ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΣΤΗΝ ΤΡΙΜΕΘΟΠΡΙΜΗ ΜΑΡΙΑ Α. ΧΑΤΖΗ ΗΜΗΤΡΙΟΥ ΙΑΤΡΟΣ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Π. Γ. Ν. Θ. ΑΧΕΠΑ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Σ. Αλεξίου- ανιήλ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2005-2006 ΑΡΙΘΜ. 1832 ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΣΤΗΝ ΤΡΙΜΕΘΟΠΡΙΜΗ ΜΑΡΙΑ Α. ΧΑΤΖΗ ΗΜΗΤΡΙΟΥ ΙΑΤΡΟΣ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

2

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΛΕΞΙΟΥ- ΑΝΙΗΛ ΣΤΥΛΙΑΝΗ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΟΥΛΙΟΥ-ΣΥΜΕΩΝΙ ΟΥ ΕΥΦΗΜΙΑ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΝΤΩΝΙΑ ΗΣ Φ. ΑΝΤΩΝΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΛΕΞΙΟΥ- ΑΝΙΗΛ ΣΤΥΛΙΑΝΗ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΟΥΛΙΟΥ-ΣΥΜΕΩΝΙ ΟΥ ΕΥΦΗΜΙΑ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΝΤΩΝΙΑ ΗΣ Φ. ΑΝΤΩΝΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥΛΟΥ- ΑΛΑΪΝΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΡΗΓΟΡΙΑ ΟΥ ΑΝΘΟΥΛΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ΝΟΡΜΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΝΙΚΟΛΑΪ ΗΣ ΠΑΥΛΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως» (Νόµος 5343/32, αρθρ.202 2 και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8) 3

4

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΜΠΟΝΤΗΣ 5

6

Στη µητέρα µου Λίνα Στον πατέρα µου Θανάση Στα παιδιά µου Μαριάννα και Άκη 7

8

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17 1. ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΑ 19 1.1 Γενικά χαρακτηριστικά 19 1.2 Ταξινόµηση 20 1.3 Επιδηµιολογία Εντεροβακτηριακών 26 1.4 Αποµόνωση Καλλιεργητικοί χαρακτήρες 32 1.5 Ταυτοποίηση 33 1.6 Αντιγονική σύσταση 38 1.7 Κλινική σηµασία Παθογόνος ράση Εντεροβακτηριακών 41 1.7.1 Παθογόνος δράση Escherichia coli 42 α. Εντεροτοξινογόνα E. coli (ETEC) 43 β. ΕντεροδιεισδυτικάE. coli (EIEC) 43 γ. Εντεροαιµορραγικά E. coli (EΗEC) ή Shiga toxin producing E. Coli (STEC) 45 δ. Εντεροπαθογόνα E. coli (EPEC) 46 ε. Αυτοσυγκολλούµενα κυτταροπροσκολλητικά E. coli (EaggEC) 46 στ. ιάχυτης προσκολλήσεως E. coli (DAEC) 46 ζ. Ουροπαθογόνα E. coli (UPEC) και άλλα που προκαλούν εξωγαστρεντερικές νόσους 46 1.7.2 Παθογόνος δράση της Klebsiella 47 1.7.3 Παθογόνος δράση του Proteus 48 1.7.4 Παθογόνος δράση της Shigella 48 1.7.5 Παθογόνος δράση της Salmonella 49 1.7.6 Παθογόνος δράση της Yersinia 50 1.7.7 Παθογόνος δράση των Enterobacter, Citrobacter, Morganella Serratia 51 1.8 Μηχανισµοί παθογένεσης λοιµογόνοι παράγοντες 46 1.9 Γενωµικές νήσοι Παθογενετικές νήσοι (pathogenetic islands PAI) και λοιµογόνος δράση 57 1.9.1 Παράγοντες προσκόλλησης 59 1.9.2 Τοξίνες 61 1.9.3 Συστήµατα έκκρισης 61 1.9.4 Πρόσληψη σιδήρου 62 2. ΡΑΣΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ 2.1. Γενικά 63 2.2. Μηχανισµοί δράσης αντιβιοτικών 63 2.3.Μηχανισµοί αντοχής των βακτηρίων στη δράση των αντιβιοτικών 67 2.4. Γενετική βάση των µηχανισµών αντοχής στα αντιβιοτικά. 79 2.4.1. Γενικά 79 2.4.2. Ενδογενής επίκτητη αντοχή 80 2.4.3. Είδος γενετικού υλικού που φέρει γονίδια αντοχής 84 3. ΤΡΙΜΕΘΟΠΡΙΜΗ 90 3.1. Χηµική δοµή και µηχανισµός δράσης. 90 9

3.2. Κλινική εφαρµογή. 92 3.2.1. Αντιµικροβιακό φάσµα. 92 3.2.2. Φαρµακολογία 93 3.3. Αντοχή στην τριµεθοπρίµη 95 3.3.1. Γενικά 95 3.3.2. Μηχανισµοί αντοχής στην τριµεθοπρίµη 98 3.3.3. Γενετική βάση αντοχής στην τριµεθοπρίµη 107 3.3.4 Μοριακή επιδηµιολογία των ανθεκτικών dhfr γονιδίων 109 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 117 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 119 2.1 Μικροβιακά στελέχη 119 2.2 Μέθοδοι 121 1. Καλλιέργεια Αποµόνωση 121 2. Ταυτοποίηση 121 3. οκιµασίες ευαισθησίας των Εντεροβακτηριακών σε αντιβιοτικά 122 4. Προσδιορισµός της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας των εντεροβακτηριακών στην τριµεθοπρίµη 122 5. Μεταβίβαση αντοχής µε σύζευξη. 124 6. οκιµασίες ευαισθησίας των αποσυζευκτών στην τριµεθοπρίµη και σε σειρά αντιβιοτικών. 126 7. Ανεύρεση και µοριακή τυποποίηση των γονιδίων αντοχής dfr των Εντεροβακτηριακών µε την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR). 128 7.1. Εξαγωγή µικροβιακού γενετικού υλικού 128 7.2. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR). 128 8.Τυποποίηση γονιδίων µε τη µέθοδο της ανεύρεσης αλληλουχίας βάσεων των γονιδίων-στόχων (DNA Sequencing) 131 9. Στατιστική ανάλυση 133 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Προέλευση και είδος των δειγµάτων. 135 3.2. Αντοχή στην τριµεθοπρίµη των αποµονωθέντων στελεχών. 138 3.3. Αντοχή στην κοτριµοξαζόλη των 102 ανθεκτικών στην τριµεθοπρίµη κλινικών στελεχών εντεροβακτηριακών. 142 3.4 Αντοχή σε σειρά αντιβιοτικών των 102 ανθεκτικών στην τριµεθοπρίµη κλινικών στελεχών εντεροβακτηριακών. 145 3.5. Μεταβίβαση αντοχής στην τριµεθοπρίµη µε σύζευξη. 151 3.6. Ανάλυση αντοχής των αποσυζευκτών σε σειρά αντιβιοτικών. 152 3.7. Μεταβίβαση αντοχής σε αντιβιοτικά από τα αρχικά στελέχη εντεροβακτηριακών στους αποσυζευκτές τους συγχρόνως µε την τριµεθοπρίµη. 153 3.8. Ταυτοποίηση των dfr γονιδίων αντοχής των εντεροβακτηριακών στην τριµεθοπρίµη. 155 10

3.9. Κατανοµή των dfr γονιδίων αντοχής στα ανθεκτικά στην τριµεθοπρίµη στελέχη Εντεροβακτηριακών. 158 3.10. Ταυτοποίηση των dfr γονιδίων αντοχής στην τριµεθοπρίµη στους αποσυζευκτές. 163 3.11. Κατανοµή των dfr γονιδίων αντοχής στην τριµεθοπρίµη στους αποσυζευκτές. 166 3.12. Συχνότητα τύπων γονιδίων dfrs στα αρχικά στελέχη που δεν µεταβιβάστηκαν στους λήπτες E.coli 26R793 και 26R764. 167 3.13. Συχνότητα µη-µεταφερόµενων dfrs και είδος αρχικού στελέχους. 168 3.14. Γονίδια αντοχής dfr αποσυζευκτών και αντοχή σε σειρά αντιβιοτικών. 169 3.15. Μελέτη της αλληλουχίας των βάσεων των γονιδίων-στόχων (DNA Sequencing) 170 3.16. Ανάλυση της αλληλουχίας των γονιδίων dfr των αποσυζευκτών (TR). 173 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 177 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 195 SUMMARY 199 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 203 11

12

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η ανακάλυψη και εφαρµογή των αντιβιοτικών στη θεραπεία των λοιµώξεων αποτέλεσε σταθµό της ιατρικής επιστήµης. Ταυτόχρονα όµως ξεκίνησε και η ανάπτυξη της µικροβιακής αντοχής η οποία αποτέλεσε σοβαρό εµπόδιο στην αποτελεσµατική θεραπεία. Η εισαγωγή κάθε νέας αντιµικροβιακής ουσίας έχει ως φυσικό επακόλουθο την ανάπτυξη µικροβιακής αντοχής. Είναι εποµένως αναγκαία η συνεχής επιτήρηση αλλά και η διερεύνηση των µηχανισµών αυτής. Η ραγδαία επιστηµονική πρόοδος των τελευταίων δεκαετιών στον τοµέα της µοριακής βιολογίας επέτρεψε την εκτενή µελέτη της ανθεκτικότητας των µικροβίων. Τεχνικές όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης, ο υβριδισµός, η αλληλούχιση περιοχών του γονιδιώµατος, αποτελούν πολύτιµα εργαλεία τόσο για την ταχύτατη ανίχνευση και ταυτοποίηση των µικροοργανισµών, όσο και για την διερεύνηση των µηχανισµών αντοχής σε γονιδιακό επίπεδο. Η τριµεθοπρίµη είναι ένα συνθετικό αντιβιοτικό µε αντιβακτηριακή και ανθελονοσιακή δράση, που χορηγείται ευρέως σε συνδυασµό µε τη σουλφοναµίδη εδώ και 30 χρόνια για τη θεραπεία διαφόρων λοιµώξεων. Από το πρώτα κιόλας χρόνια χρήσης της τριµεθοπρίµης, εντοπίστηκαν ανθεκτικά στελέχη, ενώ τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αύξηση στη συχνότητα των ανθεκτικών στην τριµεθοπρίµη βακτηρίων. Η παρούσα µελέτη έχει ως σκοπό τη διερεύνηση και κατανόηση των µηχανισµών αντοχής των Εντεροβακτηριακών στην τριµεθοπρίµη. Επίσης, τη µελέτη της δυνατότητας των Εντεροβακτηριακών να µεταφέρουν την αντοχή στην τριµεθοπρίµη µέσω της σύζευξης και τη διερεύνηση της ύπαρξης γονιδίων αντοχής. Για τη βοήθειά τους στην εκπόνηση της διατριβής αυτής ευχαριστώ θερµά: 13

