ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ 2011 Η αναγέννηση µηδενίζει το ηλικιακό ρολόι; Εκτίµηση της κυτταρικής γήρανσης σε αναγεννηµένα όργανα. Μιχάλης Αβέρωφ (επιστ. υπεύθυνος) Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας (ΙΜΒΒ), Ίδρυµα Τεχνολογίας και Έρευνας (ΙΤΕ) Ζαχαρίας Κονταράκης Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας (ΙΜΒΒ), Ίδρυµα Τεχνολογίας και Έρευνας (ΙΤΕ) Νικόλαος Κωνσταντινίδης Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας (ΙΜΒΒ), Ίδρυµα Τεχνολογίας και Έρευνας (ΙΤΕ) Δεκέµβριος 2011
1.Εισαγωγή Στόχοι Η γήρανση εκδηλώνεται ως μια σταδιακή μείωση της ικανότητας του οργανισμού για αυτο συντήρησηκαιανταπόκρισησεεξωτερικέςπροκλήσειςκαθώςαυξάνειηηλικία.το φαινόμενο της γήρανσης έχει συσχετισθεί με τη συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών τροποποιήσεων και τοξικών παραπροϊόντων του μεταβολισμού (π.χ. πρωτεϊνικά συσσωματώματα) τα οποία τα κύτταρα δεν μπορούν να αποβάλλουν. Ορισμένοιτύποικυττάρων,όπωςαυτάτηςγαμετικήςσειράς,μπορούννααποφεύγουν τη γήρανση ή να μηδενίζουν το "ηλικιακό ρολόι" κατά την αναπαραγωγή του οργανισμού. Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα κύτταρα αυτά επαναφέρουν τις επιγενετικές τροποποιήσεις και απαλάσσονται από τα συσσωρευμένα μεταβολικά παραπροϊόνταέχουνμόλιςαρχίσειναδιερευνώνται 1 2. Δεν είναι ακόμα σαφές αν και άλλοι πληθυσμοί κυττάρων, όπως αδιαφοροποίητα ή αρχέγονα βλαστικά κύτταρα, έχουν επίσης την ικανότητα να αποφεύγουν ή να καθυστερούν τη γήρανση. Για παράδειγμα, οι αναπτυξιακοί δίσκοι της Δροσίφιλας (αδιαφοροποίητακύτταραπουμαςδίνουντουςιστούςτηςενήλικηςμύγας)μπορούννα διατηρηθούν για πολλά χρόνια με διαδοχικές μεταμοσχεύσεις από μύγα σε μύγα, και κατόπινναδιαφοροποιηθούνσεφυσιολογικούςιστούς 3,ενώοκανονικόςχρόνοςζωής μιαςδροσόφιλαςείναιπερίπουέναςμήνας.παρόμοια,ποντίκιαπουέχουνγεννηθείαπό κλωνοποιημένασωματικάκύτταραδενδείχνουνσυμπτώματαπρόωρηςγήρανσηςακόμα καιμετά απόέξιγενιέςδιαδοχικώνκλωνοποιήσεων 4.Ταπαραδείγματααυτάδείχνουν ότι, κάτω από ορισμένες συνθήκες, τα σωματικά κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν σε «νεανική»κατάσταση,ενώτοάτομοπουταφιλοξενείσυνεχίζειναγερνάει. Ορισμένα ζώα έχουν τη δυνατότηνα να αναγεννούν ολόκληρες περιοχές του σώματος μετά από ακρωτηριασμό. Η διαδικασία της αναγέννησης χρησιμοποιεί βλαστικά κύτταρα ή διαφοροποιημενα κύτταρα που αποδιαφοροποιούνται, πολλαπλασιάζονται καιεπαναδιαφοροποιούνταιγιαναπαράγουντουςνέουςιστούς 5.