ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ : ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ MEL ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΜΟΝΙΜΗ ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗ ΜΕ ΤΟ ΠΛΗΡΟΥΣ ΜΗΚΟΥΣ ΑΝΤΙΝΟΗΜΑΤΙΚΟ RPS5 cdna ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Ζοπουνίδου Ελένη Ιατρός Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια Επιβλέπων Καθηγητής : Ιωάννης Σ. Βιζιριανάκης, Ph.D., Αναπληρωτής Καθηγητής Μοριακής Φαρμακολογίας και Φαρμακογονιδιωματικής, Α.Π.Θ. 1

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕ ΘΕΜΑ : «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ MEL ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΜΟΝΙΜΗ ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗ ΜΕ ΤΟ ΠΛΗΡΟΥΣ ΜΗΚΟΥΣ ΑΝΤΙΝΟΗΜΑΤΙΚΟ RPS5 cdna» ΕΛΕΝΗ Γ. ΖΟΠΟΥΝΙΔΟΥ ΙΑΤΡΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΦΟΙΤΗΤΡΙΑ Εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τομέα Φαρμακολογίας- Φαρμακογνωσίας του τμήματος Φαρμακευτικής του Α.Π.Θ. στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών στην κατεύθυνση «Φαρμακολογία και Θεραπευτική» ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ : Ιωάννης Σ. Βιζιριανάκης, Αναπληρωτής Καθηγητής Μοριακής Φαρμακολογίας και Φαρμακογονιδιωματικής Α.Π.Θ. (επιβλέπων) Αστέριος Σ. Τσιφτσόγλου, Καθηγητής Φαρμακολογίας Α.Π.Θ. Χρήστος Α. Παναγιωτίδης, Αναπληρωτής Καθηγητής Κυτταρικής & Μοριακής Βιολογίας Α.Π.Θ. 2

Στην οικογένειά μου Στον Παναγιώτη 3

Ευχαριστίες Η παρούσα Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τομέα Φαρμακολογίας-Φαρμακογνωσίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.), στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών της Κατεύθυνσης «Φαρμακολογία και Θεραπευτική», υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή Μοριακής Φαρμακολογίας και Φαρμακογονιδιωματικής κ. Ιωάννη Σ. Βιζιριανάκη. Κατ αρχήν, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Ιωάννη Σ. Βιζιριανάκη για την συνεχή υποστήριξή του καθ όλη τη διάρκεια του προγράμματος μεταπτυχιακών σπουδών, για την ακούραστη καθοδήγησή του κατά τη διαδικασία συγγραφής του κειμένου, την πίστη του σε μένα και τη θετική ενέργεια που μου μετέδιδε, καθώς και για τις νέες προεκτάσεις που δημιούργησε στις γνώσεις και τη σκέψη μου αναφορικά με τη Μοριακή Φαρμακολογία και τη Φαρμακογονιδιωματική στην Ιατρική Επιστήμη, μέσω αυτής της συνεργασίας. Ακόμη, ευχαριστώ ιδιαιτέρως τον Καθηγητή κ. Αστέριο Σ. Τσιφτσόγλου για τη μύηση στα μονοπάτια της βασικής έρευνας και για τις διδακτικές και εποικοδομητικές του παρατηρήσεις. Ευχαριστώ επίσης, τον καθηγητή μου στο Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών κ. Χρήστο Α. Παναγιωτίδη, πρώτον γιατί δέχθηκε να αποτελέσει μέλος της εξεταστικής τριμελούς επιτροπής και ακόμη γιατί μου έμαθε πως «Υπάρχουν πολλοί τρόποι να κάνεις κάτι λάθος, μα μόνο ένας τρόπος για το κάνεις σωστά». Ευχαριστώ θερμά τα μέλη του εργαστηρίου Βιοχημείας του Τομέα Βιοχημείας στο τμήμα Χημείας του Α.Π.Θ. κ. Νικολακάκη Ελένη, κ. Δανιηλίδου Μακρίνα και κ. Κουτρουμάνη Μαρία για την συνεργασία, την υπομονή και τις εύστοχες συμβουλές, καθ όλη τη μακρά διάρκειας της προσπάθειας φωτογραφικής αποτύπωσης των καλλιεργειών. Θέλω να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την υποψήφια διδάκτορα Έλσα Αμανατιάδου για την αποδοχή, την υπομονή, την ακούραστη βοήθεια και την καταλυτική της παρουσία από την έναρξη του πειραματικού τμήματος του 4

Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών. Μέσω της αγάπης της προς το αντικείμενο και της συνέπειάς της σ αυτό, πρωτοήρθα σε επαφή με το εργαστήριο της βασικής έρευνας. Ευχαριστώ όλους του συνοδοιπόρους και φίλους στο εργαστήριο Φαρμακολογίας για το θετικό και δημιουργικό κλίμα στην καθημερινότητα του εργαστηρίου και την αλληλεγγύη στις όποιες δυσκολίες αυτής της διαδρομής. Ευχαριστώ μέσα από την καρδιά μου τους γονείς μου και τον αδερφό μου που με στήριξαν με κάθε τρόπο στην επιθυμία μου να συνεχίσω τις σπουδές μου σ ένα πρωτόγνωρο αντικείμενο γεμάτο προκλήσεις. Τέλος, ευχαριστώ τον Παναγιώτη μου, που με παρακίνησε να διευρύνω τους ορίζοντές μου και υπήρξε δίπλα μου σε όλο αυτό το ταξίδι. 5

Πίνακας Περιεχομένων Α. Εισαγωγή... 12 Α.1. Ερυθροποίηση. Ανάλυση σε μοριακό και κλινικό επίπεδο... 12 A1.1. Η συμμετοχή των mirnas στην ερυθροποίηση... 15 Α2. Διαταραχές της Ερυθροποίησης... 17 Παθοφυσιολογία και εμπλεκόμενοι μοριακοί μηχανισμοί... 17 Α2.1. Τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα (ΜΔΣ) και η κλινική οντότητα του Συνδρόμου Del5q... 19 Α2.1.1.Επιδημιολογία των ΜΔΣ... 22 Α2.1.2.Κλινικά και Εργαστηριακά Χαρακτηριστικά στα ΜΔΣ... 22 Α2.1.3.Διάγνωση των ΜΔΣ... 23 Α2.1.4. Διαφορική διάγνωση των ΜΔΣ... 24 Α2.1.5. Θεραπεία στα ΜΔΣ... 24 Α2.1.5.1 Τα επιγενετικά φάρμακα. Κατηγορίες και μηχανισμοί δράσης... 25 Α2.1.5.1.α. Η 5-αζακυτιδίνη και η 5-αζα-2-δεοξυκυτιδίνη... 26 Α2.1.5.1.β. Οι αναστολείς της αποακετυλάσης των ιστονών (HDACIs)... 28 Α2.1.6. Το Σύνδρομο del5q... 29 Α2.2. Σύνδρομα Συγγενούς Ανεπάρκειας Μυελού των Οστών... 31 A2. 2. 1. Το σύνδρομο Diamond-Blackfan... 32 A2. 2. 1. 1. Επιδημιολογία... 32 Α.2.2.1.2. Κλινικά και εργαστηριακά χαρακτηριστικά της DBA... 32 A2.2.1.3.Διάγνωση της DBA... 33 Α2.2.1.4. Διαφορική διάγνωση DBA... 34 Α2.2.1.5. Θεραπεία στην DBA... 35 Α2.2.1.6. Κλινική εξέλιξη της DBA... 36 6

Α3. Διαταραχές της ερυθροποίησης και ριβοσωμικές πρωτεϊνες... 36 Α3.1. Η παθοφυσιολογία της DBA συσχετίζεται με μεταλλάξεις των γονιδίων συγκεκριμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών... 37 Α3.2. Η παθοφυσιολογία και η κλινική εικόνα του συνδρόμου del5q συσχετίζεται με μεταλλάξεις συγκεκριμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών στους ασθενείς... 41 Α4. Τα MEL κύτταρα ως μοντέλο μελέτης της ερυθροδιαφοροποίησης in vitro... 44 Α4.1. Η δέσμευση των MEL προς διαφοροποίηση (commitment) και η κυτταρική «μνήμη»... 44 Α4.2. Τα υποπρογράμματα της διαφοροποίησης στα MEL και οι μεταβολές που παρατηρούνται... 45 Α4.3. Το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των ριβοσωμικών πρωτεϊνών μεταβάλλεται κατά την ερυθροδιαφοροποίηση των MEL κυττάρων In vitro... 48 Α5. Τα antisense μετάγραφα και η antisense τεχνολογία για εφαρμογή στη Μοριακή Βιολογία και Φαρμακολογία... 51 Α5.1. Η τεχνική της ενδοπαρεμβολής του RNA (RNA interference RNAi) και η συσχέτιση με την αντίστοιχη antisense τεχνολογία... 59 Α5.2. Φαρμακολογικές και θεραπευτικές εφαρμογές της antisense τεχνολογίας... 61 Β. Υλικά και Μέθοδοι... 63 Β1. Υλικά... 63 Β1.1.Βιολογικά Υλικά... 63 Β1.2. Θρεπτικά Υλικά-Οροί-Αντιβιοτικά... 64 Β1.3. Χημικά Αντιδραστήρια... 64 Β2. Μέθοδοι... 65 Β2.1. Καλλιέργειες κυττάρων MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5 65 Β2.2. Μέτρηση Κυτταρικής Ανάπτυξης... 65 7