Τον Οµότιµο Καθηγητή Μικροβιολογίας και δάσκαλό µου κ. Ιωάννη ουµπόγια ο οποίος µου ανέθεσε και εισηγήθηκε το θέµα της διατριβής αυτής. Το συνεχές ενδιαφέρον, οι πολύτιµες συµβουλές και γνώσεις του µε βοήθησαν στην πραγµατοποίηση της διδακτορικής µου διατριβής. Αισθάνοµαι ιδιαίτερα την ανάγκη να εκφράσω τη βαθιά µου ευγνωµοσύνη για την αείµνηστη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Υγιεινής κ. Κυριακή ελίδου η οποία ως αρχικό µέλος της τριµελούς µου επιτροπής βοήθησε τα µέγιστα µε την πολύτιµη καθοδήγησή της και την πολύπλευρη συµπαράστασή της. Βαθιά ευχαριστώ την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μικροβιολογίας κ. Ευφηµία Σούλιου- Συµεωνίδου, µέλος της εισηγητικής µου επιτροπής, για τις γόνιµες και καίριες υποδείξεις της, την ανεκτίµητη βοήθειά της και την αφιέρωση πολύτιµου χρόνου τόσο στις διορθώσεις του κειµένου, όσο και την επίλυση των προβληµάτων που προέκυπταν όλο αυτό το χρονικό διάστηµα της εκπόνησης. Τον Καθηγητή Μικροβιολογίας κ. Αντώνιο Αντωνιάδη για τη συνεχή επικουρία του, τη φιλοξενία που µου παρείχε στο εργαστήριο του, τη συµπαράσταση και υποστήριξη που µου έδειξε. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την καθηγήτριά µου, τη ιευθύντρια του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ, Καθηγήτρια Μικροβιολογίας κ. Στυλιανή Αλεξίου- ανιήλ, µέλος της εισηγητικής µου επιτροπής, που µε το στοργικό ενδιαφέρον της, την αγάπη της, την ουσιαστική υποστήριξή της και τις πολύτιµες συµβουλές της µε βοήθησε να ολοκληρώσω τη διδακτορική µου διατριβή. Οφείλω να εκφράσω ευχαριστίες στον Καθηγητή Μικροβιολογίας Αθηνών κ. Αθανάσιο Τσακρή ο οποίος στάθηκε δίπλα µου στα πρώτα βήµατα της διατριβής µου, µε τις ειδικές γνώσεις του πάνω στο θέµα µου και τα πρότυπα στελέχη που µου διέθεσε. Εγκάρδιες ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω και προς τα υπόλοιπα µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής για τις πολύτιµες παρατηρήσεις τους αλλά και τη θέρµη µε την οποία µε περιέβαλλαν τόσο πριν όσο και κατά 14

την υποστήριξη της διατριβής Καθηγήτρια Μικροβιολογίας κα Βασιλική Κυριαζοπούλου- αλαϊνα, Καθηγήτρια Βιοχηµείας κα Νόρµα Βαβάτση- Χριστάκη, Καθηγήτρια Υγιεινής κα Ανθούλα Γρηγοριάδου, Καθηγητή Παθολογίας Λοιµωξιολογίας και δάσκαλό µου κο Νικολαϊδη Παύλο. Θερµότατα ευχαριστώ την κα Αναστασία Παπαδηµητρίου, τεχνολόγο του Α Εργαστηρίου Μικροβιολογίας για την πολύτιµη τεχνική της βοήθεια και συµπαράσταση τόσο επιστηµονική όσο και ανθρώπινη. Ευχαριστώ θερµά την κα Τσιακίρη Ελένη, Αναπληρώτρια ιευθύντρια του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ για τη βοήθειά της στη συλλογή του υλικού. Επίσης τις τεχνολόγους του Μικροβιολογικού εργαστηρίου του Νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ Λεµονιά Βήτου και Μαρία Γεωργαντά για την τεχνική τους βοήθεια. Βαθύτατα ευχαριστώ τον Καθηγητή Κλινικής Μικροβιολογίας του Πανεπιστηµίου του Εδιµβούργου Σκωτίας Sebastian Amyes, ο οποίος µου µετέδωσε πολύτιµες γνώσεις και εµπειρία για την εκτέλεση των µοριακών µεθόδων διερεύνησης των εντεροβακτηριακών στην τριµεθοπρίµη καθ όλο το χρονικό διάστηµα της παραµονής µου στο Εδιµβούργο. Πρωτοπόρος στο χώρο των DHFRS µε αµέριστη επιστηµονική βοήθεια ευγενικά µου διέθεσε πρότυπα στελέχη ανθεκτικά στην τριµεθοπρίµη από την προσωπική συλλογή του, µε φιλοξένησε στο εργαστήριό του παρέχοντάς µου όλα τα µέσα οικονοµικά και επιστηµονικά προς έρευνα. Θερµά ευχαριστώ τη βιολόγο Dr Orsolya Dobay η οποία µου συµπαραστάθηκε και µου µετέφερε γνώσεις και πρωτόκολλα των µοριακών µεθόδων καθώς και όλο το προσωπικό του εργαστηρίου για τη φιλοξενία και φιλική διάθεση που µου έδειξαν. Τέλος, δε βρίσκω λόγια για να ευχαριστήσω τη µητέρα µου η οποία σε κάθε στιγµή της ζωής µου, µου εµφύσησε τη δική της αγάπη για τη Μικροβιολογία, µου δίδαξε αρχές, µε όπλισε µε εγκαρτέρηση και µου συµπαραστάθηκε ηθικά, επιστηµονικά αλλά και ουσιαστικά, µε αστείρευτη αγάπη και αισιοδοξία. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τα παιδιά µου για την κατανόηση και υποµονή τους καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής µου διατριβής. 15

16

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18

1. ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΑ 1.1. Γενικά χαρακτηριστικά Τα εντεροβακτηριακά αποτελούν µια µεγάλη ετερογενή οικογένεια η οποία περιλαµβάνει Gram αρνητικά βακτηρίδια (Εικόνα 1.1) πλάτους 0.3 έως 1 µm και µήκους 0.6 έως 6.0 µm τα οποία παρουσιάζουν ορισµένα τυπικά χαρακτηριστικά [1, 2]: α) δεν σχηµατίζουν σπόρους β) κινούνται µε βλεφαρίδες ή είναι ακίνητα γ) αναπτύσσονται σε κοινά στερεά και υγρά θρεπτικά υλικά δ) αναπτύσσονται αεροβίως και προαιρετικά αναεροβίως ε) ζυµώνουν τη D-γλυκόζη και άλλα σάκχαρα συχνά µε παραγωγή οξέος ή οξέος και αερίων στ) ανάγουν τα νιτρικά άλατα σε νιτρώδη (µε µερικές εξαιρέσεις) ζ) δίνουν θετική την αντίδραση καταλάσης και αρνητική την αντίδραση οξειδάσης, η) η περιεκτικότητα του DNA τους σε γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C) κυµαίνεται µεταξύ 39-59%. Εικόνα 1.1. Gram-αρνητικά βακτηρίδια Τα Εντεροβακτηριακά είναι πολύ διαδεδοµένα στη φύση. Βρίσκονται στο περιβάλλον (έδαφος και νερό) και αποτελούν µέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του ανθρώπου και των ζώων [2,3]. Ορισµένα είδη έχουν συγκεκριµένη οικολογική φωλεά π.χ. η Salmonella typhi που προκαλεί 19

