ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΕΦΕΔΡΕΙΩΝ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΤΩΝ ΠΟΡΩΝ ΤΟΥ MÜLLER ΣΕ ΑΝΔΡΕΣ ΜΕ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ Α ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Κ. ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2012-2013 ΑΡΙΘΜ: 2794 ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΕΦΕΔΡΕΙΩΝ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΤΩΝ ΠΟΡΩΝ ΤΟΥ MÜLLER ΣΕ ΑΝΔΡΕΣ ΜΕ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑΣ ΧΡΗΣΤΟΥ Π. ΤΣΑΜΕΤΗ ΙΑΤΡΟΥ - ΕΝΔΟΚΡΙΝΟΛΟΓΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013 1

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΠΑΠΑΔΗΜΑΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΠΑΝΙΔΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΚΑΤΣΙΚΑΣ ΟΜOΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΠΑΠΑΔΗΜΑΣ ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΠΑΝΙΔΗΣ ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΚΑΤΣΙΚΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ BΑΣΙΛΕΙΟΣ Κ. ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΡΗΓΟΡΙΟΣ ΓΚΡΙΜΠΙΖΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Γ. ΓΟΥΛΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΩΝ/ΝΟΣ ΧΑΤΖΗΜΟΥΡΑΤΙΔΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5343/32, άρθρ. 202 2 και ν.1268/ 82, αρθρ.50 8) 3

AΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Κ. ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ TOY ΤΟΜΕΑ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΜΑΚΡΗΣ 5

Στην oικογένειά μου, με αγάπη και ευγνωμοσύνη Στον υπογόνιμο άνδρα 7

Περιεχόμενα Σελίδα Ευρετήριο πινάκων 15 Ευρετήριο σχημάτων 17 Κατάλογος συντομογραφιών 19 Πρόλογος 21 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 25 1. Φυσιολογία του γεννητικού συστήματος του άνδρα 27 1.1. Στοιχεία ανατομίας και ιστολογίας των όρχεων 27 1.2. Φυσιολογία του άξονα Υποθάλαμος Υπόφυση - Όρχεις 31 1.3. Φυσιολογία της σπερματογένεσης 34 1.3.1. Φάσεις της σπερματογένεσης 35 1.3.2. Κύκλος και κύμα της σπερματογένεσης 39 1.3.1. Ρύθμιση της σπερματογένεσης 40 2. Ανδρική υπογονιμότητα 45 2.1. Ορισμοί - επιδημιολογία 45 2.2. Αιτιολογία της ανδρικής υπογονιμότητας 48 2.3. Διαγνωστική προσέγγιση της ανδρικής υπογονιμότητας 56 2.3.1. Ιστορικό 58 2.3.2. Κλινική εξέταση 59 2.3.3. Έλεγχος του σπέρματος 60 2.3.4. Βασικός ορμονικός έλεγχος 67 2.3.5. Απεικονιστικός έλεγχος 68 2.3.6. Εξέταση ούρων για ύπαρξη σπερματοζωαρίων 69 2.3.7. Γενετικός έλεγχος 69 2.3.8. Ιστολογικός Κυτταρολογικός έλεγχος των όρχεων 72 3. Ανασταλτική ορμόνη των πόρων του Müller 77 3.1. Εισαγωγή - Ιστορική αναδρομή 77 3.2. Η πρωτεΐνη και το γονίδιο της ΑΜΗ 79 3.3. Σύνθεση και έκκριση της ΑΜΗ από τους όρχεις 81 9

3.4. Ρύθμιση της έκκρισης της ΑΜΗ 84 3.4.1. Ο ρόλος της τεστοστερόνης 84 3.4.2. Ο ρόλος της FSH 86 3.4.3. O ρόλος των γεννητικών κυττάρων 87 3.5. Μηχανισμός δράσης της ΑΜΗ 88 3.6. Βιολογικές δράσεις της ΑΜΗ 91 3.6.1. Υποστροφή των πόρων του Μüller 91 3.6.2. Κάθοδος των όρχεων 92 3.6.3. Ανάπτυξη των πνευμόνων 93 3.6.4. Ανάπτυξη και λειτουργία των όρχεων 93 3.6.5. Δράση στην υπόφυση και τον προστάτη 94 3.6.6. Δράση στο ΚΝΣ 95 3.7. Η ΑΜΗ στην κλινική πράξη 95 3.7.1. Συγκεντρώσεις της ΑΜΗ στον ορό φυσιολογικών ανδρών και γυναικών 96 3.7.2. Σύνδρομο παραμονής των πόρων του Μüller 98 3.7.3. Κρυψορχία 98 3.7.4. Διαταραχές διαφοροποίησης του φύλου 99 3.7.5. Πρώϊμη ήβη 100 3.7.6. Υπογοναδοτροπικός Υπογοναδισμός 101 3.7.7. Σύνδρομα με καρυοτυπικές ανωμαλίες 102 3.7.8. Κιρσοκήλη 103 3.7.9. Παχυσαρκία και μεταβολικό σύνδρομο 103 3.7.10. Διαταραχές σπερματογένεσης-ανδρική υπογονιμότητα 104 3.7.11. Η ΑΜΗ ως δυνητικά θεραπευτικός παράγοντας 106 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 107 1. Σκοπός 109 2. Ασθενείς και Μέθοδοι 110 2.1. Ασθενείς 110 2.2. Μέθοδοι 111 2.2.1. Ιστορικό 112 10

2.2.2. Κλινική εξέταση 112 2.2.3. Σπερμοδιάγραμμα 113 2.2.4. Ορμονικός έλεγχος 114 2.2.5. Δοκιμασία EFSERT 117 2.2.6. Απεικονιστικός και γενετικός έλεγχος 118 2.2.7. FNA όρχεων 119 2.2.8. Μεθοδολογία αιτιολογικής κατάταξης των υπογόνιμων ανδρών 121 2.3. Στατιστική ανάλυση 122 3. Αποτελέσματα 124 3.1. Αιτιολογική κατάταξη των υπογόνιμων ανδρών 124 3.2. Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των υπογόνιμων ανδρών και σύγκρισή τους με την ομάδα ελέγχου 126 3.2.1. Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα των υπογόνιμων ανδρών 126 3.2.2. Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα των ανδρών της ομάδας ελέγχου 128 3.2.3. Σύγκριση των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ και των υπόλοιπων κλινικοεργαστηριακών παραμέτρων μεταξύ των υπογόνιμων ανδρών και της ομάδας ελέγχου 129 3.3. Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι υπογόνιμων ανδρών με διαφορετικά αίτια υπογονιμότητας και σύγκριση μεταξύ τους 130 3.3.1. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα των υπογόνιμων ανδρών με ιδιοπαθή μη αποφρακτική αζωοσπερμία 130 3.3.2. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα των υπογόνιμων ανδρών με ιδιοπαθή δυσπερμία 131 3.3.3. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα των υπογόνιμων ανδρών με κιρσοκήλη 132 3.3.4. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα των υπογόνιμων ανδρών με κρυψορχία 133 3.3.5. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα των υπογόνιμων ανδρών με υπεργοναδοτροπικό υπογοναδισμό 135 3.3.6. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα των υπογόνιμων ανδρών με σπάνια αίτια υπογονιμότητας 136 11

3.3.7. Σύγκριση των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ και των υπόλοιπων κλινικοεργαστηριακών παραμέτρων μεταξύ υπογόνιμων ανδρών με διαφορετικά αίτια υπογονιμότητας 138 3.4. Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι ανδρών με διαφορετικές σπερματολογικές διαγνώσεις και σύγκριση μεταξύ τους 141 3.4.1.Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα ανδρών με φυσιολογικό σπερμοδιάγραμμα 141 3.4.2. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα υπογόνιμων ανδρών με μεμονωμένες διαταραχές του σπέρματος 141 3.4.3. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα υπογόνιμων ανδρών με ήπια/μέτρια ΟΤΑ 142 3.4.4. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα υπογόνιμων ανδρών με βαρεία ΟΤΑ 143 3.4.5. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα υπογόνιμων ανδρών με αζωοσπερμία 144 3.4.6. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα υπογόνιμων ανδρών με ασπερμία 146 3.4.7. Σύγκριση των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ και των υπόλοιπων κλινικοεργαστηριακών παραμέτρων μεταξύ ανδρών με διαφορετικές σπερματολογικές διαγνώσεις 147 3.5. Συσχετίσεις της ΑΜΗ με κλινικές, ορμονικές και παραμέτρους του σπερμοδιαγράμματος 150 3.5.1. Συσχετίσεις της ΑΜΗ με κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους στο σύνολο των ανδρών της μελέτης 150 3.5.2. Συσχετίσεις της ΑΜΗ με κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους στους άνδρες της ομάδας ελέγχου και τους υπογόνιμους άνδρες 155 3.5.3. Συσχετίσεις της ΑΜΗ με κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους ανάλογα με την αιτιολογική διάγνωση της υπογονιμότητας 156 3.5.4. Συσχετίσεις της ΑΜΗ με κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους ανάλογα με τη σπερματολογική διάγνωση 156 3.6. Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών που υποβλήθηκαν στη δοκιμασία EFSERT 157 3.6.1. Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα των ανδρών της ομάδας ελέγχου που υποβλήθηκαν στη δοκιμασία EFSERT 157 12

3.6.2. Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα των υπογόνιμων ανδρών που υποβλήθηκαν στη δοκιμασία EFSERT 157 3.6.3. Μεταβολές της συγκέντρωσης της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία EFSERT σε υπογόνιμους άνδρες και την ομάδα ελέγχου 158 3.6.4. Μεταβολές της συγκέντρωσης της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία EFSERT ανάλογα με το αίτιο της υπογονιμότητας 160 3.6.5. Μεταβολές της συγκέντρωσης της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία EFSERT ανάλογα με τη σπερματολογική διάγνωση 163 3.6.6. Μεταβολές της συγκέντρωσης της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία EFSERT ανάλογα με τη συγκέντρωση της FSH 165 3.6.7. Μεταβολές της συγκέντρωσης της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία EFSERT σε άνδρες με μη αποφρακτική αζωοσπερμία ανάλογα με την ανεύρεση ή όχι σπερματοζωαρίων στην FNA όρχεων 166 4. Συζήτηση 169 5. Συμπεράσματα 193 6. Περίληψη 195 7. Summary 199 8. Βιβλιογραφία 203 13

Ευρετήριο πινάκων ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 Ορισμός, επίπτωση και ταξινόμηση της υπογονιμότητας. 46 2 Αιτιολογική ταξινόμηση της ανδρικής υπογονιμότητας κατά WHO 48 3 Ταξινόμηση των αιτίων της ανδρικής υπογονιμότητας ανάλογα με το επίπεδο διαταραχής του αναπαραγωγικού άξονα 50 4 Η συχνότητα των αιτίων της ανδρικής υπογονιμότητας 52 5 Τιμές αναφοράς σπερμοδιαγράμματος. 62 6 Συγκεντρώσεις ΑΜΗ στον ορό φυσιολογικών ανδρών και γυναικών με τη χρήση ELISA 97 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 Αιτιολογική κατάταξη των υπογόνιμων ανδρών της μελέτης. 125 2 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι στο σύνολο των υπογόνιμων ανδρών. 126 3 Η συχνότητα εμφάνισης των διαφόρων διαταραχών του σπέρματος στο σύνολο των υπογόνιμων ανδρών της μελέτης. 127 4 Κυτταρολογικές διαγνώσεις των υπογόνιμων ανδρών που υποβλήθηκαν σε FNA όρχεων. 128 5 Σύγκριση κλινικών και εργαστηριακών παραμέτρων μεταξύ υπογόνιμων ανδρών και ομάδας ελέγχου. 130 6 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με ιδιοπαθή μη αποφρακτική αζωοσπερμία. 131 7 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με ιδιοπαθή δυσπερμία. 132 8 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με κιρσοκήλη. 133 9 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με κρυψορχία. 134 10 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με υπεργοναδοτροπικό υπογοναδισμό 136 11 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των υπογόνιμων ανδρών με σπάνια αίτια υπογονιμότητας 137 15

12 Σύγκριση των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ και άλλων κλινικοεργαστηριακών παραμέτρων μεταξύ υπογόνιμων ανδρών με διαφορετικά αίτια υπογονιμότητας και της ομάδας ελέγχου. 140 13 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με μεμονωμένες διαταραχές του σπέρματος. 142 14 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με ήπια/μέτρια ΟΤΑ. 143 15 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με βαρεία ΟΤΑ. 144 16 Κυτταρολογικές διαγνώσεις στους άνδρες με αζωοσπερμία που υποβλήθηκαν σε FNA όρχεων. 145 17 Κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ανδρών με αζωοσπερμία. 146 18 Κλινικές και ορμονικές παράμετροι των ανδρών με ασπερμία. 147 19 Σύγκριση των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ και άλλων κλινικοεργαστηριακών παραμέτρων μεταξύ ανδρών με διαφορετικές σπερματολογικές διαγνώσεις. 149 20 Συγκεντρώσεις της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία ΕFSERT σε υπογόνιμους άνδρες και την ομάδα ελέγχου. 159 21 Συγκεντρώσεις της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία ΕFSERT ανάλογα με το αίτιο της υπογονιμότητας. 161 22 Συγκεντρώσεις της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία ΕFSERT ανάλογα με τη σπερματολογική διάγνωση 163 23 Συγκεντρώσεις της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία ΕFSERT ανάλογα με τη συγκέντρωση της FSH 165 24 Συγκεντρώσεις της ΑΜΗ κατά τη δοκιμασία ΕFSERT σε άνδρες με μη αποφρακτική αζωοσπερμία ανάλογα με την ανεύρεση ή όχι σπερματοζωαρίων στην FNA όρχεων 167 16

Ευρετήριο σχημάτων ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 Ανατομικές σχέσεις των κυττάρων του σπερματικού σωληναρίου. 29 2 Ο άξονας Υποθάλαμος Υπόφυση Όρχεις. 32 3 Οι κυτταρικές διαιρέσεις και το χρονοδιάγραμμα της σπερματογένεσης. 36 4 Οι περιοχές AZF και οι οικογένειες γονιδίων που εμπλέκονται στη σπερματογένεση. 56 5 Η οικογένεια του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης- β (TGF-β). 78 6 (Α) Το γονίδιο της ΑΜΗ και η περιοχή του επαγωγέα του. (Β) Το πεπτιδικό μονομερές της ΑΜΗ και η θέση πρωτεόλυσής του. 80 7 Δομή και μεταβολές του μορίου της ΑΜΗ. 80 8 Η αντίστροφη σχέση που υπάρχει μεταξύ της ΑΜΗ και της ολικής Τ στη συστηματική κυκλοφορία μετά τη νεογνική περίοδο. 83 9 Αλλαγή του προσανατολισμού έκκρισης της ΑΜΗ από τα κύτταρα Sertoli μετά την εφηβεία. 83 10 Μεταβολές των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ στα διάφορα στάδια της φυσιολογικής εφηβείας και σε καταστάσεις υπογοναδοτροπικού υπογοναδισμού ή ελαττωμένης σύνθεσης ή δράσης της Τ. 85 11 Η ορμονική ρύθμιση της έκκρισης της ΑΜΗ. Αλληλεπίδραση της FSH και της Τ σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. 87 12 Ενδοκυττάριοι οδοί μετάδοσης του σήματος της ΑΜΗ. 90 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 Τυποποιημένο σχήμα διαγνωστικής προσέγγισης των υπογόνιμων ανδρών. 121 2 Διάγραμμα πλαισίου-απολήξεων (θηκόγραμμα) των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ σε υπογόνιμους άνδρες και ομάδα ελέγχου. 129 3 Διάγραμμα πλαισίου-απολήξεων (θηκόγραμμα) των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ στην ομάδα ελέγχου και τις κυριότερες αιτιολογικές διαγνώσεις των υπογόνιμων ανδρών. 139 4 Διάγραμμα πλαισίου-απολήξεων (θηκόγραμμα) των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ ανάλογα με τη σπερματολογική διάγνωση. 148 17

5 Διάγραμμα διασποράς-γραμμή τάσης μεταξύ της ηλικίας και της ΑΜΗ. 151 6 Διάγραμμα διασποράς-γραμμή τάσης μεταξύ του συνολικού όγκου των όρχεων και της ΑΜΗ. 151 7 Διάγραμμα διασποράς-γραμμή τάσης μεταξύ της FSH και της ΑΜΗ. 152 8 Διάγραμμα διασποράς-γραμμή τάσης μεταξύ της LH και της ΑΜΗ. 152 9 Διάγραμμα διασποράς-γραμμή τάσης μεταξύ της ολικής Τ και της ΑΜΗ. 153 10 Διάγραμμα διασποράς-γραμμή τάσης μεταξύ της Inh-Β και της ΑΜΗ. 153 11 Διάγραμμα διασποράς-γραμμή τάσης μεταξύ της ΑΜΗ και της σπερματολογικής διάγνωσης. 155 12 Μεταβολές της συγκέντρωσης της ΑΜΗ (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) στη δοκιμασία EFSERT σε υπογόνιμους άνδρες και ομάδα ελέγχου. 160 13 Μεταβολές των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας EFSERT ανάλογα με το αίτιο της υπογονιμότητας. 162 14 Μεταβολές των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας EFSERT ανάλογα με τη σπερματολογική διάγνωση. 164 15 Μεταβολές των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας EFSERT ανάλογα με τη συγκέντρωση της FSH. 166 16 Μεταβολές των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας EFSERT σε άνδρες με μη αποφρακτική αζωοσπερμία ανάλογα με την ανεύρεση ή όχι σπερματοζωαρίων στη FNA όρχεων. 168 18