Β2.3. Προσδιορισμός των διαφοροποιημένων κυττάρων-χρωματομετρική μέθοδος Βενζιδίνης-Η₂Ο₂... 66 Β2.4. Προσδιορισμός του κυτταρικού θανάτου με Χρώση Trypan Blue... 67 Β2.5. Απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA με τη χρήση του kit NucleoSpin RNA/ Protein ή NucleoSpin II της εταιρίας Macherey Nagel... 68 Β2.6. Απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA με τη μέθοδο της Θειοκυανικής Γουανιδίνης... 71 Β2.7. Κατακρήμνιση του RNA... 72 B2.8. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων (DNA/ RNA)... 73 B2.9. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πηκτή αγαρόζης... 74 B2.10.Α. Αλυσιδωτή αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)... 75 Β2.10.Β. Αντίστροφη Μεταγραφάση-Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (RT- PCR)... 76 Β2.11. Χρωματομετρικός ποσοτικός προσδιορισμός της αιμοσφαιρίνης... 79 Β2.12. Χρώσεις Κυττάρων May-Grunwald-Giemsa(MGG)... 81 Β2.13. Αποτύπωση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών και των χαρακτηριστικών των Χρώσεων... 83 Γ. Σκοπός... 84 Δ. Πειραματικά Αποτελέσματα... 85 Δ1. Δημιουργία της μόνιμης κυτταρικής σειράς MEL-antisenseRPS5 μετά από μόνιμη επιμόλυνση των κυττάρων MEL με το πλήρους μήκους αντινοηματικό RPS5 cdna του ποντικού... 85 Δ2. Μελέτη της Κινητικής Ανάπτυξης, Διαφοροποίησης και κυτταρικού Θανάτου στις Καλλιέργειες MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5... 87 Δ2.1. Συγκριτικές Κινητικές Ανάπτυξης των κυττάρων MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5... 88 8

Δ.2.2. Συγκριτικές Κινητικές Διαφοροποίησης των κυττάρων MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5.... 92 Δ2.3. Συγκριτικές μελέτες του κυτταρικού θανάτου των καλλιεργειών MEL- Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5... 93 Δ3. Μορφολογικά-Φαινοτυπικά Χαρακτηριστικά των Κυττάρων MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5... 98 Δ3.1. Φωτογραφική αποτύπωση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των κυττάρων MEL-Parental.... 101 Δ3.2. Φωτογραφική αποτύπωση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των κυττάρων MEL-C14.... 101 Δ3.3. Φωτογραφική αποτύπωση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των κυττάρων MEL-antisenseRPS5.... 102 Δ4. Φωτογραφική αποτύπωση των κυττάρων MEL-Parental, MEL-C14 και MELantisenseRPS5 μετά από τη Χρώση May-Grunwald-Giemsa μετά την προσθήκη ΗΜΒΑ.... 104 Δ.4.1. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης May-Grunwald (MG) στα κύτταρα MEL-Parental μετά την προσθήκη ΗΜΒΑ.... 106 Δ.4.2. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης May-Grunwald (MG) στα κύτταρα MEL-C14 μετά την προσθήκη ΗΜΒΑ.... 106 Δ.4.3. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης May-Grunwald (MG) στα κύτταρα MEL-antisenseRPS5 μετά την προσθήκη ΗΜΒΑ.... 107 Δ4.4. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης Giemsa στα κύτταρα MEL-Parental μετά την προσθήκη του ΗΜΒΑ.... 109 Δ.4.5. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης Giemsa στα κύτταρα MEL-C14 μετά την προσθήκη του ΗΜΒΑ.... 109 Δ.4.6. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης Giemsa στα κύτταρα MELantisenseRPS5 μετά την προσθήκη του ΗΜΒΑ.... 110 Δ4.7. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης May-Grunwald-Giemsa (MGG) στα κύτταρα MEL-Parental μετά την προσθήκη του ΗΜΒΑ.... 112 9

Δ.4.8. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης May-Grunwald-Giemsa (MGG) στα κύτταρα MEL-C14 μετά την προσθήκη του ΗΜΒΑ.... 112 Δ.4.9. Φωτογραφική αποτύπωση της χρώσης May-Grunwald-Giemsa (MGG) στα κύτταρα MEL-antisenseRPS5 μετά την προσθήκη του ΗΜΒΑ.... 112 Δ5. Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης των διαφόρων καλλιεργειών των MEL κυττάρων απουσία ή παρουσία του ΗΜΒΑ με RT-PCR ανάλυση.... 113 Δ5.1. Χρονοεξαρτώμενη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στα κύτταρα MELantisenseRPS5 κατά την ανάπτυξη των κυττάρων στην καλλιέργεια.... 113 Δ5.2. Συγκριτική χρονοεξαρτώμενη RT-PCR ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης στα κύτταρα MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5 παρουσία του επαγωγέα διαφοροποίησης ΗΜΒΑ.... 116 Δ5.3.RT-PCR ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου β -major στα κύτταρα MELantisenseRPS5 που καλλιεργήθηκαν παρουσία του επαγωγέα διαφοροποίησης HMBA... 119 Δ5.4. Συγκριτική RT-PCR ανάλυση των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης για την β-ακτίνη, την RPS5 και το β -major στα κύτταρα MEL-Parental, MEL-C14 και MELantisenseRPS5 πριν την προσθήκη του επαγωγέα διαφοροποίησης HMBA... 121 Δ6. Χρονοεξαρτώμενη ποσοτική μελέτη συσσώρευσης της αιμοσφαιρίνης σε κύτταρα MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5 που υπόκεινται σε διαφοροποίηση με τον επαγωγέα ΗΜΒΑ... 123 Δ6.1. Μέτρηση της συσσώρευσης της αιμοσφαιρίνης ανά 10⁷ κύτταρα στις καλλιέργειες MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5... 123 Δ6.2. Μέτρηση της συσσώρευσης της αιμοσφαιρίνης ανά 10⁷ διαφοροποιημένα κύτταρα στις καλλιέργειες MEL-Parental, MEL-C14 και MELantisenseRPS5... 126 Ε. Συζήτηση... 129 Ε1. Το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυττάρων MEL μετά από μόνιμη επιμόλυνση με το πλήρους μήκους αντινοηματικό RPS5 cdna... 131 10

Ε2.1. Η σημασία της επιμολύνσης των κυττάρων MEL με το antisense RPS5 cdna στην ικανότητα διαφοροποίησης.... 135 Ε.2.2. Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των κυττάρων MEL-Parental, MEL-C14 και MEL-antisenseRPS5 με χρώση May-Grunwald-Giemsa (MGG)... 138 Ε.3. Η ερυθροδιαφοροποίηση στα MEL-antisenseRPS5 κύτταρα και τα επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών.... 139 ΣΤ. Περίληψη... 143 Ζ. Summary... 145 Η. Συντμήσεις... 147 Θ. Βιβλιογραφία... 152 11

Α. Εισαγωγή Κυρίαρχο στοιχείο της παρούσας μεταπτυχιακής πειραματικής διπλωματικής εργασίας αποτελεί η συσχέτιση του ρόλου της ριβοσωμικής πρωτεϊνης RPS5 με διαταραχές της ερυθροποίησης. Έτσι, το εισαγωγικό τμήμα θα καλύψει διάφορες πτυχές του συγκεκριμένου επιστημονικού πεδίου που αφορούν την ερυθροδιαφοροποίηση και τις διαταραχές αυτής με το ρόλο συγκεκριμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών και με την ανάλυση πειραματικών δεδομένων με πιθανό φαρμακολογικό ενδιαφέρον και προσέγγιση. Α.1. Ερυθροποίηση. Ανάλυση σε μοριακό και κλινικό επίπεδο Η διαδικασία της ερυθροποίησης είναι η διαδικασία μέσω της οποίας παράγονται τα ερυθρά αιμοσφαίρια στο περιφερικό αίμα. Πρόκειται για μία πολυσταδιακή, πολύπλοκη και καλά ενορχηστρωμένη διαδικασία κατά την οποία τα αρχέγονα πολυδύναμα αιμοποιητικά στελεχιαία κύτταρα δίνουν τη θέση τους σε ώριμα, λειτουργικά πλέον, ερυθροκύτταρα (Tsiftsoglou et al.2009). Στα θηλαστικά η ερυθροποίηση ξεκινά στο εμβρυϊκό ήπαρ μέσω κυττάρων προγεννητόρων του λεκιθικού ασκού και συνεχίζεται στον ενήλικα στο μυελό των οστών (Palis et al. 1999). Αρχικά, διακρίνεται ο πληθυσμός των πολυδύναμων στελεχιαίων κυττάρων (Hemopoietic Stem Cells-HSC) που γεννούν τους πρώιμους και αργά αναπτυσσόμενους προγεννήτορες BFU-E (Burst-Forming Unit-Erythroids). Αυτοί με τη σειρά τους διαιρούμενοι και παράλληλα διαφοροποιούμενοι δίνουν τους ταχέως διαιρούμενους CFU-E (Colony-Forming-Unit-Erythroids) προγεννήτορες. Οι CFU-E προγεννήτορες διαιρούνται 3-5 φορές σε διάστημα 2-3 ημερών και καθώς διαφοροποιούνται υφίστανται ουσιαστικές αλλαγές οι οποίες περιλαμβάνουν την 12

ελάττωση του μεγέθους τους, την πύκνωση της χρωματίνης και την παραγωγή αιμοσφαιρίνης έως την επακόλουθη εκπυρήνιση τους. Έτσι, προκύπτουν διαδοχικά ο προερυθροβλάστης, ο βασεόφιλος ερυθροβλάστης, ο πολυχρωματοφιλικός ερυθροβλάστης, ο ορθοχρωματικός νορμοβλάστης, τα δικτυοερυθροκύτταρα και τέλος τα ώριμα ερυθρά αιμοσφαίρια (Εικόνα 1Α,Β) (Fawcett 1997). Α. Β. Εικόνα 1Α. Σχηματική αναπαράσταση της φυσιολογικής αιμοποίησης και απεικόνιση του μονοπατιού της ανάπτυξης των ερυθροκυττάρων (Tsiftsoglou et al.2009). Β. Συνοπτική παρουσίαση της ερυθροποίησης αναφορικά με την κυτταρική διαφοροποίηση και τα αναπτυξιακά στάδια παραγωγής ερυθροκυττάρων. 13