Στημελέτηαυτήμας ενδιαφέρει να διερευνήσουμε κατά πόσο αυτή η διαδικασία "κυτταρικού επαναπρογραμματισμού"επηρεάζειτοβαθμόγήρανσηςτωναναγεννημένωνιστών. Η μελέτη μας επικεντρώνεται στην αναγέννηση των άκρων στο καρκινοειδές Parhyale hawaiensis 6. Τα άκρα του Pahyale αναγεννώνται πλήρως περίπου μία εβδομάδα μετά τονακρωτηριασμότους.ηδιάρκειαζωήςτουparhyaleείναιπερίπου1,5με2χρόνια.στο
εργαστήριοδιατηρούμεαναπαραγωγικούςπληθυσμούςπουπεριλαμβάνουνάτομααπό όλεςτιςηλικίες. Στόχος της μελέτης μας είναι η ταυτοποίηση ενός αξιόπιστου δείκτη κυτταρικής γήρανσης και η χρήση του για τη μέτρηση της κυτταρικής γήρανσης σε αναγεννημένα άκρα, στον οργανισμό Parhyale hawaiensis. Για την ταυτοποίηση του δείκτη γήρανσης ακολουθήσαμε δύο συμπληρωματικές προσεγγίσεις:(α) ελέγξαμε υποψήφιους δείκτες κυτταρικής γήρανσης που έχουν χρησιμοποιηθεί σε άλλους οργανισμούς 7 12, και (β) συγκρίναμε το μεταγραφικό προφίλ (transcriptome profile) άκρων από νεαρά και ηλικιωμέναάτομα. Πρινξεκινήσουμετημελέτηθελήσαμεεπίσηςνακαθιερώσουμεμιαμέθοδοπουθαμας επιτρέπει να εκτιμήσουμε την ηλικία ενός ατόμου στον Parhyale, όταν δεν γνωρίζουμε την ημερομηνία γέννησής του. Όπως συμβαίνει στα περισσότερα καρκινοειδή, ο Parhyaleεξακολουθείναμεγαλώνεισεμέγεθοςκαθ'ολητηδιάρκειατηςζωήςτου,μέσα απόδιαδοχικέςεκδύσεις ταηλικιωμέναάτομαέχουνπάνταμεγαλύτερομέγεθοςαπό τα νεαρά.τομέγεθοςεξαρτάταιεπίσηςσεκάποιοβαθμό από τηδιατροφήκαι από το φύλο (τα αρσενικά είναι συνήθως μεγαλύτερα). Στο παρακάτω γράφημα φαίνεται η σχέσημεγέθους(μήκοςτουσώματοςστηραχιαίαπλευρά)καιηλικίαςσεαρσενικάκαι θηλυκά άτομα, από ένα δείγμα 37 ατόμων των οποίων η ημερομηνία εκκόλαψης ήταν γνωστή.βασιζόμενοισεαυτήτησυσχέτιση,χρησιμοποιήσαμετομήκοςτουσώματοςγια νακατατάξουμεταάτομαενόςπληθυσμούσεδιαφορετικέςηλικιακέςκατηγορίες.
2.Υποψήφιοιδείκτεςκυτταρικήςγήρανσης Εστιάσαμε την προσοχή μας σε τρία χαρακτηριστικά που έχουν χρησιμοποιηθεί ως δείκτεςκυτταρικήςγήρανσηςσεάλλουςοργανισμούς τηνικανότητατωνκυττάρωννα αποκρίνονται σε θερμικό σοκ 7 9, τη συσσώρευση κατεστραμμένων μακρομορίων μέσα στο κύταρο 10, και την ενεργότητα λυσοσωμικής β γαλακτοσιδάσης 11 12 και ελέγξαμε κατάπόσοθαμπορούσαννααποτελέσουναξιόπιστουςδείκτεςγήρανσηςστονparhyale. Μάρτυραςθερμικούσοκ:ΣτοεργαστήριοδιαθέτουμεδιαγονιδιακέςσειρέςParhyaleπου φέρουν την κατασκευή PhHS DsRed, η οποία επάγει έκφραση της φθορίζουσας πρωτεΐνης DsRed μετά από θερμικό σοκ 13. Η ρυθμιστική αλληλουχίαphhs προέρχεται από γονίδιο hsp70 του Parhyale και περιλαμβάνει θέσεις πρόσδεσης για τον μεταγραφικόπαράγονταhsf,ο οποίοςρυθμίζειτην απόκρισηστοθερμικόσοκ.