Κατάλογος Συντομογραφιών ΕΛΛΗΝΙΚΟΙ ΟΡΟΙ ΔΜΣ ΙΔ ΙΜΑΑ ΚΝΣ ΟΤΑ ΠΟΥ ΥΠΥ ΥΥ YYO Δείκτης Μάζας Σώματος Ιδιοπαθής δυσπερμία Ιδιοπαθής μη αποφρακτική αζωοσπερμία Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Ολιγο- Ασθενο- Τερατοσπερμία Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας Υπεργοναδοτροπικός Υπογοναδισμός Υπογοναδοτροπικός Υπογοναδισμός Άξονας «Υποθάλαμος Υπόφυση Όρχεις» ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ ΑΜΗ AZF DHT E 2 EFSERT FNA FSH GnRH hcg ICSI Inh-Β IΝΟΑ IQR IVF KS LH PRL SCOS T TESE TGF-β WHO Αnti-Müllerian Hormone (Ανασταλτική ορμόνη των πόρων του Müller) Azoospermia Factor (Παράγοντας αζωοσπερμίας) Dihydrotestosterone (Διυδροτεστοστερόνη) Estradiol (Οιστραδιόλη) Exogenous FSH SErtoli Reserve Test (Δυναμική δοκιμασία διέγερσης των κυττάρων Sertoli με εξωγενή χορήγηση FSH) Fine Needle Aspiration (Αναρροφητική βιοψία δια λεπτής βελόνης) Follicle Stimulating Hormone (Θυλακιοτρόπος ορμόνη) Gonadotropin Releasing Hormone (Εκλυτική ορμόνη των γοναδοτροπινών) Human Chorionic Gonadotropin (Χοριακή γοναδοτροπίνη) Intracytoplasmic Sperm Injection (Ενδοωαρική έγχυση σπερματοζωαρίων) Inhibin-B (Ανασταλτίνη-Β) Idiopathic Non-Obstructive Azoospermia (Ιδιοπαθής μη αποφρακτική αζωοσπερμία) Interquartile range (Ενδοτεταρτημοριακό διάστημα) In-vitro Fertilization (Εξωσωματική γονιμοποίηση) Klinefelter Syndrome (Σύνδρομο Klinefelter) Lutenizing Hormone (Ωχρινοτρόπος ορμόνη) Prolactin (Προλακτίνη) Sertoli Cell Only Syndrome (Σύνδρομο απλασίας του σπερματικού επιθηλίου) Testosterone (Τεστοστερόνη) Testicular Sperm Extraction (Ανοικτή βιοψία όρχεων) Transforming Growth Factor-β (αυξητικός παράγοντας μεταμόρφωσης-β) World Health Organisation (Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας) 19

Πρόλογος Η υπογονιμότητα αποτελεί συχνό πρόβλημα στις σύγχρονες κοινωνίες, δεδομένου ότι αφορά περίπου το 15-17% των ζευγαριών. Επιπλέον, θεωρείται σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας δεδομένου ότι έχει σοβαρές κοινωνικο-οικονομικές επιπτώσεις και μπορεί να επηρεάσει δυσμενώς τη ποιότητα ζωής του ζευγαριού προκαλώντας τριβές, ψυχολογική φθορά και κοινωνική απομόνωση. Στις μισές περίπου περιπτώσεις υπογόνιμων ζευγαριών το πρόβλημα εντοπίζεται αποκλειστικά ή μερικώς στον άνδρα. Παρά τη σημαντική πρόοδο που επιτεύχθηκε τις δύο τελευταίες δεκαετίες στο τομέα της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, πολλά σημεία της παθοφυσιολογίας της ανδρικής υπογονιμότητας παραμένουν αδιευκρίνιστα. Αυτό αντανακλάται στο γεγονός ότι παρά τη συστηματική διερεύνηση, σε ένα σημαντικό ποσοστό υπογόνιμων ανδρών, περίπου 40%, δεν είναι δυνατή η τεκμηρίωση της αιτιολογικής διάγνωσης της υπογονιμότητας. Τα τελευταία χρόνια, το ερευνητικό ενδιαφέρον στο γνωστικό πεδίο της Ανδρολογίας εστιάστηκε στη γενετική της ανδρικής υπογονιμότητας και στη διερεύνηση των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των κυτταρικών πληθυσμών του ορχικού μικροπεριβάλλοντος. Φαίνεται ότι τα κύτταρα Sertoli κατέχουν κομβική θέση στo ορχικό μικροπεριβάλλον, όχι μόνο ως υποστηρικτικά κύτταρα του σπερματικού επιθηλίου αλλά ασκώντας ενεργό ενδοκρινική και παρακρινική δράση μέσω των εκκριτικών τους προιόντων. Η ανασταλτική ορμόνη των πόρων του Müller συντίθεται και εκκρίνεται αποκλειστικά από τα κύτταρα Sertoli και η παρούσα μελέτη φιλοδοξεί να συμβάλλει στη διευκρίνηση του ρόλου της στην ανδρική υπογονιμότητα μέσω της διερεύνησης των συγκεντρώσεών της στη συστηματική κυκλοφορία υπογόνιμων και φυσιολογικών ανδρών και των μεταβολών της μετά από διέγερση των κυττάρων Sertoli. Θα ήθελα να εκφράσω τη βαθιά ευγνωμοσύνη και τις ευχαριστίες μου στον δάσκαλό μου, Ομότιμο Καθηγητή Ενδοκρινολογίας - Ενδοκρινολογίας Αναπαραγωγής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κύριο Ιωάννη Παπαδήμα, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου τη παρούσα διατριβή αλλά και για τη συνεχή υποστήριξη και ενθάρρυνσή του, τις πολύτιμες υποδείξεις του και την εμπνευσμένη καθοδήγησή του σε όλα 21

τα στάδια εκπόνησης της διατριβής. Επίσης, τον ευχαριστώ για την αγάπη και το ερευνητικό πάθος που μου μετέδωσε για το γνωστικό αντικείμενο της Ενδοκρινολογίας Αναπαραγωγής και ειδικά της Ανδρολογίας. Ευχαριστώ θερμά τον Ομότιμο Καθηγητή Ενδοκρινολογίας του ΑΠΘ, κύριο Δημήτριο Πανίδη και τον Καθηγητή Ουρολογίας του ΑΠΘ, κύριο Βασίλειο Κατσίκα, μέλη της τριμελούς επιτροπής, για το ενδιαφέρον, τις συμβουλές και τη συμπαράστασή τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Θεωρώ υποχρέωσή μου να εκφράσω την ευγνωμοσύνη και τις ευχαριστίες μου στον Επίκουρο Καθηγητή Ενδοκρινολογίας - Ενδοκρινολογίας Αναπαραγωγής του ΑΠΘ, κύριο Δημήτριο Γ. Γουλή για την ουσιαστική συμβολή του στην ολοκλήρωση της παρούσας μελέτης με τις καθημερινές πολύτιμες υποδείξεις και παρεμβάσεις του, για την υπομονή και την αμέριστη συμπαράστασή του. Ευχαριστώ θερμά τον βιοπαθολόγο Σπυρίδωνα Γέρου και την βιολόγο Βασιλική Παυλίδου για το έντονο ενδιαφέρον που έδειξαν για τη μελέτη και την ουσιαστική συμβολή τους στη μέτρηση της ανασταλτικής ορμόνης των πόρων του Müller, παρά τις δυσκολίες που συνάντησαν. Ευχαριστώ θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Μαιευτικής - Γυναικολογίας του ΑΠΘ, κύριο Γρηγόριο Γκριμπίζη, για την εκτέλεση των αναρροφητικών βιοψιών των όρχεων με λεπτή βελόνη σε ομάδα ανδρών που συμμετείχαν στη μελέτη αυτή. Ευχαριστώ θερμά τον Παθολογοανατόμο Αθανάσιο Παπανικολάου, διευθυντή του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Νοσοκομείου Γ. Γεννηματάς της Θεσσαλονίκης, την κυτταρολόγο Παναγιώτα Σεβαστιάδου, διευθύντρια του Κυτταρολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκομείου «Παπαγεωργίου» και την κυτταρολόγο Ευαγγελία Αθανασίου, επιμελήτρια Α' του Κυτταρολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκομείου «Παπαγεωργίου», που ασχολήθηκαν με την μελέτη των ιστολογικών παρασκευασμάτων των όρχεων με ιδιαίτερο ζήλο και αφοσίωση. 22

Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Πάρι Πολυχρόνου, Μαιευτήρα Γυναικολόγο, την Πασχαλία Ηλιάδου, Ενδοκρινολόγο, την Περσεφόνη-Δήμητρα Κανταρτζή, Ειδικευόμενη Βιοπαθολογίας και την Γεσθημανή Μηντζιώρη, Ειδικευόμενη Ενδοκρινολογίας, συνεργάτες μου στη Μονάδα Ενδοκρινολογίας Αναπαραγωγής του Νοσοκομείου Παπαγεωργίου, για τη σημαντική βοήθειά τους στην ολοκλήρωση της παρούσας μελέτης. Θα ήταν παράλειψή μου να μην εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλους τους υπογόνιμους άνδρες και τους άνδρες που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου, που δέχθηκαν να συμμετέχουν στη παρούσα μελέτη. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την οικογένειά μου για την απίστευτη υπομονή που έδειξε καθόλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής, τη συνεχή ενθάρρυνση και υποστήριξή της. Θεσσαλονίκη, Νοέμβριος 2012. 23

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 25

1. Φυσιολογία του γεννητικού συστήματος του άνδρα 1.1. Στοιχεία ανατομίας και ιστολογίας των όρχεων Οι γεννητικοί αδένες του άνδρα, οι όρχεις, είναι μεικτοί αδένες με εξωκρινική και ενδοκρινική λειτουργία. Η εξωκρινική λειτουργία αφορά τη παραγωγή των γεννητικών κυττάρων, δηλαδή των σπερματοζωαρίων, ενώ η ενδοκρινική λειτουργία αφορά την παραγωγή των γεννητικών ορμονών με κύριο εκπρόσωπο την τεστοστερόνη (Τ). Οι όρχεις στον ενήλικα έχουν ωοειδές σχήμα και διαστάσεις 4 x 3 x 2,5 cm, αν και το μέγεθός τους ποικίλει από άτομο σε άτομο. Βρίσκονται σε αντίστοιχους θύλακες του οσχέου, το οποίο τους προστατεύει από τραύματα και ρυθμίζει τοπικά τη θερμοκρασία. Το όσχεο αποτελείται από το δέρμα, το δαρτό μυ, την επιπολής περινεϊκή περιτονία και την εξωτερική και εσωτερική σπερματική περιτονία. Η ανατομική αυτή σύνθεση είναι σημαντική για τη ρύθμιση της θερμοκρασίας του οσχέου. Ο κάτω πόλος των όρχεων είναι καθηλωμένος στο όσχεο με δεσμίδα συνδετικού ιστού, ενώ ο άνω πόλος και η οπίσθια επιφάνεια καλύπτονται από την επιδιδυμίδα. Οι όρχεις συγκρατούνται στο όσχεο με τους σπερματικούς τόνους, οι οποίοι περιέχουν τους σπερματικούς πόρους, αγγεία, νεύρα και τους κρεμαστήριους μύες. Η λειτουργία των όρχεων βρίσκεται υπό τον ρυθμιστικό έλεγχο του συστήματος «υποθάλαμος - υπόφυση» και υποβοηθείται από τους επικουρικούς γεννητικούς αδένες, δηλαδή τον προστάτη, τις σπερματοδόχους κύστεις, τους βολβοουρηθραίους και τους ουρηθραίους αδένες. Η μεταφορά του σπέρματος γίνεται με την αποχετευτική οδό που περιλαμβάνει τις επιδιδυμίδες, τους σπερματικούς πόρους, τις σπερματοδόχους κύστεις, τους εκσπερματιστικούς πόρους και την ουρήθρα. Οι όρχεις περιβάλλονται από τον ινώδη χιτώνα και ιστολογικά το παρέγχυμα τους εμφανίζει δύο ανατομικά διακριτές μονάδες: τα σπερματικά σωληνάρια (εξωκρινής μοίρα) και τo διάμεσο ιστό που περιέχει τα κύτταρα Leydig (ενδοκρινής μοίρα). Ο ινώδης χιτώνας αποτελείται κυρίως από κολλαγόνες και λίγες λείες μυϊκές ίνες και στο σημείο που ο όρχις 27

συνδέεται με την επιδιδυμίδα, παχύνεται και σχηματίζει το μεσόρχιο από το οποίο εισέρχονται στο ορχικό παρέγχυμα ινώδη διαφραγμάτια που το διαχωρίζουν σε 200-300 λοβία, μέσα στα οποία βρίσκονται τα σπερματικά σωληνάρια. Τα σπερματικά σωληνάρια είναι περιελιγμένοι σωληνίσκοι με μεγάλο μήκος (30 cm έως 1,5 m), διάμετρο 150-300 μικρόμετρα και βρίσκονται ανά 2-4 μέσα στα λοβία των όρχεων. Αντίστοιχα προς το μεσόρχιο εξελίσσονται σε εκφορητικούς αγωγούς που εκβάλουν στην επιδιδυμίδα. Συνολικά υπάρχουν περίπου 400-900 σπερματικά σωληνάρια και στους δύο όρχεις και αποτελούν το κύριο προσδιοριστικό παράγοντα του μεγέθους τους. Τα σπερματικά σωληνάρια περιλαμβάνουν τη βασική μεμβράνη, το σπερματικό επιθήλιο που αποτελείται από τα κύτταρα της γεννητικής σειράς σε διάφορα στάδια ωρίμανσης (κύτταρα σπερματογένεσης) και τα σωματικά μεταμιτωτικά κύτταρα Sertoli (Σχήμα 1). 28

Σχήμα 1. Ανατομικές σχέσεις των κυττάρων του σπερματικού σωληναρίου. 1. σπερματογόνιο, 2. πρωτογενές σπερματοκύτταρο, 2α. μειωτική διαίρεση, 3. δευτερογενές σπερματοκύτταρο, 4. πρώιμη σπερματίδα, 5. όψιμη σπερματίδα, 6. σπερματοζωάριο, 7. κύτταρο Sertoli, 8. βασική μεμβράνη, 9. ερυθροκύτταρο, 10. κύτταρο Leydig, 15. οβελιαία τομή όρχι. Η βασική μεμβράνη αποτελείται από ίνες κολλαγόνου σε υπόστρωμα από βλεννοπολυσακχαρίτες (θεμέλια ουσία), από μυοειδή ή περισωληναριακά κύτταρα και ινοβλάστες. Η μεμβράνη εκτός της ανατομικής στήριξης που παρέχει, συμμετέχει και στη λειτουργικότητα του σωληναρίου. Τα μυοειδή κύτταρα με τη σύσπασή τους υποβοηθούν τη μεταφορά των σπερματοζωαρίων προς το μεσαύλιο και έχουν την ικανότητα να μεταβολίζουν στεροειδή και να εκκρίνουν, υπό την επίδραση της Τ, πρωτείνες οι οποίες επηρεάζουν τη λειτουργία των κυττάρων Sertoli. H θεμέλια ουσία προσδίδει δομική ομοιογένεια στο τοίχωμα των σπερματικών σωληναρίων και συμμετέχει στον αιματο-ορχικό φραγμό, ο οποίος δημιουργείται κυρίως από τα κύτταρα Sertoli. 29