Στους παράγοντες που ρυθμίζουν την ερυθροποίηση ανήκουν: η ομοιόσταση του σιδήρου και της αίμης, η υποξία, το στρες, αναπτυξιακοί παράγοντες, μεταγραφικοί παράγοντες και τα mirnas που διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στον έλεγχο παραγωγής ερυθροκυττάρων. Κάθε στάδιο της ερυθροποίησης ρυθμίζεται από διαφορετικές κυτοκίνες. Τα πρώτα στάδια της ερυθροποίησης ελέγχονται σε μεγάλο βαθμό από την ερυθροποιητίνη (EPO), μία ορμόνη που παράγεται από την παρασπειραματική συσκευή του νεφρού και η οποία διεγείρεται σε συνθήκες υποξίας οδηγώντας στην τελική διαφοροποίηση τους CFU-E προγεννήτορες (Molineux et al.2009). Η διαφοροποίηση των BFU-E προγεννητόρων εξαρτάται κατά κύριο λόγο από την ερυθροποιητίνη, γεγονός που δεν ισχύει τόσο στα επόμενα αναπτυξιακά στάδια. Άλλωστε, έχει δειχθεί πειραματικά πως οι υποδοχείς της ερυθροποιητίνης μειώνονται σημαντικά κατά την πορεία της ερυθροδιαφοροποίησης (Zhang et al. 2003). Έτσι, οι BFU-E απαντούν σε ορμονικά ερεθίσματα που δέχονται τόσο από την ερυθροποιητίνη όσο και από άλλους παράγοντες όπως ο SCF (Stem Cell Factor), ο IGF-1 (Insulin Growth Factor-1), τα κορτικοστεροειδή,η IL-3 και η IL-6. Πρόσφατα έχει επίσης αναδειχθεί η σημασία της φιμπρονεκτίνης, μιας πρωτεϊνης της ουσίας του εξωκυττάριου πλέγματος στη διαδικασία της ερυθροποίησης (Eshghi et al.2007). Η λειτουργική ρύθμιση που επιτελούν οι μεταγραφικοί παράγοντες δεν έγκειται μόνο στην ενεργοποίηση ειδικών για την ερυθροδιαφοροποίηση γονιδίων, αλλά και στην εκλεκτική καταστολή της μεταγραφικής πολυδυναμικότητας των στελεχιαίων κυττάρων και των προγεννητόρων, ευνοώντας κατ αυτόν τον τρόπο την ωρίμανση της ερυθράς σειράς έναντι των άλλων σειρών που παράγουν τα υπόλοιπα έμμορφα συστατικά του αίματος (Akashi et al.2003). Ιδιαίτερα ο ρόλος του GATA-1 στην ερυθρά διαφοροποίηση δεν χαρακτηρίζεται απλά ως ρυθμιστικός. Φαίνεται πως επιτελεί καθοδηγητικό ρόλο επιβάλλοντας κατά κάποιο τρόπο ένα μεταγραφικό πρόγραμμα που ενισχύει την κατεύθυνση της ερυθράς σειράς σε κύτταρα που έχουν τη δυνατότητα να εκτραπούν σε διαφορετικές κατευθύνσεις (Graf T.2002). Αναφέρονται επίσης σημαντικές αλληλεπιδράσεις με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι FOG-1, EKLF, TAL-1/SCL, PU.1 και συμπαράγοντες όπως oι CBP/p300, Brg1, MeCP1/NuRD και άλλοι (Ferreira et al.2005). 14

Το πεδίο της φυσιολογίας της ερυθροδιαφοροποίησης με τους εμπλεκόμενους μοριακούς μηχανισμούς είναι αρκετά εκτεταμένο και πολύπλοκο, κρίνεται όμως σκόπιμο να μην υπάρξει περαιτέρω ανάλυση στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας παρά μόνο ορισμένα δεδομένα για το ρόλο ορισμένων μορίων RNA στη διαδικασία αυτή. Αντίθετα, θα υπάρξει εκτεταμένη αναφορά σε στοιχεία που αφορούν την παθοφυσιολογία των διαταραχών της ερυθροποίησης στις επόμενες ενότητες. A1.1. Η συμμετοχή των mirnas στην ερυθροποίηση Τα τελευταία χρόνια έχει αρχίσει να αναδεικνύεται ο ρόλος των micrornas (mirnas) στη ρύθμιση της ερυθροποίησης. Τα mirnas αποτελούν μικρά RNAs (μήκους 21-25 νουκλεοτιδίων) που δεν κωδικοποιούν πρωτεϊνες και ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε μεταμεταγραφικό επίπεδο. Αυτό το επιτυγχάνουν μέσω πρόσδεσης στην 3 αμετάφραστη περιοχή του mrna-στόχου. Εικόνα 2 : Απεικόνιση του σχηματισμού και της ωρίμανσης των mirnas καθώς και της μεταφραστικής καταστολής της έκφρασης των γονιδίων Ανάλογα με την έκταση της συμπληρωματικότητας επακολουθεί κατακερματισμός 15

του mrna ή αναστολή της μετάφρασης (Chang and Mendell, 2007). Tα mirnas μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση II ως μεγάλου μήκους (περίπου 1kb) πρόδρομα RNA μετάγραφα (pri-mirnas), φέρουν μία καλύπτρα στο 5 άκρο τους και μια ουρά polyα στο 3 άκρο τους, ενώ αναδιπλώνονται με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίζουν δομές μίσχου-θηλιών. Τα μόρια αυτά στη συνέχεια μετατρέπονται σε ώριμα mirnas. Τα pri-mirnas υφίστανται επεξεργασία στον πυρήνα από το ένζυμο Drosha (μία RNAάση) προς pre-mirnas μήκους 60 νουκλεοτιδίων. Έπειτα, με ενεργητική μεταφορά μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα από την μεταφορική πρωτεΐνη exportin-5 RanGT και πέπτονται στη βάση της θηλιάς τους από το ένζυμο Dicer (μία νουκλεάση με λειτουργία RNAάσης III) σχηματίζοντας έτσι ένα δίκλωνο μόριο, το οποίο αποτελείται από δύο συμπληρωματικά mirnas, μήκους 21 έως 24 νουκλεοτιδίων, όπου ο ένας κλώνος δεν είναι απόλυτα συμπληρωματικός με τον άλλο. Τέλος, ακολουθεί η επιλογή του ώριμου κλώνου του mirna, ο οποίος και ενσωματώνεται μαζί με την πρωτεΐνη Ago2 (Argonaute 2) στο σύμπλεγμα RISC (RNA-Induced Silencing Complex), το οποίο πλέον καλείται mirisc (Εικόνα 2). Ο κλώνος ο οποίος επιλέγεται είναι αυτός ο οποίος έχει μικρότερη ομολογία με το 5 άκρο. Το mirisc αναγνωρίζει το mrna-στόχο και συνδέεται μαζί του, χωρίς όμως να υπάρχει απόλυτη συμπληρωματικότητα ανάμεσα στο mirna και το RNAστόχο. Αποτέλεσμα αυτού είναι να μην πραγματοποιείται τελικά αποικοδόμηση του στόχου, αλλά καταστολή της μετάφρασης. Τα mirnas μπορούν να διαθέτουν πολυάριθμα RNA στόχους καθώς δεν απαιτείται η πλήρης συμπληρωματικότητα προκειμένου να ασκήσουν τη δράση τους. Ακόμη και μέσω ατελούς συμπληρωματικότητας μπορούν να επηρεάσουν το RNA στόχο στο επίπεδο της μετάφρασης. Η σημασία τους στη διαδικασία της ερυθροποίησης έχει διαφανεί μέσω διαφόρων πειραματικών προσεγγίσεων. Σε ποντίκια που απουσιάζει η Ago2 η διαδικασία της ερυθροποίησης φαίνεται να μπλοκάρεται και να σταματά στο στάδιο των βασεόφιλων ερυθροβλαστών, ενώ ταυτόχρονα παρατηρείται συσσώρευση πρώιμων ερυθροβλαστών στο μυελό των οστών και στο σπλήνα, ελάττωση των ώριμων mirnas καθώς και δραματική ελάττωση των ώριμων ερυθρών αιμοσφαιρίων, με επακόλουθο την εκδήλωση αναιμίας (O Caroll et al. 2007, Martinez and Busslinger, 2007). 16

