Βιοτημεία Ι. Καραπαναγιωηίδης

Βιοτημεία Ι. Καραπαναγιωηίδης

Σν ζπλέλδπκν Α είλαη ν παγθφζκηνο κεηαθνξέαο αθπιν-νκάδσλ Σν ζπλέλδπκν Α (CoA) είλαη έλα θεληξηθφ κφξην ηνπ κεηαβνιηζκνχ Σν CoΑ ζπλδέεηαη κε αθπιν-νκάδεο (CHO-) παξάγνληαο αθπιν-coa πλδεδεκέλν κε αθεηπιν-νκάδα (COCH 3 ) παξάγεη ην αθεηπιν-coa

Κχθινο ηνπ θηηξηθνχ νμένο Ληπφιπζε = απνδφκεζε ησλ ιηπηδίσλ ηεο ηξνθήο - Σειηθφ πξντφλ = 1 αθεηπιν-coa, 1 FADH 2 θαη 1 NADH Γιπθφιπζε = απνδφκεζε ησλ πδαηαλζξάθσλ ηεο ηξνθήο - Σειηθφ πξντφλ = C 6 H 12 O 6 ----- CH 3 -CO-CΟOH + CH 3 -CO-CΟOH 1 κφξην γιπθφδεο κεηαηξέπεηαη ζε 2 κφξηα ππξνπβηθνχ νμένο ε αεξφβηεο ζπλζήθεο ην ππξνπβηθφ νμχ εηζέξρεηαη ζηα κηηνρφλδξηα, απνθαξβνμπιηψλεηαη νμεηδσηηθά θαη κεηαηξέπεηαη ζε αθέηπιν-ζπλέλδπκν Α ππξνπβηθή δευδξνγνλάζε CH 3 -CO-CΟOH ------------------------- CH 3 -CO-S-CoA Πξσηεφιπζε - ηειηθφ πξντφλ αθεηπιν-coa θαη ππξνπβηθφ νμχ κεηαμχ άιισλ Tν ηειηθφ πξντφλ απνδφκεζεο φισλ ησλ ζξεπηηθψλ ζπζηαηηθψλ είλαη ην αθεηπιν-coa

ΜΔΣΑΒΟΛΙΜΟ 1 ν ηάδην Τδξφιπζε ζξεπηηθψλ ζπζηαηηθψλ Παξαγσγή βαζηθψλ κνλάδσλ 2 ν ζηάδην Απνδφκεζε ηνπο ζε Αθέηπιν-CoA 3 ν ζηάδην Παξαγσγή κεηαβνιηθήο Δλέξγεηαο ζε κνξθή ATP

Κχθινο ηνπ θηηξηθνχ νμένο Σα αθεηπιν-coa πθίζηαληαη κία θπθιηθή αιιεινπρία αληηδξάζεσλ πνπ νλνκάδεηαη θχθινο ηνπ θηηξηθνχ νμένο ή θχθινο ηνπ Krebs - Με ηε βνήζεηα αξθεηψλ ελδχκσλ ηα νπνία βξίζθνληαη ζηα ΜΙΣΟΥΟΝΓΡΙΑ Απνηειεί ην ηειηθφ ζηάδην απνδφκεζεο ησλ πδαηαλζξάθσλ, ησλ ιηπψλ θαη ησλ πξσηετλψλ πνπ πξνζιακβάλνληαη κε ηελ ηξνθή γηα ηελ παξαγσγή Δλέξγεηαο Απνηειεί ζεκαληηθφ κέξνο ηεο θπηηαξηθήο αεξφβηαο αλαπλνήο - Απαηηείηαη άθζνλν νμπγφλν ζε αλαεξφβηεο ζπλζήθεο ν θχθινο παχεη - ηα πεξηζζφηεξα θχηηαξα ν θχθινο ηνπ θηηξηθνχ νμένο δηεθπεξαηψλεη ηα 2/3 ηνπ ζπλφινπ ησλ νμεηδψζεσλ ησλ ελψζεσλ ηνπ άλζξαθα - Τν κνξηαθό Ο 2 δελ ζπκκεηέρεη απεπζείαο ζηνλ θύθιν ηνπ θηηξηθνύ σζηόζν ν θύθινο ιεηηνπξγεί ζε αεξόβηεο ζπλζήθεο γηαηί ηα NAD & FAD είλαη ζε ζέζε λα αλαγελλεζνύλ ζην κηηνρόλδξην κόλν κε ηε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ ζην κνξηαθό νμπγόλν