τυφοειδή πυρετό βρίσκεται µόνο στον άνθρωπο. Αντίθετα, το είδος Klebsiella pneumoniae παρουσιάζει ευρεία εξάπλωση στο περιβάλλον όπου συµµετέχει σε βιοχηµικές και γεωχηµικές διεργασίες, αλλά, παράλληλα, προσβάλλει και τον άνθρωπο στον οποίο µπορεί να προκαλεί λοιµώξεις [2,4]. 1.2. Ταξινόµηση Τα Εντεροβακτηριακά αποτελούν µια οικογένεια µικροβίων ιδιαίτερα ετερογενή. Έχουν περιγραφεί περισσότερα από 30 γένη και 120 είδη [5]. Η ταξινόµησή τους αρχικά στηρίχθηκε σε βιοχηµικά, φαινοτυπικά, λειτουργικά και αντιγονικά χαρακτηριστικά και αποτέλεσε πεδίο έντονης αντιπαράθεσης, διαφωνιών και σύγχυσης. Με την πρόοδο στον τοµέα των τεχνικών αλληλούχισης και υβριδισµού των νουκλεϊκών οξέων, καθώς και της φυλογενετικής ανάλυσης, έγινε δυνατή η καλύτερη ταξινόµηση και ο προσδιορισµός των σχέσεων µεταξύ των διαφόρων µελών της οικογένειας καθώς επίσης και η ανακάλυψη νέων ειδών. Σύµφωνα µε την ταξινόµηση η οποία προτάθηκε από το Κέντρο Ελέγχου Λοιµωδών Νοσηµάτων (CDC) των ΗΠΑ, τα γένη της οικογένειας των εντεροβακτηριακών είναι τα ακόλουθα: Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia, Shigella, Ewingella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pragia, Pantoea, Photorhabdus, Plesiomonas, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Tatumella, Trabulsiella, Xenorhabdus, Yersinia, Yokenella (Koserella), Enteric Group 58, 59, 60, 63, 64, 68, 69,137 [4]. Κάθε γένος υποδιαιρείται σε είδη και υποείδη, των οποίων ο αριθµός είναι δύσκολο να προσδιοριστεί, δεδοµένης της συνεχούς ανακάλυψης νέων ειδών και στελεχών. Επίσης λόγω του µεγάλου αριθµού και της ποικιλίας των Εντεροβακτηριακών είναι αναγκαίο να διακρίνονται τα βακτηρίδια της οικογένειας αυτής σε δύο οµάδες. Η πρώτη οµάδα (πίνακας 1.1) περιλαµβάνει γένη και είδη που αποικίζουν το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου ή είδη που σχετίζονται µε την πρόκληση λοιµώξεων στον άνθρωπο. Η δεύτερη οµάδα 20

(πίνακας 1.2) περιλαµβάνει γένη που δύνανται να αποικίζουν τον άνθρωπο αλλά σπανίως προκαλούν λοιµώξεις σ αυτόν. Συνηθέστερα χαρακτηρίζονται ως αποικιστές του περιβάλλοντος και των ζώων [6]. Είδος της δεύτερης οµάδας ενδέχεται µελλοντικά να αποµονωθεί από κλινικό δείγµα ανθρώπου [4]. Πίνακας 1.1 Γένη και είδη της Οικογένειας των Εντεροβακτηριακών που αποικίζουν τον άνθρωπο ή σχετίζονται µε λοιµώξεις που προκαλούν σ αυτόν. Citrobacter Citrobacter freundii Citrobacter (diversus) koseri Citrobacter amanolaticus Edwardsiella Edwardsiella tarda Enterobacter Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans group (Pantoea agglomerans) Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazaki Enterobacter amnigenus Enterobacter (cancerogenous) taylorae Escherichia Escherichia coli Hafnia Hafnia alvei Klebsiella Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Morganella Morganella subsp. morganii Proteus Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia Providencia rettgeri Providencia stuartii morganii Salmonella Salmonella, all serotypes Serratia Serratia marcescens Serratia liquefaciens group Shigella Shigella dysenteriae (group A) Shigella flexneri (group B) Shigella boydii (group C) Shigella sonnei (group D) Yersinia Yersinia pestis Yersinia enterocolitica supsp. Enterocolitica Yersinia frederiksenii Yersinia intermedia Yersinia pseudotuberculosis 21

Πίνακας 1.2 Γένη και είδη της Οικογένειας των Εντεροβακτηριακών που δεν σχετίζονται µε λοιµώξεις του ανθρώπου. Budvicia Budvicia aquatica Buttiauxella Buttiauxella agrestis Buttiauxella noackia Cedecea Cedecea davisae Cedecea lapagei Cedecea neteri Citrobacter Citrobacter braaki Citrobacter farmeri Citrobacter gilleni Citrobacter murliniaei Citrobacter sedlakii Citrobacter werkmanii Citrobacter youngae Edwardsiella Edwardsiella hoshinae Enterobacter Enterobacter asburiae Enterobacter hormaechei Enterobacter intermedium Enterobacter kobei Erwinia Erwinia spp. Escherichia Escherichia fergusonii Escherichia hermannii Escherichia vulneris Ewingella Ewingella americana Klebsiella Klebsiella ornithinolytica Klebsiella planticola Klebsiella rhinoscleromatis Kluyvera Kluyvera ascorbata Kluyvera cryocrescens Kluyvera georgiana Leclercia Leclercia adecarboxylata Leminorella Leminorella grimontii Leminorella richardii Moellerella Moellerella wisconsensis Morganella morganii subsp. Sibonii Photorhabdus Photorhabdus spp. Pragia Pragia fontium Proteus Proteus hauseri Providencia Providencia alcalifaciens Providencia rustigianii Rahnella Rahnella aquatilis Serratia Serratia rubidaea Serratia odorifera Serratia plymuthica Serratia ficaria Tatumella Tatumella pytseos Trabulsiella Trabulsiella guamensis Yersinia Yersinia kristensenii Yersinia rohdei Yersinia bercovieri Yersinia mollaretii Yokenella Yokenella regensburgei Πληθώρα νέων ειδών περιγράφονται συνεχώς από ερευνητές. Η Buttiauxella noackiae και η Kluyvera georgiana αποτελούν δύο νέα είδη µε κλινική σηµασία για τον άνθρωπο [7]. Η Plesiomonas shigelloides αποτελεί επίσης νέο είδος αφού η αλληλούχιση του rrna έδειξε µεγάλη γενετική συγγένεια µε τον Proteus vulgaris [2,8]. Επίσης, πρέπει να σηµειωθεί ότι η περιγραφή νέων ειδών, ο επαναπροσδιορισµός των φυλογενετικών σχέσεων µε τη χρήση των νέων τεχνικών µοριακής βιολογίας και η συσσώρευση νέων δεδοµένων, οδηγεί αναπόφευκτα σε αλλαγές στην ταξινόµηση των εντεροβακτηριακών. Παρακάτω παρατίθενται συνοπτικά οι κυριότερες πρόσφατα προτεινόµενες αλλαγές στην ταξινόµηση: 22

Citrobacter. Τα ονόµατα Citrobacter diversus και Citrobacter koseri χρησιµοποιούνται και τα δύο στη βιβλιογραφία, ενώ έχει προταθεί η αντικατάσταση του παλαιότερου ονόµατος του είδους Citrobacter diversus από το Citrobacter koseri καθώς και η αντικατάσταση του ονόµατος του είδους C. amalonaticus οροτύπου 1 από το C. farmeri [2]. Enterobacter agglomerans Group Pantoea agglomerans. Έχει προταθεί η δηµιουργία ενός νέου γένους µε το όνοµα Pantoea, µε σκοπό την αναταξινόµηση των στελεχών της οµάδας Enterobacter agglomerans [9]. Xenorhabdus Photorhabdus. Έχει προταθεί η κατάργηση της ένταξης του µικροοργανισµού Xenorhabdus luminescens από το γένος Xenorhabdus και η αναταξινόµησή του στο νέο γένος Photorhabdus, µε την ονοµασία Photorhabdus luminescens, βασιζόµενη στην ύπαρξη σηµαντικών φαινοτυπικών και γενετικών διαφορών µεταξύ των δύο γενών [10]. Klebsiella Έχει προταθεί η αναταξινόµηση του είδους Calymmatobacterium granulomatis στο γένος Klebsiella µε βάση την αλληλούχιση του 16S rdna καθώς και το γεγονός ότι η K. (C.) granulomatis προκαλεί ελκώδεις βλάβες παρόµοιες µε αυτές που προκαλούνται από την K. ozonae και την K. rhinoscleromatis [11,12]. Salmonellae. Η ταξινόµηση του γένους Salmonella έχει αποτελέσει πεδίο έντονης αντιπαράθεσης. Έως τη δεκαετία του 1970, η ταξινόµησή του βασίστηκε σε επιδηµιολογικά, βιοχηµικά και αντιγονικά χαρακτηριστικά (το σωµατικό αντιγόνο Ο, τις φάσεις 1 και 2 του βλεφαριδικού αντιγόνου Η, την παρουσία του αντιγόνου Vi). Αργότερα, το 1973, ο Crosa et al χρησιµοποιώντας DNA-DNA υβριδισµό κατέληξε ότι η Salmonella µπορεί να διαιρεθεί σε πέντε κύριες οµάδες [13]. Από τότε έως σήµερα δύο επιπλέον οµάδες είναι γνωστές. Η ανάλυση του γενετικού υλικού των σαλµονελλών προσέθεσε νέα δεδοµένα και οδήγησε σε αναθεώρηση της ταξινόµησης αυτών. Ακόµη και σήµερα όµως εξακολουθούν να υπάρχουν διαφορές και αντιπαραθέσεις σε ό,τι αφορά την ταξινόµηση του γένους Salmonella. 23

Σήµερα το πλέον αποδεκτό είναι ότι το γένος Salmonella αποτελείται από δύο είδη: Το είδος Salmonella enterica και το είδος Salmonella bongori (παλαιότερη ονοµασία Οµάδα V αποτελούµενο από 21 οροτύπους) [14]. Το είδος Salmonella enterica διαιρείται σε 6 υποείδη, τα εξής: Salmonella enterica subsp. enterica, υποείδη Οµάδας I (1478 ορότυποι) Salmonella enterica subsp. salamae, υποείδη Οµάδας II (498 ορότυποι) Salmonella enterica subsp. arizonae, υποείδη Οµάδας IIIa (94 ορότυποι) Salmonella enterica subsp. diarizonae, υποείδη Οµάδας IIIb (327 ορότυποι) Salmonella enterica subsp. houtenae, υποείδη Οµάδας IV (71 ορότυποι) Salmonella enterica subsp. indica, υποείδη Οµάδας VI (12 ορότυποι) [4]. Τα υποείδη της οµάδας Ι συνήθως αποµονώνονται από κλινικά δείγµατα ανθρώπων και ζώων. Τα υποείδη των υπολοίπων οµάδων καθώς και του είδους Salmonella bongori αποµονώνονται από τα ζώα και το περιβάλλον και σπανιότατα από τον άνθρωπο αλλά θα πρέπει να χαρακτηρίζονται δυνητικά παθογόνα [15]. Στον πίνακα 1.3 φαίνεται η ταξινόµηση κατά Kauffman-White των οροτύπων Salmonella enterica subsp. enterica. Το σχήµα κατά Kauffman- White ανανεώνεται ετησίως µε νέους ορότυπους και δηµοσιεύεται κάθε πέντε χρόνια µε νέα έκδοση από τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας [16]. 24