Η συμβολή των mirnas φαίνεται να αφορά τόσο το αρχικό στάδιο της δέσμευσης ή μη προς την ερυθρά σειρά όσο όμως και ύστερα στάδια κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης των ερυθρών. Ακόμη, μπορεί να αφορά την ενίσχυση της έκφρασης ορισμένων mirnas ή ακόμη και την ελάττωση της γονιδιακής έκφρασης. Για παράδειγμα, αναγνωρίζονται mirnas που εκφράζονται αποκλειστικά στα αιμοποιητικά κύτταρα (Chen et al.2004). Το mir-210 ενισχύεται κατά την επαγόμενη από ερυθροποιητίνη διαφοροποίηση, ενώ η καταστολή του στα κύτταρα αυτά οδηγεί σε απόπτωση (Kosaka et al.2008). Ακόμη, το mir-451 φαίνεται να σχετίζεται ισχυρά με τον ερυθροειδή φαινότυπο και να ενισχύεται η λειτουργία του κατά την ερυθρά ωρίμανση, γεγονός που έρχεται σε συμφωνία με την παρατήρηση ότι το γονίδιο του ελέγχεται μεταγραφικά από τον παράγοντα GATA-1 (Dore et al.2008). Υπερέκφραση του mir-451 οδηγεί σε ωρίμανση και διαφοροποίηση των MEL κυττάρων, ενώ η έλλειψή του επηρεάζει την ομαλή μετάβαση από το στάδιο του προερυθροβλάστη στο στάδιο του βασεόφιλου ερυθροβλάστη (Papapetrou et al. 2010). Στον αντίποδα, η έκφραση των mir-221 και mir-222 καταστέλλεται κατά την ερυθροδιαφοροποίηση στους CD34+ προγεννήτορες του ανθρώπου και έτσι με έμμεσο τρόπο σχετίζονται με την πορεία της διαφοροποίησης της ερυθράς σειράς (Felli et al.2005). Α2. Διαταραχές της Ερυθροποίησης Παθοφυσιολογία και εμπλεκόμενοι μοριακοί μηχανισμοί Η διαδικασία της ερυθροποίησης, όπως προαναφέρθηκε, απαιτεί την άρτια σύμπραξη παραγόντων ώστε να αποδοθούν στην κυκλοφορία ώριμα και λειτουργικά ερυθροκύτταρα. Όταν διαταραχθεί η ισορροπία της διαδικασίας τότε εκδηλώνεται κλινικά η κατάσταση που καλείται αναιμία. Με τον όρο αυτό περιγράφεται η χαμηλή συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης (Hemoglobin-Hb) που είναι κάτω από 13,5 g/dl για 17

τους άνδρες και κάτω από 11,5 g/dl για τις γυναίκες υποδηλώνονται ποσοτικές και ποιοτικές διαταραχές των ερυθροκυττάρων. Οι ποσοτικές μπορεί να οφείλονται : σε απώλεια αίματος λόγω οξείας ή χρόνιας αιμορραγίας, σε χρόνια νοσήματα που επηρεάζουν την ικανότητα του μυελού να παράγει ερυθροκύτταρα (μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα, σύνδρομα συγγενούς ανεπάρκειας μυελού των οστών, νεοπλασματικά νοσήματα, απλαστική αναιμία, χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, χρόνιες λοιμώξεις), σε ανεπάρκεια βασικών στοιχείων της ερυθροποίησης (σιδηροπενική αναιμία επί ένδειας σιδήρου, μεγαλοβλαστική αναιμία επί έλλειψης βιταμίνης Β12) και σε αυξημένη καταστροφή των ερυθρών στην κυκλοφορία ή το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (μακροφάγα ήπατος, σπλήνα, μυελού των οστών). Αντίστοιχα, οι ποιοτικές διαταραχές αφορούν τη διαταραγμένη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης στα ερυθροκύτταρα και περιλαμβάνουν : τις αιμοσφαιρινοπάθειες (α- και β-θαλασσαιμία, δρεπανοκυτταρική αναιμία), βλάβες της μεμβράνης των ερυθροκυττάρων (κληρονομική σφαιροκυττάρωση, κληρονομική ελλειπτοκυττάρωση) Ακόμη, οι αναιμίες κατατάσσονται με βάση τις ερυθροκυτταρικές παραμέτρους του εργαστηρίου που περιγράφουν τη μορφολογία των ερυθρών. Αυτές είναι: ο μέσος όγκος ερυθρών MCV (Mean Corpuscular Volume) που έχει φυσιολογικό εύρος τιμών 80-95 femtolitres-fl, η μέση περιεκτικότητα των ερυθρών σε αιμοσφαιρίνη MCH (Mean Cell Hemoglobin) με εύρος φυσιολογικών τιμών 27-32 pg και η μέση συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης MCHC (Mean Cell Hemoglobin Concentration) με εύρος φυσιολογικών τιμών 30-36 g/dl. Με βάση αυτές τις παραμέτρους οι αναιμίες χαρακτηρίζονται ως εξής : MCV μεταξύ 80 και 95 fl ορθοκυτταρική αναιμία MCV> 96fl μακροκυτταρική αναιμία MCV< 80fl μικροκυτταρική αναιμία MCH μεταξύ 27 και 32pg ορθόχρωμη αναιμία 18

MCH< 27 pg υπόχρωμη αναιμία Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας δε θα επεκταθούμε στην ανάλυση των επιμέρους διαταραχών της ερυθροποίησης, αλλά θα επικεντρωθούμε κυρίως στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα και τα σύνδρομα συγγενούς ανεπάρκειας του μυελού των οστών. Α2.1. Τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα (ΜΔΣ) και η κλινική οντότητα του Συνδρόμου Del5q Ο όρος Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα (ΜΔΣ) περιλαμβάνει οντότητες που έχουν περιγραφεί πριν από εκατό και πλέον χρόνια και έχουν χαρακτηριστεί ποικιλοτρόπως. Αυτό διότι πρόκειται για μια ετερογενή ομάδα επίκτητων αιματολογικών διαταραχών. Η πρώτη ταξινόμηση των ΜΔΣ προτάθηκε από την ομάδα FAB (French-American-British) που διέκρινε τα ΜΔΣ με βάση μορφολογικά κριτήρια και το ποσοστό βλαστών στο μυελό, ενώ συμπεριέλαβε και δυο νέες οντότητες τη σιδηροβλαστική αναιμία και τη χρόνια μυελομονοκυτταρική λευχαιμία (Πίνακας 1). Πίνακας 1 : Κατάταξη κατά FAB των ΜΔΣ (1982) Υπότυπος κατά FAB % Βλάστες %Βλάστες Μετατροπή Μέση % στην στο μυελό σε ΟΜΛ Επιβίωση Διάγ Περιφέρεια (μήνες) νωσ η ΜΔΣ Refractory Anemia RA Ανθεκτική Αναιμία <1 <5 10-20 30-65 10-40 Refractory Anemia with RARS Ανθεκτική Αναιμία με δακτυλιοειδείς <1 <5 10-35 34-83 10-35 ringed sideroblasts σιδηροβλάστες Refractory RAEB Ανθεκτική Αναιμία <5 5-20 >50 8-18 25-19

Anemia with με περίσσεια 30 excess blasts βλαστών Refractory RAEB-t Ανθεκτική Αναιμία 5 21-30 60-100 4-11 10- Anemia with με περίσσεια 30 excess blasts βλαστών σε in στάδιο transformatio μεταμόρφωσης n Chronic CMML Χρόνια <5 5-20 >40 10-20 10- Myelomonoc Μυελομονοκυττα 20 ytic Leukemia ρι-κή Λευχαιμία Αργότερα, το 1997 οι Greenberg et al. πρότειναν το διεθνές σύστημα ταξινόμησης IPSS (International Prognostic Scoring System), που ισχύει μέχρι σήμερα. To IPSS αξιολογεί τρείς παραμέτρους που ευνοούν την ταξινόμηση των ΜΔΣ: α) την αναλογία βλαστών στο μυελό των οστών, β) τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες σε κύτταρα του μυελού των οστών και γ) την παρουσία μίας ή περισσότερων κυτταροπενιών στο περιφερικό αίμα. Τέλος, το 2000 εμφανίστηκε η πρώτη ταξινόμηση από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (World Health Organisation-WHO) η οποία το 2008 αναθεωρήθηκε και περιλαμβάνει πλέον τη σιδηροβλαστική αναιμία και το σύνδρομο Del5q (Πίνακας 2). Πίνακας 2: Κατάταξη κατά WHO των ΜΔΣ (Brunning R. 2008) (αναπαραγωγή από τη ΜΔΕ -Παναγιώτης Ανδρεάδης,2011) Υπότυπος κατά WHO Αιματολογικά Ευρήματα Ευρήματα μυελού των οστών RAUD 1 Refractory Anemia with unilineage dysplasia Απλή ή κυτταροπενία σε δύο σειρές a Χωρίς ή <1% βλάστες b Δυσπλασία σε >10% μιας σειράς, <5% βλάστες <15%Δακτυλιοειδείς σιδεροβλάστες 1 Στην κατηγορία αυτή συμπεριλαμβάνονται: η Ανθεκτική Αναιμία (RA), η Ανθεκτική Ουδετεροπενία (RN), η Ανθεκτική Θρομβοκυτταροπενία (RT), που παλιότερα περιλαμβάνονταν στα MDS-U. 20