Tα κύτταρα της σπερματογένεσης προέρχονται από μητρικά κύτταρα, τα σπερματογόνια, τα οποία μετατρέπονται στα ώριμα γεννητικά κύτταρα του άνδρα, τα σπερματοζωάρια. Τα βασικά στάδια της κυτταρικής αυτής μετατροπής είναι: α. Σπερματογόνια. β. Πρωτογενή σπερματοκύτταρα (τύπος Α), γ. Δευτερογενή σπερματοκύτταρα (τύπος Β), δ. Σπερματίδες και ε. Σπερματοζωάρια (Σχήμα 1). Τα κύτταρα Sertoli βρίσκονται μεταξύ των κυττάρων της σπερματογένεσης, στηρίζονται στη βασική μεμβράνη και φθάνουν μέχρι τον αυλό των σωληναρίων. Το σχήμα τους είναι ανώμαλο γιατί το κυτταρόπλασμά τους περικλείει τα γεννητικά κύτταρα στα διάφορα στάδια ωρίμανσής τους και στο κορυφαίο τμήμα τους υπάρχουν εκκολπώματα όπου εισέρχονται οι κεφαλές των σπερματοζωαρίων (1). Τα κύτταρα Sertoli δεν διαιρούνται στον ενήλικα άνδρα. Στα σημεία επαφής μεταξύ γειτονικών κυττάρων δημιουργούνται στερρές συνδέσεις (tight junctions) οι οποίες διαχωρίζουν τον ορχικό ιστό σε δύο λειτουργικά διακριτά και σχεδόν στεγανά διαμερίσματα (βασικό και παρααυλικό) μεταξύ των οποίων υπάρχει περιορισμένη διαπερατότητα σε μακρομόρια (αιματο-ορχικός ή αιματο-σωληναριακός φραγμός). Το βασικό διαμέρισμα περιλαμβάνει το διάμεσο ιστό με τα κύτταρα Leydig, τη βασική μεμβράνη των σωληναρίων και την εξωτερική στιβάδα του σπερματικού επιθηλίου που περιέχει τα σπερματογόνια. Το παρααυλικό διαμέρισμα περιλαμβάνει τις υπόλοιπες στιβάδες του σπερματικού επιθηλίου με τα πρωτογενή σπερματοκύτταρα και τα πιο προχωρημένα κυτταρικά στάδια της σπερματογένεσης (2). Δομικά, ο αιματο-ορχικός φραγμός αποτελείται από: Μεμβρανικές πρωτεΐνες των στερρών συνδέσεων (tight junctions): occludins, claudins, tricellulin, JAMs, CAR. Μεμβρανικές πρωτείνες των συνδέσεων που μοιάζουν με δεσμοσώματα (desmosomelike junctions): desmogleins, desmocollins Mεμβρανικές πρωτείνες των χασματο-συνδέσεων (gap junctions): connexins, N- cadherins, nectins Συμπλέγματα ρυθμιστικών και δομικών πρωτεϊνών και Πρωτεινικούς μεταφορείς φαρμάκων 30

Τα κύτταρα Leydig είναι μεσεγχυματικής προέλευσης και βρίσκονται στο διάμεσο ιστό μεμονωμένα ή κατά ομάδες. Ο αριθμός τους είναι μικρός και ο ολικός όγκος τους αποτελεί μόλις το 3% του όρχι. Τα κύτταρα Leydig δεν εμφανίζουν μιτωτική δραστηριότητα στον ενήλικα άνδρα σε αντίθεση με ότι συμβαίνει κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ζωής (ιδιαίτερα μεταξύ 7ης και 12ης εμβρυϊκής εβδομάδας). Το κυτταρόπλασμά τους εμφανίζει πρωτεινικά έγκλειστα (κρύσταλλοι Reinke) και είναι πλούσιο σε λείο ενδοπλασματικό δίκτυο, λιποσταγονίδια και μιτοχόνδρια χαρακτηριστικό της στεροειδοπαραγωγού ικανότητάς τους. Συνθέτουν και εκκρίνουν τη Τ καθώς και άλλες στεροειδείς ορμόνες όπως οιστρογόνα, 17- υδρόξυ-προγεστερόνη, Δ 4 -ανδροστενεδιόνη και διυδροτεστοστερόνη (1). 1.2. Φυσιολογία του άξονα «Υποθάλαμος Υπόφυση Όρχεις» Η αναπαραγωγική λειτουργία ρυθμίζεται από τον άξονα «Υποθάλαμος Υπόφυση Όρχεις» (ΥΥΟ) (Σχήμα 2). Κύριο ρόλο σε αυτή τη ρύθμιση παίζει ο υποθάλαμος ο οποίος επικοινωνεί με την υπόφυση μέσω ενός πυλαίου αγγειακού συστήματος και ενός δικτύου νευρωνικών οδών. Από τους υποθαλαμικούς νευρώνες που βρίσκονται κυρίως στον τοξοειδή πυρήνα και στην προοπτική περιοχή, συντίθεται και εκκρίνεται η εκλυτική ορμόνη των γοναδοτροπινών (GnRH). Το γονίδιο που κωδικοποιεί τη GnRH εκφράζεται στον υποθάλαμο, στην υπόφυση, στον εγκεφαλικό φλοιό, στις ωοθήκες, στους όρχεις, και στον πλακούντα. Οι νευράξονες των υποθαλαμικών νευρώνων πορεύονται προς το μέσο έπαρμα όπου σχηματίζουν εκτενές πλέγμα που καταλήγει στο πυλαίο αγγειακό σύστημα της υπόφυσης. Η GnRH απελευθερώνεται στην πυλαία κυκλοφορία με παλμικότητα, ως αποτέλεσμα μιας «γεννήτριας» ώσεων στο διάμεσο υποθάλαμο (παλμογεννήτρια GnRH), που βρίσκεται υπό την τονική αναστολή των περιφερικών στεροειδών ορμονών. Επίσης η παραγωγή της GnRH επηρεάζεται αρνητικά από την προλακτίνη (PRL), την εκλυτική ορμόνη της φλοιοτρόπου (CRH) και κυτταροκίνες [κυρίως την ιντερλευκίνη-1 (IL-1)] ενώ ευοδωτικά δρά η λεπτίνη, ορμόνη που παράγεται κυρίως από το λιπώδη ιστό (Σχήμα 2). Σημαντικό ρόλο στην έκκριση της GnRH έχουν οι νευροδιαβιβαστές και η πρωτείνη kisspeptin που δρά μέσω του υποδοχέα της ΚΙSS1R (ή GPR54) (3). 31

Σχήμα 2. Ο άξονας Υποθάλαμος Υπόφυση Όρχεις. Η GnRH δρα μέσω υποδοχέων στα γοναδοτρόπα κύτταρα της υποφύσεως και προκαλεί την κατά ώσεις έκκριση των γοναδοτροπινών, δηλαδή της ωχρινοτρόπου (LH) και της θυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH). Απαραίτητος παράγοντας για τη σύνδεση της GnRH με τον υποδοχέα της είναι ο στεροειδογενετικός παράγοντας 1 (Steroidogenic Factor-1, SF-1). H μετάδοση του ενδοκυττάριου σήματος στα γοναδοτρόπα κύτταρα γίνεται με μηχανισμό ανεξάρτητο του κυκλικού AMP (camp), με διαμεσολαβητή πιθανόν την διακυλογλυκερόλη και το ενδοκυττάριο ασβέστιο (4). Βασική προϋπόθεση για τη διέγερση της έκκρισης των γοναδοτροπινών είναι η παλμική παραγωγή της GnRH, η οποία αποτρέπει την απενεργοποίηση ή τη μειορύθμιση των υποδοχέων της στα γοναδοτρόπα κύτταρα (5). H ποσότητα των εκλυόμενων γοναδοτροπινών εξαρτάται από την ηλικία του ατόμου, τη 32

συχνότητα και το μέγεθος των εκκριτικών ώσεων της GnRH. Διαφοροποίηση του ρυθμού ή του εύρους των εκκριτικών της αιχμών μπορεί να προκαλέσει εκλεκτική έκκριση μίας εκ των δύο γοναδοτροπινών. Οι FSH και LH είναι γλυκοπρωτεΐνες που αποτελούνται από δύο πολυπεπτιδικές υπομονάδες, την α και την β, εκ των οποίων η α είναι κοινή και για τις δύο ενώ η β είναι διαφορετική στην κάθε μία γοναδοτροπίνη, και είναι αυτή η οποία διαμορφώνει τη χαρακτηριστική δομή και λειτουργία της κάθε ορμόνης. Η γλυκοζυλίωση είναι απαραίτητη για την έκκρισή τους, τον καθορισμό του χρόνου ημίσειας ζωής και την έκφραση της βιολογικής τους δράσης. Οι γοναδοτροπίνες ασκούν τη δράση τους μέσω διαμεμβρανικών υποδοχέων. Κύριος στόχος της δράσης της LH στον άνδρα είναι τα κύτταρα Leydig των όρχεων, όπου μέσω ενός μηχανισμού εξαρτώμενου από το camp προκαλεί τη σύνθεση και έκκριση της Τ. Η FSH δρα στα κύτταρα Sertoli, όπου δεσμεύεται από τους υποδοχείς που βρίσκονται στη βασική επιφάνεια των κυττάρων αυτών και μέσω διέγερσης του camp επάγει τη σύνθεση διαφόρων πρωτεινών όπως είναι η πρωτεΐνη που δεσμεύει τα ανδρογόνα (Αndrogen Binding Protein - ABP), η ανασταλτίνη-β (Inh-B) και το ένζυμο αρωματάση (CYP19) που καταλύει τη μετατροπή της Τ σε οιστραδιόλη (Ε 2 ). Υποδοχείς της FSH εκφράζονται και στα σπερματογόνια. Η FSH επάγει τη σπερματογένεση άμεσα, δρώντας στα πρόδρομα κύτταρα του σπερματικού επιθηλίου και έμμεσα μέσω της επίδρασης της στα κύτταρα Sertoli, ενώ η LH την επηρεάζει έμμεσα, καθώς προάγει τη σύνθεση της Τ στα παρακείμενα κύτταρα Leydig (6-8). Η φυσιολογική και αποτελεσματική λειτουργία του άξονα ΥΥΟ στηρίζεται στην ύπαρξη ενός κυκλώματος ελέγχου μέσω παλίνδρομης αλληλορύθμισης μεταξύ του οργάνου - στόχου (όρχεις) και των ρυθμιστικών κέντρων του άξονα (υποθάλαμος -υπόφυση). Στον άνδρα η Τ με μηχανισμό παλίνδρομης αρνητικής αλληλορύθμισης αναστέλλει την έκκριση της LH δρώντας σε υποθαλαμικό και υποφυσιακό επίπεδο. Στον υποθάλαμο, η Τ καταστέλλει την παλμογεννήτρια του GnRH, πιθανώς μέσω οπιοειδών, με αποτέλεσμα τη μείωση της συχνότητας των εκκριτικών αιχμών της LH και στην υπόφυση αναστέλλει άμεσα την απελευθέρωση της LH από τα γοναδοτρόπα κύτταρα (9-11). Η Τ μπορεί να δρα τόσο αυτούσια όσο και μετά το μεταβολισμό της σε διυδροτεστοστερόνη (DHT) ή Ε 2 μέσω της 33

αρωματάσης που υπάρχει στον εγκέφαλο και την υπόφυση. Πιθανολογείται ότι η Τ και η Ε 2 ρυθμίζουν την έκκριση των γοναδοτροπινών ανεξάρτητα η μία από την άλλη. Η Ε 2 φαίνεται να είναι πιο σημαντική από τη Τ για τη ρύθμιση της έκκρισης της FSH (12). Eπίσης, τα οιστρογόνα στον άνδρα ελαττώνουν τη συχνότητα των εκκριτικών ώσεων της GnRH σε υποθαλαμικό επίπεδο και καταστέλλουν την απαντητικότητα των γοναδοτρόπων σε αυτή με αποτέλεσμα τη μείωση της έντασης των εκκριτικών αιχμών της LH (13). H έκκριση της FSH ελέγχεται επίσης με μηχανισμό παλίνδρομης αλληλορύθμισης όπου, εκτός των στεροειδών και τη λειτουργική ακεραιότητα του σπερματικού επιθηλίου, σημαντικό ρόλο παίζουν οι πεπτιδικές ορμόνες, με κύριο εκπρόσωπο την ανασταλτίνη. Είναι γνωστό ότι τα επίπεδα της FSH αυξάνονται σε βλάβη ή απώλεια του σπερματικού επιθηλίου. Η ανασταλτίνη είναι γλυκοπρωτεΐνη που αποτελείται από δύο υπομονάδες α και β και ανήκει στην ευρύτερη οικογένεια του αυξητικού μετατρεπτικού παράγοντα-β (TGF-β). Eπειδή η υπομονάδα β υπάρχει σε δύο μορφές, η ανασταλτίνη απαντάται σε δύο τύπους: ανασταλτίνη-α και -Β. Ο τύπος που φυσιολογικά παράγεται στον άνδρα είναι η ανασταλτίνη-β (Inh-B). Η ορμόνη αυτή παράγεται από τα κύτταρα Sertoli και τα γεννητικά κύτταρα. Η έκκριση της προυποθέτει τη δράση της FSH και των ανδρογόνων. Η ανασταλτίνη δρα στην υπόφυση και αναστέλλει αποκλειστικά την GnRH εξαρτώμενη έκκριση της FSH (14-16). Mελέτες έχουν δείξει αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων στο αίμα της FSH και της Inh-Β σε φυσιολογικούς και υπογόνιμους άνδρες. Στους ενήλικες άνδρες οι συγκεντρώσεις της Inh-B σχετίζονται καλύτερα με τη ύπαρξη γεννητικών κυττάρων στα πρώτα σπερματογενετικά στάδια παρά με την παρουσία των κυττάρων Sertoli, όπως συμβαίνει πριν την εφηβεία (17). 1.3. Φυσιολογία της σπερματογένεσης Η σπερματογένεση, δηλαδή η διαδικασία της παραγωγής των σπερματοζωαρίων, αποτελεί μια συνεχή και περιοδική διαδικασία, που ξεκινά από την εφηβεία, με την έναρξη της κατά ώσεις έκκρισης των γοναδοτροπινών, και συνεχίζεται κατά τη μεγαλύτερη διάρκεια της ζωής του άνδρα. Λαμβάνει χώρα στο σπερματικό επιθήλιο των σπερματικών σωληναρίων. Κατά την εμβρυογένεση, αρχέγονα βλαστικά ή στελεχιαία κύτταρα (stem cells) 34

μεταναστεύουν στους όρχεις και μετατρέπονται σε ανώριμα βλαστικά κύτταρα, που ονομάζονται σπερματογόνια. Τα σπερματογόνια διατάσσονται σε δύο ή τρεις στοιβάδες, στην εσωτερική επιφάνεια των σπερματικών σωληναρίων. Tα μόνα άλλα κύτταρα των σωληναρίων κατά αυτήν την χρονική περίοδο είναι τα κύτταρα Sertoli, που είναι σωματικά (διπλοειδικά) κύτταρα, τα οποία δεν στηρίζουν απλώς τα βλαστικά κύτταρα, αλλά διαδραματίζουν έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην αλληλουχία των γεγονότων της σπερματογένεσης. Κατά την εφηβεία, τα σπερματογόνια εισέρχονται στον κύκλο της σπερματογένεσης ανά τακτά χρονικά διαστήματα και κατά ομάδες, που ονομάζονται «γενεές». Η ωρίμανση των κυττάρων που ανήκουν στην ίδια γενεά διακρίνεται σε διαδοχικές μιτωτικές, μειωτικές και μετα-μειωτικές φάσεις. Τα σπερματογόνια βρίσκονται στη βάση της πυραμίδας της σπερματογένεσης. Μπορούν να ανανεώνονται και να παράγουν ένα μεγάλο αριθμό διαφοροποιημένων βλαστικών κυττάρων. Η διατήρηση της φυσιολογικής σπερματογένεσης και, επακόλουθα, της γονιμότητας προϋποθέτει την ύπαρξη ισορροπίας μεταξύ της ανανέωσης των σπερματογονίων και της διαφοροποίησής τους προς σπερματοζωάρια. Αυτές οι δύο διαδικασίες ρυθμίζονται τόσο από τη γονιδιακή έκφραση στα σπερματογόνια όσο και από εξωγενή σήματα, όπως είναι οι διαλυτοί παράγοντες και τα μόρια προσκόλλησης από το ορχικό μικροπεριβάλλον, που ονομάζεται «φωλιά» (niche). 1.3.1. Φάσεις της σπερματογένεσης Η σπερματογένεση εξελίσσεται σε τέσσερις διαδοχικές χρονικά φάσεις, οι οποίες είναι οι εξής: 1. Πολλαπλασιαμός των σπερματογονίων 2. Μείωση 3. Σπερμιογένεση (spermiogenesis) και 4. Απελευθέρωση των σπερματοζωαρίων (spermiation). α. Πολλαπλασιασμός των σπερματογονίων. Η πρώτη φάση, αυτή του πολλαπλασιαμού των σπερματογονίων (spermatogonial replication), περιλαμβάνει τη διαίρεσή τους, τόσο για να αντικαταστήσουν τον εαυτό τους όσο και για να παράγουν έναν αριθμό κυττάρων που θα 35

μετατραπούν σε ώριμα σπερματοζωάρια. Με βάση την εμφάνιση του πυρήνα τους, διακρίνονται τρεις λειτουργικά διαφορετικοί τύποι σπερματογονίων: τα τύπου A βαθυχρωματικά (dark - Ad), τα τύπου A ωχρά (pale - Ap) και τα τύπου B σπερματογόνια (B) (σχήμα 3). Tα σπερματογόνια τύπου Α παραμένουν εκτός του αιματο-ορχικού φραγμού και συνεχίζουν να διαιρούνται από την εφηβεία έως το θάνατο. Με τον τρόπο αυτό, διατηρείται μια δεξαμενή μητρικών κυττάρων που, θεωρητικά τουλάχιστον, διατηρεί τη γονιμοποιητική ικανότητα του άνδρα έως μια προχωρημένη ηλικία. Τα σπερματογόνια Αd δεν οδηγούν άμεσα στην παραγωγή σπερματοζωαρίων. Κύριος ρόλος τους είναι να διατηρούν έναν ικανό αριθμό βλαστικών κυττάρων. Η διαίρεσή τους μπορεί να ακολουθήσει δύο δρόμους: είτε προς την παραγωγή δύο σπερματογονίων Ad, όμοιων προς το αρχικό, είτε προς την παραγωγή δύο σπερματογονίων Ap. Σχήμα 3. Οι κυτταρικές διαιρέσεις και το χρονοδιάγραμμα της σπερματογένεσης (3). 36