γιανα ελέγξουμε την ικανότητα απόκρισης στο θερμικό σοκ σε συνάρτηση με την ηλικία επιλέξαμε τη διαγονιδιακή σειρά h1a, η οποία εγκαθιδρύθηκε από ένα διαγονιδιακό άτομο (G0) και περιλαμβάνει άτομα διαφόρων ηλικιών. Υποβάλλαμε 24 άτομα διαφόρων ηλικιών σε θερμικό σοκ (1h στους 37 C) και μετρήσαμε την αύξηση στην ένταση φθορισμού της DsRed μετά από 1 ημέρα. Όπως φαίνεται στο παρακάτω γράφημα,δενπαρατηρήσαμεσημαντικήδιαφοράστηναύξησητηςέντασηςφθορισμού μεταξύ νεαρών (μικρών) και ηλικιωμένων (μεγάλων) ατόμων στο δείγμα μας, με εξαίρεση3νεαράάτομαπουεμφάνισανπολύμεγαλύτερηαύξηση.συμπεραίνουμεότιη έντασητηςαπόκρισηςστοθερμικόσοκδεναποτελείαξιόπιστομάρτυραγήρανσης,αλλά ίσωςνασυσχετίζεταιμετη γήρανσησεειδικέςπεριπτώσεις(κρατήσαμετατρίαάτομα πουπαρουσίασαναυξημένηαπόκρισηγιαναταεξετάσουμεσεμεγαλύτερηηλικία).
Λυσοσωμική β γαλακτοσιδάση: Ιστοχημική χρώση για την ανίχνευση λυσοσωμικής β γαλακτοσιδάσηςέγινεσενεαράκαιηλικιωμέναάτομα,χρησιμοποιώνταςx galσεόξινες συνθήκες(ph=6.0).μετάαπόπολλέςώρεςαντίδρασης,παρατηρήσαμεμόνομηειδική χρώση στην εξωτερική επιφάνεια του εξωσκελετού. Δεν παρατηρήσαμε διαφορά στην έντασητηςχρώσηςανάμεσασενεαράκαισεηλικιωμέναάτομα. Συσσώρευση κατεστραμμένων μακρομορίων: Η συσσώρευση κατεστραμμένων μακρομορίων με τη μορφή καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών ή lipofuscin στο κυτταρόπλασμαέχειχρησιμοποιηθείστοπαρελθόνωςδείκτηςγήρανσης 10.Ηανίχνευση αυτώντωνμακρομορίωνγίνεταισυνήθωςμεβιοχημικέςμεθόδουςήμεπαρατήρησητου αυτοφθορισμού της lipofuscin στο μικροσκόπιο. Επιλέξαμε τη μέθοδο του αυτοφθορισμού γιατί θα μας επέτρεπε να παρατηρήσουμε άμεσα τον εντοπισμό της lipofuscin σε συγκεκριμένους ιστούς και κυτταρικούς τύπους, που θα ήταν ιδιαίτερα χρήσιμη για μετέπειτα παρατηρήσεις στα αναγεννημένα άκρα. Οι μετρήσεις αυτοφθορισμούέγινανσε42άτομαδιαφορετικώνηλικιώνμεδιέγερσηστα340 380nm καιπαρατήρησηστα>420nm.όπωςφαίνεταιστοπαρακάτωγράφημα,παρατηρήθηκε μόνομιαασθενήςσυσχέτισημεταξύτουαυτοφθορισμούκαιτουμεγέθους(ηλικίας)των ζώων. Συμπεραίνουμε ότι η μέθοδος αυτή δεν αποτελεί ευαίσθητο ή αξιόπιστο δείκτη γήρανσηςστονparhyale.