RARS Refractory Anemia with Ringed Sideroblasts RCMD Refractory Anemia with multilineage dysplasia RAEB-1 Refractory Anemia with excess blasts-1 RAEB-2 Refractory Anemia with excess blasts-2 Αναιμία Χωρίς βλάστες Κυτταροπενία (2 ή 3 σειρών) Χωρίς ή με σπάνιους βλάστες, <1x10 9 μονοκύτταρα Χωρίς κοκκία Auer c Κυτταροπενία(-ες), <5% βλάστες b, <1x10 9 μονοκύτταρα Χωρίς κοκκία Auer c Κυτταροπενία(-ες), 5-19% Βλάστες b, <1x10 9 μονοκύτταρα ±Κοκκία Auer >15% δακτυλιοειδείς σιδεροβλάστες, <5% βλάστες, δυσπλασία μόνο ερυθράς σειράς Δυσπλασία σε 10% των κυττάρων σε 2 σειρές, <5% βλάστες, ±15% δακτυλιοειδείς σιδεροβλάστες Χωρίς Κοκκία Auer c Δυσπλασία σε >1 σειρά, χωρίς κοκκία Auer, 5-9% βλάστες b Δυσπλασία σε 1 σειρά, ± κοκκία Auer, 10-19% βλάστες b MDS-U MDSdel5q Myelodysplastic Syndrome, Unclassified Myelodysplastic syndrome associated with isolated del 5q Κυτταροπενίες Δυσπλασία σε 1 σειρά όταν <1% βλάστες b συνοδεύεται από κυτταρογενετικές ανωμαλίες, <5% βλάστες, Αναιμία, αιμοπετάλια φυσιολογικά ή αυξημένα Χωρίς ή <1% βλάστες Δυσπλασία ερυθράς σειράς, <5% βλάστες, del5q Χωρίς κοκκία Auer a Κυτταροπενία σε δύο σειρές μπορεί να παρατηρηθεί. Περιπτώσεις με πανκυτταροπενία θα πρέπει να κατατάσσονται σαν MDS-U (Αταξινόμητο ΜΔΣ) b Αν οι βλάστες του μυελού είναι <5% αλλά οι βλάστες στο αίμα είναι 2-4% τότε η διάγνωση είναι RAEB-1. Περιπτώσεις RCUD και RCMD με <1% βλάστες στο αίμα θα πρέπει να κατατάσσονται σαν MDS-U c Περιστατικά με κοκκία auer και <5%, βλάστες στο αίμα και <10% βλάστες στον μυελό θα πρέπει να κατατάσσονται στην RAEB-2. Παρόλο που το εύρημα βλαστών 5-19% στο αίμα μπορεί να είναι από μόνο του διαγνωστικό, περιστατικά με <5% βλάστες εάν έχουν κοκκία auer ή 10-19% βλάστες στο μυελό, κατατάσσονται επίσης στη RAEB-2. Αντίστοιχα, αν <10% βλάστες στο μυελό αλλά υπάρχουν κοκκία auer και/ ή 5-19% βλάστες στο αίμα 21

Α2.1.1.Επιδημιολογία των ΜΔΣ Τα ΜΔΣ αποτελούν μία από τις συχνότερες αιματολογικές διαταραχές σε άτομα τρίτης ηλικίας. Υπολογίζεται πως το 80% των ασθενών με ΜΔΣ κατά την πρώτη διάγνωση είναι άνω των 60 ετών. Ακόμη, η συχνότητα είναι αυξημένη στους άνδρες συγκριτικά με τις γυναίκες. Αν και η ακριβής επίπτωση των ΜΔΣ δεν έχει καθοριστεί με ακρίβεια, εκτιμάται από 1 έως 75 περιπτώσεις ανά 100.000 κατοίκους ανά έτος. Ο κίνδυνος εμφάνισης των ΜΔΣ αυξάνει με την ηλικία ενώ διατυπώνεται επίσης σαφής αιτιολογική συσχέτιση με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, την ακτινοβολία, το βενζένιο/βενζόλιο και το κάπνισμα. Αξίζει όμως να σημειωθεί πως τα ΜΔΣ υποδιαγιγνώσκονται ενώ πολλές φορές οι γιατροί δεν καταγράφουν-αναφέρουν τα νέα περιστατικά στα αντίστοιχα μητρώα (registries) εξαιτίας της ήπιας εικόνας της νόσου (David and Ayalew, 2003). Α2.1.2.Κλινικά και Εργαστηριακά Χαρακτηριστικά στα ΜΔΣ Γενικά, τα ΜΔΣ χαρακτηρίζονται από κυτταροπενία, ατελή και μη αποτελεσματική αιμοποίηση και μυελό των οστών με δυσπλαστικά στοιχεία. Σε μια τουλάχιστον από τις κυτταρικές σειρές (μυελοειδή, ερυθρά ή μεγακαρυοκυτταρική), παρατηρείται δυσπλασία, στοιχείο που αποτελεί κλινικό χαρακτηριστικό των νοσημάτων αυτών. Έτσι, οι ασθενείς που πάσχουν από ΜΔΣ μπορεί να είναι από ασυμπτωματικοί ή να εμφανίζουν κλινική εικόνα αντίστοιχη της κυτταροπενίας που παρατηρείται σε μια ή περισσότερες σειρές. Ο ελαττωμένος αριθμός των ώριμων κυττάρων στην περιφέρεια, έρχεται σε αντίθεση με την κυτταροβρίθεια του μυελού των οστών. Παρότι συνήθως τα ΜΔΣ διαδράμουν με ήπια πορεία και έχουν μέση κλινική βαρύτητα, δεν είναι ασύνηθες, να εμφανιστούν με επιθετικότερη μορφή και να οδηγήσουν στο θάνατο του πάσχοντος εντός 6 μηνών από τη διάγνωση της κυτταροπενίας. Οι ασθενείς που πάσχουν από ΜΔΣ, έχουν αυξημένο κίνδυνο 22

εκτροπής σε Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία- ΟΜΛ (Acute Myeloid Leukemia-AML) και να κινδυνεύσουν στη συνέχεια από τις επιπλοκές της νόσου (αιμορραγία, λοιμώξεις, μεταγγίσεις, αιμοσιδήρωση (iron overload) και Ανεπάρκεια Πολλαπλών Οργάνων (MODS ) εξαιτίας δευτερογενών αιτιών (Awais et al. 2010). Α2.1.3.Διάγνωση των ΜΔΣ Για τη διάγνωση των ΜΔΣ τίθεται εν αρχή ως σημαντικός παράγοντας η υποψία της ύπαρξης του ΜΔΣ. Ιδιαίτερα, καθώς αφορά ηλικιωμένους ασθενείς που μπορούν να προσέλθουν για να εξεταστούν λόγω αναιμίας, καταβολής, λοιμώξεων ή αιμορραγιών στο γιατρό, είναι σημαντικό να διαφοροδιαγνωστούν τα ποικίλα αίτια που μπορούν να ενταχθούν στο διαγνωστικό αλγόριθμο και να συμπεριληφθεί και η υπόνοια των ΜΔΣ. Από την ανάλυση της γενικής αίματος μπορεί να διαπιστωθεί κατ αρχήν κυτταροπενία με στοιχεία δυσπλασίας σε μία ή και τις τρεις σειρές, ενώ σε επίχρισμα περιφερικού αίματος, μπορεί να είναι εμφανής η μακροκυττάρωση ή η ανισοποικιλοκυττάρωση. Επικουρική είναι και η συμβολή της ανάλυσης δείγματος μυελού ο οποίος μπορεί να είναι φυσιολογικός ή κυτταροβριθής. Μπορούν ωστόσο να παρατηρηθούν ευμεγέθεις ερυθροβλάστες ή πυρηνικές ανωμαλίες στους ερυθροβλάστες καθώς και οι λεγόμενοι δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες που συμβάλλουν στην ταξινόμηση των ΜΔΣ, μεγακαρυοκύτταρα με αποδιοργανωμένους πυρήνες και τέλος ανώμαλη εντόπιση άωρων κυττάρων (ALIP- Abnormal Localisation of Immature Precursors). Εκτός όμως από τα παραπάνω γενικά στοιχεία για τη διάγνωση των ΜΔΣ έχουν θεσπιστεί κάποια ελάχιστα μορφολογικά κριτήρια : Πρέπει στο 10% τουλάχιστον των κυττάρων μιας σειράς του μυελού να εντοπιστεί αδιαμφισβήτητη δυσπλασία και να χαρακτηριστεί η σειρά ως δυσπλαστική Πρέπει να αποκλειστεί κάθε δευτερογενές αίτιο δυσπλασίας Πρέπει να εντοπιστούν χρωμοσωμικές ανωμαλίες σε συγκεκριμένο κλώνο όπως π.χ. οι ελλείψεις del7q, del5q, del13q, del11q, del9q αλλά 23

και μεταθέσεις μεταξύ χρωμοσωμάτων όπως t(11;16)(q23;p13.3), t(3;21)(qp36.3;q21.1). Α2.1.4. Διαφορική διάγνωση των ΜΔΣ Τα ΜΔΣ θα πρέπει να διαφοροδιαγνωστούν από άλλα νοσήματα που απαιτούν διαφορετική αντιμετώπιση του ασθενούς. Αυτά μπορεί να είναι : Λοιμώξεις που μπορούν να προκαλέσουν κυτταροπενία Ανεπάρκεια βιταμίνης Β12 και φυλλικού οξέος, καθότι προκαλεί μεγαλοβλαστική αναιμία Ιστορικό λήψης μυελοκατασταλτικών, χημειοθεραπευτικών φαρμάκων ή ακτινοθεραπείας Σπληνομεγαλία με στοιχεία υπερσπληνισμού, με αποτέλεσμα την αυξημένη καταστροφή κυττάρων στην περιφέρεια. Συχνές σε λεμφώματα, πυλαία υπέρταση λόγω ηπατικής κίρρωσης και συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια Ιστορικό αλκοολισμού Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία. Σ αυτή την περίπτωση θα πρέπει να γίνει αναζήτηση βλαστών σε ποσοστό > 20% στο μυελό έτσι ώστε να τεθεί η διάγνωση της λευχαιμίας. Α2.1.5. Θεραπεία στα ΜΔΣ Λόγω της ετερογένειας των ΜΔΣ δεν υπάρχει αυστηρά καθορισμένη θεραπευτική κατεύθυνση, αλλά αυτή επιλέγεται κατά περίπτωση και σύμφωνα με την προϋπαρξη ταξινόμησης του συνδρόμου. Σε γενικές γραμμές, η λογική της αντιμετώπισης των ΜΔΣ βασίζεται σε τρεις βασικούς άξονες: 24