Πίνακας 1.3 Ταξινόµηση κατά Kauffman-White των οροτύπων Salmonella enterica subsp. enterica. Η- Αντιγόνα Είδος ή ορότυπος Ο Αντιγόνα Φάση 1 Φάση 2 Group A S. paratyphi 1, 2, 12 a - Group B S. schottmulleri 1, 4, 12 b 1, 2 Group C1 S. choleraesuis S. montevideo Group C2 6, 7 6, 7 c g, m, s 1, 5 - S. manhattan 6, 8 d 1, 5 Group D1 S. typhi S. panama Group D2 9, 12, (Vi) 1, 9, 12 d 1, v - 1, 5 S. strasbourg 9, 46 d 1, 7 Group E1 S. anatum 3, 10 e, h 1, 6 Group E2 S. new-brunswick 3, 15 1, v 1, 7 Group E3 S. minneapolis 3, 15, 34 e, h 1, 6 25

1.3 Επιδηµιολογία Εντεροβακτηριακών Τα Εντεροβακτηριακά βρίσκονται τόσο στο έδαφος και στα φυτά όσο και στον γαστρεντερικό σωλήνα ανθρώπων και ζώων [17]. Ορισµένα είδη, π.χ. η Escherichia coli, αποτελούν τµήµα της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου του ανθρώπου [18]. Τα είδη αυτά µπορεί να αποτελέσουν αίτιο λοίµωξης, εάν µεταφερθούν και αποικίσουν κάποια άλλη περιοχή του σώµατος, π.χ. το ουρογεννητικό σύστηµα [17,19]. Αυτό συµβαίνει συχνά σε νοσηλευόµενους ή ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς και µπορεί να οδηγήσει σε πνευµονία, σηψαιµία, µηνιγγίτιδα. Εντούτοις, στο σηµείο αυτό αξίζει να αναφερθεί ότι η Escherichia coli είναι ο κύριος παράγοντας λοιµώξεων του ουροποιητικού σωλήνα σε ασθενείς της κοινότητας [17]. Άλλα είδη, όπως π.χ. Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolitica, εντοπίζονται στον άνθρωπο µόνο σε περίπτωση µόλυνσης, συνήθως µέσω µολυσµένου νερού ή τροφής, ενώ το είδος Yersinia pestis είναι το µοναδικό Εντεροβακτηριακό που µεταδίδεται από µολυσµένο ζώο µέσω δήγµατος από έντοµο [17]. Τα Εντεροβακτηριακά αναλογούν στο 80% των σηµαντικών κλινικών στελεχών Gram-αρνητικών βακτηρίων που αποµονώνονται στα κλινικά εργαστήρια [19]. Σύµφωνα µε εκτιµήσεις, τα Εντεροβακτηριακά ευθύνονται για το 1/3 των περιπτώσεων σηψαιµίας, τα 2/3 των περιπτώσεων γαστρεντερίτιδας βακτηριακής προέλευσης και τα 3/4 των λοιµώξεων του ουροποιητικού σωλήνα [19]. Η E. coli είναι δυνητικά ή ευκαιριακά παθογόνο µικρόβιο [20]. Μεγάλος αριθµός στελεχών E. coli βρίσκονται στον γαστρεντερικό σωλήνα ως µέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του ανθρώπου και των ζώων. Η E. coli θεωρείται το αίτιο των περισσοτέρων (>80%) λοιµώξεων του ουροποιητικού στην κοινότητα και των περισσοτέρων ενδονοσοκοµειακών λοιµώξεων [5]. Οι περισσότερες λοιµώξεις είναι γηγενείς, δηλαδή, στελέχη της φυσιολογικής χλωρίδας προκαλούν λοίµωξη σε άλλα σηµεία του σώµατος, κυρίως όταν υπάρχει ανοσοκαταστολή. Η E. coli χρησιµοποιείται ως δείκτης για τον έλεγχο µόλυνσης του πόσιµου νερού και των τροφίµων από κόπρανα [3]. 26

Η Klebsiella όπως και η E. coli, αποτελεί µέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του γαστρεντερικού σωλήνα. Μπορεί να αποικίζει το ανώτερο αναπνευστικό σύστηµα των ανθρώπων, ιδιαίτερα βρεφών και νεογνών. Βρίσκεται στο έδαφος και στο νερό. Αποτελεί συχνό αίτιο νοσοκοµειακών λοιµώξεων (10%), κυρίως ουρολοιµώξεων, λοιµώξεων του κατώτερου αναπνευστικού συστήµατος και διαπυήσεων τραυµάτων [3]. Οι σαλµονέλλες απαντούν τόσο στο περιβάλλον όσο και στα ζώα. Έχουν αποµονωθεί από πουλερικά, ερπετά, αιγοπρόβατα, βοοειδή, τρωκτικά, κατοικίδια ζώα, πουλιά και από τον άνρθωπο. Αποτελούν παγκοσµίως το συχνότερο αίτιο τροφιµογενών λοιµώξεων. Από επιδηµιολογικής άποψης οι σαλµονέλλες µπορούν να διακριθούν σε 3 οµάδες: α) αυτές που απαντούν µόνο στον άνθρωπο, β) αυτές που απαντούν στα ζώα και γ) αυτές που απαντούν στον άνθρωπο και στα ζώα. Στην πρώτη οµάδα ανήκουν οι S. typhi και S. paratyphi A, B, C. Αυτές είναι παθογόνες µόνο για τον άνθρωπο, πλην της S. paratyphi B που είναι παθογόνος και για τα ζώα. Οι σαλµονέλλες µεταδίδονται από τον µολυσµένο άνθρωπο µέσω της µόλυνσης του νερού ή των τροφίµων. Μόλυνση του κεντρικού δικτύου ύδρευσης µπορεί να οδηγήσει σε επιδηµία [3]. Πριν από µερικά χρόνια παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση των σαλµονελλώσεων µε τη µορφή πανδηµίας. Η αύξηση αυτή παρατηρήθηκε από το 1986 έως το 1995 σχεδόν σε όλες τις χώρες του κόσµου και οφείλονταν κυρίως στην αύξηση της S. enteritidis PT4 (90-95% των στελεχών). Αν και τα αίτια της αύξησης δεν έγιναν πλήρως γνωστά, αποδόθηκε κυρίως στα κοτόπουλα, στα αυγά και γενικά στη διασπορά των σαλµονελλών σε πολλά είδη τροφών. Στην Ελλάδα η αύξηση των σαλµονελλώσεων παρατηρήθηκε από το 1987 έως το 1994 µε κύριο ορότυπο τη S. enteritidis. Από το 1995 άρχισε να παρατηρείται σταδιακή ελάττωση. εύτερος σε συχνότητα ορότυπος ήταν η S. typhimurium. Από το 1998 παρατηρείται µικρή αύξηση της S. typhimurium, ιδιαίτερα του τύπου DT104. Η σαλµονέλλα αυτή εµφανίστηκε για πρώτη φορά στην Αγγλία το 1990 και σήµερα αποτελεί το 55% των στελεχών που αποµονώνονται στην Αγγλία. Ακολούθως ο ορότυπος αυτός εµφανίστηκε στις ΗΠΑ, στον Καναδά, αλλά και σε άλλες χώρες. Ιδιαίτερα 27

ανησυχητικό είναι το γεγονός ότι εµφανίστηκαν στελέχη S. Typhimurium DT 104 ανθεκτικά σε έξι συγχρόνως αντιβιοτικά (αµπικιλλίνη, χλωραµφενικόλη, στρεπτοµυκίνη, σουλφοναµίδες, σπεκτινοµυκίνη και τετρακυκλίνες). Η αύξηση των πολυανθεκτικών αυτών στελεχών έγινε ιδιαίτερα αισθητή στην Αγγλία και µάλιστα το 2000 τριπλασιάστηκε η αναλογία αποµόνωσης τέτοιων στελεχών σε σχέση µε το 1999, µε αποτέλεσµα να εντατικοποιηθεί η καταγραφή και η επιτήρηση. Πολυανθεκτικά στελέχη αποµονώθηκαν και από ζώα, όπως πουλερικά, γάτες και σκύλους. Πιστεύεται πως η εµφάνιση της πολυανθεκτικότητας των στελεχών σχετίζεται και µε τη χορήγηση αντιβιοτικών στα ζώα. Στην Ελλάδα, παρ όλο που παρατηρείται µικρή αύξηση των στελεχών S. typhimurium τα τελευταία χρόνια, δεν αποµονώνονται πολυανθεκτικά στελέχη. Το 1998 έκανε αισθητή την παρουσία του ένας άλλος ορότυπος, η S. blockley, η οποία προκάλεσε επιδηµίες σε πολλές χώρες της Ευρώπης και στην Ελλάδα, ενώ µέχρι τότε ο ορότυπος αυτός ήταν εξαιρετικά σπάνιος [4,5,20]. Τα είδη Enterobacter βρίσκονται κυρίως στο φυσικό περιβάλλον (έδαφος, νερό, λύµατα), αλλά έχουν και τη δυνατότητα αποικισµού του εντερικού σωλήνα των ανθρώπων και ζώων καθώς και του αναπνευστικού τους βλεννογόνου [18]. Τελευταία ενοχοποιούνται ως αίτια ενδονοσοκοµειακών λοιµώξεων, κυρίως ουρολοιµώξεων και σηψαιµίας. Η Serratia βρίσκεται τόσο στο περιβάλλον (έδαφος και νερό) όσο και στον άνθρωπο και τα ζώα αποικίζοντας παροδικά τους αναπνευστικούς βλεννογόνους και το γαστρεντερικό σωλήνα. Είναι δυνητικά παθογόνος. Αποτελεί αίτιο ενδονοσοκοµειακών λοιµώξεων, ιδιαίτερα σε ασθενείς χειρουργικών ουρολογικών κλινικών [3]. Ιδιαίτερα η Serratia marcescens εµπλέκεται σε ενδονοσοκοµειακές πνευµονίες, σηψαιµίες, λοιµώξεις ουροποιητικού και χειρουργικών τραυµάτων και ενδοκαρδίτιδες στους χρήστες ναρκωτικών ουσιών [18]. Το Citrobacter είναι µικρόβιο της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου του ανθρώπου και διαφόρων ζώων. Βρίσκεται στο φυσικό περιβάλλον (έδαφος, νερό, υγρά υπονόµων) και στα τρόφιµα που µολύνονται από 28