3.Μεταγραφικόπροφίλτηςγήρανσης(RNA seq) Για να διακρίνουμε αν υπάρχει ένα αξιόπιστο "μοριακό προφίλ" κυτταρικής γήρανσης ακολουθήσαμε τη στρατηγική της αλληλούχισης και ποσοτικής σύγκρισης μεγάλου αριθμούμεταγράφων(rna seq 14 )απόταάκρανεαρώνκαιηλικιωμένωνατόμων. Sample N o ofanimals Size Inferredage RNAquantity Young 109 4,5 6,0mm 4,5 6,5mm 3 6μήνες 15μg Old 53 7,5 9,0mm 9,0 11,5mm >12μήνες 45μg ΣτοολικόRNAπουαπομονώσαμεαπόκάθεδείγμαέγινεπέψημεDNAaseI,απομόνωση τουπολυαδενυλιωμένουrna(mrna)καιαλληλούχισηστηνπλατφόρμαabisolid4του CentreforGeneticsandGenomics(Univ.Nottingham).Ηαπόδοσηήταν33.144.669και 35.618.284readsγιαταδείγματααπόνεαράκαιηλικιωμέναάτομααντίστοιχα. Οι αλληλουχίες του RNA seq χαρτογραφήθηκαν στο transcriptome του Parhyale, χρησιμοποιώνταςμιαβάσηδεδομένωνπουπεριλαμβάνει104.033πιθανάδιαφορετικά μετάγραφα (isotigs), οι οποίοι αντιστοιχούν σε 55.519 πιθανούς γενετικούς τόπους (isogroups) στον Parhyale. Πάνω από το 40% των reads αντιστοιχήθηκαν σε isogroups, και πάνω από 20% αντιστοιχήθηκαν σε ένα μόνο isogroup. Κατόπιν έγινε στατιστική ανάλυσηγιαναταυτοποιηθούνοιπιοσημαντικέςδιαφορέςανάμεσαστανεαράκαιστα γηρασμένα άκρα, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα DEGseq 15. Για την ταυτοποίηση αυτών των διαφορών επικεντρωθήκαμε στις αλληλουχίες που αντιστοιχήθηκαν σε ένα μόνο isogroup (uniquely mapped reads). Η ανάλυση αυτή έγινε απο τον Martin Blythe στοcentreforgeneticsandgenomics(nottingham). Sample Reads ExcludedReads (rrna,artifacts) Young 33.144.669 552.953 (2%) Old 35.618.284 454.607 (1%) MappedReads 13.850.506 (42%) 14.940.716 (42%) Uniquely MappedReads 7.241.704 (22%) 7.972.924 (22%)
Από την ανάλυση προέκυψαν 73 διαφορετικοί γενετικοί τόποι (isogroups) που παρουσιάζουνστατιστικάσημαντικήδιαφοράσταεπίπεδαέκφρασήςτουςσενεαράκαι ηλικιωμέναάτομα(λόγοςέκφρασης>4). 4.Επιβεβαίωσημοριακώνδεικτώνγήρανσης(qPCR) Από αυτά τα 73 isogroups επιλέξαμε δέκα για επιβεβαίωση και περαιτέρω μελέτη με qpcr. Συγκεκριμένα, επιλέξαμε τους δέκα γενετικούς τόπους που παρουσίαζαν τις υψηλότερες διαφορές μεταξύ των δύο δειγμάτων πέντε με υψηλότερη έκφραση στα νεαρά και πέντε στα γηρασμένα άκρα με την προϋπόθεση αυτά τα isogroups να αντιπροσωπεύονταιαπότουλάχιστον100readsσταδύοδείγματα. Isogroup ReadsinYoung ReadsinOld log2difference ig14190 1 1075 10,1 ig25990 257 27924 6,8 ig30705 1 399 8,6 ig44123 52 7679 7,2 ig47225 22 6559 8.2 ig11643 100 2 5,6 ig16642 158 8 4,3 ig24095 141 2 6,1 ig41884 137 7 4,3 ig03206 193 9 4,4 Ταυτόχρονα, από τα δεδομένα του RNA seq επιλέξαμε και δύο γονίδια αναφοράς για κανονικοποίηση των δειγμάτων στα qpcrs: τα isogroups ig07133 και ig08602, που κωδικοποιούν προϊόντα που εμφανίζουν σημαντική ομοιότητα με τον ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης της μετάφρασης eif3 και με τον παράγοντα ματίσματος U3, αντίστοιχα.σύμφωναμεταδεδομένατουrna seq,ταεπίπεδάέκφρασήςτουςσενεαρά καιηλικιωμέναάκραπαρουσιάζουνδιαφορέςμικρότερεςτου0.35%(log2<0,005). ΤαqPCRsσταδέκαεπιλεγμέναisogroupsέδωσανταεξήςαποτελέσματα: i) Τέσσερα isogroups (ig25990, ig44123, ig47225, ig16642) εκφράζονται και στα δύο δείγματα δίνοντας το αναμενόμενο προϊόν. Η ποσοτική ανάλυση με qpcr