Την αντιμετώπιση της δυσπλασίας της ερυθράς σειράς. Ανάλογα με τη βαρύτητα οι ασθενείς υποβάλλονται σε μετάγγιση αίματος. Την αντιμετώπιση της δυσπλασίας της κοκκιώδους σειράς. Αυτή αφορά την αντιμετώπιση των λοιμώξεων είτε με χορήγηση αντιβιοτικής αγωγής συχνά συνδυασμένης ή με χορήγηση αυξητικών παραγόντων. Την αντιμετώπιση της δυσπλασίας της μεγακαρυοκυτταρικής σειράς. Αυτή συνίσταται στην πρόληψη των αιμορραγικών επεισοδίων, την παύση οποιασδήποτε χορήγησης αντιπηκτικών ή αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων και την προσαρμογή των δόσεων των ήδη υπάρχοντων με βάση τα συνοδά νοσήματα του ασθενούς. Καθώς όμως η παγκόσμια ερευνητική κοινότητα «ξεκλειδώνει» σε μοριακό επίπεδο παθοφυσιολογικά μονοπάτια που ως τώρα αγνοούσαμε, νεότερα φάρμακα δίνουν θεραπευτικές λύσεις και ελπιδοφόρα αποτελέσματα που βελτιώνουν το προσδόκιμο και την ποιότητα ζωής των ασθενών με ΜΔΣ. Τα επιγενετικά φάρμακα ανήκουν σε αυτή την κατηγορία. Α2.1.5.1 Τα επιγενετικά φάρμακα. Κατηγορίες και μηχανισμοί δράσης Ο όρος «επιγενετική» χαρακτηρίζει τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και αναφέρεται σε κληρονομικά μεταβιβαζόμενες αλλαγές που δεν επιτελούνται μέσω τροποποίησης της αλληλουχίας του DNA, αλλά μέσω του ελέγχου της λειτουργικότητας των γονιδίων. Οι μηχανισμοί που συνιστούν την επιγενετική ρύθμιση είναι η μεθυλίωση του DNA και οι μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών. Τα επιγενετικά φάρμακα έχουν δημιουργηθεί με βάση την ολοένα αυξανόμενη γνώση των μηχανισμών επιγενετικής ρύθμισης. Στόχο έχουν να προσφέρουν νέες θεραπευτικές λύσεις σε νοσήματα που μέχρι τώρα είχαν δύσκολη θεραπευτική προσπέλαση (όπου ανήκουν και τα ΜΔΣ). Ανάλογα με το μηχανισμό επιγενετικής ρύθμισης που στοχεύουν διακρίνονται σε: 25

1. Αναστολείς της μεθυλίωσης του DNA i. Μη νουκλεοσιδικοί αναστολείς της μεθυλίωσης του DNA ii. Νουκλεοσιδικοί αναστολείς της μεθυλίωσης του DNA. 2. Αναστολείς της αποακετυλίωσης ιστονών Τα επιγενετικά φάρμακα αρχικά αναπτύχθηκαν ως κυτταροτοξικοί παράγοντες στις λευχαιμίες σε υψηλές δόσεις. Η κύρια δράση τους, όμως, είναι η τροποποίηση και αναστροφή της επιγενετικής απορρύθμισης. Οι αναστολείς της μεθυλίωσης προκαλούν μη αναστρέψιμη αναστολή της δράσης των DNA μεθυλοτρανσφερασών (DNMTs) όταν σχηματίσουν ομοιοπολικό δεσμό μεταξύ του ενζύμου και του τμήματος του DNA όπου έχουν εισχωρήσει. Συγκεκριμένα, ως νουκλεοσιδικά ανάλογα, αντικαθιστούν την κυτοσίνη κατά την αντιγραφή στη φάση S. Οι DNA μεθυλοτρανσφεράσες παγιδεύονται στο τμήμα του DNA που περιέχει τις τροποποιημένες βάσεις αδυνατώντας να προκαλέσουν τη μεθυλίωση της τροποποιημένης πια 5 θέσης της κυτοσίνης με αποτέλεσμα τη μη σύνδεση του ενζύμου και το σχηματισμό μη μεθυλιωμένου κληρονομήσιμου κλώνου DNA (Zhou t al. 2002). Α2.1.5.1.α. Η 5-αζακυτιδίνη και η 5-αζα-2-δεοξυκυτιδίνη Η 5-αζακυτιδίνη είναι ο πρώτος νουκλεοσιδικός υπομεθυλιωτικός παράγοντας που εγκρίθηκε από το FDA το 2004 για τη θεραπεία των μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων. Συγκεκριμένα αφορά τους εξής 5 υποτύπους FAB(French-American-British) μυελοδυσπλαστικών : επίμονη αναιμία (RA) ή επίμονη αναιμία με δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες (RARS) (όταν συνοδεύονται με ουδετεροπενία ή θρομβοπενία ή απαιτούν μετάγγιση), επίμονη αναιμία με ύπαρξη πολυάριθμων βλαστών (RAEB), επίμονη αναιμία με ύπαρξη πολυάριθμων βλαστών υπό μεταμόρφωση (RAEB-T) και χρόνια μυελομονοκυτταρική λευχαιμία (CMMoL). 26

Η 5 -αζακυτιδίνη έχει επιπλέον την ικανότητα να προσδένεται στο RNA και να εμποδίζει τη μετάφραση. Χορηγείται ενιέμενη υποδορίως ή ενδοφλεβίως και τα μέγιστα επίπεδα του φαρμάκου στο πλάσμα ανιχνεύονται σε διάστημα 30 λεπτών από τη στιγμή της χορήγησης. Σε ασθενείς που εμφανίζουν καλή ανοχή του φαρμάκου εφαρμόζονται συνήθως 4-6 κύκλοι θεραπείας ανά 28 ημέρες ο καθένας.παράλληλα, πρέπει πάντα να ελέγχεται η λειτουργικότητα του ήπατος, λόγω δυνητικής ηπατοτοξικότητας. Στη μεγαλύτερη μελέτη φάσης 3 που έγινε σε ασθενείς με υψηλού κινδύνου μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα η αζακυτιδίνη επέκτεινε σημαντικά την επιβίωση σε σχέση με τη συμβατική θεραπεία. Σε μία τυχαιοποιημένη κλινική μελέτη 191 ασθενών με χαμηλού κινδύνου μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα η συνολική απάντηση (αναφορικά με την πλήρη ή μερική επαναφορά του αριθμού των ερυθροκυττάρων και της μορφολογίας του μυελού των οστών στο φυσιολογικό) ήταν 23% στους ασθενείς που λάμβαναν αζακυτιδίνη σε σχέση με καμία απάντηση στην ομάδα ελέγχου (Silverman et al.2002). Οι ασθενείς που απάντησαν στο διάστημα αυτό δε χρειάστηκαν μετάγγιση. Κατά τη διασταύρωση των αποτελεσμάτων οι μισοί ασθενείς της ομάδας ελέγχου έλαβαν 5-αζακυτιδίνη και ελέγχθηκαν για φαινόμενα crossover, συγκρίθηκε ο μέσος χρόνος επιβίωσης ο οποίος στην ομάδα ελέγχου ήταν 11 μήνες ενώ στην ομάδα μελέτης 18 μήνες με την ποιότητα ζωής σημαντικά βελτιωμένη. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρήθηκαν μετά από υποδόρια ή ενδοφλέβια χορήγηση 5-αζακυτιδίνης συμπεριλάμβαναν : ναυτία (70,5% σε μελέτες φάσης 1,2 και 48% σε φάσης 4) αναιμία (69,5% σε μελέτες φάσης 1,2 και 51,4% σε φάσης 4) θρομβοπενία (65,5% σε μελέτες φάσης 1,2 και 69,4% σε φάσης 4) έμετο (54,1%) πυρετό (51,8%) διάρροια (36,4%) ερυθρότητα του δέρματος στο σημείο ένεσης (35%) δυσκοιλιότητα (33,6%) 27

ουδετεροπενία (48,2% σε μελέτες φάσης 1,2 και 65,7% σε φάσης 4) αίσθημα νυγμού στο σημείο της ένεσης (σε ενδοφλέβια έγχυση) εμφάνιση πετεχειών στο σώμα (45,8%σε ενδοφλέβια έγχυση) ρίγος (35,4% σε ενδοφλέβια έγχυση) καταβολή (35,4% σε ενδοφλέβια έγχυση) υποκαλιαιμία (31,8% σε ενδοφλέβια έγχυση) πόνος στο στήθος (16,4%) μυαλγία (15,9%) μυελοκαταστολή Στην ίδια κατηγορία με την 5-αζακυτιδίνη το δομικό ανάλογό της, η 5-αζα-2- δεοξυκυτιδίνη ανήκει επίσης στους νουκλεοσιδικούς υπομεθυλιωτικούς παράγοντες και έχει φανεί αποτελεσματική σε κακοήθειες της μυελοειδούς σειράς όπως η οξεία μυελογενής λευχαιμία, η οξεία λεμφοκυτταρική λευχαιμία, τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα και η χρόνια μυελογενής λευχαιμία. Αναφορικά με τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα, η αγωγή με 5-αζα-2-δεοξυκιτιδίνη φάνηκε αποτελεσματικότερη κατά 17% από τη συμβατική θεραπεία και φάνηκε να καθυστερεί τη μετάπτωση σε οξεία μυελογενή λευχαιμία ενώ στο μεσοδιάστημα της ύφεσης της νόσου οι ασθενείς ήταν ελεύθεροι μετάγγισης. Ένα σημείο που πρέπει να τονιστεί είναι η χρήση επιγενετικών βιοδεικτών (biomarkers) απόκρισης στη θεραπεία όπως το p15 που απομεθυλιώνεται με την επίδραση της 5-αζακυτιδίνης και ανευρίσκεται μεθυλιωμένο στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (Tien et al. 2001). Η ανάδειξη υποψήφιων βιοδεικτών μελλοντικά θα ενισχύσει την εκτίμηση της απάντησης στη θεραπεία και θα διασαφηνίσει μηχανισμούς όπως είναι ο εξατομικευμένος βαθμός μεταβολισμού και ενσωμάτωσης της 5-αζακυτιδίνης στο DNA. Α2.1.5.1.β. Οι αναστολείς της αποακετυλάσης των ιστονών (HDACIs) Εκτός από τους νουκλεοσιδικούς υπομεθυλιωτικούς παράγοντες θεραπευτική αξία στα ΜΔΣ έχουν και οι αναστολείς της αποακετυλίωσης των 28