Βήκαηα ηνπ θχθινπ ηνπ θηηξηθνχ νμένο 1 ν ΒΗΜΑ: Ο θχθινο αξρίδεη κε κία ζπλέλσζε (ζπκπχθλσζε): - κίαο κνλάδαο 4 αηφκσλ C (ΟΞΑΛΟΞΙΚΟ ΟΞΤ) - κίαο κνλάδαο 2 αηφκσλ C (αθεηπιν-νκάδαο ηνπ αθεηπιν-coa) - Γεκηνπξγείηαη ΚΙΣΡΙΚΟ ΟΞΤ(6 C) - Μέζσ πδξφιπζεο - Παξνπζία θηηξηθήο ζπλζάζεο H 2 O CoA

Βήκαηα ηνπ θχθινπ ηνπ θηηξηθνχ νμένο 2 ν ΒΗΜΑ: Σν ΚΙΣΡΙΚΟ ΟΞΤ ηζνκεξίδεηαη ζε ΙΟΚΙΣΡΙΚΟ ΟΞΤ - Πξψηα αθπδάησζε (έλδπκν αθνληηάζε) - Μεηά ελπδάησζε (έλδπκν αθνληηάζε) - Απνηέιεζκα: ε αληαιιαγή ελφο Η θαη ελφο ΟΗ - Ο ιφγνο πνπ γίλεηαη ε ηζνκεξείσζε είλαη γηα λα ππνζηεί αξγφηεξα απνθαξβνμπιίσζε

Βήκαηα ηνπ θχθινπ ηνπ θηηξηθνχ νμένο 3 ν ΒΗΜΑ: Σν ΙΟΚΙΣΡΙΚΟ ΟΞΤ πθίζηαηαη κία πξψηε αληίδξαζε νμεηδσηηθήο απνθαξβνμπιίσζεο Γει, νμεηδψλεηαη & απνθαξβνμπιηψλεηαη ζε α-κδσογλοτσαρικο ΟΞΤ - Ομείδσζε κε NAD+ ζρεκαηίδεηαη νμαινειεθηξηθφ (αζηαζέο) - Απφ ηελ αληίδξαζε παξάγεηαη 1 κφξην NADH - Ομαινειεθηξηθφ απνθαξβνμπιηψλεηαη (έλδπκν ηζνθηηξηθή αθπδξνγνλάζε) - Έθπγε 1 C (σο CO 2 ) θαη έηζη ην α-θεηνγινπηαξηθφ έρεη 5 C

Βήκαηα ηνπ θχθινπ ηνπ θηηξηθνχ νμένο 4 ν ΒΗΜΑ: Σν α-κδσογλοτσαρικο ΟΞΤ πθίζηαηαη εθ λένπ νμεηδσηηθή απνθαξβνμπιίσζε - Ομείδσζε κε NAD+ (έλδπκν α-θεηνγινπηαξηθή αθπδξνγνλάζε) - Καη απνθαξβνμπιηψλεηαη ζε κία έλσζε κε 4 C, δεκηνπξγψληαο ην ΗΛΔΚΣΡΤΛΟ-CoA - Απφ ηελ αληίδξαζε παξάγεηαη έλα 2o κφξην NADH

Με ηηο 2 αληηδξάζεηο απνθαξβνμπιίσζεο, νπζηαζηηθά νη 2 C ηεο αθεηπινκάδαο πνπ ηξνθνδφηεζε ηελ πξψηε αληίδξαζε ηνπ θχθινπ δελ απνκαθξχλνληαη σο CΟ 2 αιιά ελζσκαηψλνληαη ζηα νμέα. Ωζηφζν, κπνξεί ζε επφκελεο δηαδξνκέο ηνπ θχθινπ λα απνκαθξπλζνχλ σο CΟ 2 Οη αληηδξάζεηο πνπ αθνινπζνχλ έρνπλ ζθνπφ λα αλαγελλήζνπλ ην νμαινμηθφ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ζηελ 1ε αληίδξαζε - θαη λα ζρεκαηηζηεί έηζη κηα θπθιηθή πνξεία αληηδξάζεσλ