επιβεβαίωσεκαιστις4περιπτώσειςότι αυτά τα isogroups παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα εκφρασής τους σε νεαρά και ηλικιωμένα άτομα. Οι λόγοι έκφρασης ήταν διαφορετικοί από αυτούς που παρατηρήσαμε με RNAseq, αλλά σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκαν διαφορέςπροςτηνίδιακατεύθυνση.ηπαραπάνωεικόνααπεικονίζειτιςδιαφορέςστα επίπεδαέκφρασηςανάμεσασενεαράκαισεηλικιωμέναάκρα. ii) Δύο isogroups (ig30705, ig41884) εμφανίζουν προϊόν σε ένα από τα δύο δείγματα αλλά όχι στο άλλο, δίνοντας πληροφορία πάνω στην έκφραση ή μη της αλληλουχίας.τααποτελέσματασυμφωνούνμε τηδιαφοράπουβλέπουμεστο RNAseq (βλ.παρακάτω). iii)δύοisogroups(ig11643,ig24095)εμφανίζουνδιαφορετικάπροϊόντασταδύο δείγματα, που ενδεχομένως αντιστοιχούν σε διαφορετικές ισομορφές του ίδιου μεταγράφου (βλ. παρακάτω). Στην περίπτωση του ig24095 αυτό επιβεβαιώθηκε με κλωνοποίηση και αλληλούχιση του προϊόντος, αποκαλύπτοντας μια ενδιαφέρουσα περίπτωσηδιαφορετικούματίσματοςστανεαράκαιηλικιωμέναάκρα. v) Δύο isogroups (ig14190, ig03206) δίνουν παραπροϊόντα που καθιστούν τα qpcrsμηαξιόπιστα. 5.Εκτίμησητηςγήρανσηςσεαναγεννημέναάκρα ΟσυνδυασμόςRNA seqκαιqpcrμαςεπέτρεψενααπομονώσουμεοκτώγονίδια δείκτες και να χαρακτηρίσουμε τις τιμές (ποσοτικές ή ποιοτικές) που αντιστοιχούν στη γηρασμένη και νεαρή κατάσταση. Τώρα μπορούμε επομένως να προσεγγίσουμε το αρχικόμαςερώτημα πώςηαναγέννησηεπηρεάζειτηνηλικίατωνάκρων ελέγχοντας πώςσυμπεριφέρονταιαυτοίοιδείκτεςστααναγεννημέναάκρα. Από τα 56 ηλικιωμένα άτομα που χρησιμοποιήσαμε αρχικά για την απομόνωση του υλικού για RNA seq, 16 επιβίωσαν και αναγέννησαν όλα τους τα άκρα. Απομονώσαμε αυτά τα αναγεννημένα άκρα και ακολουθήσαμε την ίδια διαδικασία για την εξαγωγή
πολυαδενυλιωμένου RNA (mrna) και τον έλεγχο των επιπέδων έκφρασης για τον καθένααπό τους οκτώδείκτες,μεqpcr.ηπαρακάτωεικόναδείχνει τα αποτελέσματα πουπαίρνουμεμεpcrγιατονκαθένααπότουςοκτώδείκτες,απόγηρασμένα,νεανικά καιγηρασμένααλλάαναγεννημέναάκρα(απόαριστεράπροςταδεξιά). Στα αναγεννημένα άκρα, από τους τέσσερις ποσοτικούς δείκτες, ο ένας (ig16642) εμφανίζειεπίπεδαέκφρασηςπουείναιχαρακτηριστικάτωνηλικιωμένωνάκρων,ενώοι άλλοι τρεις (ig259901, ig441231, ig472251) εμφανίζουν επίπεδα έκφρασης που βρίσκονταιπιοκοντάστιςτιμέςτωννεανικώνάκρων(καιστιςτρειςπεριπτώσειςοιτιμές είναιακόμηπιοχαμηλέςαπόαυτέςπουπαρατηρούμεστανεανικάάκρα).μεβάσητους δείκτες ig30705 και ig41884 ο αναγεννημένος ιστός ακολουθεί την νεαρή κατάσταση. Τέλος, με βάση τις διαφορετικές ισομορφές που παρατηρούμε στα isotigs ig11643 και ig24095, τα αναγεννημένα άκρα φαίνεται να διατηρούν τις ιδιότητες των ηλικιωμένων άκρων. Μπορούμε δηλαδή να πούμε πως τα αναγέννημένα παρουσιάζουν χαρακτηριστικά ηλικιωμένου ιστού με βάση τους τρεις από τους οκτώ δείκτες, και χαρακτηριστικάνεανικούιστούμεβάσηάλλουςπέντεδείκτες. Isotig Young Old RegeneratedOld ig25990 1-3.00 0-7.82 ig44123 1-3.83 0-7.54 ig47225 1-3.20 0-11.43 ig16642 1 6.39 0-0.66 ig30705 OFF ON OFF ig41884 ON OFF ON ig11643 isoformα isoformsa+b isoformsa+b ig24095 isoformα isoformβ isoformβ 1 Valuesrepresentlog2differenceofexpressionlevelsrelativetothe'Old'sample.