Αντίθετα, τα σπερματογόνια Ap διαιρούνται μιτωτικά για να παράξουν όμοια κύτταρα - κλώνους, που ενώνονται μεταξύ τους με κυτταροπλασματικές γέφυρες και επιτρέπουν το συντονισμό των περαιτέρω διαιρέσεων. Τελικά, τα σπερματογόνια Ap διαφοροποιούνται σε σπερματογόνια τύπου Β. Στη συνέχεια, τα σπερματογόνια τύπου Β θα διαιρεθούν μιτωτικά προς σπερματοκύτταρα πρώτης τάξης (πρωτογενή σπερματοκύτταρα), που αποτελούν ενδιάμεσα διπλοειδικά κύτταρα. Καθώς τα πρωτογενή σπερματοκύτταρα ετοιμάζονται να εισέλθουν στη μακράς διάρκειας πρόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης (μείωση Ι), μετακινούνται από τη βασική μεμβράνη του σπερματικού σωληναρίου προς τον αυλό, περνώντας μέσω του αιματο-ορχικού φραγμού. Σε αυτό το σημείο, τα σπερματοκύτταρα δεσμεύονται από τα κύτταρα Sertoli μέσω ειδικών κυτταρικών συνδέσεων (tight junctions). Μπροστά από το σπερματοκύτταρο, η σύνδεση μεταξύ δύο γειτονικών κυττάρων Sertoli λύεται, ενώ μια νέα σύνδεση σχηματίζεται από την άλλη πλευρά, κλείνοντας έτσι την ανατομική και λειτουργική «πόρτα» του αιματο-ορχικού φραγμού (1). β. Μείωση. Στη δεύτερη φάση της σπερματογένεσης τα πρωτογενή σπερματοκύτταρα υφίστανται μείωση, κατά την οποία ο διπλοειδής αριθμός των χρωματοσωμάτων του είδους ανάγεται σε απλοειδή και το DNA υποδιπλασιάζεται. Η διεργασία της μείωσης περιλαμβάνει δύο κυτταρικές διαιρέσεις. Η πρόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης (πρόφαση Ι) καταλαμβάνει περισσότερο από το 90% της συνολικής διάρκειας της μείωσης και διαιρείται σε τέσσερα επιμέρους στάδια: το στάδιο της λεπτοταινίας, της ζυγοταινίας, της παχυταινίας και της διπλοταινίας. Μετά την πρόφαση Ι ακολουθεί η μετάφαση, ανάφαση και τελόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης, με τελικά προϊόντα δύο σπερματοκύτταρα δεύτερης τάξης για κάθε σπερματοκύτταρο πρώτης τάξης. Τα δευτερογενή σπερματοκύτταρα περιέχουν απλοειδή αριθμό (1n) χρωματοσωμάτων αλλά με DNA που αντιστοιχεί σε εκείνο των σωματικών κυττάρων. Κατά τη διάρκεια της δεύτερης μειωτικής διαίρεσης, οι αδελφές χρωματίδες διαχωρίζονται και παράγονται δύο στρογγυλές σπερματίδες από κάθε δευτερογενές σπερματοκύτταρο. Οι σπερματίδες έχουν απλοειδή αριθμό (1n) χρωματοσωμάτων του είδους και το μισό DNA σε σχέση με τα σωματικά κύτταρα. Στο τέλος αυτής της φάσης, από ένα σπερματοκύτταρο πρώτης τάξης θα έχουν σχηματιστεί τέσσερις σπερματίδες (Σχήμα 3). Πολλά σημεία της διαδικασίας της μείωσης ρυθμίζονται από επιγενετικές τροποποιήσεις. 37

γ. Σπερμιογένεση. Η σπερμιογένεση (spermiogenesis) είναι η μακρά φάση της σπερματογένεσης κατά την οποία οι απλοειδικές σπερματίδες μετατρέπονται σε σπερματοζωάρια. Η φάση της σπερμιογένεσης χωρίζεται σε τέσσερις επιμέρους φάσεις: Κατά την πρώτη φάση (φάση Golgi) σχηματίζεται το ακροσωμικό κυστίδιο (acrosomic vesicle), η χρωματίνη της κάθε σπερματίδας συμπυκνώνεται δημιουργώντας μια συμπαγή μάζα και ο πυρήνας περιβάλλεται από ένα μεμβρανικό παράγωγο του συστήματος Golgi. Κατά τη δεύτερη φάση (φάση Cap), το ακροσωμικό κυστίδιο μετακινείται προς τον πυρήνα της στρογγυλής σπερματίδας και αρχίζει να σχηματίζεται ο πρόδρομος της ουράς (μαστίγιο) από το κεντριόλιο. Κατά την τρίτη φάση (ακροσωμιακή φάση), ο πυρήνας της σπερματίδας επιμηκύνεται και σχηματίζεται το ακρόσωμα, που περιέχει ένζυμα απαραίτητα για τη διείσδυση του σπερματοζωαρίου στο ωάριο. Τέλος, κατά την τέταρτη φάση (φάση της ωρίμανσης), τα μιτοχόνδρια συγκεντρώνονται γύρω από το μαστίγιο, το οποίο διαμορφώνεται πλήρως. Καθώς ο σχηματισμός του σπερματοζωαρίου προχωρά, το μεγαλύτερο μέρος του κυτταροπλάσματος αποβάλλεται. Το τελικό στάδιο της μεταμόρφωσης της σπερματίδας σε σπερματοζωάριο αποτελεί ο σχηματισμός της πολύπλοκης ουράς από το αξονημάτιο (axonemal complex), που αποτελείται από δύο εσωτερικά μονά και εννέα εξωτερικά διπλά μικροσωληνάρια. δ. Απελευθέρωση των σπερματοζωαρίων. Στη φάση αυτή διασπώνται οι δεσμοί που συνδέουν τις ώριμες σπερματίδες με τα κύτταρα Sertoli και ακολουθεί η απελευθέρωση των σπερματοζωαρίων στον αυλό του σπερματικού σωληναρίου. Τα σπερματοζωάρια μεταφέρονται μέσω του αυλού των σωληναρίων στην επιδιδυμίδα, όπου παραμένουν για 21 ημέρες περίπου και υφίστανται τη διαδικασία της ωρίμανσης κατά την οποία επάγεται η κινητικότητά τους (maturation). Η τελική φάση ωρίμανσηςενεργοποίησης των σπερματοζωαρίων (capacitation) πιθανόν λαμβάνει χώρα μετά την εκσπερμάτιση, στο γεννητικό σωλήνα της γυναίκας. Κάθε σπερματογόνιο που αρχίζει να διαφοροποιείται μετά την εφηβεία δημιουργεί 16 πρωτογενή σπερματοκύτταρα, κάθε ένα από τα οποία μέσω της μειωτικής διαίρεσης οδηγεί στο σχηματισμό τεσσάρων σπερματίδων και τελικά τεσσάρων σπερματοζωαρίων. Δεδομένου ότι καθημερινά περίπου τρία εκατομμύρια σπερματογόνια εισέρχονται στη διαδικασία, υπολογίζεται ότι δίνουν γένεση σε 38

200 εκατομμύρια σπερματοζωάρια. Επειδή το 50% περίπου αυτών αποπίπτουν τελικά, οι όρχεις του ενήλικα άνδρα παράγουν περίπου 100 εκατομμύρια σπερματοζωάρια ημερησίως (18). 1.3.2. Κύκλος και κύμα της σπερματογένεσης Η θέση που κατέχουν τα γεννητικά κύτταρα στο σπερματικό επιθήλιο δεν είναι τυχαία. Υπάρχει υψηλός βαθμός κυκλικής αρχιτεκτονικής οργάνωσής του, που χαρακτηρίζεται από ομάδες λειτουργικά συναφών κυττάρων, η τοποθέτηση των οποίων μέσα στο επιθήλιο είναι σταθερή (τα πλέον άωρα κύτταρα κοντά στη βασική μεμβράνη και τα πλέον ώριμα προς τον αυλό) και επιπλέον σχετίζεται με το στάδιο του κύκλου ωρίμανσης του επιθηλίου. Οι επαναλαμβανόμενες με συγκεκριμένο τρόπο ομάδες κυττάρων του σπερματικού επιθηλίου αποτελούν τα λεγόμενα στάδια εξέλιξης και ωρίμανσής του. Οι Leblond και Clermont μελετώντας τρωκτικά κατά τη δεκαετία του 1950 όρισαν ως κύκλο του σπερματικού επιθηλίου τη σειρά των μεταβολών από άποψη κυτταρικής σύνθεσης σε δεδομένη περιοχή του επιθηλίου, που απαντώνται μεταξύ δύο διαδοχικών εμφανίσεων του ιδίου σταδίου εξέλιξης (19). Αργότερα, μετά από μελέτες σε ανθρώπινο ορχικό ιστό (20,21) ο Clermont τροποποίησε τον ορισμό του κύκλου της σπερματογένεσης, ορίζοντάς τον ως την πλήρη σειρά των κυτταρικών σχέσεων που εμφανίζονται διαδοχικά σε κάθε περιοχή του σπερματικού σωληναρίου. Στον άνθρωπο, σε κάθε κύκλο του επιθηλίου διακρίνονται έξι στάδια εξέλιξης (I-VI) και η χρονική διάρκεια του κύκλου είναι 16 ημέρες περίπου. Για να παραχθούν ώριμα γεννητικά κύτταρα από τα σπερματογόνια απαιτούνται 4,6 κύκλοι. Έτσι το χρονικό διάστημα που απαιτείται για τη παραγωγή σπερματοζωαρίων από τα σπερματογόνια στον άνθρωπο είναι περίπου 74 ημέρες. Δεν είναι ξεκαθαρισμένο μέχρι σήμερα το πώς επιτυγχάνεται ο συγχρονισμός που απαιτείται κατά τον κύκλο της σπερματογένεσης. Μία άποψη είναι ότι οφείλεται σε εξωγενείς επιδράσεις. Ως ενδεχόμενος ρυθμιστής του κύκλου έχουν προταθεί τα κύτταρα Sertoli (22). Υπάρχει όμως και η θεωρία του εσωτερικού προγραμματισμού της εξέλιξης και ωρίμανσης του σπερματικού επιθηλίου, που είναι συνυφασμένη με την ανά τακτά χρονικά διαστήματα διαίρεση των σπερματογονίων (23). 39

Ότι αποτελεί στο χρόνο ο κύκλος του σπερματικού επιθηλίου, αποτελεί στο χώρο το σπερματογενετικό κύμα, δηλαδή η κατανομή κατά μήκος του σπερματικού σωληναρίου των σταδίων του κύκλου της σπερματογένεσης (24). Κατά τις διάφορες φάσεις του κύματος και του κύκλου της σπερματογένεσης τα κύτταρα Sertoli υφίστανται κυκλικές μεταβολές σε σχέση με την έκφραση γονιδίων, τη μεταβολική και βιοχημική τους δραστηριότητα και τη μορφολογία τους (25). Διαμέσου των κυττάρων Sertoli, η FSH και η Τ ρυθμίζουν τον κύκλο της σπερματογένεσης και το σπερματογενετικό κύμα. 1.3.3. Ρύθμιση της σπερματογένεσης Η σπερματογένεση αν και αποτελεί μία από τις δύο λειτουργίες των όρχεων και λαμβάνει χώρα σε ξεχωριστό μορφολογικά και λειτουργικά ανατομικό διαμέρισμά τους, βρίσκεται σε στενή και άμεση σχέση με τη δεύτερη αποστολή των ανδρικών γονάδων, την παραγωγή ορμονών. Και οι δύο αυτές λειτουργίες βρίσκονται υπό τον έλεγχο του άξονα «υποθάλαμος - υπόφυση». Οι κυριότεροι ορμονικοί ρυθμιστές της σπερματογένεσης είναι η FSH και η Τ. Επιπρόσθετα, ένα ιδιαίτερα πολύπλοκο σύστημα τοπικών (ενδοορχικών) αυτοκρινικών και παρακρινικών παραγόντων είναι απαραίτητο για την πλήρη και επαρκή έκφραση της λειτουργικότητας των σπερματικών σωληναρίων, το οποίο συμπληρώνεται από κατάλληλες παρεμβάσεις για την ωρίμανση των σπερματοζωαρίων στο επίπεδο της επιδιδυμίδας. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η φυσιολογική εξέλιξη της σπερματογένεσης εξαρτάται ιδιαίτερα από την λειτουργική ακεραιότητα του αιματο-ορχικού φραγμού και τις επιγενετικές τροποποιήσεις που γίνονται κατά τη φάση της μείωσης. Τέλος, ένας φυσικός παράγοντας ελέγχου της σπερματογένεσης είναι η θερμορύθμιση του οσχέου (26). Oι γοναδοτροπίνες επηρεάζουν τη σπερματογένεση άμεσα και έμμεσα. Σημαντικό ρόλο παίζει η FSH η οποία δρα άμεσα στα σπερματογόνια και έμμεσα μέσω των κυττάρων Sertoli. Στα τελευταία επάγει τη παραγωγή της ABP, της τρανσφερρίνης, της Inh-Β, της αρωματάσης και των ενεργοποιητών του πλασμινογόνου (8). Η ABP συνδέεται με τη Τ και είναι υπεύθυνη για τη μεταφορά της στον αυλό του σωληναρίου, ώστε να διατηρούνται υψηλές ενδοσωληναριακές συγκεντρώσεις Τ, που είναι απαραίτητες για τη σπερματογένεση. Επίσης διατηρεί υψηλές συγκεντρώσεις Τ στις επιδιδυμίδες όπου μεταφέρεται ως σύμπλεγμα ABP+T και απορροφάται από τα κύτταρα της κεφαλής της επιδιδυμίδος. Η 40

τρανσφερρίνη συμβάλλει στη μεταφορά σιδήρου στα κύτταρα της σπερματογένεσης. Η Inh- Β με μηχανισμό αρνητικής παλίνδρομης αλληλορύθμισης αναστέλλει την έκκριση της FSH και ασκεί αυτοκρινική και παρακρινική δράση. Η αρωματάση καταλύει της μετατροπή των ανδρογόνων σε οιστρογόνα τα οποία δρούν ανασταλτικά στον άξονα «υποθάλαμος - υπόφυση». Επίσης φαίνεται να υποστηρίζουν τη σπερματογένεση και με αυτοκρινικόπαρακρινικό τρόπο δεδομένου ότι έχουν εντοπιστεί οιστρογονικοί υποδοχείς (τύπου α και β) στον ορχικό ιστό. Eπίσης η FSH διεγείρει μεταβολικά τα κύτταρα Sertoli, επάγοντας τη πρόσληψη γλυκόζης από αυτά και τη μετατροπή της σε γαλακτικό οξύ (3). Επιπλέον, μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η FSH έχει κεντρικό ρόλο στην ωρίμανση των κυττάρων Sertoli κατά την εφηβεία, τη διατήρηση του κυτταρικού σκελετού τους και των κυτταρικών συνδέσεων μεταξύ τους (27) και στην ανάπτυξη και διατήρηση των σπερματογονίων μέσω αναστολής της απόπτωσής τους (28). Η LH επηρεάζει έμμεσα τη σπερματογένεση, επάγοντας τη παραγωγή της Τ από τα κύτταρα Leydig που αποτελεί το πιο σημαντικό ρυθμιστή της σπερματογένεσης σε αυτοκρινικό/παρακρινικό επίπεδο. Μελέτες έδειξαν ότι και οι δύο γοναδοτροπίνες είναι απαραίτητες για την έναρξη της σπερματογένεσης κατά την εφηβεία, αλλά μόνο η LH αρκεί για τη διατήρησή της ή την επανέναρξή της μετά από προσωρινή διακοπή ή υποστροφή της στον ενήλικα άνδρα. Επιπλέον φαίνεται ότι η FSH είναι απαραίτητη για τη διατήρηση ποσοτικά φυσιολογικής σπερματογένεσης (29-31). Η Τ, όπως προαναφέρθηκε, είναι ένας σημαντικός τοπικός ρυθμιστικός παράγοντας της σπερματογένεσης. Είναι γνωστό ότι απαιτούνται υψηλές ενδοορχικές συγκεντρώσεις T για την έναρξη και διατήρηση της σπερματογένεσης, οι οποίες είναι υψηλότερες εκείνων που χρειάζονται για να εκδηλωθεί η δράση της ορμόνης στους περιφερικούς ιστούς (32). Το γεγονός αυτό εικάζεται ότι οφείλεται σε ειδικές για τον όρχι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της Τ, του υποδοχέα της και άλλων συμπαραγόντων (33). Ανδρογονικούς υποδοχείς εκφράζουν τα κύτταρα Sertoli, Leydig, τα περισωληναριακά-μυοειδή κύτταρα και οι λείες μυικές ίνες των αγγείων, όχι όμως τα γεννητικά κύτταρα. Μελέτες δείχνουν ότι υπάρχει σχέση του βαθμού έκφρασης των ανδρογονικών υποδοχέων από τα κύτταρα Sertoli με το στάδιο του κύκλου της σπερματογένεσης (34). Η Τ προκαλεί αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων Sertoli στη 41

