна даљина и моћ увећавања. На микроскопу постоји обично 3-4 објектива с различитом моћи увеличавања. Објектив даје увећан, стваран и обрнут лик објекта.објективе према начину микроскопирања делимо на објективе суве имерзије (увећавају обично 10, 40 или 60x), код којих се приликом микроскопирања између препарата и самог објектива налази ваздух и објективе уљане имерзије. Објектив уљане имерзије означен је једним или два црна прстена при врху и увећава обично 90 до 100x. Приликом употребе овог објектива ставља се кап имерзионогуља на препарат и фронтално сочиво се урања у њега, чиме се спречава расипање свтлосних зрака при употреби објектива с великим увећањем. Окулар се налази на горњем крају тубуса и има улогу да додатно повећа лик предмета који потиче од објектива. Чине га окуларно (горње) и сабирно (доње) сочиво, смештени у металној цеви. На сваком окулару пише моћ увећавања, а обично се креће од 5 до 20x. Код монокуларних микроскопа постоји један, а код бинокуларних два окулара. Приликом микроскопирања неопходно је знати с коликим се увећањем посматра препарат. Нпр. када је увећање објектива 90x, а окулара 10x, објекат се посматра при увећању од 900x. -Поред светлосних, постоје и фазноконтрастни и флуоресцентни микроскопи. -Фазноконтрастним микроскоп има специјалан објектив и дијафрагму, који омогућавају да се створи знатно већи контраст између објекта и околине. Овим микроскопом омогућено је посматрање живих, необојених објеката. -Флуоресцентни микроскоп се користи за визуелизацију објеката који имају могућност да одају светлост одређене боје тј. да флуоресцирају, када се осветле ултравиолетном светлошћу. Ако објекат нема могућност флуоресценције, третира се одговарајућим флуоресцентним бојама, тзв. флуорохромина. Овај вид микроскопирања има велику примену у идентификацији

микроорганзама, при чему се користе антитела обележена флуоресцентним бојама, која се везују за тражене антигене, тј. микроорганизме Принцип рада микроскопа Uvečani lik I` OKULAR Слика.106 а) Делови микроскопа б) оптички принцип рада микроскопа. Предмет који се посматра О се ставља увек иза првог фокуса објектива F 1. Микроскоп се састоји од објектива и окулара (слика 106a). На слици 106b може се видети оптичка схема рада микроскопа. Посматрано тело О се поставља увек иза првог фокуса F 1 објектива. Карактеристични зраци који полазе са посматраног тела О секу се и формирају изврнут и реалан лик I, унутар фокуса F 2 окулара.положај лика I се подешава размаком између објектива и окулара. После преламања на окулару, карактеристични зраци формирају увечан,изврнут и имагинаран лик I. f 1 је жижна даљина објектива а f 2 је жижна даљина окулара Што се тиче повечања микроскопа важно је угаоно увечање М. Ово укупно угаоно увечање микроскопа је производ два фактора. Први фактор је m 1 =-s 1 /s 1 бочно или латерално увечање објектива које је одређено линеарном величином реалног лика, s 1 is 1 су респективно удаљеност предмета и лика од објектива (слика 106). Други фактор је угаоно увечање M 2 окулара који повезује угаону величину виртуалног лика који се види кроз окулар са угаоном величином реалног лика и који видимо без окулара. Обично,

предмет је врло близу жижне тачке и растојање s 1 је много вече од жижне даљине f 1 a s 1 је скоро једнако f 1 тако да можемо написати да је m 1 =-s 1 /s 1 =-s 1 /f 1 Угаоно повечанје окулара се рачуна као количник даљине јасног вида d, која износи 25цм, и жижне даљине окулара f 2. Укупно угаоно увечање за микроскоп је M=m 1 M 2 =(25cm) s 1 /f 1 f 2 Крајњи лик је окренут у односу на предмет који се посматра. Правила микроскопирања За посматрање протозоа и плесни користи се углавном објектив сувог система, а за посматрање бактерија, квасаца и ситних протозоа објектив уљане имерзије. При микроскопирању није потребно носити наочаре, већ треба подесити слику употребом микрометарског или макрометарског завртња. При употреби објектива са мањим увећањем, отвор дијафрагме треба смањити, док га при употреби објектива велике моћи увећања треба повећати, а кондензатор подићи у највиши положај. При микроскопирању објективом уљане имерзије неопходно је прво наћи лик објекта употребом објектива са мањим повећањем, а тек онда окренути револвер и ставити објектив уљане имерзије. Такође је важно добро поставити Veličina mikroorganizama препарат, а он се окреће тако да објекат буде са горње стране предметног стакла, ближе објективу. У супротном, лик се не може пронаћи, а последица је ломљење предметног стакла објективом и оштећење сочива објектива. Електронски микроскоп Први електронски микроскоп је конструисан у Немачкој у периоду између 1928-1934. Шира примена почиње почетком педесетих година двадесетог века. Основни принцип рада електронског микроскопа је да уместо видљиве светлости и оптичких сочива, за добијање увеличане слике објекта користи се сноп електрона који се усмерава и фокусира уз помоћ електромагнетног поља. Сноп електрона, овде је аналоган са снопом светлости. Магнети имају улогу сочива, скречу електроне са правог пута. Комора и колона електронског микроскопа за време рада налазе се под високим вакуумом