κόπρανα. Νόσος από το C. freundii αναπτύσσεται σε νοσοκοµειακούς ευπαθείς ασθενείς όπως τα νεογνά (µηνιγγίτις) και σε ασθενείς µε προβλήµατα από το ουροποιητικό ως ενδονοσοκοµειακή ή αυτόχθονη ουρολοίµωξη. Μπορεί επίσης να προκαλέσει λοιµώξεις του αναπνευστικού, κυρίως σε ασθενείς µε έκπτωση της ανοσιακής άµυνας. Περιγράφονται και περιπτώσεις τροφικής δηλητηρίασης από Citrobacter [3]. Τα είδη Proteus, Providencia, Morganella είναι µικρόβια του φυσικού περιβάλλοντος αλλά αποτελούν και µέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του ανθρώπου και των ζώων. [3,21]. Οι Πρωτείς είναι από τα πιο συχνά µικρόβια του φυσικού µας περιβάλλοντος αλλά και του σώµατός µας. Αποτελούν τον πρωταρχικό κρίκο στην αλυσίδα της αποσύνθεσης της οργανικής ύλης στο έδαφος. Στα νοσοκοµεία αποικίζουν όχι µόνο το έντερο αλλά και τον ανώτερο αναπνευστικό βλεννογόνο των ευπαθών ασθενών, των νεογνών και των ανοσοκατεσταλµένων. Ο P. vulgaris βρίσκεται στο έδαφος και τα νερά των υπονόµων και σπάνια είναι παθογόνος για τον άνθρωπο. Αποτελεί µέρος της συνεχώς ανανεούµενης χλωρίδας του δέρµατος της περιγεννητικής περιοχής. Ο P. mirabilis βρίσκεται επίσης στο έδαφος και τα νερά των υπονόµων, αλλά και στα κόπρανα των ανθρώπων, στους οποίους προκαλεί κυρίως ουρολοιµώξεις. Η Providencia rettgeri βρίσκεται κυρίως στα κόπρανα πουλερικών, στο νερό και στους βατράχους. Η Morganella είναι µικρόβιο µε αερογενή µετάδοση που συχνά αποικίζει χειρουργικά τραύµατα από εγκαύµατα. Σε νοσοκοµειακούς ασθενείς µπορεί να προκαλέσει ουρολοιµώξεις [18,22]. Οι σιγκέλλες είναι παθογόνα µικρόβια µόνο για τον άνθρωπο. Η κύρια νόσος που προκαλούν οι σιγκέλλες είναι η µικροβιακή δυσεντερία. Κανένα από τα πειραµατόζωα δεν παθαίνει δυσεντερία όταν λάβει σιγκέλλες από το στόµα, αλλά νοσούν κατά την ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση της ενδοτοξίνης της σιγκέλλας. Ο άνθρωπος µολύνεται από κόπρανα άλλου ανθρώπου που πάσχει από σιγκέλλωση ή από φορέα που αποβάλλει σιγκέλλα µε τα κόπρανα. Η 29

µετάδοση µπορεί να γίνει µε οποιονδήποτε τρόπο άµεσης ή έµµεσης επαφής µε τα κόπρανα αυτά. Η εντερίτιδα από τη S. sonnei είναι συχνή στην Ευρώπη και καµία χώρα δεν έχει πετύχει ακόµα την εκρίζωσή της παρ όλα τα µέτρα που λαµβάνονται [22]. Εµφανίζεται µε τη µορφή τροφογενών επιδηµιών σε κοινοβιούντες πληθυσµούς οικοτροφείων, ψυχιατρείων και άλλων ιδρυµάτων και σπανιότερα σαν σποραδικά κρούσµατα. Τροφογενείς επιδηµίες σιγκελλώσεων παρατηρήθηκαν και σε πληθυσµό της κοινότητας (πελάτες εστιατορίων ή καταστηµάτων παρασκευής έτοιµων τροφίµων). Στις ΗΠΑ ο αριθµός των σιγκελλώσεων που δηλώνονται στις ηµόσιες Υγειονοµικές υπηρεσίες κατ έτος κυµαίνεται γύρω στους 22.000 (επικρατεί η S. sonnei). Στις χώρες της Μέσης Ανατολής φαίνεται να επικρατεί η δυσεντερία από τη S. flexneri σα νόσος θερινής κατανοµής. Στις χώρες της Ασίας συχνότερες είναι οι βαριές δυσεντερίες από τη S. dysenteriae που ενδηµεί σε ορισµένες περιοχές των Ινδιών και του Μπαγκλαντές από τις οποίες ξεκινούν επιδηµίες. Τα τελευταία χρόνια οι περιπτώσεις σιγκέλλωσης στην Ελλάδα παρουσιάζουν σηµαντική ελάττωση. Στη χώρα µας, οι µισές από τις σιγκέλλες που αποµονώνονται από ασθενείς σε νοσοκοµεία για εντερική νόσο είναι S. sonnei και οι άλλες µισές S. flexneri. Πολυαντοχή εµφανίζεται σε όλες τις οµάδες σιγκελλών. Το 1973 ήταν ανθεκτικές στην αµπικιλλίνη τα 87% των στελεχών της S. sonnei και τα 66% της S. flexneri καθώς και όλα τα επιδηµικά στελέχη της S. dysenteriae σε µια επιδηµία στο Μπαγκλαντές [5,17]. Η Υερσίνια εντοπίζεται στις πλάκες του Payer του εντέρου. Ο άνθρωπος µολύνεται από τρόφιµα και ποτά µολυσµένα µε υερσίνιες, άµεσα ή έµµεσα όπως περίπου µε όλα τα άλλα εντεροβακτηριακά. Η Yersinia pestis στον άνθρωπο, τα ποντίκια και τους αρουραίους προκαλεί την πανώλη, νόσο µε πολύ υψηλή θνητότητα. Το µικρόβιο µεταδίδεται µε τον ψύλλο των ποντικών Xenopsylla cheopis. Η πανώλη δεν υπάρχει στην Ευρώπη σήµερα, αλλά υπάρχουν περιοχές στην Ασία όπου ενδηµεί. Κατά την τελευταία δεκαετία στον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας (Π.Ο.Υ) αναφέρθηκαν περίπου 15000 περιπτώσεις της νόσου [3]. 30

Η Y. enterocolitica είναι µικρόβιο παρασιτικό των θηλαστικών. Βρίσκεται στα άγρια και τα κατοικίδια ζώα όπως ο χοίρος, ο σκύλος, η γάτα, οι λαγοί κ.α. Έχουν διατυπωθεί πολλές απόψεις για τον τρόπο µόλυνσης του ανθρώπου. Φαίνεται ότι η µόλυνση αυτή γίνεται µε τους ίδιους τρόπους µε τους οποίους γίνονται οι µολύνσεις µε τα εντεροβακτηριακά και ότι η πύλη εισόδου είναι το πεπτικό σύστηµα. Η µόλυνση εποµένως µπορεί να γίνεται: α) Με τροφές και ποτά µολυσµένα από ζώο ή άνθρωπο φορέα (επειδή είναι µικρόβιο ψυχρόφιλο, διατηρείται στα τρόφιµα και στα ποτά σε ψυγείο). β) Με άµεση επαφή µε τον πάσχοντα ή µε φορέα. γ) Με µετάγγιση µολυσµένων ερυθρών αιµοσφαιρίων [3]. Πάντως στις περισσότερες µεµονωµένες περιπτώσεις είναι δύσκολο ή µάλλον αδύνατο να βρεθεί η πηγή του µικροβίου και ο τρόπος µετάδοσής του. Οι συχνότεροι παθογόνοι ορότυποι της Y. enterocolitica είναι για την Ευρώπη οι Ο:3, O:9, O:5 και για τις ΗΠΑ και χώρες της Άπω Ανατολής, οι O:8, O:13, O:20, O:21,O:18 [5]. Πηγή υερσινιών οροτύπου O:3 στην Ευρώπη θεωρούνται οι χοίροι και τα σκυλιά. Στη Φιλανδία και στις Σκανδιναβικές χώρες της Ευρώπης η συχνότητα των γαστρεντερίτιδων από την υερσίνια αυτή είναι τόσο υψηλή όσο και εκείνη από σαλµονέλλα. Αντίθετα, στις χώρες της Β. Αµερικής είναι σπάνιες οι υερσινιώσεις και επικρατεί ο ορότυπος O:8. Μέχρι το 1988 ήταν σχεδόν άγνωστες οι περιπτώσεις ή οι επιδηµίες από τον ορότυπο O:3, όταν εµφανίστηκε επιδηµία από τον ορότυπο αυτό στην Ατλάντα σε µαύρα παιδιά, τα 2/3 των οποίων είχαν φάει χοιρινό κρέας. Στην Ελλάδα επικρατεί ο ορότυπος O:3. Η Yersinia pseudotuberculosis είναι παθογόνος για οικιακά και άλλα ζώα, όπως η γάτα, η αγελάδα, το πρόβατο, ο χοίρος, η κατσίκα, το κουνέλι, οι αρουραίοι και κάποια άγρια ζώα. Στα ζώα αυτά προκαλεί νεκρωτική πυώδη κοκκιωµατώδη νόσο που προσβάλει το ήπαρ, το σπλήνα και τα λεµφικά αγγεία. Σπάνια µολύνεται ο άνθρωπος. Οι ανθρώπινες λοιµώξεις είναι πιθανόν αποτέλεσµα κατανάλωσης µολυσµένης τροφής ή νερού και είναι συχνότερες σε χώρες της Άπω Ανατολής, όπου εµφανίζονται επιδηµίες [3,22]. 31