δράση της FSH. Δεδομένα από πειραματόζωα δείχνουν ότι η Τ και η FSH από κοινού υποστηρίζουν τη μείωση, αναστέλλουν την απόπτωση των σπερματοκυττάρων και των στρογγυλών σπερματίδων (28,35) και δρουν συνεργικά στην ωρίμανση των σπερματίδων και την απελευθέρωση των σπερματοζωαρίων (36). Επίσης η Τ μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας ασκεί και ενδοκρινική δράση καταστέλλοντας την έκκριση της LH. Η εξωγενής χορήγηση ανδρογόνων μπορεί συνεπώς να προκαλέσει αναστολή της σπερματογένεσης. Άλλοι παράγοντες, εκτός της Τ, των οιστρογόνων και της Inh-Β, που φαίνεται να συμβάλλουν στη ρύθμιση της σπερματογένεσης σε αυτοκρινικό/παρακρινικό επίπεδο είναι νευροπεπτίδια, οπιοειδή, μεταλλοπρωτεάσες, το σύμπλεγμα ρενίνης-αγγειοτενσίνης, αυξητικοί και ανοσολογικοί παράγοντες (8). Οι αυξητικοί παράγοντες που εμπλέκονται είναι οι αυξητικοί παράγοντες μεταμόρφωσης-α και -β (TGF-α και TGF-β), οι παρόμοιοι με την ινσουλίνη αυξητικοί παράγοντες-ι και -ΙΙ (IGF-I και IGF-II), η ακτιβίνη, οι αυξητικοί παράγοντες των ινοβλαστών (FGF-1 και FGF-2), ο επιδερμιδικός αυξητικός παράγοντας (EGF), και ο νεκρωτικός αυξητικός παράγων (Necrosis Growth Factor- NGF). Οι κυτοκίνες, όπως οι ιντερλευκίνες 1 και 6 (IL-1, IL-6), ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων τύπου α (TNF-α) και το σύμπλεγμα του παράγοντα των αρχέγονων κυττάρων (Stem Cell Factor - SCF) και του υποδοχέα του c-kit, φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της σχέσης μεταξύ των κυττάρων Sertoli και του σπερματικού επιθηλίου. Ο παράγοντας SCF που εκφράζεται στα κύτταρα Sertoli και ο υποδοχέας του c-kit στα σπερματογόνια συμβάλλουν στην οντογένεση, τη μετανάστευση των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων και τη διαφοροποίηση των σπερματογονίων προς ωριμότερες μορφές (37). Ανεξάρτητα όμως από τη σχετική συμβολή καθενός από τους προαναφερθέντες παράγοντες, θεωρείται ότι οι τοπικοί μηχανισμοί τροποποιούν τον κεντρικό ορμονικό έλεγχο δρώντας παράλληλα και ως διαμεσολαβητές του στα διάφορα διαμερίσματα και κύρια στα σπερματικά σωληνάρια. Ο αιματο-ορχικός φραγμός επιτελεί πολλές λειτουργίες που είναι ιδιαίτερα σημαντικές για τη σπερματογένεση. Εμποδίζει εκλεκτικά τη δίοδο του νερού, των ηλεκτρολυτών, των ιόντων, των ορμονών και των ουσιών που δρουν παρακρινικά, ρυθμίζοντας, με αυτόν τον τρόπο, τόσο το είδος όσο και την ποσότητα των ουσιών που απαιτούνται για την ανάπτυξη 42

των απλοειδικών σπερματίδων. Ο αιματο-ορχικός φραγμός αποτελεί, επίσης, ανοσολογικό φραγμό για το διαχωρισμό των αντιγόνων, που εκφράζονται προσωρινά κατά την μεταμειωτική εξέλιξη των σπερματικών κυττάρων, από το ανοσολογικό σύστημα του ξενιστή, με σκοπό την αποτροπή της παραγωγής αντι-σπερματικών αντισωμάτων. Τέλος, ο αιματοορχικός φραγμός προσδίδει πολικότητα στα κύτταρα του όρχι, καθώς άλλες ουσίες εκκρίνονται προς το διάμεσο χώρο, άλλες προς τα βλαστικά κύτταρα και άλλες προς τον αυλό των σπερματικών σωληναρίων. Στα κύτταρα Sertoli, ο πυρήνας βρίσκεται κοντά στη βασική μεμβράνη και κάθε ένα από αυτά συνδέεται με κυτταροπλασματικές αποφυάδες με 30 έως 50, περίπου γεννητικά κύτταρα, που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξής τους. Η σημασία της επιγενετικής ρύθμισης της σπερματογένεσης υπογραμμίζεται από το γεγονός ότι οποιαδήποτε απόκλισή της μπορεί να οδηγήσει σε υπογονιμότητα ή άλλες συνέπειες για τις μελλοντικές γενεές. Η επιγενετική είναι ο κλάδος της γενετικής που μελετά τις κληρονομήσιμες μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση ή τον κυτταρικό φαινότυπο, που δεν οφείλονται σε αντίστοιχες μεταβολές της αλληλουχίας του DNA. Oι επιγενετικές μεταβολές, όπως η μεθυλίωση του DNA, η μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, ή ακετυλίωση των ιστονών και η αναδόμηση (remodeling) της χρωματίνης έχουν άμεσα αποτελέσματα στη δομή της χρωματίνης. Η ρύθμιση της τελευταίας είναι ιδιαίτερα σημαντική ώστε, από τη μία μεριά, να οργανώνεται το DNA σε μικρό χώρο και, από την άλλη, να καθορίζεται ποια τμήματά του θα μεταγραφούν. Ως αποτέλεσμα, η δομή της χρωματίνης διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στον φαινότυπο του κυττάρου αλλά και ολόκληρου του οργανισμού. Πολλές από τις επιγενετικές μεταβολές που συμβαίνουν κατά τη σπερματογένεση έχουν μελετηθεί και διευκρινιστεί. Στα βλαστικά κύτταρα που διαιρούνται με μίτωση, η μεθυλίωση του DNA δημιουργεί τα ειδικά πατρικά αποτυπώματα. Στα κύτταρα που διαιρούνται με μείωση, η φωσφορυλίωση βοηθά στον ανασυνδυασμό και το σχηματισμό του σωματίου XY (XY body) ενώ η υπερακετυλίωση στη μετάβαση ιστόνης - πρωταμίνης (histone protamine transition). Παρ όλη την πρόοδο των τελευταίων ετών, πολλά ερωτήματα δεν έχουν ακόμη απαντηθεί, όπως οι λειτουργίες όλων των επιγενετικών τροποποιήσεων της σπερματογένεσης, η χρονική τους ακολουθία και οι παράγοντες από τους οποίους επηρεάζονται. 43

Τέλος σημαντική προϋπόθεση για την φυσιολογική εξέλιξη της σπερματογένεσης αποτελεί η διατήρηση χαμηλότερης θερμοκρασίας στο όσχεο σε σχέση με το υπόλοιπο σώμα. Η θερμορύθμιση του οσχέου επιτυγχάνεται με δύο μηχανισμούς: O πρώτος χρησιμοποιεί την αποβολή θερμότητας διαμέσου του δέρματος του οσχέου που λόγω της ρυτίδωσής του έχει μεγάλη επιφάνεια, είναι λεπτό και χαρακτηρίζεται από μηδενική παρουσία λίπους. Ο δεύτερος επιδρά διαμέσου μεταβολών της αιματικής ροής από το φλεβικό δίκτυο (37). Διαταραχές στο επίπεδο της θερμορύθμισης ή στη σύνθεση, έκκριση ή δράση των ορμονικών και αυτοκρινικών/παρακρινικών ρυθμιστών της σπερματογένεσης μπορεί να οδηγήσουν σε ανεπάρκεια ή πλήρη αναστολή της. Οι διαταραχές της σπερματογένεσης αποτελούν το κύριο παθογενετικό υπόστρωμα της ανδρικής υπογονιμότητας. 44

2. Ανδρική υπογονιμότητα 2.1. Ορισμοί - Επιδημιολογία Η πιθανότητα τεκνοποίησης ενός ζευγαριού είναι συνισταμένη τριών παραγόντων: του δυναμικού γονιμότητας του άνδρα, του δυναμικού γονιμότητας της γυναίκας και του χρονικού διαστήματος με ελεύθερες σεξουαλικές επαφές. Η τελευταία παράμετρος έχει χρησιμοποιηθεί ως κριτήριο για τον ορισμό της υπογονιμότητας. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (World Health Organization - WHO) ορίζει την υπογονιμότητα ως την αδυναμία ενός ζευγαριού να επιτύχει κύηση μετά από χρονικό διάστημα τουλάχιστον ενός έτους ελεύθερων σεξουαλικών επαφών κατά τις γόνιμες ημέρες του εμμηνορυσιακού κύκλου (38). O ορισμός αυτός βασίστηκε σε πολυκεντρικές μελέτες οι οποίες με εργαλείο τον εκτιμώμενο χρόνο επίτευξης κύησης (time to pregnancy - TTP), έδειξαν ότι η πιθανότητα αυτόματης σύλληψης είναι 20% ανά κύκλο και περίπου 85-90% ανά έτος (38-40). Η Ευρωπαική Εταιρεία Ανθρώπινης Αναπαραγωγής και Εμβρυολογίας (Εuropean Society for Human Reproduction and Embryology - ESHRE) ορίζει την υπογονιμότητα ως την αδυναμία επίτευξης κύησης μετά από δύο έτη συστηματικών ελεύθερων επαφών (41). Πρόσφατες προοπτικές μελέτες όμως, υποδεικνύουν ότι η πιθανότητα αυτόματης σύλληψης είναι μεγαλύτερη απ' ότι παλαιότερα είχε εκτιμηθεί. Σε μελέτη που έγινε στη Κίνα με εργάτριες κλωστουφαντουργίας 20-34 ετών διαπιστώθηκε ότι το 50% αυτών έμειναν έγκυες μετά από δύο κύκλους και το 90% τους πρώτους 6 μήνες. Η πιθανότητα σύλληψης ανά κύκλο υπολογίστηκε ότι ήταν 30-35% (42). Aνάλογη προοπτική μελέτη που έγινε σε ζευγάρια στη Γερμανία έδειξε ότι η αθροιστική πιθανότητα αυτόματης σύλληψης ήταν 38%, 68%, 81% και 92% μετά από 1, 3, 6 και 12 κύκλους, αντίστοιχα (43). Η υπογονιμότητα αναφέρεται στην ελαττωμένη πιθανότητα σύλληψης και όχι στη μηδενική που χαρακτηρίζει τη στειρότητα και μπορεί να είναι παροδική ή μόνιμη. Διακρίνεται τόσο στον άνδρα όσο και στη γυναίκα σε πρωτοπαθή και δευτεροπαθή. Ως πρωτοπαθής υπογονιμότητα ορίζεται η μη επίτευξη σύλληψης, ποτέ κατά το παρελθόν, ενώ αν έχει επιτευχθεί σύλληψη με τον / την ίδιο / ίδια ή άλλον / άλλη σύντροφο, ανεξάρτητα από την 45

εξέλιξη και τη τελική έκβαση της κύησης, η υπογονιμότητα χαρακτηρίζεται ως δευτεροπαθής. Ως χρονική διάρκεια της υπογονιμότητας ορίζεται το διάστημα κατά το οποίο το ζευγάρι, ενώ είχε ελεύθερες σεξουαλικές επαφές, δεν επέτυχε σύλληψη. Το χρονικό διάστημα αυτό είναι σημαντικό, διότι αποτελεί το κύριο προσδιοριστικό παράγοντα του χρόνου έναρξης της διερεύνησης ενός υπογόνιμου ζευγαριού και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το καθορισμό του βαθμού βαρύτητας και της επίπτωσης της υπογονιμότητας. Επίσης δίνει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη πρόγνωση της μελλοντικής γονιμότητας του ζευγαριού. Οι Gnoth et al πρότειναν έναν τρόπο ορισμού και ταξινόμησης της υπογονιμότητας σε τρεις βαθμούς (Grades) ανάλογα με τη χρονική διάρκειά της (Πίνακας 1) (44). Πίνακας 1. Ορισμός, επίπτωση και ταξινόμηση της υπογονιμότητας (44). Χρονική διάρκεια Επίπτωση/ χαρακτηρισμός Πιθανότητα μελλοντικής αυτόματης σύλληψης Μετά από 6 ανεπιτυχείς κύκλους Μετά από 12 ανεπιτυχείς κύκλους (κλινικός ορισμός του WHO) ~ 20%, ηπίου βαθμού υπογονιμότητα ~ 10%, μετρίου ή σοβαρού βαθμού υπογονιμότητα 50% στους επόμενους 6 κύκλους/μήνες. Το υπόλοιπο ποσοστό θεωρείται ότι έχει μετρίου βαθμού υπογονιμότητα 55% στους επόμενους 36 μήνες. Τα υπόλοιπα ζευγάρια θεωρούντα σχεδόν στείρα Μετά από 48 μήνες ~ 5%, σχεδόν στειρότητα Σπάνιες, σποραδικές αυτόματες συλλήψεις. 1,5% / μήνα 46

Η επίπτωση της υπογονιμότητας ποικίλει στις διάφορες μελέτες και εξαρτάται από τη χώρα στην οποία διεξάγονται (χαμηλά ποσοστά στις ανεπτυγμένες περιοχές και υψηλότερα στις αναπτυσσόμενες χώρες) και τη μεθοδολογία που υιοθετούν για να την ορίσουν. Παγκοσμίως, το ποσοστό των υπογόνιμων ζευγαριών- τουλάχιστον αυτών που αναζητούν ιατρική βοήθεια- υπολογίζεται σε 4-17% (45). Περίπου 3-4% όλων των ζευγαριών παραμένουν ακουσίως άτεκνα καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής τους. Σε πολυκεντρική μελέτη του WHO (38), που διενεργήθηκε κατά τα έτη 1982-1985, βρέθηκε ότι στο 20% των περιπτώσεων το πρόβλημα της υπογονιμότητας εντοπίζεται στον άνδρα, στο 38% στην γυναίκα, ενώ στο 27% περίπου, ανευρίσκεται αίτιο και στον άνδρα και στη γυναίκα. Σε ένα σημαντικό ποσοστό των υπογόνιμων ζευγαριών (15%), παρά τον ενδελεχή έλεγχο δεν είναι δυνατή η ανεύρεση κάποιου αιτίου (αδιευκρίνιστης αιτιολογίας υπογονιμότητα). Είναι προφανές ότι ο ανδρικός παράγων ενέχεται στις μισές περίπου περιπτώσεις υπογόνιμων ζευγαριών (1,38). Παρόμοια δεδομένα παρέχονται και από την ASRM (American Society of Reproductive Medicine): o ανδρικός παράγοντας είναι αποκλειστικά υπεύθυνος για την υπογονιμότητα στο 20% των ζευγαριών και συνυπεύθυνος στο 30-40% (46). Πρόσφατες επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν αυξημένη επίπτωση της υπογονιμότητας σε άνδρες ηλικίας μεγαλύτερης των 40 ετών (47,48). Eνδιαφέρον έχουν προκαλέσει μελέτες από διάφορες περιοχές του κόσμου που αναφέρουν διαχρονικά προοδευτική επιδείνωση σε παραμέτρους του σπέρματος, κυρίως στη συγκέντρωση των σπερματοζωρίων, με παράλληλη αύξηση της επίπτωσης στον ανδρικό πληθυσμό της υπογονιμότητας, συγγενών διαταραχών του ουρογεννητικού συστήματος και καρκίνου των όρχεων (49-52). Δεν είναι ξεκάθαρο πάντως εάν για τη τάση αυτή, εφόσον επιβεβαιωθεί, εμπλέκονται περιβαλλοντικές τοξίνες ή ρύποι. Φαίνεται ότι η υπογονιμότητα είναι ένα συχνό ιατρικό πρόβλημα. Επιπλέον, θεωρείται σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας δεδομένου ότι έχει σοβαρές κοινωνικο-οικονομικές επιπτώσεις και μπορεί να επηρεάσει δυσμενώς τη ποιότητα ζωής του ζευγαριού προκαλώντας τριβές, ψυχολογική φθορά (αισθήματα ενοχής, ντροπή, κατάθλιψη) και κοινωνική απομόνωση (53). 47