На датој слици упоређујемо оптички микроскоп са трансмисионим електронским микроскопом (ТЕМ) и скенирајучим електронским микроскопом (СЕМ). Из добро нам познатог Де Брољевог закона који повезује таласна и честична својства квантних честица у овом случају електрона, можемо добити колика је брзина електронског снопа потребна за распознавање узорка величине 10 9 m (1 nm), λ = h / m v me = 9.11 10 31 kg h = 6.63 10 34 J s Да би се могао распознати објекат величине 10 9 m (1 nm), потребно је на њега усмерити електроне који ће имати брзину приближно 100 000 m s 1 ). Убрзавање електрона до потребних брзина за ову сврху захтева велики напон (50-100 000 V). Електрон при овом напону има таласну дужину од 0.55 (0.39) nm

Резолуција (раздвојна моћ ) је најмање растојање између две тачке при коме се оне распознају као раздвојени објекти. Резолуција је одређена таласном дужином осветљавајућег снопа. Максимална теоретска резолуција је око половине таласне дужине снопа који пада на објекат Због тога што је таласна дужина електрона знатно краћа од таласне дужине фотона видљиве светлости, граница резолуције електронског микроскопа је пуно мања од оне светлосног микроскопа: око 0,1-0,2 nm електронског микроскопа у поређењу с око 200-350 nm код светлосног микроскопа. Међутим, за биолошке узорке стварна граница резолуције обично није нижа од 2 nm или је виша, због проблема с припремом препарата и контрастом. Електронски микроскоп има око 100 пута већу резолуцију од светлосног микроскопа. Као последица је и искористиво повећање такође веће: до 100.000 пута електронског микроскопа, у поређењу с 1000 до 1500 пута код светлосног микроскопа. На тај је начин, посматрајући електронским уместо светлосним микроскопом, могуће је запазити много више детаља у грађи ћелије. Основни типови електронских микроскопа су трансмисиони електронски микроскоп (ТЕМ-Трансмисиона електронска микроскопија) и скенирајући електронски микроскоп (СЕМ- Скенинг електронска микроскопија). Трансмисијски и скенирајући електронски микроскопи су слични по томе што оба примењују зрак електрона који се простире кроз високи вакуум, но за стварање слике користе различите механизме. Као што само име говори, ТЕМ слику обликује помоћу електрона који се одашиљу кроз препарат. СЕМ, пак, скенира површину препарата те слику добија на три начина: детектовањем електрона који се добијају као одбијени сноп електрона од узорка, детектовањем секундарних електрона избијених из узорка и детектовањем фотона из узорка насталих услед преласка електрона у атомима узорка са једног на други енергетски ниво. Скенирајућа електронска микроскопија је необична техника због утиска дубине који се стиче посматрањем приказаних биолошких структура. Слика 107. Пример слике микроорганизма добијеног помочу СЕМ микроскопа. (преузето из предавања Микробиологија на Фармацеутском факултету у Београду) Због ниске продорне снаге електрона, узорци који се припремају за електронско микроскопирање морају бити изузетно танки. Справа која се користи за ту сврху назива се ултрамикротом. Опремљена је дијамантним ножићем и може резати пресеке дебљине до 20 nм. Постојећи дебљи препарати се такође могу посматрати електронским микроскопом, али је у том случају потребан знатно већи погонски напон како би се примерено повећала продорна снага електрона. Такав високонапонски електронски микроскоп користи погонски напон од неколико хиљада киловолта (кv), што је једва у поређењу с распоном од 50-100

кv колико је потребно већини конвенционалних инструмената. Пресеци до 1 μм дебљине се могу проучавати искључиво с таквим високонапонским инструментима. Толика дебљина нам омогућава детаљније истраживање органела и других ћелијских структура. Слика 108. Пресек и спољашњи изглед једног ТЕМ микроскопа. а) б) Слика109.Шема ТЕМ микроскопа. Основни делови су смештени унутар главне микроскопске колоне металног цилиндра у коме је вакуум: - електронски топ - кондензорско сочиво- место за узорак- објективско сочиво- пројекторско сочиво- флуоресцентни екран- фотографска плоча На слици б) видимо део електронског снопа који делимично пролази кроз узорак и делимично се одбија од узорка. Електрони који су прошли кроз узорак, доспевају на фотографску плочу где се добија финални лик узорка. Електронски топ представља извор електрона у коме се налази катода - ужарена волфрамова нит. Емитовани електрони убрзавају се према аноди која има функцију пропуштања електрона тачно дефинисаних енергија. Електронски сноп фокусира се системом електромагнетних сочива (калемова) смештених у средишњему делу микроскопске колоне. Отклон снопа омогућују електромагнетни калемови смештени при дну микроскопске колоне.