6.Συμπεράσματα Στην προσπάθειά μας να ταυτοποιήσουμε δείκτες κυτταρικής γήρανσης στον Parhyale εξετάσαμευποψήφιουςδείκτεςγήρανσηςπουέχουν χρησιμοποιηθείσεάλλαείδηστο παρελθόν,καισυγκρίναμετομοριακό(μεταγραφικό)προφίλτωνάκρωναπόνεαράκαι ηλικιωμέναζώα.ηπρώτηπροσέγγισηδεναπέδωσεικανοποιητικάαποτελέσματα,όμως η δεύτερη αποκάλυψε ένα μεγάλο αριθμό αλληλουχιών που εμφανίζουν διαφορετικά επίπεδαέκφρασηςανάλογαμετηνηλικία.τουλάχιστονοκτώαπόαυτέςτηςαλληλουχίες φαίνεται να αποτελούν αξιόπιστους δείκτες της ηλικίας των άκρων: τα επίπεδα έκφρασής τουςή οι ισομορφές τους παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στα άκρανεαρώνκαιηλικιωμένωνάτομων. Χρησιμοποιώντας αυτούς τους οκτώ δείκτες, εξετάσαμε τον "ηλικιακό χαρακτήρα" αναγεννημένωνάκρων.ηανάλυσηαυτήέδειξε: i) Τα άκρα ηλικιωμένων ατόμων που έχουν υποστεί αναγέννηση διατηρούν, για ορισμένους από τους δείκτες μας (ig16642, ig11643, ig24095), τα χαρακτηριστικά που είχανπριντηναναγέννηση.ηπαρατήρησηαυτήυποδηλώνειότιτααναγεννημέναάκρα δεν είναι όμοια με τα νεανικά άκρα ως προς το μεταγραφικό τους προφίλ, αλλά διατηρούν τουλάχιστον κάποια από τα χαρακτηριστικά των γηρασμένων άκρων. Μας δείχνει επίσης ότι τα συγκεκριμένα γονίδια δείκτες αποτελούν ιδιαίτερα αξιόπιστους δείκτεςτηςηλικίαςτουζώου,καθώςδεφαίνεταιναεπηρεάζονταιαπότιςαλλαγέςπου συμβαίνουνκατάτηδιαδικασίατηςανάπλασηςτωνάκρων. ii) Ως προς τους άλλους πέντε δείκτες, το προφίλ των αναγεννημένων άκρων φαίνεται να αλλάζει σημαντικά και να βρίσκεται πιο κοντά στις τιμές των άκρων από νεαρά άτομα. Αυτό μπορεί να σημαίνει ότι τα αναγεννημένα άκρα αποκτούν κάποια "νεανικά" χαρακτηριστικά. Μπορεί όμως να οφείλεται και στο ότι κάποιοι από τους δείκτες αυτούς σχετίζονται με λειτουργίες που ενεργοποιούνται από τη ίδια τη διαδικασίααναγέννησης(π.χ.τονκυτταρικόπολλαπλασιασμό,τηναύξησηιστικήςμάζας ήτηνέκδυση)καιδεναποτελούνμόνοχαρακτηριστικόνεανικούιστού.θαεξετάσουμε αυτότοενδεχόμενομελετώνταςτισυμβαίνειστααναγεννημέναάκρανεαρώνατόμων. Για την περειτέρω διερεύνηση αυτού του θέματος θα μελετήσουμε το μεταγραφικό προφίλ αναγεννημένων άκρων (από νεαρά και από ηλικιωμένα ζώα) σε μεγαλύτερη