Βήκαηα ηνπ θχθινπ ηνπ θηηξηθνχ νμένο 5 ν ΒΗΜΑ: Σν ΗΛΔΚΣΡΤΛΟ-CoA κεηαηξέπεηαη ζε ΗΛΔΚΣΡΙΚΟ ΟΞΤ - Σν ειέθηξπιν-coa πεξηέρεη έλα δεζκφ πςειήο ελέξγεηαο (Θεηνεζηεξηθφο δεζκφο) - 'Δηζη, φηαλ ην ειεθηξπιν-cνα κεηαηξέπεηαη ζε ειεθηξηθφ, ν δεζκφο πςειήο Δ δηαζπάηαη θαη ε Δ απηή ρξεζηκνπνηείηαη γηα ην ζρεκαηηζκφ ελφο κνξίνπ GTP (ηξηθσζθνξηθή γνπαλνζίλε) απφ GDP (δηθσζθνξηθή γνπαλνζίλε) νξζνθσζθνξηθφ νμχ

Βήκαηα ηνπ θχθινπ ηνπ θηηξηθνχ νμένο 6 ν 7 ν 8 ν ΒΗΜΑ: Σν ΗΛΔΚΣΡΙΚΟ ΟΞΤ κεηαηξέπεηαη ζε ΟΞΑΛΟΞΙΚΟ ΟΞΤ ζε 3 βήκαηα: - Μία νμείδσζε (εδψ ν δέθηεο Η είλαη ην FAD, παξαγσγή κνξίνπ FADH 2 ) - Μία ελπδάησζε - Γεχηεξε νμείδσζε (παξαγσγή κνξίνπ ΝΑDH) - Σν νμαινμηθφ έπεηηα ζα επαλα-ζπκπεθλσζεί κε έλα λέν αθεηπιν-coa γηα έλα λέν θχθιν αληηδξάζεσλ

ΒΗΜΑΣΑ 1. Αθεηπιν-νκάδα κε νμαινμηθφ & λεξφ δίλεη θηηξηθφ 2. Ιζνκεξίδεηαη ζε ηζνθηηξηθφ 3. Απνθαξβνμπιηψλεηαη (νμείδσζε) ζε α-κεηνγινπηαξηθφ 4. Απνθαξβνμπιηψλεηαη (νμείδσζε) ζε ειεθηξπιν-coa

ΒΗΜΑΣΑ 5. Μεηαηξνπή ζε ειεθηξηθφ 6. Ομείδσζε ζε θνπκαξηθφ 7. Με ελπδάησζε πξνθχπηεη κειηθφ 8. Ομείδσζε ζε νμαινμηθφ - Αλαγέλλεζε νμαινμηθνχ πνπ επαλαρξεζηκνπνηείηαη ζε λέν θχθιν

ΒΗΜΑΣΑ - Σειηθά κφξηα: 2 κφξηα CO 2 θαη νμαινμηθφ - ε θάζε θχθιν, 2 άηνκα C εηζέξρνληαη σο αθεηπιν-νκάδα θαη 2 άηνκα C απνδίδνληαη σο CO 2 - Σα άηνκα C ηνπ CO 2 δελ είλαη απηά ηεο αθεηπιννκάδαο ΝΑDH & FADH 2 κεηαθέξνπλ ηα πςειήο ελέξγεηαο ειεθηξφληά ηνπο ζηελ αιπζίδα κεηαθνξάο ειεθηξνλίσλ ψζηε λα πξαγκαηνπνηεζεί ε νμεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε (ε νπνία απνδίδεη 11 ΑTP). Απηά ηα ειεθηξφληα ζην ηέινο αληηδξνχλ κε ην O 2 H 2 O - ε 3 αληηδξάζεηο κεηέρεη ην NAD σο ζπλέλδπκν πνπ αλάγεηαη ζε NADH - ε 1 αληίδξαζε κεηέρεη ην FAD σο ζπλέλδπκν πνπ αλάγεηαη ζε FADH 2