Кондензорско сочиво: за ширење електронског снопа и усмеравање струје електрона на узорак. Објективско сочиво: за изоштравање променом јачине струје. Пројекторско сочиво: за регулацију увеличања. Променом јачине струје у њему, фокусна тачка се помера горе-доле дуж оптичке осе. Флуоресцентни екран: емитује светлост под утицајем електронског бомбардовања (цинк-сулфид итд.). Фотографска плоча: испод флуоресцентног екрана, за каснију анализу. Вакуумски систем - пумпе: обезбеђује вакуум у колони чиме се обезбеђује већа продорност електрона у колони и онемогућује јонизација молекула ваздуха. СЕМ Микроскоп a) Слика110.a) Изглед СЕМ микроскопа. b) СЕМ микроскоп у Лабораторији микробиологије на Фармацеутском факултету у Београду

Слика 111. а) Шема СЕМ микроскопа. б) детаљнија шема СЕМ микроскопа. Код СЕМ микроскопа, скенирање површине се остварује прелажењем уског снопа (примарних) електрона преко површине узорка. У свакој тачки узорка у интеракцији електрона примарног снопа и молекула (атома) узорка долази до стварања сигнала који се детектује. Сигнал се мапира на видео екрану свака тачка интеракције одговара посебној слици на екрану. Оштрина слике зависи од јачине сигнала са узорка (енергија секундарних електрона). Сигнал може бити састављен од: -секундарних електрона -одбијених електрона - апсорбованих - пропуштених - катодолуминесценција - X - зрака

СЕМ микроскоп може користити три основна типа детектора за најважније од наведених сигнала: - SE (engl. Scondary Electron) детектор секундарних електрона - BSE (engl. Back Scatter Electron) детектор распршених(одбијених) електрона - EDS (engl. Energy Disperssive Spectrometer) енергијско дисперзивни детектор (детектује зраћење настало прегруписавањем електрона унутар узорка при чему се емитују фотони одређене енергије-х зраћење) Приликом судара с атомским језгром атома који граде узорак, електрони из електронског снопа микроскопа се може одбити натраг. Такве одбијене електроне називамо електрони повратног распршења или BSE. Њих детектирамо помоћу BSE детектора повратног распршења. BSE показује узорак у нијансама сиве боје које одговарају атомским тежинама атома који изграђују узорак. BSE детектор користи се за проучавање разлика у хемијском саставу узорака, а уједно смањује ефекте изазване накупљањем електрона на површини узорка. -Други важан ефект који нам се догађа у тренутку судара електрона из снопа и узорка је избијање електрона из електронског омотача атома из узорка. Те избијене електроне називамо секундарни електрони или SE (engl. Scondary Electron). SE детектор приказује површину узорка у великој резолуцији, па је посебно погодан за проучавање морфологије. -Код избијања електрона из електронског омотача атома остаје празно тзв. вакантно место, које се попуни електроном из друге електронске љуске више енергије. Приликом тог скока електрона емитује се један квант енергије или X-зрачење. Енергија овако насталог зрачења карактеристична је за сваки хемијски елемент. Ову врсту зрачења детектује трећа врста детектора, EDS детектор (енгл. Energy Disperssive Spectrometer). Овај детектор служи за одређивање хемијског састава узорка на темељу X-зрака које емитује узорак под електронским снопом микроскопа.

Karakteristika Svetlosni TEM SEM Rezolucija 500 nm 10 nm 2 nm Max rezolucija 100 nm 0.5 nm 0.2 nm Uveličanje do 1500X do 300000X ~ 100000X Dubina pregledanog polja slaba promenljiva visoka Objekat živ neživ neživ Preparativna tehnika jednostavna složena jednostavna Debljina preparata srednja Izuzetno mala varijabilna Vidno polje relativno veliko ograničeno veliko Izvor radijacije vidljiva svetlost elektroni elektroni Medijum vazduh vakuum vakuum Sočiva staklena elektromagnetna elektromagnetna Fokusiranje mehaničko e.m. kalemovima e.m.kalemovi Podešavanje uveličanja promena objektiva Promena struje u projektorskim Promena struje u projektorskim e.m. kalemovima e.m. kalemovima

Dobijanje slike - kontrast apsorpcija propuštene svetlosti skretanje elektrona skretanje elektrona У горе наведеној табели извршили смо упоређивање карактеристика оптичког микроскопа са ТЕМ и SEM електронским микроскопима.