1.4 Αποµόνωση Καλλιεργητικοί χαρακτήρες Εντεροβακτηριακά µπορεί να αποµονωθούν από κλινικά, τροφικά, φαρµακευτικά αλλά και άλλα δείγµατα. Τα περισσότερα εντεροβακτηριακά αναπτύσσονται πολύ καλά σε κοινά θρεπτικά υλικά όπως το θρεπτικό, το αιµατούχο και το σοκολατόχρωµο άγαρ και σε µεγάλο εύρος θερµοκρασιών (10-42 o C) µε ευνοϊκότερη θερµοκρασία τους 35-37 o C. Το διαφοροποιητικό υλικό που χρησιµοποιείται συχνότερα για την αποµόνωση των εντεροβακτηριακών είναι το MacConkey άγαρ. Το MacConkey άγαρ περιέχει ως βάση την πεπτόνη, ως δείκτη ουδέτερο του ερυθρού, άλατα χολής, λακτόζη και κρυσταλλικό ιώδες για την παρεµπόδιση της ανάπτυξης των Gram θετικών βακτηρίων και των µυκήτων. Στην περίπτωση που κάποιο εντεροβακτηριακό ζυµώνει τη λακτόζη, πέφτει το ph του θρεπτικού υλικού µε αποτέλεσµα η αποικία του µικροβίου να παίρνει κόκκινο-ροζ χρώµα [6]. Για την αποµόνωση των εντεροβακτηριακών από δείγµατα του εντερικού σωλήνα η καλλιέργεια περιλαµβάνει τη χρήση ενός κοινού θρεπτικού υλικού όπως το αιµατούχο άγαρ, το χαµηλής έως µέτριας εκλεκτικότητας MacConkey άγαρ και ένα υψηλότερης εκλεκτικότητας θρεπτικό υλικό όπως το Hektoen εντερικό άγαρ ή το XLD (xylose-lysinedeoxycholate) ή το S-S (Salmonella-Shigella) άγαρ. Μπορεί επίσης να συµπεριληφθεί θρεπτικός εµπλουτιστικός ζωµός όπως ζωµός σεληνίτη. Το Hektoen εντερικό άγαρ χρησιµοποιείται για την διάκριση των σαλµονελλών και των σιγκελλών από τα υπόλοιπα εντεροβακτηριακά. Περιέχει πεπτόνη, χολικά άλατα, λακτόζη, σουκρόζη, σαλικίνη, κιτρικό αµµώνιο σιδήρου (για την ανίχνευση παραγωγής του H 2 S) και ως δείκτες όξινη φουξίνη και κυανό της βρωµοθυµόλης. Σχεδόν παρόµοια, το XLD άγαρ χρησιµοποιείται για την διάκριση των σαλµονελλών και των σιγκελλών. Περιέχει ξυλόζη, L-λυσίνη, λακτόζη, σουκρόζη, δεοξυχολικό νάτριο, κιτρικό αµµώνιο σιδήρου και ως δείκτη ερυθρό της φαινόλης. Το S-S άγαρ είναι εκλεκτικό υλικό που εµποδίζει την ανάπτυξη των εσχεριχιών αλλά επιτρέπει την ανάπτυξη των σαλµονελλών και σιγκελλών. Περιέχει πεπτόνη, λακτόζη, χολικά άλατα, κιτρικό νάτριο, 32

θειοθεϊκό νάτριο, κιτρικό σίδηρο, στίλβον πράσινο και ως δείκτη ουδέτερο ερυθρό. Το θειοθειϊκό νάτριο αποτελεί πηγή θείου που χρησιµοποιείται από τα βακτήρια που παράγουν H 2 S και δίνει µαύρο χρώµα στις αποικίες αυτών από την καθίζηση του κιτρικού σιδήρου. Ο ζωµός σεληνίτη ενώ είναι τοξικός για τα περισσότερα εντεροβακτηριακά, ευνοεί την ανάπτυξη των Salmonella spp. Ειδικότερα για την αποµόνωση της Salmonella χρησιµοποιείται υψηλής εκλεκτικότητας θρεπτικό υλικό όπως το brilliant green άγαρ ή το bismuth sulfite άγαρ. Στο brilliant green άγαρ το στίλβον πράσινο εµποδίζει την ανάπτυξη των περισσοτέρων Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων συµπεριλαµβανοµένης της σιγκέλλας και της σαλµονέλλας του τύφου ενώ αναπτύσσονται όλες οι υπόλοιπες σαλµονέλλες. Τελευταία για την καλλιέργεια των εντεροβακτηριακών χρησιµοποιείται και το CHROMagar Orientation χρωµογόνο άγαρ (CHROMagar Co., Paris, France) µε το οποίο µπορεί να γίνει αδρή ταυτοποίηση βασισµένη στο χρώµα που παίρνουν οι αποικίες των βακτηρίων όταν αυτά αναπτυσσόµενα αντιδρούν ενζυµατικά µε χρωµογόνα συστατικά του υλικού. Η θρεπτική βάση του CHROMagar είναι πεπτόνη και γλυκόζη ενώ διάφορα άλλα συστατικά, µίγµατα χρωµογόνων και αντιβιοτικά συντελούν στην εύκολη ταυτοποίηση των εντεροβακτηριακών και ιδιαίτερα του E. coli O157: H7 [4]. 1.5. Ταυτοποίηση Η ταυτοποίηση των εντεροβακτηριακών µε βάση τις βιοχηµικές τους ιδιότητες (σακχαροδιασπαστικές και ενζυµικές-βιολογικές) γίνεται µε ορισµένες βιοχηµικές δοκιµασίες. Οι σπουδαιότερες από αυτές είναι: Ι) Η δοκιµασία διάσπασης της λακτόζης η οποία αναγνωρίζεται εύκολα κατά την ανάπτυξη σε θρεπτικά υλικά τα οποία περιέχουν λακτόζη και δείκτη. Έτσι γίνεται µια αδρή διάκριση των εντεροβακτηριακών σε γένη που ζυµώνουν τη λακτόζη (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter) και σε γένη που δε ζυµώνουν τη λακτόζη (Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Serratia, Proteus- Providencia) [17]. 33

ΙΙ) Η δοκιµασία παραγωγής της ινδόλης. Κατά την ανάπτυξη ορισµένων ειδών Εντεροβακτηριακών παράγεται το ένζυµο τρυπτοφανάση το οποίο διασπά το αµινοξύ τρυπτοφάνη που υπάρχει πλούσιο στην πεπτόνη του θρεπτικού υλικού σε ινδόλη. Η παραγωγή της ινδόλης ανιχνεύεται µε το αντιδραστήριο Kovacs (π-διµεθυλοαµινοβελζαλδεϋδη, αµυλική αλκοόλη, πυκνό υδροχλωρικό οξύ). ΙΙΙ) Η δοκιµασία διάσπασης της ακετυλοµεθυλοκαρβινόλης (ακετοϊνης) ή Voges Proskauer η οποία στηρίζεται στην ικανότητα που έχουν ορισµένα είδη Εντεροβακτηριακών να διασπούν τους υδατάνθρακες που υπάρχουν σε θρεπτικά υλικά (CLARK και LUBS) και να παράγουν ακετυλοµεθυλοκαρβινόλη. IV) Η δοκιµασία ερυθρού του µεθυλίου (methyl red) η οποία στηρίζεται στον κατά προσέγγιση προσδιορισµό του πυκνώµατος των ιόντων του θρεπτικού υλικού (CLARK και LUBS) κατά την παραγωγή µεγάλης ποσότητας οξέος από την ανάπτυξη κάποιων εντεροβακτηριακών. Το υλικό λαµβάνει κόκκινο χρώµα µε την προσθήκη ερυθρού του µεθυλίου σε θετική αντίδραση. V) Η δοκιµασία που ελέγχει την ικανότητα ανάπτυξης των εντεροβακτηριακών σε θρεπτικό υλικό (Koser, Simmons) το οποίο περιέχει ως µόνη πηγή άνθρακα το κιτρικό νάτριο. VΙ) Η δοκιµασία διάσπασης της ουρίας από εντεροβακτηριακά που παράγουν ουρεάση. VΙΙ) Η δοκιµασία παραγωγής υδρόθειου από εντεροβακτηριακά που διασπούν αµινοξέα που περιέχουν θείο. VΙΙΙ) Η δοκιµασία ρευστοποίησης της πηκτής [15]. ΙΧ) Η δοκιµασία διάσπασης διαφόρων σακχάρων (γλυκόζη, αδονιτόλη, αραβινόλη, δουλσιτόλη, εσκουλίνη, ινοσιτόλη, µαλτόζη, µαννιτόλη, σαλικίνη, σορβιτόλη, σουκρόζη, τρεχαλόζη, ξυλόζη) µε την παραγωγή οξέος και αερίου σε πεπτονούχα υλικά. Χ) οκιµασία αποκαρβοξυλίωσης αµινοξέων (λυσίνη, ορνιθίνη) και υδρόλυσης της αργινίνης. 34