πλνπηηθή παξνπζίαζε ηνπ θχθινπ ηνπ θηηξηθνχ νμένο Αθεηπιν-CoA + 3 NAD + + FAD + GDP + Pi + 2H 2 O 2CO 2 + 3 NADH + FADH 2 + GTP + 2H + +CoA Ο θχθινο νμεηδψλεη κνλάδεο 2 αηφκσλ C (αθεηπιν-coa) παξάγνληαο 2 κφξηα CO 2, δεκηνπξγείηαη έλαο θσζθνξηθφο δεζκφο πςειήο ελέξγεηαο (1 κφξην GTP) θαη ειεθηξφληα πςειήο ελέξγεηαο ζηε κνξθή NADH (3 κφξηα) θαη FADH 2 (1 κφξην) ΝΑDH & FADH 2 είλαη κόξηα πινύζηα ζε Ε δηόηη ην θαζέλα πεξηέρεη έλα δεύγνο e- κε πςειό δπλακηθό κεηαθνξάο

+CO 2 +ATP+H 2 O Σηο κσηοδιάλσμα μεηαηροπή ζε ακέησλο-coa O θχθινο δελ είλαη απνθιεηζηηθά θαηαβνιηθφο Κάησ απφ θαηάιιειεο ζπλζήθεο, ελψζεηο ηνπ θχθινπ κεηέρνπλ ζε αλαβνιηθνχο δξφκνπο φπσο π.ρ. γιπθνλενγέλεζε, βηνζχλζεζε ιηπαξψλ νμέσλ, βηνζχλζεζε ακηλνμέσλ Αλ ην νμαινμηθφ αλαιψλεηαη π.ρ. κεηαηξέπεηαη ζε ακηλνμέα γηα ζχλζεζε πξσηετλψλ, ηφηε ν θχθινο παχεη λα ιεηηνπξγεί ;;;.φρη δελ παχεη δηφηη ην νμαινμηθφ ζρεκαηίδεηαη απφ ηελ θαξβνμπιίσζε ηνπ ππξνζηαθπιηθνχ (CH3COCOOH) κε έλδπκν θαξβνμπιάζε. Απαηηείηαη κηα ειάρηζηε πνζφηεηα απφ νμαινμηθν ψζηε λα ιεηηνπξγήζεη ν θχθινο.

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε Η ελέξγεηα πνπ ρξεηάδεηαη θαζεκεξηλά ν άλζξσπνο (άλδξαο, θαζηζηηθή δσή, 70 Κg) = 2000 Kcal Απαηηείηαη πνζφηεηα 83 Kg ATP Όκσο ν άλζξσπνο δελ έρεη παξά κφλν 250 g ATP αλά πάζα ζηηγκή Η ηεξάζηηα δηαθνξά κεηαμχ ηεο δηαζέζηκεο θαη ηεο απαηηνχκελεο ATP θαιχπηεηαη απφ ηε δηαξθή αλαθχθισζε ADP ζε ΑTP θαη αληηζηξφθσο Κάζε κφξην ATP αλαθπθιψλεηαη πεξίπνπ 300 θνξέο εκεξεζίσο Η αλαθχθισζε επηηπγράλεηαη κέζσ ηεο νμεηδσηηθήο θσζθνξπιίσζεο Tα ΑΣP, ADP & AMP είλαη αιιεινκεηαηξέςηκα: ΑΣP + AMP ----- ΑDP + ADP (+ P i +PP i )