ιστονών που δρουν εμποδίζοντας τη δράση του ενζύμου αποακετυλάση των ιστονών (HDAC-histone deacetylase) (Εικόνα 3). Εικόνα 3 : Μηχανισμοί δράσης του Vorinostat για τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Παράλληλη αναφορά γνωστών αντινεοπλασματικών φαρμάκων με τους στόχους δράσης τους. Το SAHA (suberoylanilide hydroamic acid) ή Vorinostat με εμπορική ονομασία Zolinza αποτελεί το πρώτο φάρμακο αυτής της κατηγορίας που εγκρίθηκε από το FDA το 2006 για τη θεραπεία του καρκίνου και πιο συγκεκριμένα για το Τ-κυτταρικής αρχής λέμφωμα του δέρματος. Το Vorinostat αναστέλλει τις τάξης I και II αποακετυλάσες των ιστονών και συγκεκριμένα τις HDAC1, HDAC2, HDAC3 και HDAC6 (Johnstone, 2004, Marks, 2007). Ο συνδυασμός HDAC αναστολέων με υπομεθυλιωτικούς παράγοντες όπως η 5-αζακυτιδίνη και η 5-αζα-2δεοξυκυτιδίνη έχει λογική ένδειξη εάν αναλογιστούμε την αλληλεπίδραση της μεθυλίωσης του DNA με τις διαδικασίες τροποποίησης των ιστονών. Σε προκλινικές μελέτες, η προσθήκη Vorinostat στις ήδη υπάρχουσες θεραπείες σε αιμοποιητικές κακοήθειες όπως το πολλαπλό μυέλωμα και η λευχαιμία έδειξε συνεργική ή ακόμη και ενισχυτική δράση (Campbell et al.2008, Pei et al.2004, Dai Y et al.2008, Fiskus et al. 2008). Α2.1.6. Το Σύνδρομο del5q Το σύνδρομο del5q αναγνωρίζεται ως ξεχωριστή κλινική οντότητα και αποτελεί ανεξάρτητο υπότυπο των ΜΔΣ στην κατάταξη κατά WHO από το 2002. Χαρακτηρίζεται από <5% μυελοειδείς βλάστες και την έλλειψη του μακρού σκέλους 29

του χρωμοσώματος 5 ως τη μόνη κυτταρογενετική ανωμαλία (Vardiman et al.2002). Περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Van Den Berghe το 1974 σε 3 ασθενείς με ανθεκτική αναιμία και διάμεση εξάλειψη του μακρού σκέλους του χρωμοσώματος 5. Παρατηρείται, σε αντίθεση με το σύνολο των ΜΔΣ, με μεγαλύτερη συχνότητα στις γυναίκες (7:3), ενώ σημαντική ιδιαιτερότητά του αφορά την πολύ καλή απόκριση των ασθενών στη θεραπεία με λεναλιδομίδη. Το σύνδρομο χαρακτηρίζεται από σοβαρή μακροκυτταρική αναιμία, φυσιολογικά ή ενίοτε ανεβασμένα αιμοπετάλια με ελάττωση της λόβωσης των μεγακαρυοκυττάρων και χαμηλό ρυθμό εξέλιξης σε Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία συγκριτικά με τους άλλους τύπους των ΜΔΣ (Vardiman et al. 2002). Η λεναλιδομίδη, ένα δομικό παράγωγο του ανοσοτροποποιητικού παράγοντα θαλιδομίδη, είναι πολύ αποτελεσματική σε ασθενείς με σύνδρομο del5q. Μεταξύ των διαφόρων βιολογικών της δράσεων, προάγει την ερυθροποίηση και ρυθμίζει την παραγωγή κυτταροκινών. Σε κλινική μελέτη αποτελεσματικότηταςασφάλειας του φαρμάκου που πραγματοποιήθηκε σε 148 ασθενείς με del5q σύνδρομο, το 76% των ασθενών απάντησαν θετικά στη θεραπεία, ενώ το 67% των ασθενών εμφάνισαν ανεξαρτητοποίηση από την ανάγκη μετάγγισης και βελτίωση της αρχικής τιμής της αιμοσφαιρίνης η οποία ανήλθε στα φυσιολογικά επίπεδα. Η αιματολογική απάντηση στη θεραπεία ήταν άμεση (περίπου 4,6 εβδομάδες από την έναρξή της) και είχε διάρκεια (το 62% των ασθενών που απάντησαν θετικά στη θεραπεία με λεναλιδομίδη δεν απαίτησαν μετάγγιση αίματος τουλάχιστον για 1 χρόνο μετά, ενώ η μέση διάρκεια μη απαίτησης μετάγγισης ανέρχεται στα δύο χρόνια). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωναν τις αρχικές παρατηρήσεις ότι η λεναλιδομίδη καταστέλλει κατά κάποιον τρόπο τον del5q κλώνο των αιμοποιητικών κυττάρων. Εκτός όμως από τη βελτίωση των αιματολογικών παραμέτρων, το 73% των ασθενών εμφάνισε και κυτταρογενετική απάντηση, ενώ το 45% είχε πλήρη κυτταρογενετική ύφεση σε συνδυασμό με την μη ανάγκη μετάγγισης και τη βελτίωση στα μορφολογικά χαρακτηριστικά του μυελού των οστών.στο 36% των ασθενών παρατηρήθηκε βελτίωση της κυτταρικής δυσπλασίας σε όλες της σειρές του αιμοποιητικού. Στις ανεπιθύμητες ενέργειες της θεραπείας με λεναλιδομίδη οι πιο συχνές που παρατηρήθηκαν ήταν ουδετεροπενία και θρομβοπενία (List et al. 2006). 30

Σε μια πρόσφατη πολυκεντρική μελέτη που εκτιμούσε την αιματολογική απάντηση στη λεναλιδομίδη σε 215 ασθενείς με χαμηλού κινδύνου ΜΔΣ χωρίς την έλλειψη 5q, μόνο το 26% των ασθενών εμφάνισαν ανεξαρτητοποίηση από τη ανάγκη μετάγγισης συγκρινόμενο με το ποσοστό 67% σε ασθενείς με σύνδρομο del5q όπως προαναφέρθηκε, γεγονός που υποδεικνύει ότι η αποτελεσματικότητα της λεναλιδομίδης στα ΜΔΣ σχετίζεται άμεσα με την έλλειψη 5q (List et al. 2005). Α2.2. Σύνδρομα Συγγενούς Ανεπάρκειας Μυελού των Οστών Τα Σύνδρομα Συγγενούς Ανεπάρκειας του Μυελού των Οστών αποτελούν μια ετερογενή ομάδα διαταραχών που χαρακτηρίζονται από ανεπάρκεια του μυελού των οστών σε συνδυασμό με μία ή περισσότερες συγγενείς δυσπλασίες και προδιάθεση για νεοπλασία. Τα σύνδρομα αυτά εμφανίζονται συνήθως στην παιδική ηλικία αν και υπάρχουν περιπτώσεις στις οποίες παραμένουν υποκλινικά μέχρι την ενήλικη ζωή. Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος αναφορικά με τη γενετική βάση των συνδρόμων, γεγονός που με τη σειρά του επιτρέπει την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών της ερυθροποίησης και του πώς αυτή διαταράσσεται στους ασθενείς με σύνδρομα ανεπάρκειας του μυελού. Στα σύνδρομα αυτά συμπεριλαμβάνονται : Η αναιμία Fanconi Η συγγενής δυσκεράτωση (dyskeratosis congenita) Το σύνδρομο Shwachman-Diamond (SDS) Η αναιμία Diamond-Blackfan (ή σύνδρομο Diamond-Blackfan-DBA) Η σοβαρή συγγενής ουδετεροπενία ( συμπεριλαμβανομένου του συνδρόμου Kostmann) Η συγγενής αμεγακαρυοκυτταρική θρομβοπενία 31

Στη συνέχεια θα αναφερθούν περισσότερα στοιχεία για την DBA με κριτήριο την πιο άμεση συσχέτισή της με την παρούσα μεταπτυχιακή πειραματική διπλωματική εργασία. A2. 2. 1. Το σύνδρομο Diamond-Blackfan A2. 2. 1. 1. Επιδημιολογία Η αναιμία Diamond-Blackfan ή σύνδρομο Diamond-Blackfan (DBA) περιγράφηκε αρχικά από τον Josephs σε μία βιβλιογραφική ανασκόπηση σχετικά με την αναιμία στη βρεφική και παιδική ηλικία το 1936 και στη συνέχεια κατηγοριοποιήθηκε περαιτέρω από τους Diamond και Blackfan ως συγγενής απλαστική αναιμία (Josephs, 1936). Σήμερα κατατάσσεται ως ένα από τα σύνδρομα συγγενούς ανεπάρκειας του μυελού των οστών με συχνότητα εμφάνισης 5-7 περιπτώσεις ανά 10⁶ υγιείς ζωντανές γεννήσεις. Παρουσιάζεται συνήθως μέσα στο πρώτο έτος της ζωής, με το 95% των διαγνώσεων να γίνεται πριν την ηλικία των 2 ετών και μέση ηλικία διάγνωσης τους 3 μήνες ζωής (Vlachos et al.2008, Gulbis et al.2010). Α.2.2.1.2. Κλινικά και εργαστηριακά χαρακτηριστικά της DBA Στον εργαστηριακό αιματολογικό έλεγχο διαπιστώνεται μακροκυτταρική αναιμία με απουσία ή λιγότερους από 5% ερυθροβλάστες (ερυθροβλαστοπενία) και δικτυοερυθροκυτταροπενία σε έναν κατά τα άλλα φυσιολογικό μυελό των οστών. Τα αιμοπετάλια και τα λευκά αιμοσφαίρια διατηρούνται συνήθως φυσιολογικά σε αριθμό, ενώ έχουν περιγραφεί και περιπτώσεις μέτριας ουδετεροπενίας, θρομβοπενίας ή θρομβοκυττάρωσης (Willig et al. 1999). Αυξημένα επίπεδα εμβρυϊκής 32