2.2. Αιτιολογία της ανδρικής υπογονιμότητας Η αιτιολογική ταξινόμηση της ανδρικής υπογονιμότητας, σύμφωνα με τον WHO, φαίνεται στον Πίνακα 2 (38). Πίνακας 2. Αιτιολογική ταξινόμηση της ανδρικής υπογονιμότητας κατά WHO (38). Ιδιοπαθής υπογονιμότητα 1. Ιδιοπαθής ολιγοσπερμία 2. Ιδιοπαθής ασθενοσπερμία 3. Ιδιοπαθής τερατοσπερμία 4. Ιδιοπαθής αζωοσπερμία Συγγενείς ανωμαλίες 1. Ατελής κάθοδος των όρχεων 2. Συγγενής αγενεσία των εκφορητικών οδών του σπέρματος 3. Καρυοτυπικές ανωμαλίες 4. Άλλες συγγενείς ανωμαλίες Συστηματικές παθήσεις Επίκτητη βλάβη των όρχεων Αποφρακτική αζωοσπερμία Διαταραχές στύσης και εκσπερμάτισης Ανοσολογικής αιτιολογίας Λοιμώξεις γεννητικών οργάνων Κιρσοκήλη Μεμονωμένες παθήσεις σπερματικού υγρού Ενδοκρινικές διαταραχές Ιατρογενούς αιτιολογίας Μικτές βλάβες 48

Εκτός της προαναφερθείσας κατάταξης, πολλοί ερευνητές (54) προτείνουν την ταξινόμηση των αιτίων της ανδρικής υπογονιμότητας σε τέσσερις κατηγορίες ανάλογα με το επίπεδο του αναπαραγωγικού άξονα του άνδρα που εντοπίζεται η διαταραχή: 1. Παθήσεις υποθαλάμου - υπόφυσης 2. Παθήσεις των όρχεων 3. Διαταραχές στη μεταφορά του σπέρματος και 4. Ιδιοπαθής ανδρική υπογονιμότητα Αναλυτικά τα νοσήματα που προκαλούν υπογονιμότητα στον άνδρα φαίνονται στο Πίνακα 3. 49

Πίνακας 3. Ταξινόμηση των αιτίων της ανδρικής υπογονιμότητας ανάλογα με το επίπεδο διαταραχής του αναπαραγωγικού άξονα (54). α. Παθήσεις υποθαλάμου - υποφύσεως Συγγενείς διαταραχές Διαταραχή στην έκκριση ή δράση του GnRH (σ. Kallmann, αδρανοποιητικές μεταλλάξεις του υποδοχέα GnRH, ιδιοπαθής ΥΥ) Μεμονωμένη ανεπάρκεια LH Αιμοχρωμάτωση Πολυοργανικές γενετικές διαταραχές (σ. Prader-Willi, σ. Laurence-Moon-Beidl, παρεγκεφαλιδική αταξία) Επίκτητες Διαταραχές Όγκοι υποθαλάμου-υποφύσεως (μακροαδενώματα, κρανιοφαρυγγίωμα) Διηθητικές νόσοι (αιμοσιδήρωση, σαρκοείδωση, ιστιοκύτωση, φυματίωση, μυκητιάσεις) Tραύμα, χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία Αγγειακές διαταραχές (υποφυσιακή αποπληξία, ανεύρυσμα) Ορμονικές διαταραχές (υπερπρολακτιναιμία, περίσσεια ανδρογόνων, οιστρογόνων, κορτιζόλης) Φάρμακα (οπιοειδή, νευροληπτικά, GnRH αγωνιστές ή ανταγωνιστές) Συστηματικές νόσοι Χρόνιες παθήσεις Υποθρεψία Παχυσαρκία β. Παθήσεις των όρχεων Συγγενείς-γενετικές διαταραχές Σύνδρομα Klinefelter, Noonan, 46XX άρρεν Mετάλλαξη του υποδοχέα της FSH ή της LH Μεταλλάξεις σε γονίδια DAZL Μικροελλείψεις του Υ χρωμοσώματος Κρυψορχία Μυοτονική δυστροφία Συγγενής ανορχία Μεικτή γοναδική δυσγενεσία Κιρσοκήλη Ενζυμικές διαταραχές στη σύνθεση της τεστοστερόνης Διαταραχές του υποδοχέα των ανδρογόνων Ανεπάρκεια 5α-αναγωγάσης 50

Επίκτητες διαταραχές Ιογενής ορχίτιδα (παρωτίτιδα, ιοί ECHO και ARBO) Koκκιωματώδης ορχίτιδα (φυματίωση, λέπρα) Επιδιδυμο-ορχίτιδα (γονόρροια, χλαμύδια) Όγκοι των όρχεων Φάρμακα (π.χ. χημειοθεραπευτικά, αλκοόλ, μαριχουάνα, αντιανδρογόνα, σπιρονολακτόνη, κετοκοναζόλη, ανταγωνιστές Η 2 υποδοχέων) Iονίζουσα ακτινοβολία Περιβαλλοντικές τοξίνες (π.χ. διβρωμοχλωροπροπάνιο,κάδμιο, μόλυβος, υδράργυρος, χημικά με οιστρογονική ή αντιανδρογόνα δράση [εντομοκτόνα], φυτοοιστρογόνα, κάπνισμα) Υπερθερμία Ανοσολογικές διαταραχές (αντισπερμικά αντισώματα, πολυενδοκρινικά αυτοάνοσα σύνδρομα) Επίκτητη ανορχία (τραύμα, συστροφή, χειρουργική αφαίρεση) Συστηματικά νοσήματα (π.χ. νεφρική ανεπάρκεια, κίρρωση, νεοπλάσματα, δρεπανοκυτταρική αναιμία, αμυλοείδωση, αγγειίτιδα, κοιλιοκάκη) γ. Διαταραχές στη μεταφορά και εναπόθεση του σπέρματος Διαταραχές των επιδιδυμίδων Αγενεσία Απόφραξη (συγγενής ή επίκτητη), Δυσλειτουργία (λοιμώξεις, φάρμακα, περιβαλλοντικές τοξίνες) Διαταραχές των σπερματικών πόρων και των εκφορητικών οδών Συγγενής αγενεσία Κυστική ίνωση Σύνδρομο Υoung Λοιμώξεις Σύνδρομο ακίνητων κροσσών Ιατρογενής απόφραξη Διαταραχές εκσπερμάτισης Παθήσεις νωτιαίου μυελού Δυσλειτουργία αυτόνομου νευρικού συστήματος Σακχαρώδης Διαβήτης Πρόωρη εκσπερμάτιση Παλίνδρομη εκσπερμάτιση Στυτική δυσλειτουργία δ. Ιδιοπαθής ανδρική υπογονιμότητα 51

Η συχνότητα εμφάνισης των διαφόρων αιτίων της ανδρικής υπογονιμότητας ποικίλει στις διάφορες μελέτες και εξαρτάται από τη γεωγραφική περιοχή που διεξάγονται, τα κριτήρια παραπομπής των ανδρών για διερεύνηση και την έκταση της διαγνωστικής διερεύνησης. Στον Πίνακα 4 φαίνεται η ταξινόμηση των αιτίων ανδρικής υπογονιμότητας κατά σειρά συχνότητας. Πίνακας 4. Η συχνότητα των αιτίων της ανδρικής υπογονιμότητας (55). Ιδιοπαθής 31,1% Κιρσοκήλη 15,6% Υπογοναδισμός 8,9% Λοιμώξεις γεννητικού συστήματος 8,0% Κρυψορχία 7,8% Διαταραχές στύσης και εσκσπερμάτισης 5,9% Ανοσολογικός παράγοντας 4,5% Συστηματικές νόσοι 3,1% Απόφραξη των εκφορητικών οδών του σπέρματος 1,7% Όγκοι των όρχεων 0,3-0,5% Λοιπά αίτια 12,0% Σύνολο 100,0% Η πιο συχνή μορφή ανδρικής υπογονιμότητας είναι η ιδιοπαθής, δηλαδή η διαταραχή μίας ή περισσότερων παραμέτρων του σπέρματος χωρίς να ανευρίσκεται το αίτιο που την προκαλεί. Αυτό συμβαίνει περίπου στο 30-50% των υπογόνιμων ανδρών. Θα πρέπει να διακρίνεται από την υπογονιμότητα του ζευγαριού αδιευκρίνιστης αιτιολογίας όπου δεν υπάρχει κανείς προφανής επιβαρυντικός παράγοντας στη γυναίκα και δεν διαπιστώνονται διαταραχές στις παραμέτρους του σπέρματος στον άνδρα. 52

Οι κύριοι παθογενετικοί μηχανισμοί πρόκλησης υπογονιμότητας στον άνδρα είναι τρείς: η διαταραχή της σπερματογένεσης, η διαταραχή στη μεταφορά του σπέρματος μέσω των εκφορητικών οδών και την εκσπερμάτιση και η σεξουαλική δυσλειτουργία. Όλες οι μελέτες δείχνουν ότι η ανδρική υπογονιμότητα και στειρότητα αποτελούν μία ετερογενή ομάδα διαταραχών που επιδρούν μέσω ενός ή περισσοτέρων από τους προαναφερθέντες μηχανισμούς (56). Ο πιο συχνός μηχανισμός πρόκλησης υπογονιμότητας στον άνδρα είναι η δυσλειτουργία της σπερματογένεσης η οποία εκδηλώνεται με διαταραχές σε μία ή περισσότερες παραμέτρους του σπέρματος. Οι πιο συνηθισμένες είναι οι ακόλουθες: 1. Ολιγοσπερμία: η ελάττωση της συγκέντρωσης των σπερματοζωαρίων κάτω από τα όρια αναφοράς 2. Ασθενοσπερμία: ελάττωση του ποσοστού των σπερματοζωαρίων με φυσιολογική προωθητική κινητικότητα την πρώτη ώρα μετά την εκσπερμάτιση 3. Τερατοσπερμία: ελάττωση του ποσοστού των μορφολογικά φυσιολογικών σπερματοζωαρίων 4. Ολιγο-ασθενο-τερατοσπερμία (ΟΤΑ): σύγχρονη μείωση του αριθμού, της πρωοθητικής κινητικότητας και των φυσιολογικών μορφών των σπερματοζωαρίων κάτω από τα όρια αναφοράς 5. Αζωοσπερμία: πλήρης απουσία σπερματοζωαρίων στο σπερματικό υγρό ακόμη και μετά από φυγοκέντρηση του δείγματος και χρώση του ιζήματος 6. Ασπερμία: πλήρης απουσία σπέρματος κατά την εκσπερμάτιση παρά τη φυσιολογική στύση και οργασμό Οι πιο πολλοί υπογόνιμοι άνδρες εμφανίζουν ιδιοπαθή ολιγοσπερμία ή ΟΤΑ (38,57,58). Η συχνότητα της αζωοσπερμίας κυμαίνεται ανάλογα με τις μελέτες από 7-20% (58-60) ενώ το ποσοστό της αζωοσπερμίας στο γενικό πληθυσμό είναι ~1%. Περίπου 10% των υπογόνιμων ανδρών εμφανίζει σοβαρού βαθμού ολιγοσπερμία (< 1 εκατομμύριο/ml) (41). Θα πρέπει να τονιστεί ότι η τεκμηρίωση της διάγνωσης της αζωοσπερμίας προϋποθέτει την απουσία σπερματοζωαρίων σε τουλάχιστον δύο διαφορετικά φυγοκεντρημένα δείγματα σπέρματος. Η διαταραχή αυτή μπορεί να εμφανιστεί και σε γόνιμους άνδρες ως παροδικό φαινόμενο, αποτέλεσμα ποικίλων αιτίων (παροδική αζωοσπερμία). 53

Η ιδιοπαθής μη αποφρακτική αζωοσπερμία (IMAA, Idiopathic Non-Obstructive Azoospermia INOA) είναι στην ουσία μία διάγνωση εξ αποκλεισμού και τίθεται μετά τον αποκλεισμό των γνωστών αιτίων της ανδρικής υπογονιμότητας. Τα κριτήρια για να τεθεί η διάγνωση της είναι τα εξής: 1. Πρωτοπαθής υπογονιμότητα 2. Απουσία γνωστών αιτίων υπογονιμότητας 3. Μικρό μέγεθος των όρχεων 4. Επίπεδα της FSH ορού υψηλά ή στα ανώτερα φυσιολογικά όρια 5. Φυσιολογικά επίπεδα της LH και Τ ορού 6. Αζωοσπερμία Στη βιοψία των όρχεων μπορεί να παρατηρηθούν τρεις διαφορετικές ιστολογικές εικόνες: 1. Σύνδρομο απλασίας του σπερματικού επιθηλίου (Sertoli Cell-Only Syndrome - SCOS), όπου ανευρίσκονται μόνο κύτταρα Sertoli και υπάρχει πλήρης απουσία των κυττάρων της σπερματικής σειράς. Το σύνδρομο μπορεί να είναι πλήρους ή μερικής μορφής, δηλαδή σε μερικά σπερματικά σωληνάρια να ανευρίσκονται κάποια κύτταρα της σπερματικής σειράς 2. Διακοπή της σπερματογένεσης, όπου ανευρίσκονται κύτταρα της σπερματικής σειράς μέχρι κάποιο επίπεδο ωρίμανσης, όπου και η εξέλιξή τους διακόπτεται χωρίς να ανευρίσκονται ωριμότερες μορφές 3. Βαρεία υποσπερματογένεση Έρευνες όμως, με τεχνικές μοριακής γενετικής, έδειξαν ότι ένα σημαντικό ποσοστό ανδρών που θεωρούνταν ότι πάσχουν από ιδιοπαθή ολιγοσπερμία ή αζωοσπερμία εμφανίζουν γενετικές βλάβες στο μακρό σκέλος του χρωμοσώματος Υ. Πρόκειται για ελλείψεις μικρών τμημάτων του χρωμοσώματος, μή ορατές με οπτικό μικροσκόπιο που ονομάστηκαν Υqμικροελλείψεις. Το ποσοστό ανεύρεσής τους σε άνδρες με ιδιοπαθή αζωοσπερμία ή βαρεία ΟΤΑ κυμαίνεται από 3% έως 10%. (61-63). Οι Υq-μικροελλείψεις έχουν ανιχνευθεί επίσης σε γόνιμους άνδρες καθώς και σε άνδρες με γνωστά αίτια υπογονιμότητας (κρυψορχία, 54

κιρσοκήλη, συγγενή αγενεσία των εκφορητικών οδών), αν και στις περιπτώσεις αυτές το ποσοστό ανεύρεσής τους είναι πολύ χαμηλότερο συγκριτικά με άνδρες που έχουν ΙMAA (64). Οι μικροελλείψεις εντοπίζονται κυρίως στo γενετικό τόπο Yq11 ο οποίος ονομάστηκε περιοχή του παράγοντα αζωοσπερμίας (Azoospermia Factor-AZF) και περιλαμβάνει τρείς υποπεριοχές: AZFa, AZFb και AZFc (Σχήμα 4). Mικροελλείψεις των περιοχών AZFa και AZFb σχετίζονται με σοβαρή διαταραχή της σπερματογένεσης που εκδηλώνεται με αζωοσπερμία και ιστολογικά διαπιστώνεται εικόνα SCOS ή διακοπής της σπερματογένεσης. Αντίθετα ελλείψεις της περιοχής AZFc έχουν ποικίλο φαινότυπο. Είναι προφανές ότι στις περιοχές AZF υπάρχουν γονίδια που παίζουν κριτικό ρόλο στη διαδικασία της σπερματογένεσης. Οι οικογένειες γονιδίων του Υ χρωμοσώματος που φαίνεται να ενέχονται είναι κυρίως οι DAZ (Deleted In Azoospermia), RBM (RNA binnding motif containing) και τα γονίδια DDx3Y (DEAD [Asp-Glu-Ala-Asp] box polypeptide 3, Y-linked gene), USP9Y, CDY1 και PRY (Σχήμα 4) (54). Η ιδιοπαθής ανδρική υπογονιμότητα έχει συσχετισθεί και με άλλες γενετικές βλάβες εκτός των Υq μικροελλείψεων. Σε άνδρες με ιδιοπαθή αζωοσπερμία έχουν εντοπιστεί διαταραχές σε γονίδια που βρίσκονται σε αυτοσωματικά χρωμοσώματα ή στο Χ, όπως πολυμορφισμοί του DAZL που είναι το αυτοσωματικό ομόλογο του γονιδίου DAZ, ή μεταλλάξεις του SYCP3 που ρυθμίζει τη μειωτική σύναψη ομόλογων χρωμοσωμάτων (54). Eπίσης μεταβολές του αριθμού των επαναλήψεων του τρινουκλεοτιδίου CAG στο εξόνιο 1 του γονιδίου του ανδρογονικού υποδοχέα έχουν συσχετισθεί με ιδιοπαθή ολιγοσπερμία (65). Τέλος, έχει βρεθεί ότι μεταλλάξεις του γονιδίου CREM (camp-response element modulator), το οποίο κωδικοποιεί μεταγραφικό παράγοντα που εκφράζεται στα μεταμειωτικά γεννητικά κύτταρα, σχετίζονται με ιστολογική εικόνα διακοπής της σπερματογένεσης (germ cell arrest) σε άνδρες με ιδιοπαθή αζωοσπερμία (66). 55