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε θαηά ηελ νμείδσζε ηεο αθεηπινκάδαο ηνπ αθεηπιν-cνα ζε CΟ 2 (θχθινο θηηξηθνχ νμένο) ζρεκαηίδνληαη 3 NADH θαη 1 FADH 2 Σα αλεγκέλα απηά ζπλέλδπκα πξέπεη λα δψζνπλ ηα Η θαη e- ηνπο (επαλνμεηδσζνχλ) ψζηε λα κπνξνχλ λα μαλακεηαθέξνπλ λέα Η & e- απφ ηνλ λέν θχθιν Απηφ επηηπγράλεηαη κε ηε κεηαθνξά ησλ ειεθηξνλίσλ ηνπο ζην κνξηαθφ νμπγφλν (Ο 2 ) κέζσ κηαο αιπζίδαο κεηαθνξάο ειεθηξνλίσλ (αλαπλεπζηηθή αιπζίδα) κε παξάιιειε θσζθνξπιίσζε ηνπ ADP ζε AΣP Η ηειεπηαία απηή δηεξγαζία νλνκάδεηαη νμεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε θαη απειεπζεξψλεη έλα κεγάιν πνζφ Δ, πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηελ παξαγσγή ΑΣΡ Έηζη, νμεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε είλαη ε δηεξγαζία ζηελ νπνία παξάγεηαη ΑΣΡ θαηά ηε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ απφ ην NADH ή ην FADH 2 πξνο ην O 2, δηακέζνπ κίαο ζεηξάο θνξέσλ ειεθηξνλίσλ Η κεηαβνιηθή απηή πνξεία απνηειεί ηελ θπξηφηεξε πεγή δεκηνπξγίαο ΑΣΡ ζηνπο αεξφβηνπο νξγαληζκνχο

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε θαηά ηελ νμεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε: 1. Η νμεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε γίλεηαη απφ αλαπλεπζηηθά ζπγθξνηήκαηα πνπ βξίζθνληαη κέζα ζηελ εζσηεξηθή κεκβξάλε ησλ κηηνρνλδξίσλ - Δλψ, ν θχθινο ηνπ θηηξηθνχ νμένο θαη ε πνξεία ηεο νμείδσζεο ησλ ιηπαξψλ νμέσλ, πνπ δίλνπλ θαη ηε κεγαιχηεξε πνζφηεηα NADH θαη FADH 2 γίλνληαη ζην εζσηεξηθφ ηνπ κηηνρνλδξίνπ - (κήηξα) ηα κηηνρφλδξηα πεξηβάιινληαη απφ κηα δηπιή κεκβξάλε

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε Η ξνή ειεθηξνλίσλ ιακβάλεη ρψξα κέζα ζε 4 κεγάια ζπκπιέγκαηα πξσηετλψλ πνπ βξίζθνληαη ζηελ εζσηεξηθή κεκβξάλε ησλ κηηνρνλδξίσλ - Αλαγσγάζε NADH-νπβηθηλφλεο (ζχκπινθν I) - Αλαγσγάζε ειεθηξηθνχ-νπβηθηλφλεο (ζχκπινθν II) - Κπηνρξσκηθή αλαγσγάζε (ζχκπινθν III) - Κπηνρξσκηθή νμεηδάζε (ζχκπινθν IV)

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε Γηα ηελ νμείδσζε ηνπ NADH ρξεζηκνπνηείηαη ν δξφκνο ησλ ζπκπινθψλ Ι ΙΙΙ IV O 2 ελψ γηα ηελ νμείδσζε ηνπ FADH 2 ν δξφκνο είλαη ΙΙ ΙΙΙ IV O 2

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε Η ξνή ειεθηξνλίσλ απφ ην NADH πξνο ην O 2 πξνζθέξεη ειεχζεξε Δ (εμψεξγε αληίδξαζε): NADH + ½ O 2 + H + H 2 O + NAD + ΓG ν = - 52,6 kcal/mol - E H Eλέξγεηα απηή είλαη ζηελ νπζία έλα ειεθηξηθό δπλακηθό Απηή ε ειεχζεξε ελέξγεηα νμείδσζεο ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηε ζχλζεζε ηνπ ATP: ADP + Pi + H + ATP + H 2 O ΓG ν = + 7,3 kcal/mol + E