αιμοσφαιρίνης και έκφραση του αντιγόνου i 2 έναντι του I 3,ως δείκτες της εμβρυϊκής ερυθροποίησης αποτελούν επίσης χαρακτηριστικά του συνδρόμου. Κλινικά, οι ασθενείς με DBA στη νεογνική ή βρεφική ηλικία μπορεί να εμφανίζονται με ωχρότητα, δυσχέρεια αναπνοής κατά τη διάρκεια του θηλασμού, καθυστέρηση ή αδυναμία ανάπτυξης και συστολικό φύσημα (Da Costa et al. 2010). Στο 30-50% των ασθενών με DBA απαντώνται συγγενείς δυσπλασίες με συχνότερη εντόπιση στο κρανίο (μικροκεφαλία, ευρεία βάση ρινός, υπερτελορισμός, μικρογναθία), τα άνω άκρα και τους αντίχειρες (τριφαλαγγικοί αντίχειρες, διπλασιασμός αντίχειρα ή υποπλασία, επιπέδωση θέναρος) (Orfali et al. 2004). Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις συγγενείς ανωμαλίες εντοπίζονται στην καρδιά, τους νεφρούς, την ουρογεννητική οδό και τα οστά. Η καθυστέρηση της ανάπτυξης αποτελεί επακόλουθο των ήδη υπάρχοντων συγγενών δυσπλασιών οι οποίες επιδεινώνονται πολλές φορές λόγω της θεραπευτικής προσέγγισης με μακροχρόνια χορήγηση στεροειδών ή υπερφόρτωση σιδήρου. A2.2.1.3.Διάγνωση της DBA Για τη διάγνωση της νόσου έχουν θεσπιστεί ορισμένα ισχυρά κριτήρια και επιπρόσθετα επικουρικά τα οποία συνηγορούν υπέρ του συνδρόμου ιδιαίτερα επί απουσίας γονοτυπικής ανάλυσης ή επί απουσίας ευρημάτων από αυτήν. Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται τα διαγνωστικά κριτήρια της DBA όπως διατυπώθηκαν από τους Vlachos et al. το 2008 : 2 Το αντιγόνο i βρίσκεται στα εμβρυϊκά ερυθροκύτταρα και αποτελεί αλλοαντιγόνο που μεταβάλλεται κατά την ανάπτυξη του ανθρώπου. Διαθέτει υδρογονανθρακική γραμμική δομή. 3 Το αντιγόνο I παράγεται κατά την ενήλικη ζωή και ανιχνεύεται στα κύτταρα του αίματος των ενηλίκων. Διαθέτει υδρογονανθρακική δομή με διακλαδώσεις. 33

Πίνακας 3 : Μείζονα και ελάσσονα διαγνωστικά κριτήρια της DBA όπως διατυπώθηκαν από τους Vlachos et al. το 2008. Διαγνωστικά Κριτήρια DBA Ηλικία μικρότερη του 1 έτους Μακροκυτταρική αναιμία χωρίς άλλη σημαντική κυτταροπενία Δικτυοερυθροκυτταροπενία Φυσιολογική κυτταροβρίθεια μυελού των οστών με ελαττωμένο αριθμό προγονικών κυττάρων ερυθράς σειράς Επικουρικά Κριτήρια Μείζονα Μεταλλάξεις γονιδίων σχετιζόμενων με την κλασική DBA Θετικό οικογενειακό ιστορικό Ελάσσονα Αυξημένη δραστηριότητα απαμινάσης της αδενοσίνης των ερυθρών (eada) Συγγενείς ανωμαλίες της κλασικής DBA Αυξημένα επίπεδα HbF Απουσία άλλων στοιχείως υπέρ IBMFS Α2.2.1.4. Διαφορική διάγνωση DBA Προτού τεθεί η διάγνωση της DBA είναι σημαντικό να αποκλειστούν ορισμένες διαταραχές οι οποίες επίσης χαρακτηρίζονται από απλασία της ερυθράς σειράς. 34

Αυτές είναι : Η ερυθροβλαστοπενία που έπεται της λοίμωξης από τον παρβοϊό Β19 (IgM και IgG ορολογικός έλεγχος και απομόνωση του DNA του Β19 παρβοϊού με PCR από δείγμα μυελού των οστών) Η Παροδική Ερυθροβλαστοπενία της Παιδικής ηλικίας (Transient Eryhtroblastopenia of Childhood-TEC) που υφίεται αυτόματα Ορισμένες μορφές της αναιμίας Fanconi (τεστ ευθραυστότητας των χρωμοσωμάτων και Western Blot για την FANCD2) To Σύνδρομο Pearson Α2.2.1.5. Θεραπεία στην DBA Η θεραπευτική προσέγγιση στην DBA έχει καταρχήν υποστηρικτικό χαρακτήρα και αποσκοπεί στην αποκατάσταση της αναιμίας. Για την αντιμετώπιση της αναιμίας στην DBA οι ασθενείς υποβάλλονται σε μία ή περισσότερες μεταγγίσεις. Επιπλέον, εφαρμόζεται θεραπεία με κορτικοστεροειδή με αρχική δόση per os 2mg/kg την ημέρα πρεδνιζόνης ή κάποιου ισοδύναμου. Συνήθως, αυτή αρχίζει σε ασθενείς με ηλικία άνω του ενός έτους έτσι ώστε να διευκολυνθεί η όσο το δυνατόν ομαλή ανάπτυξη. Το 60 % περίπου των ασθενών απαντούν θετικά στη θεραπεία με κορτικοστεροειδή και ο αριθμός των δικτυοερυθροκυττάρων αυξάνει σε 10-15 ημέρες. Μετά από την επιτυχή απόκριση η δόση των κορτικοστεροειδών ελαττώνεται σταδιακά σε 0,5mg/kg την ημέρα. Οι ασθενείς που εμφανίζουν πτωχά αποτελέσματα με τα κορτικοστεροειδή μπαίνουν είτε σε μακροπρόθεσμο πρόγραμμα μεταγγίσεων σε συνδυασμό φυσικά με τη χρήση χηλικών ενώσεων απομάκρυνσης της περίσσειας σιδήρου για την αποφυγή αιμοχρωμάτωσης (δεσφεροξαμίνη ή δεφεριπρόνη, όταν η φερριτίνη ορού ξεπερνά τα 1000ng/ml). Ωστόσο, η μεταμόσχευση μυελού των οστών αποτελεί την μόνη θεραπευτική λύση που στοχεύει πιο κοντά στην αντιμετώπιση της αιτιοπαθογένειας του συνδρόμου. Μόνο όμως οι ασθενείς που έχουν εμφανίσει σοβαρές επιπλοκές όπως λευχαιμία, μυελοδυσπλασία ή απλαστική αναιμία είναι υποψήφιοι για 35

μεταμόσχευση. Ο δότης επιλέγεται προσεκτικά και πρέπει να είναι από HLAταυτόσημο αδερφό ή από αίμα ομφαλίου λώρου. Και στις περιπτώσεις αυτές όμως θα πρέπει να γίνεται προσεκτική επιλογή γιατί πάντα ελλοχεύει ο κίνδυνος για μη κλασικό σύνδρομο DBA στην οικογένεια με ήπιο φαινότυπο. Άλλες θεραπείες που έχουν δοκιμασθεί σε ορισμένες περιπτώσεις, είναι η χορήγηση ιντερλευκίνης 3 (IL-3), μετοκλοπραμίδης, λευκίνης, βαλπροϊκού οξέος και κυκλοσπορίνης μόνη ή σε συγχορήγηση με στεροειδή (Vlachos et al.2008). Α2.2.1.6. Κλινική εξέλιξη της DBA Η κλινική εξέλιξη στην DBA είναι συχνά απρόβλεπτη. Αφενός, οι επιπλοκές της θεραπευτικής προσέγγισης με τη μακροχρόνια χρήση στεροειδών, την υπερφόρτωση σιδήρου λόγω των μεταγγίσεων και τις πιθανές αιματογενείς λοιμώξεις μπορούν να επηρεάσουν δυσμενώς την ποιότητα ζωής των ασθενών. Αφετέρου, σ ένα ποσοστό 2-4% των ασθενών με DBA έχει αναφερθεί ύπαρξη αυξημένου κινδύνου για νεοπλασματικές νόσους με εντόπιση σε συμπαγή όργανα (οστεοσάρκωμα, μαστός, ήπαρ, στόμαχος, καρκινώματα του πεπτικού) ή στο αιμοποιητικό (οξεία μυελοειδής και λεμφοβλαστική λευχαιμία, λέμφωμα, μυελοδυσπλασία) (Vlachos et al. 2001, Lipton et al. 2001). Στις επόμενες ενότητες θα αναφερθούν πιο λεπτομερειακά παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί τόσο της DBA όσο και του συνδρόμου Del5q που σχετίζονται με τη λειτουργία των ριβοσωμάτων και το ρόλο συγκεκριμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών στις διαταραχές αυτές της ερυθροποίησης. Α3. Διαταραχές της ερυθροποίησης και ριβοσωμικές πρωτεϊνες Οι ριβοσωμοπάθειες συνθέτουν ένα σύνολο διαταραχών στις οποίες οι γενετικές ανωμαλίες που εντοπίζονται επιφέρουν ελαττωματική βιογένεση των 36