Σχήμα 4. Οι περιοχές ΑΖF και οι οικογένειες γονιδίων που εμπλέκονται στη σπερματογένεση (54). 2.3. Διαγνωστική προσέγγιση της ανδρικής υπογονιμότητας Η διερεύνηση του υπογόνιμου άνδρα πρέπει να γίνεται παράλληλα με της συντρόφου του στα πλαίσια μίας συνολικής στρατηγικής διαγνωστικής προσέγγισης και αντιμετώπισης του υπογόνιμου ζευγαριού. Ο διαγνωστικός έλεγχος πρέπει να ξεκινά μετά τη συμπλήρωση ενός έτους άκαρπων προσπαθειών τεκνοποίησης, βάσει και του ορισμού της υπογονιμότητας από τον WHO. Είναι σημαντικό να τηρείται αυτό στη κλινική πράξη, γιατί ένα σημαντικό ποσοστό (~ 55%) των ζευγαριών που έχουν χαρακτηριστεί ως υπογόνιμα βάσει του υπάρχοντος ορισμού, θα τεκνοποιήσει αυτόματα τους επόμενους 36 μήνες (67). Βέβαια έχει προναφερθεί ότι όσο αυξάνεται η χρονική διάρκεια της υπογονιμότητας, ελαττώνεται σημαντικά η πιθανότητα αυτόματης σύλληψης, γι' αυτό και από την άλλη μεριά, δεν πρέπει να υπάρχει καθυστέρηση στην έναρξη της διαγνωστικής διαδικασίας. Αρκετοί ερευνητές, βασιζόμενοι σε προαναφερθέντες προοπτικές μελέτες που δείχνουν αυξημένα ποσοστά αυτόματης σύλληψης σε φυσιολογικά ζευγάρια (42,43), προτείνουν να ξεκινά ο διαγνωστικός έλεγχος νωρίτερα και συγκεκριμένα μετά τη παρέλευση 6 μηνών μη σύλληψης, ιδιαίτερα όταν η ηλικία της γυναίκας είναι μεγαλύτερη των 35 ετών (44,53). Κάτι τέτοιο όμως, θα μπορούσε να επηρεάσει τη προγνωστική αξία των διαγνωστικών εξετάσεων και τη σχέση κόστους-οφέλους των θεραπευτικών παρεμβάσεων (41). Η διαγνωστική διερεύνηση του άνδρα μπορεί να ξεκινήσει πριν τη συμπλήρωση του έτους, ακόμα και 56

άμεσα, εάν υπάρχει ιστορικό νοσημάτων ή θεραπευτικών παρεμβάσεων που είναι γνωστό ότι προκαλούν υπογονιμότητα (π.χ. σεξουαλικώς μεταδιδόμενα νοσήματα, κιρσοκήλη, κρυψορχία, συστηματικά νοσήματα, χημειοθεραπεία / ακτινοθεραπεία, χειρουργικές επεμβάσεις στο ουρογεννητικό) ή εάν υπάρχει έντονη αγωνία ή υπόνοια στο ζευγάρι σχετικά με το δυναμικό γονιμότητας του (46). Οι στόχοι της διερεύνησης του υπογόνιμου άνδρα πρέπει να είναι οι εξής: 1. Η διάγνωση των δυνητικά θεραπεύσιμων μορφών υπογονιμότητας (π.χ. υπογοναδοτροπικός υπογοναδισμός, ορμονικές διαταραχές, σεξουαλική δυσλειτουργία, απόφραξη των εκφορητικών οδών, κιρσοκήλη, λοιμώξεις). 2. Η εντόπιση των ανδρών με μη αναστρέψιμες διαταραχές που όμως μπορεί να αντιμετωπιστούν με μεθόδους υποβοηθούμενης αναπαραγωγής όπως η εξωσωματική γονιμοποίηση (ΙVF) ή η ενδοωαρική έγχυση σπερματοζωαρίου (Ιntracytoplasmic Sperm Injection, ICSI). 3. Η εντόπιση μη αναστρέψιμων καταστάσεων που υποδεικνύουν τη προσφυγή του ζευγαριού σε δότη σπέρματος ή υιοθεσία για την αντιμετώπιση της υπογονιμότητας. 4. Η διαπίστωση νοσημάτων, ως αιτιολογικό υπόστρωμα της υπογονιμότητας, που μπορεί να ενέχουν κινδύνους για τη ζωή ή τη γενικότερη υγεία του άνδρα και χρήζουν άμεσης θεραπευτικής παρέμβασης (π.χ. αδενώματα υπόφυσης, υπογοναδισμός, όγκοι των όρχεων, συστηματικά νοσήματα) και 5. Η εντόπιση γενετικών διαταραχών που μπορεί να μεταδοθούν στους απογόνους, εφόσον πρόκειται να εφαρμοσθούν μέθοδοι υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (41). Είναι προφανές ότι η αιτιολογική διερεύνηση της ανδρικής υπογονιμότητας είναι ο ακρογωνιαίος λίθος για την επιλογή της στρατηγικής αντιμετώπισης του υπογόνιμου ζευγαριού. Στη διαγνωστική προσέγγιση του υπογόνιμου άνδρα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η σχετική συχνότητα εμφάνισης των διαφόρων γνωστών αιτίων ώστε να κατευθύνεται η κλινική σκέψη και να γίνεται επιστημονικά και οικονομικά ορθολογικός 57

προγραμματισμός των εργαστηριακών εξετάσεων. Οι επιμέρους συνιστώσες της διαγνωστικής διερεύνησης είναι οι εξής: α. Ιστορικό β. Κλινική εξέταση γ. Παρακλινικός έλεγχος 1. έλεγχος σπέρματος 2. βασικός ορμονικός έλεγχος 3. απεικονιστικός έλεγχος 4. εξέταση ούρων για ύπαρξη σπερματοζωαρίων 5. γενετικός έλεγχος και 6. κυτταρολογικός-ιστολογικός έλεγχος. 2.3.1. Ιστορικό Η προσεκτική λήψη του ατομικού και οικογενειακού ιστορικού του υπογόνιμου άνδρα είναι ιδιαίτερα σημαντική γιατί συμβάλλει στην αιτιολογική διάγνωση στο 25% των περιπτώσεων και βοηθά στο καθορισμό της πρόγνωσης και της θεραπευτικής αντιμετώπισης. Χρήσιμα στοιχεία από το ιστορικό είναι η συχνότητα και ο χρόνος των σεξουαλικών επαφών, η χρονική διάρκεια και ο τύπος (πρωτοπαθής ή δευτεροπαθής) της υπογονιμότητας, οι αλλαγές στη σεξουαλική επιθυμία (libido) και τη συχνότητα των πρωινών αυτόματων στύσεων, η ύπαρξη προβλημάτων στη στύση ή την εκσπερμάτιση, η ηλικία εμφάνισης και ο ρυθμός εξέλιξης της εφηβείας και η ύπαρξη άλλων συστηματικών νοσημάτων όπως σακχαρώδης διαβήτης, διαταραχές του θυρεοειδούς, υπέρταση, κυστική ίνωση, ηπατική ή νεφρική νόσος. Επίσης, σημασία έχουν η εμφάνιση πρόσφατου εμπυρέτου, το ιστορικό λοιμώξεων (παρωτίτιδα, φυματίωση, σεξουαλικώς μεταδιδόμενα νοσήματα, λοιμώξεις του ουρογεννητικού και αναπνευστικού), κρυψορχίας, υποσπαδία, κιρσοκήλης, χημειοθεραπείας, ακτινοθεραπείας και τραυματισμών ή χειρουργικών επεμβάσεων στο ουρογεννητικό σύστημα. Ο άνδρας πρέπει να ερωτάται για φάρμακα που έλαβε και λαμβάνει, τις έξεις και συνήθειες της προσωπικής του ζωής (αλκοόλ, κάπνισμα, εξαρτησιογόνες ουσίες) και για τυχόν επαγγελματική ή μη έκθεση σε βλαπτικούς περιβαλλοντικούς παράγοντες (ακτινοβολία, υψηλές θερμοκρασίες, βαρέα μέταλλα, 58

εντομοκτόνα, φυτο-οιστρογόνα). Τέλος, στοιχεία από το οικογενειακό ιστορικό που ενδιαφέρουν είναι η ύπαρξη άλλων συγγενών ανδρών με υπογονιμότητα και η παρουσία νοσημάτων όπως ο διαβήτης, η υπέρταση και η κυστική ίνωση. Συνοπτικά τα κύρια στοιχεία που πρέπει να ελέγχονται στο ατομικό ιστορικό είναι τα εξής: 1. Ιστορικό γονιμότητας 2. Σεξουαλική δραστηριότητα του υπογόνιμου άνδρα 3. Σεξουαλική ωρίμανση 4. Συστηματικές νόσοι 5. Παθήσεις, τραύματα ή επεμβάσεις σχετικές με το γεννητικό σύστημα 6. Λοιμώξεις του ουροποιογεννητικού συστήματος, σεξουαλικά μεταδιδόμενα νοσήματα και πρόσφατες εμπύρετες λοιμώξεις 7. Λήψη φαρμάκων 8. Έκθεση σε βλαπτικούς παράγοντες 9. Συνήθειες και τρόπος ζωής (αλκοόλ, καπνός) 2.3.2. Κλινική εξέταση Η ενδελεχής φυσική εξέταση του γεννητικού αλλά και όλων των άλλων συστημάτων είναι κριτικής σημασίας στη διερεύνηση του υπογόνιμου άνδρα και περιλαμβάνει κυρίως τα εξής: 1. Μέτρηση βάρος, ύψους (υπολογισμός του δείκτη μάζας σώματος) και αρτηριακής πίεσης. 2. Εκτίμηση σωματικών αναλογιών (άνοιγμα χεριών, ηβικό ύψος) για τη διερεύνηση ύπαρξης ευνοχοειδικών χαρακτήρων (άνοιγμα άνω άκρων μεγαλύτερο του συνολικού ύψους κατά 5 cm και ηβικό ύψος μεγαλύτερο του υπολοίπου ύψους του σώματος κατά 5 cm). 3. Επισκόπηση του δέρματος (ρυτίδωση προσώπου, βαθμός και κατανομή της τρίχωσης). 4. Εξέταση των μαστών (έλεγχος για γυναικομαστία) και του θυρεοειδούς. 5. Εξέταση της κοιλιάς (ουλές από επεμβάσεις, βουβωνοκήλη, κρυψορχία, ψηλαφητές μάζες, ηπατομεγαλία, ασκίτης). 59

6. Έλεγχος των έξω γεννητικών οργάνων. Πρέπει να γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου και ήρεμο περιβάλλον και ελέγχονται το μέγεθος του πέους (για μικροφαλία), η εκβολή της ουρήθρας (διαπίστωση ύπαρξης υπο- ή επισπαδία), η ρυτίδωση και ο βαθμός μελάγχρωσης του οσχέου (απουσία τους σε υπογοναδισμό), η θέση (έλεγχος για ανορχία, κρυψορχία ή ανελκόμενους όρχεις), η σύσταση (μαλθακοί όρχεις υποδηλώνουν υπογοναδοτροπικό υπογοναδισμό και η ύπαρξη σκληρίας θέτει υπόνοια ύπαρξης κακοήθειας) και το μέγεθος των όρχεων. Το μέγεθος των όρχεων προσδιορίζεται με το ορχιδόμετρο του Prader και εκφράζεται σε ml μετά από σύγκριση με τα πλαστικά μοντέλα του ορχιδόμετρου που είναι γνωστών διαστάσεων. Φυσιολογικές τιμές για τους ενήλικες άνδρες της Καυκάσιας φυλής θεωρούνται οι μεγαλύτερες των 15 ml, καθώς υπάρχουν διαφορές ανάλογα με τη φυλή (38). Ο όγκος των όρχεων συνίσταται κατά 90-95% από τα κύτταρα του σπερματικού επιθηλίου και έχει ισχυρή θετική συσχέτιση με τον αριθμό των σπερματοζωαρίων. Θεωρείται η πιο πολύτιμη κλινική παράμετρος στη μελέτη του υπογόνιμου άνδρα. Μικρό μέγεθος όρχεων απαντάται συνήθως σε γενετικές ή ορμονικές διαταραχές (π.χ. σύνδρομο Κlinefelter) και υποδηλώνει σοβαρή διαταραχή του σπερματικού επιθηλίου. Μεγάλη διόγκωση των όρχεων ανευρίσκεται στο σύνδρομο ευθραύστου Χ ή διηθητικές νόσους, ενώ ετερόπλευρη διόγκωση υποδηλώνει φλεγμονή (συνυπάρχει ευαισθησία), υδροκήλη ή παρουσία νεοπλασίας. Επιπρόσθετα κατά την κλινική εξέταση ψηλαφώνται οι επιδιδυμίδες για έλεγχο τυχόν απουσίας τους ή ύπαρξης διογκώσεως ή ευαισθησίας και οι σπερματικοί τόνοι σε όρθια στάση για τη διαπίστωση πιθανής απουσίας των σπερματικών πόρων ή διόγκωσής τους. Η εξέταση ολοκληρώνεται με δοκιμασία Valsalva για την αποκάλυψη κιρσοκήλης εάν αυτή δεν είναι ήδη εμφανής επισκοπικά η ψηλαφητικά. 7. Δακτυλική εξέταση από το ορθό γιά έλεγχο του τόνου του σφιγκτήρα, εκτίμηση της αισθητικότητας του περινέου και διερεύνηση ύπαρξης διόγκωσης ή ευαισθησίας του προστάτη. 2.3.3. Έλεγχος του σπέρματος Κομβικό σημείο της παρακλινικής διερεύνησης του υπογόνιμου άνδρα αποτελεί ο έλεγχος του σπέρματος που περιλαμβάνει το σπερμοδιάγραμμα, το μικροβιολογικό, βιοχημικό και 60

ανοσολογικό έλεγχο και τις λειτουργικές δοκιμασίες. Το σπερμοδιάγραμμα διενεργείται τουλάχιστον δύο φορές υπό κατάλληλες προϋποθέσεις και συνθήκες (68). Το δείγμα σπέρματος λαμβάνεται συνήθως με αυνανισμό, σε ειδικό χώρο, στο εργαστήριο όπου θα εξεταστεί. Ο εξεταζόμενος μπορεί να το προσκομίσει από το σπίτι του σε χρονικό διάστημα μικρότερο των 45 λεπτών από τη λήψη και να παραμένει σε θερμοκρασία σώματος. Η χρήση κοινών προφυλακτικών δε συστήνεται, καθώς είναι πιθανόν να έχουν σπερματοκτόνες ουσίες. Υπάρχουν, ωστόσο, ειδικά προφυλακτικά χωρίς σπερματοκτόνο, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη λήψη του δείγματος. Οι εξεταζόμενοι πρέπει να απέχουν από εκσπερμάτιση κατά τις προηγούμενες 2-4 ημέρες, διάστημα το οποίο πρέπει να είναι το ίδιο σε κάθε επανάληψη της εξέτασης, ώστε τα αποτελέσματα να είναι συγκρίσιμα. Μετά την προσκόμισή του, το δείγμα επωάζεται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία 37 ο C και στη συνέχεια αξιολογείται. Η αξιολόγηση του σπερμοδιαγράμματος περιλαμβάνει την εξέταση μακροσκοπικών (όψη, οσμή, ρευστοποίηση, γλοιότητα, όγκος, ph) και μικροσκοπικών (αριθμός σπερματοζωαρίων, κινητικότητα σπερματοζωαρίων, μορφολογία σπερματοζωαρίων, βιωσιμότητα σπερματοζωαρίων, αριθμός και αναγνώριση των μορφών των στρογγυλών κυττάρων, παρουσία συγκολλήσεων και συσσωρεύσεων) παραμέτρων. Επειδή η εκτίμηση του σπερμοδιαγράμματος χαρακτηρίζεται από σημαντική υποκειμενικότητα (69) έχουν γίνει συστηματικές προσπάθειες για να περιορισθεί. Σε αυτή την προσπάθεια εντάσσεται και η έκδοση από τον WHO του εγχειριδίου για την εξέταση του σπέρματος και της αλληλεπίδρασης σπερματοζωαρίων τραχηλικής βλέννης το 1999 (68). Πρόσφατα, ο WHO πρότεινε αναθεώρηση των τιμών αναφοράς για τις παραμέτρους του σπερμοδιαγράμματος με βάση τα αποτελέσματα μεγάλης μελέτης που περιελάμβανε 1900 άνδρες των οποίων οι σύζυγοι έμειναν έγκυες σε χρονικό διάστημα <12 μηνών (70). Οι φυσιολογικές τιμές (αναφοράς) για τις σημαντικότερες παραμέτρους του σπερμοδιαγράμματος βάσει των προηγούμενων και των πρόσφατων οδηγιών του WHO φαίνονται στον Πίνακα 5. 61