κλίμακα,χρησιμοποιώνταςrna seq.ηπροσέγγισηαυτήθαμαςδώσειμιαπληρέστερη εικόνα της ηλικιακής ταυτότητας των αναγεννημένων ποδιών, με βάση το σύνολο των μεταγράφωνπουπαρουσιάζουνδιαφορέςέκφρασηςσενεαράκαισεγηρασμέναάτομα. Βιβλιογραφία 1 2 3 4 5 6 7 8 9 AguilaniuH,GustafssonL,RigouletMandNyströmT(2003)Asymmetricinheritanceof oxidativelydamagedproteinsduringcytokinesis.science299:1751 1753. LiuB,LarssonL,CaballeroA,HaoX,OlingD,GranthamJandNyströmT(2010)The polarisomeisrequiredforsegregationandretrogradetransportofproteinaggregates. Cell140:257 267. HadornE(1968)Transdeterminationincells.SciAm.219:110 114. WakayamaT,ShinkaiY,TamashiroKL,NiidaH,BlanchardDC,BlanchardRJ,OguraA, TanemuraK,TachibanaM,PerryAC,ColganDF,MombaertsPandYanagimachiR (2000)Cloningofmicetosixgenerations.Nature407:318 319. BrockesJPandKumarA(2002)Plasticityandreprogrammingofdifferentiatedcellsin amphibianregeneration.natrevmolcellbiol3:566 74. PavlopoulosAandAverofM(2005)Establishinggenetictransformationfor comparativedevelopmentalstudiesinthecrustaceanparhyalehawaiensis.pnas102: 7888 7893. HeydariAR,YouS,TakahashiR,Gutsmann ConradA,SargeKDandRichardsonA (2000)Age relatedalterationsintheactivationofheatshocktranscriptionfactor1in rathepatocytes.expcellres256:83 93. ReaSL,WuD,CypserJR,VaupelJWandJohnsonTE(2005)Astress sensitivereporter predictslongevityinisogenicpopulationsofcaenorhabditiselegans.natgenet37: 894 898. WesterheideSD,AnckarJ,StevensSMJr,SistonenLandMorimotoRI(2009)Stressinducibleregulationofheatshockfactor1bythedeacetylaseSIRT1.Science323: 1063 1066. 10 TermanAandBrunkUT(2004)Lipofuscin.IntJBiochemCellBiol36:1400 1404.
11 LeeBY,HanJA,ImJS,MorroneA,JohungK,GoodwinEC,KleijerWJ,DiMaioDand 12 13 14 15 KishiS,BaylissPE,UchiyamaJ,KoshimizuE,QiJ,NanjappaP,ImamuraS,IslamA, NeubergD,AmsterdamAandRobertsTM(2008)Theidentificationofzebrafish mutantsshowingalterationsinsenescence associatedbiomarkers.plosgenet4: e1000152. PavlopoulosA,KontarakisZ,LiubicichD,SeranoJ,AkamM,PatelNHandAverofM (2009)ProbingtheevolutionofappendagespecializationbyHoxgenemis expression inanemergingmodelcrustacean.pnas106:13897 13902. WilhelmBTandLandryJR(2009)RNA Seq quantitativemeasurementofexpression throughmassivelyparallelrna sequencing.methods48:249 257. WangL,FengZ,WangX,WangXandZhangX(2010)DEGseq:anRpackagefor HwangES(2006)Senescence associatedbeta galactosidaseislysosomalbetagalactosidase.agingcell5:187 195. identifyingdifferentiallyexpressedgenesfromrna seqdata.bioinformatics26:136 138.