Αλαπλεπζηηθή αιπζίδα Tα ζύμπλοκα ποσ μεηαθέροσν e- από ηο NADH ανηλούν πρωηόνια H προς ηην άλλη πλεσρά ηης μεμβράνης. Ενώ, ηo ζύμπλοκo (II) ηοσ FADH 2 δεν ανηλεί Η+ 2 e- 2 e- 2 e- + 2 e- Tα e- μεηαθέρονηαι από ηο NADH ζηο ζύμπλοκο Ι -> ζύμπλοκο ΙΙΙ -> ζύμπλοκο IV -> Ο 2 -> δίνει H 2 O

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε Πψο ζπλδέεηαη ε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ απφ ηα NADH FADH 2 κε ηε θσζθνξπιίσζε ηνπ ADP ;;; Αληινχληαη Η+ απφ ηε κήηξα πξνο ηελ άιιε πιεπξά ηεο εζσηεξηθήο κεκβξάλεο Η ζπγθέληξσζε Η+ γίλεηαη κεγαιχηεξε -> δεκηνπξγείηαη έλα ζεηηθφ ειεθηξηθφ δπλακηθφ

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε H ζχλζεζε ηνπ ATP πξαγκαηνπνηείηαη πάιη ζηελ εζσηεξηθή κεκβξάλε ηνπ κηηνρνλδξίνπ κέζσ ελφο άιινπ, ηελ κηηνρνλδξηαθή ATP-ζπλζεηάζε (ζχκπινθν V) Σν ζχκπινθν απηφ απνηειείηαη απφ ηελ θαηαιπηηθή κνλάδα ζχλζεζεο ηνπ ΑΣΡ (F1), ε νπνία βξίζθεηαη πξνο ηελ πιεπξά ηεο κήηξαο ηνπ κηηνρνλδξίνπ, θαη απφ ην αγσγφ ησλ πξσηνλίσλ (Fo) Γει. ε ΑΣP-ζπλζεηάζε αληιεί Η+ Πίζσ ζηε κήηξα γηα λα ζπλζέζεη ATP ADP + Pi + H + ATP + H 2 O Όπσο εηπψζεθε πξηλ, ε Δ πνπ απαηηείηαη Πξνέξρεηαη απφ ηε κεηαθνξά e-

Ομεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε

Αλαπλεπζηηθή αιπζίδα Tα ζύμπλοκα ποσ μεηαθέροσν e- από ηο NADH ανηλούν πρωηόνια H προς ηην άλλη πλεσρά ηης μεμβράνης. Ενώ, ηo ζύμπλοκo (II) ηοσ FADH2 δεν ανηλεί Η+ 2 e- 2 e- 2 e- + 2 e- Από κάθε μόριο NADH -> 3 H+ -> 3 μόρια ATP Από κάθε μόριο FADH 2 -> 2 H+ -> 2 μόρια ATP

Σειηθά πφζα κφξηα ΑΣP ζπλζέηνληαη απφ ηνλ θχθιν ηνπ θηηξηθνχ θαη ηελ νμεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε ;;;;;; θαηά ηελ νμεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε: Η νμείδσζε ηνπ NADH απνδίδεη 3 ΑΣP Η νμείδσζε ηνπ FADH 2 απνδίδεη 2 ΑΣP - Όπσο ε ATP έηζη θαη ε GTP ηξηθνζθσξηθή γνπαλνζίλε εζσθιείεη Δ ε νπνία απειεπζεξψλεηαη κέζσ πδξφιπζεο γηα λα ρξεζηκνπνηεζεί θπξίσο γηα βηνζπλζέζεηο νξγαληθψλ καθξνκνξίσλ - Η κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ απφ ηα NADH & FADH 2 πξνο ην O 2 (αλαπλεπζηηθή αιπζίδα) θαη ε θσζθνξπιίσζε ηνπ ADP γηα ηε δεκηνπξγία ηνπ ΑΣΡ είλαη πνξείεο ζπδεπγκέλεο

βηβιηνγξαθία Stryer L. Βηνρεκεία. Σξίηε έθδνζε. Απφδνζε ζηα ειιεληθά. Παλεπηζηεκηαθέο εθδφζεηο Κξήηεο, 1997. Σξαθαηέιιεο Α. Βηνρεκεία. Δθδνηηθφο Οίθνο Αδειθψλ Κπξηαθίδε, Θεζζαινλίθε 1991.