ΧΙ) οκιµασία παραγωγής ONPG (β- γαλακτοσιδάσης). Η ONPG έχει δοµή παρόµοια µε τη δοµή της λακτόζης. ιασπάται υπό την επίδραση της β- γαλακτοσιδάσης προς γαλακτόζη και ορθο-νιτροφαινόλη. ΧΙΙ) οκιµασία αναγωγής των νιτρικών (ΝΟ 3 ) σε νιτρώδη (ΝΟ 2 ). ΧΙΙΙ) DNAάση δοκιµή ή δοκιµή δεοξυριβονουκλεάσης. Κάποια µικρόβια παράγουν DNAάση που διασπά το DNA. Το DNA καθιζάνει µε το υδροχλωρικό οξύ. XIV) PPA δοκιµή απαµίνωσης της φαινυλαλανίνης. Μερικά µικρόβια έχουν την ικανότητα να παράγουν πυροσταφυλικό οξύ από τη φαινυλαλανίνη. Στον Πίνακα 1.4 που ακολουθεί φαίνονται οι βιοχηµικές ιδιότητες των κυριότερων εντεροβακτηριακών. Υπάρχουν διάφορες προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση των εντεροβακτηριακών. Εκτός από τις κλασσικές βιοχηµικές δοκιµασίες µε τη µέθοδο των σωληναρίων οι οποίες ακόµα χρησιµοποιούνται σε εργαστήρια αναφοράς, σήµερα προτιµούνται manual συστήµατα µε τυποποιηµένα αντιδραστήρια του εµπορίου (API 20E, CRYSTAL,ΕNTEROTUBE κ.ά). Το API 20E (Analytical Profil Index) (BioMerieux Vitek, Hazelwood, Mo) είναι ένα αυτόνοµο µικροσύστηµα των συµβατικών βιοχηµικών δοκιµασιών ταυτοποίησης των εντεροβακτηριακών. Η ταυτοποίηση γίνεται µε την µετατροπή του αποτελέσµατος της αντίδρασης σε αριθµητικό προφίλ το οποίο στη συνέχεια ερµηνεύεται βάσει ειδικού καταλόγου [24]. Η εξέλιξη της µικροβιακής διαγνωστικής είναι η χρησιµοποίηση αυτοµατοποιηµένων συστηµάτων ταυτοποίησης (Vitek 60, Vitek II, Phoenix, Pasco-Difco κ.ά). Η ταυτοποίηση η οποία βασίζεται στις βιοχηµικές ιδιότητες των µικροβίων αποθηκευµένες στη µνήµη ηλεκτρονικού υπολογιστή, γίνεται µε τη βοήθεια αλγόριθµων. Ο συνδυασµός και η τελική ερµηνεία των αποτελεσµάτων στηρίζεται σε αρχές και µεθοδολογίες της στατιστικής [25]. Οι σαλµονέλλες, οι σιγκέλλες και τα εντεροπαθογόνα κολοβακτηρίδια ταυτοποιούνται συµπληρωµατικά και µε ορολογικές αντιδράσεις. Τέλος, ιδιαίτερα σηµαντικό ρόλο διαδραµατίζουν οι διάφορες µοριακές τεχνικές (PCR, RFLP, SEQUENCING), οι οποίες βοηθούν σηµαντικά αφενός 35

στη γρηγορότερη µικροβιακή ταυτοποίηση (ακόµα και χωρίς τη χρήση καλλιέργειας) και αφετέρου στην διερεύνηση και στην επιδηµιολογία της αντοχής των παθογόνων µικροοργανισµών. PCR ή polymerase chain reaction είναι η αλυσιδωτή αντίδραση του ενζύµου DNA πολυµεράση που χρησιµοποιείται για την ποσοτική µεγέθυνση ενός συγκεκριµένου τµήµατος DNA. Επιλέγεται ένα τµήµα DNA, που συνήθως περιέχει µία γονιδιακή περιοχή, και αυτό αποτελεί το στόχο (target) DNA, το οποίο µε πολλαπλές αντιγραφές πολλαπλασιάζεται. Ως άλυσοι αφετηρίες (εκκινητές-primers) χρησιµοποιούνται δύο συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια που έχουν δοµή συµπληρωµατική προς τις πλευρικές αλληλουχίες του DNA στόχου, το κάθε ένα αντίστοιχα προς τον ένα κλώνο του στόχου και µε αντίθετη κατεύθυνση. Τρία στάδια, η µετουσίωση (denaturation), η σύνδεση ή υβριδισµός των αφετηριών (annealing) και η επέκταση των αφετηριών (extention) µε τη σύνθεση καινούριου κλώνου DNA, αποτελούν έναν κύκλο της αντίδρασης PCR ο οποίος εκτελείται σε τρεις διαφορετικές θερµοκρασίες. Με επαναλαµβανόµενους κύκλους αυξάνει εκθετικά (8,16,64 κλπ) ο αριθµός των αντιγράφων του στόχου DNA, διότι οι κλώνοι που σχηµατίζονται χρησιµοποιούνται ως πρότυπο στον επόµενο κύκλο. Έτσι επιτυγχάνεται πολλαπλασιασµός (amplification) 2 n (n=ο αριθµός των κύκλων) µε την αντίδραση PCR [26]. 36

Πίνακας 1.4. Βιοχηµικές ιδιότητες των κυριοτέρων εντεροβακτηριακών Providencia Proteus ΓΕΝΟΣ / ΕΙ ΟΣ E.coli Klebsiella Enterobacter cloacae Serratia marcesens alcal stuart retgeri mirabilis vulgari peneri Salmonella Morganella morganii Shigella Citrobacter freundi ΙΑΣΠΑΣΗ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΕΡΙΟΥ ΙΑΣΠΑΣΗ ΛΑΚΤΟΖΗΣ + + + + + + + + + + + + + + ΚΟΙΝΗ Ι ΙΟΤΗΤΑ ΓΙΑ ΟΛΑ ΤΑ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΑ + + + +/- +/- - + + + + + + - + + + + Βραδέως - - - - - - - - - Βραδέως ONPG¹ + + + + - - - - - - - - ΚΙΝΗΤΙΚΟ- ΤΗΤΑ Υ ΡΟΛΥΣΗ ΟΥΡΙΑΣ 37 - sonei+ +/- - + + + + + + + + + + - + - + - - - -/+ - + + + - + - - CITRATE - + + + + + + + + + + - - + ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΝ ΟΛΗΣ + - Oxytoca + - - + + + - + + - + - ή + - Η 2 S - - - - - - - + + - + - - + PPA Phe 2 - - - - + + + + + + - + - - VP 3 - + + + - - - +ή- - - - - - - Arginine D - + - - - - - - - +ή - - - D Lysine + + - + - - - - - - + - - Ornithine D - + + - - - + - + + - sonei+ ΟΞΕΙ ΑΣΗ - - - - - - - - - - - - - - DNAάση 4 - - - + - - - - - - - - - - ΝΙΤΡΙΚΑ + + + + + + + + + + + + + + ONPG¹: ο-νιτρο-φαινυλ-β-γαλακτοπυρανοσίδη, PPA Phe 2 : απαµίνωση της φαινυλαλανίνης, VP 3 : Voges Proskauer, DNAάση 4 : δοκιµή δεοξυριβονουκλεάσης. +

1.6. Αντιγονική σύσταση Πολλές από τις χηµικές ουσίες του κυτταρικού τοιχώµατος, της κάψας και των βλεφαρίδων των εντεροβακτηριακών έχουν αντιγονικές ιδιότητες. Οι κυριότερες οµάδες αντιγόνων που χρησιµεύουν και για το διαχωρισµό των διαφόρων Εντεροβακτηριακών σε ορότυπους είναι οι εξής: 1) Αντιγόνα σωµατικά ή αντιγόνα-ο. Πρόκειται για το µεταβαλλόµενο πολυσακχαριδικό τµήµα του λιποπολυσακχαρίτη του κυτταρικού τοιχώµατος [3,20]. Είναι ανθεκτικό στη θερµότητα. Το αντιγόνο-ο είναι ειδικό για κάθε είδος. Σε ορισµένες όµως περιπτώσεις παρατηρούνται οµοιότητες µεταξύ των ειδών µε αποτέλεσµα να εµφανίζονται διασταυρούµενες αντιδράσεις όπως µεταξύ των αντιγόνων-ο της E. coli και της Shigella καθώς και της Salmonella µε το Citrobacter [19]. 2) Αντιγόνα βλεφαρίδων ή αντιγόνα-η. Πρόκειται για θερµοευαίσθητα πρωτεϊνικά µόρια που αποτελούν δοµικά συστατικά των βλεφαρίδων [19]. Σε µικροοργανισµούς που φέρουν βλεφαρίδες, τα αντιγόνα-η επικρατούν έναντι των αντιγόνων-ο και, µάλιστα, οι αντιδράσεις συγκόλλησης µέσω των αντιγόνων-η είναι πολύ πιο γρήγορες και έντονες από αυτές των αντιγόνων-ο [19]. Επειδή συχνά οι ξενιστές παράγουν αντισώµατα ειδικά για τα αντιγόνα- Η, τα οποία αντισώµατα ακινητοποιούν τα βακτήρια και κατ επέκταση εµποδίζουν τη λοιµογόνο δράση τους, τα εντεροβακτηριακά διαθέτουν µηχανισµούς ελέγχου και αλλαγής της έκφρασης των αντιγόνων-η ώστε να αποφεύγουν την επίπτωση της πρόσδεσης των ειδικών αντι-αντιγόνων-η αντισωµάτων [19]. 3) Αντιγόνα ελύτρου ή αντιγόνα-κ. Πρόκειται για θερµοευαίσθητα πολυσακχαριδικά ή πρωτεϊνικά µόρια, συστατικά του ελύτρου. Συχνά παρεµποδίζουν την ανίχνευση των αντιγόνων-ο, αλλά αυτό µπορεί να αποφευχθεί µε βρασµό του µικροοργανισµού που έχει ως αποτέλεσµα την καταστροφή και αποµάκρυνση του αντιγόνου-κ [20]. Συγκεκριµένα η αντιγονική δοµή των κυριοτέρων Εντεροβακτηριακών έχει ως εξής:

Escherichia coli. Η αντιγονική δοµή της E. coli είναι η τυπική των Gram αρνητικών βακτηρίων. Περιλαµβάνει τις τρεις κύριες οµάδες αντιγόνων: σωµατικά αντιγόνα-ο (~ 160 είδη), βλεφαριδικά αντιγόνα-η (~ 60 είδη) και αντιγόνα-κ ή ελύτρου (~ 100 είδη) [3,22]. Το σωµατικό αντιγόνο-o είναι θερµοανθεκτικό, δεν καταστρέφεται µε βρασµό για 60 και προκαλεί την παραγωγή αντισωµάτων που προκαλούν συγκόλληση του εναιωρήµατος της E. coli. Έχει παρατηρηθεί οµοιότητα µεταξύ Ο-αντίγονων της E. coli και άλλων Εντεροβακτηριακών, π.χ. το O124 της E. coli αντιδρά µε αντιορούς προς τα Ο- αντιγόνα της Shigella dysenteriae [19]. Όσον αφορά στα αντιγόνα-η, έχουν εντοπιστεί περίπου 60 διαφορετικά είδη, αλλά τα συχνότερα είναι τα Η1, Η12 και Η11 [22]. Πρόκειται για σταθερά µόρια που δεν εµφανίζουν µετάπτωση από µια φάση σε άλλη. Καταστρέφονται µε βρασµό και µονιµοποιούνται µε φορµόλη. Τα αντιγόνα-κ διακρίνονται σε περίπου 100 είδη και συντίθενται από ένζυµα της επιφάνειας της E. coli, ανεξάρτητα από το εάν πρόκειται για έλυτρο ή απλώς εξωτερική µεµβράνη [22]. Μερικά Κ αντιγόνα σχετίζονται µε συγκεκριµένες νόσους π.χ. το αντιγόνο-κ1 εντοπίζεται σε στελέχη E. coli που αποµονώνονται από ούρα ασθενών µε οξεία πυελονεφρίτιδα καθώς και στο 80% των αποµονωθέντων στελεχών E. coli από περιστατικά νεογνικής µηνιγγίτιδας και σηψαιµιών [22]. Αν και θεωρητικά θα µπορούσαν να υπάρχουν άπειροι συνδυασµοί αντιγόνων Ο, Η και Κ, είναι λίγοι οι συνδυασµοί αυτοί. Σε ό,τι αφορά την παραγωγή τοξινών από στελέχη E. coli εκτός της ενδοτοξίνης η οποία υπάρχει σε όλα τα Gram αρνητικά βακτηρίδια, ορισµένα στελέχη παράγουν και εξωτοξίνες: εντεροτοξίνες, αιµολυσίνες καθώς και κολισίνες [15]. Οι κολισίνες -των οποίων η παραγωγή ρυθµίζεται από πλασµίδιο- είναι ουσίες πρωτεϊνικές και δρουν µικροβιοκτόνα έναντι άλλων στελεχών του αυτού είδους ή συγγενών ειδών [15]. Shigella. Οι σιγκέλλες δεν διαθέτουν βλεφαριδικά αντιγόνα-η Το σωµατικό τους αντιγόνο παρουσιάζει ισχυρή αντιγονικότητα και πολλές διαφορές µεταξύ των διαφόρων υποοµάδων. Η µεγάλη πλειοψηφία των αντιγόνων-ο µοιάζει µε τα σωµατικά αντιγόνα της E. coli [22]. 39

Salmonella. Το γένος Salmonella περιλαµβάνει µια τεράστια ποικιλία από αντιγόνα-ο και Η [3]. Έχουν περιγραφεί περισσότεροι από 2000 ορολογικοί τύποι σαλµονελλών [3]. Η χρήση ειδικών αντιορών επιτρέπει την αναγνώριση των αντιγόνων αυτών µε αποτέλεσµα το διαχωρισµό και την ταυτοποίηση των σαλµονελλών (Πίνακας 1.3, Ταξινόµηση κατά Kauffman-White). Η κάθε σαλµονέλλα φέρει περισσότερα από ένα θερµοανθεκτικά αντιγόνα-ο. Με βάση το συνδυασµό αντιγόνων-ο που φέρουν οι σαλµονέλλες κατατάσσονται σε διάφορες οµάδες. Κατά τη διατήρηση της Salmonella σε υγρό θρεπτικό υλικό, το στέλεχος µεταπίπτει από την φάση S (smooth) στην R (rough) φάση οπότε µέρος του σωµατικού αντιγόνου µπορεί να χαθεί [3]. Όσον αφορά στα βλεφαριδικά αντιγόνα του γένους Salmonella, αυτά παράγονται τόσο από κινητά όσο και από µη κινητά στελέχη. Επίσης, οι σαλµονέλλες παράγουν 2 ειδών αντιγόνα-η : α) αντιγόνα-η 1 ης φάσης ή ειδικά και β) αντιγόνα-η 2 ης φάσης ή µη ειδικά [22]. Τα στελέχη που παράγουν βλεφαριδικά αντιγόνα και των δύο φάσεων ονοµάζονται διφασικά, ενώ αυτά που παράγουν αντιγόνα µόνο της 1 ης φάσης λέγονται µονοφασικά [22]. Επιπλέον, ορισµένα είδη Salmonella, όπως S. typhi, S. paratyphi και S. dublin φέρουν κι ένα ακόµη αντιγόνο περιβλήµατος, το αντιγόνο Vi [22]. Πρόκειται για ένα θερµοευαίσθητο όξινο πολυσακχαριδικό πολυµερές, που περιβάλλει το αντιγόνο-ο, παρεµποδίζοντας έτσι τη συγκόλληση της Salmonella µε τους ειδικούς αντιορούς [3]. Έχει παρατηρηθεί σε πειραµατόζωα ότι στελέχη που φέρουν το αντιγόνο Vi (Vi = virulence) είναι πιο παθογόνα από στελέχη που δεν το έχουν αν και το αντιγόνο Vi από µόνο του δεν είναι παθογόνο, παρά µόνο σε συνδυασµό µε το αντιγόνο-ο [22]. Θεωρείται ότι το αντιγόνο Vi προστατεύει τη Salmonella από τη φαγοκυττάρωση. Klebsiella. Τα κύρια αντιγόνα της Klebsiella είναι το Κ-αντιγόνο του ελύτρου και το Ο-σωµατικό αντιγόνο [3]. Συνήθως τα στελέχη Klebsiella διακρίνονται σε τύπους Κ και σπανιότερα σε τύπους Ο. Τα σωµατικά αντιγόνα της Klebsiella παρουσιάζουν µεγάλη οµοιότητα µε τα αντιγόνα-ο της E. coli [3]. Τα αντιγόνα-κ αποτελούνται συνήθως από γλυκουρονικό οξύ και 2-4 σάκχαρα. Ακόµη, στελέχη Klebsiella παράγουν και ινιδιακά αντιγόνα, που 40

διακρίνονται σε πυκνά και αραιά, καθώς και τα R-αντιγόνα που αποκαλύπτονται µετά την απώλεια των Κ- και Ο-αντιγόνων [22]. Τα αντιγόνα Κ1-Κ6 απαντώνται κυρίως σε στελέχη που προκαλούν λοιµώξεις του αναπνευστικού [3]. Proteus. Η αντιγονική δοµή του γένους περιέχει σωµατικά αντιγόνα-ο και βλεφαριδικά αντιγόνα-η. Τα είδη P. mirabilis και P. vulgaris έχουν κοινό αντιγόνο-ο. Επίσης, το αντιγόνο Ο19 του P. vulgaris είναι ταυτόσηµο µε σωµατικά αντιγόνα του γένους Rickettsia [3]. Yersinia. Το αντιγόνο-ο είναι ισχυρό αντιγόνο, λιποπολυσακχαριδικό και παρουσιάζει διαχωριστική αντιγονικότητα στα διάφορα στελέχη. Ορισµένοι Ο- ορότυποι της Y. enterocolitica ανήκουν σε συγκεκριµένους βιοτύπους και προκαλούν συχνότερα ορισµένες κλινικές εικόνες [3]. 1.7. Κλινική σηµασία Παθογόνος ράση Εντεροβακτηριακών Η οικογένεια των Εντεροβακτηριακών περιλαµβάνει έναν σηµαντικό αριθµό παθογόνων ειδών, που είναι αίτια διαφόρων λοιµώξεων στον άνθρωπο [6]. Τα είδη αυτά µπορούν να διακριθούν στα ευκαιριακά παθογόνα και στα παθογόνα. Στην κατηγορία των παθογόνων ανήκουν τα Εντεροβακτηριακά Salmonella typhi, Shigella spp. και Yersinia pestis, που προκαλούν τυφοειδή πυρετό, δυσεντερία και βουβωνική πανώλη, αντίστοιχα [6]. Στα ευκαιριακά παθογόνα ανήκουν τα Citrobacter spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Serratia spp., τα οποία σε υγιή άτοµα δεν προκαλούν νόσο [6]. Παρ ότι πρόκειται για ευκαιριακά παθογόνα, η λοιµογόνος δράση τους µπορεί να προκαλέσει θανατηφόρες λοιµώξεις σε άτοµα µε πτώση του ανοσοποιητικού συστήµατος ή σε ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς. Το είδος Escherichia coli αποτελεί ιδιαίτερη περίπτωση αφού αποτελεί µέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου του ανθρώπου, όµως, δύναται να επιµολύνει άλλες περιοχές του σώµατος µε αποτέλεσµα την πρόκληση σοβαρών λοιµώξεων [6]. 41