Πίνακας 5. Τιμές αναφοράς σπερμοδιαγράμματος (68,70). Παράμετρος Τιμή αναφοράς (WHO 1999) Τιμή αναφοράς (WHO 2010) Όγκος σπέρματος > 2 ml > 1,5 ml Ρευστοποίηση Γλοιότητα Όψη Συγκέντρωση σπερματοζωαρίων Συνολικός αριθμός ανά εκσπερμάτιση Συνολική κινητικότητα πρώτης ώρας Προωθητική κινητικότητα πρώτης ώρας Φυσιολογικές μορφές σπερματοζωαρίων Βιωσιμότητα των σπερματοζωαρίων Λευκά αιμοσφαίρια < 60 min Νημάτια < 2 cm Γκριζωπή, μή διαφανής > 20 εκατομμύρια/ml > 15 εκατομμύρια/ml > 40 εκατομμύρια > 39 εκατομμύρια > 50% (ζωηρή + νωθρή) > 25% (ζωηρή) >40% >32% (ζωηρή + νωθρή) > 15% > 4% (μέθοδος Tyberberg) < 1 εκατομμύριο/ml > 58% ζωντανά σπερματοζωάρια Ο όγκος του σπέρματος είναι φυσιολογικά > 2 ml (> 1,5 ml με βάση τις πρόσφατες οδηγίες). Η ελάττωση του όγκου κάτω από τη τιμή αναφοράς ονομάζεται υποσπερμία, ενώ η πλήρης απουσία σπέρματος παρά τη φυσιολογική στύση και οργασμό αναφέρεται ως ασπερμία. Εφόσον αποκλειστεί η πιθανότητα απώλειας δείγματος κατά τη συλλογή, η ανεύρεση υποσπερμίας υποδηλώνει λοίμωξη των επικουρικών γεννητικών αδένων (ιδίως των σπερματοδόχων κύστεων), συγγενή αγενεσία των εκφορητικών οδών του σπέρματος (συνήθως όγκος < 0,5 ml), αμφοτερόπλευρη απόφραξη των εκσπερματιστικών πόρων, υπογοναδισμό ή παλίνδρομη εκσπερμάτιση (συνήθως ασπερμία) (1). Η ρευστοποίηση του σπέρματος παραγματοποιείται σε χρονικό διάστημα < 60 min ( συνήθως < 20 min). Παράταση του χρόνου ρευστοποίησης είναι συμβατή με δυσλειτουργία του προστάτη. Παθολογικό χρώμα του σπέρματος μπορεί να εμφανιστεί σε αιματοσπερμία (σκούρο καφέ), λήψη βιταμινών τύπου Β2 (κίτρινο) ή φαρμάκων. Το ph του πρόσφατου σπέρματος είναι ηπίως αλκαλικό (7,2-7,8). Όξινο ph (< 7) υποδηλώνει συγγενή αγενεσία ή απόφραξη των 62

εκφορητικών οδών του σπέρματος ενώ η αύξησή του (> 8) είναι συμβατή με οξεία φλεγμονή των επικουρικών γεννητικών αδένων (1). Η ορολογία των διαταραχών του αριθμού (ολιγοσπερμία, αζωοσπερμία), της κινητικότητας (ασθενοσπερμία), της μορφολογίας (τερατοσπερμία) ή του συνδυασμού των (ΟΤΑ) έχει ήδη αναφερθεί. Η κατώτερη τιμή αναφοράς για τη συγκέντρωση και το συνολικό αριθμό σπερματοζωαρίων είναι, βάσει των πρόσφατων προτάσεων του WHO, τα 15 εκατομμύρια/ml και 39 εκατομμύρια αντίστοιχα. Φαίνεται ότι ο συνολικός αριθμός των σπερματοζωαρίων ανά εκσπερμάτιση αποτελεί σημαντικότερη παράμετρο όσον αφορά τη γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος. Θα πρέπει να τονιστεί ότι άνδρες με συγκέντρωση σπερματοζωαρίων χαμηλότερη της τιμής αναφοράς μπορεί να είναι γόνιμοι και το αντίθετο. Μελέτες έδειξαν ότι για την επιτυχία της εξωσωματικής γονιμοποίησης (invitro fertilization, IVF) αρκούν τιμές συγκέντρωσης ίσες ή και μικρότερες των 10 εκατομμυρίων/ml (68,71,72). Η αζωοσπερμία, όπως έχει ήδη αναφερθεί, μπορεί να είναι παροδική ή μόνιμη οπότε και αποτελεί αντικείμενο διερεύνησης και αντιμετώπισης. Διακρίνεται στην αποφρακτική και τη μη αποφρακτική. Η πρώτη απαντάται σε περιπτώσεις συγγενούς αγενεσίας ή επίκτητης απόφραξης των εκφορητικών οδών του σπέρματος και η δεύτερη αντανακλά σοβαρού βαθμού διαταραχή της σπερματογένεσης. Στοιχεία από τον έλεγχο του σπέρματος που συνηγορούν υπέρ της αποφρακτικής της αιτιολογίας είναι η υποσπερμία, το χαμηλό ph και η ελάττωση ή απουσία της φρουκτόζης στο βιοχημικό έλεγχο. Η κρυπτοζωοσπερμία αναφέρεται στη περίπτωση που δεν ανευρίσκονται σπερματοζωάρια στη μικροσκοπική εξέταση του δείγματος αλλά εντοπίζονται μετά τη φυγοκέντρηση και εξέταση του ιζήματος, εύρημα με σημαντική προγνωστική και θεραπευτική αξία εφόσον μπορεί να εφαρμοσθεί μέθοδος ICSI. Η κινητικότητα των σπερματοζωαρίων ταξινομείται σε τέσσερις κατηγορίες: ζωηρή προωθητική (τύπος a), νωθρή προωθητική (τύπος b), μη προωθητική-επιτόπια (τύπος c) και απουσία κινητικότητας (τύπος d). Κλινική αξία έχει η εκτίμηση της προωθητικής αλλά και της συνολικής κινητικότητας κυρίως την πρώτη ώρα μετά την εκσπερμάτιση. Οι κατώτερες τιμές αναφοράς είναι το 32% για τα σπερματοζωάρια με ζωηρή και νωθρή (τύποι a+b) κινητικότητα και το 40% για το άθροισμα των συνολικά κινούμενων σπερματοζωαρίων 63

(τύποι a+b+c) (70). Εφόσον το ποσοστό ακίνητων σπερματοζωαρίων βρεθεί αυξημένο (>50-60%) τότε πρέπει να γίνει έλεγχος της βιωσιμότητας των σπερματοζωαρίων ώστε να διευκρινησθεί εάν η πλειονότητα των μη κινούμενων είναι ζωντανά ή νεκρά. Ο έλεγχος της βιωσιμότητας μπορεί να γίνει με χρώση εωσίνης-νιγροσίνης ή με τη δοκιμασία της υποωσμωτικής διόγκωσης (73). Η διάκριση μεταξύ ζωντανών - ακίνητων σπερματοζωαρίων και νεκρών είναι πολύ σημαντική γιατί επηρεάζει την απόφαση για το εάν και ποια μέθοδος υποβοηθούμενης αναπαραγωγής θα εφαρμοσθεί για την αντιμετώπιση της υπογονιμότητας (74). Η μορφολογία των σπερματοζωαρίων αξιολογείται βάσει αυστηρών κριτηρίων που περιλαμβάνουν την εκτίμηση του σχήματος της κεφαλής, του μήκους και του πλάτους των σπερματοζωαρίων, της επιφάνειας που καλύπτει το ακρόσωμα και των διαταραχών του αυχένα και της ουράς των σπερματοζωαρίων. Η επιλογή τους βασίστηκε στην προγνωστική τους αξία όσον αφορά τη πιθανότητα επίτευξης κύησης με IVF. To κατώτερο όριο αναφοράς για το ποσοστό φυσιολογικών μορφών σπερματοζωαρίων είναι το 4% (70,75). Συχνά υπάρχουν περισσότερες της μίας μορφολογικές ανωμαλίες ανά σπερματοζωάριο. Με βάση τον αριθμό των ανωμαλιών και τον αριθμό των ανώμαλων σπερματοζωαρίων υπολογίζεται ο δείκτης πολλαπλών ανωμαλιών τους (teratozoospermia index - TZI), o οποίος έχει συσχετισθεί με την γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος και το αποτέλεσμα της IVF (76). Στο σπερματικό υγρό είναι δυνατό να ανευρεθούν ερυθρά αιμοσφαίρια, τα οποία φυσιολογικά πρέπει να είναι πολύ λίγα, εκφυλισμένα επιθηλιακά κύτταρα, των οποίων η ύπαρξη δεν έχει κλινική σημασία και «στρογγυλά κύτταρα». Οι κυτταρικές αυτές μορφές μπορεί να είναι λευκοκύτταρα ή ανώριμα γεννητικά κύτταρα. Η διαφορική διάγνωση μεταξύ στρογγύλων κυττάρων της γεννητικής ή της λευκής σειράς μπορεί να γίνει μόνο με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (ακριβής μέθοδος) ή τη μέθοδο της υπεροξειδάσης (μέθοδος ρουτίνας) (73). Το ανώτερο όριο της τιμής αναφοράς για τη παρουσία λευκών αιμοσφαιρίων είναι το ένα εκατομμύριο/ml. H ανεύρεση μεγαλύτερου αριθμού υποδηλώνει την ύπαρξη λοίμωξης. Η έντονη παρουσία ανώριμων κυττάρων της γεννητικής σειράς είναι συμβατή με διαταραχές στη σπερματογένεση (74). 64

Η εκτίμηση του σπερμοδιαγράμματος περιλαμβάνει και τον έλεγχο για ύπαρξη συγκολλήσεων και συσσωρεύσεων των σπερματοζωαρίων. Οι συγκολλήσεις αποτελούνται μόνο από σπερματοζωάρια παγιδευμένα σε μάζες, χωρίς άλλα κύτταρα ή υπολείμματα. Η κύρια αιτία των συγκολλήσεων είναι η ύπαρξη αντισπερμικών αυτοαντισωμάτων. Όταν υπάρχουν και άλλα κύτταρα και υπολείμματα, τότε έχουμε συσσώρευση. Λίγες συγκολλήσεις ή συσσωρεύσεις είναι δυνατό να υπάρχουν σε σπέρμα φυσιολογικών ανδρών. Όταν όμως η παρουσία τους είναι αυξημένη, συστήνεται ανοσολογικός έλεγχος του σπέρματος (1). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα αποτελέσματα ενός σπερμοδιαγράμματος δεν μπορούν να οδηγήσουν σε σαφή διάκριση μεταξύ γόνιμων και υπογόνιμων ανδρών δεδομένου ότι υπάρχουν αλληλοεπικαλύψεις μεταξύ τους όσον αφορά τις τιμές και των τριών κυρίων παραμέτρων (αριθμός, κινητικότητα, μορφολογία). Αυτό που τεκμαίρεται από ένα σπερμοδιάγραμμα είναι πιθανές διαταραχές της λειτουργίας του γεννητικού συστήματος και, σε μικρότερο βαθμό, μία ασαφής κατηγοριοποίηση ασθενών σε άνδρες που έχουν περισσότερες ή λιγότερες πιθανότητες να επιτύχουν γονιμοποίηση. Οι υπόλοιπες εξειδικευμένες εξετάσεις του σπέρματος γίνονται εξατομικευμένα και εφόσον υπάρχουν οι κατάλληλες κλινικές ή εργαστηριακές ενδείξεις. Η καλλιέργεια του σπέρματος γίνεται για τον έλεγχο ύπαρξης αεροβίων ή αναεροβίων βακτηρίων, μυκοπλάσματος, χλαμυδίων και ουρεοπλάσματος. Συστήνεται όταν υπάρχουν κλινικά σημεία φλεγμονής ή λοίμωξης του γεννητικού συστήματος, αυξημένη παρουσία λευκών αιμοσφαιρίων στο σπερμοδιάγραμμα, αλκαλικό ph, αιμοσπερμία ή υποσπερμία. Η παρουσία μικροβίων μπορεί να επηρεάσει δυσμενώς κυρίως τη κινητικότητα (ταχεία πτώση της τη δεύτερη ώρα) και τη βιωσιμότητα των σπερματοζωαρίων και συνεπώς τη γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος (1). Ο βιοχημικός έλεγχος του σπερματικού υγρού διενεργείται για την εκτίμηση της λειτουργίας των επικουρικών γεννητικών αδένων. Η μέθοδος εκλογής για την εκτίμηση της λειτουργίας του προστάτη, των σπερματοδόχων κύστεων και των επιδιδυμίδων είναι η μέτρηση της όξινης φωσφατάσης, της φρουκτόζης και της ουδέτερης α-γλυκοσιδάσης αντίστοιχα. Οι 65

πληροφορίες των βιοχημικών εξετάσεων είναι απαραίτητες στις περιπτώσεις αζωοσπερμίας με πολύ μικρό όγκο σπέρματος. Στις περιπτώσεις αυτές η ανεύρεση μη ανιχνεύσιμης ή πολύ χαμηλών τιμών φρουκτόζης είναι ενδεικτική ύπαρξης συγγενούς αγενεσίας των εκφορητικών οδών ή αμφοτερόπλευρης πλήρους απόφραξης των εκσπερματιστικών πόρων αντίστοιχα (73). Ο ανοσολογικός έλεγχος του σπέρματος συστήνεται κυρίως όταν ανευρίσκονται συγκολλήσεις αν και ο WHO τον προτείνει ως εξέταση ρουτίνας. Σκοπός του είναι η ανίχνευση ύπαρξης αντισπερμικών αντισωμάτων (IgG ή IgA) με τη μέθοδο IBT (immunobed) ή τη δοκιμασία MAR (Mixed Antiglobulin Reaction). Kάθε θετικό αποτέλεσμα πρέπει να επιβεβαιώνεται με τη δοκιμασία αλληλεπίδρασης σπερματοζωαρίων τραχηλικής βλέννης. Η παρουσία των αντισωμάτων έχει συσχετισθεί με τη κινητικότητα των σπερματοζωαρίων, όχι όμως με το αποτέλεσμα της IVF (73). Εχει βρεθεί ότι τα αντισπερμικά αντισώματα προκαλούν συγκόλληση των σπερματοζωαρίων στη τραχηλική βλέννη και ελάττωση της ικανότητας τους για διείσδυση. Aνευρίσκονται συνήθως σε άνδρες μετά από διατομή ή απόφραξη των σπερματικών πόρων, σε λοίμωξη των επικουρικών αδένων και σε ασθενείς με ιστορικό ορχίτιδας, κρυψορχίας ή τραυματισμών των όρχεων (1). Οι λειτουργικές δοκιμασίες του σπέρματος είναι εξειδικευμένα διαγνωστικά εργαλεία της Εργαστηριακής Ανδρολογίας τα οποία δεν εφαρμόζονται ως ρουτίνα στη καθημερινή κλινική πράξη αλλά εξατομικευμένα και ιδιαίτερα σε περιπτώσεις ανδρικής υπογονιμότητας με φυσιολογικό ή σχεδόν φυσιολογικό σπερμοδιάγραμμα και απουσία άλλων εμφανών αιτίων. Οι δοκιμασίες αυτές ελέγχουν τους μοριακούς μηχανισμούς που είναι απαραίτητοι για τη γονιμοποίηση του ωαρίου και διερευνούν τη ποιότητα του γενετικού υλικού. Οι πλέον σημαντικές είναι οι εξής: η δοκιμασία αλληλεπίδρασης σπερματοζωαρίων και τραχηλικής βλέννης, η ακροσωμιακή αντίδραση, η δοκιμασία διείσδυσης του σπερματοζωαρίου σε ετερόλογο ωάριο, ο προσδιορισμός των ελεύθερων ριζών οξυγόνου, ο έλεγχος της ικανότητας του σπερματοζωαρίου να συνδεθεί με τη διαφανή ζώνη του ωαρίου, δοκιμασίες ελέγχου της συμπύκνωσης της χρωματίνης και της ωριμότητας του πυρήνα και η εκτίμηση του βαθμού κατάτμησης του DNA (DNA fragmentation) (74). 66

2.3.4. Bασικός ορμονικός έλεγχος Ο ορμονικός έλεγχος περιλαμβάνει τη μέτρηση μετά από πρωινή αιμοληψία των βασικών συγκεντρώσεων στο πλάσμα της FSH, LH, ολικής Τ και προλακτίνης. Η μέτρηση της συγκέντρωσης της FSH θεωρείται ο βασικότερος ορμονικός προσδιορισμός, ιδιαίτερα όταν στο σπερμοδιάγραμμα ανευρίσκεται βαρεία ΟΤΑ ή αζωοσπερμία. Η μεγάλη αξία της FSH αποδίδεται στην ισχυρή αρνητική συσχέτιση που εμφανίζει με την ιστολογία του σπερματικού επιθηλίου. Ο αριθμός των σπερματογονίων σε βιοψίες όρχεων και ο αριθμός των σπερματοζωαρίων στο σπέρμα εμφανίζουν σημαντικές αρνητικές συσχετίσεις με την FSH. Επίσης, ο συντελεστής διακυμάνσεως των τιμών της FSH πλάσματος λόγω της παραγωγής της κατά εκκριτικά επεισόδια δεν υπερβαίνει το 10% (1). Ο προσδιορισμός των επιπέδων της Τ γίνεται για τη διάγνωση πιθανού ή την επιβεβαίωση κλινικού υπογοναδισμού και συνδυάζεται πάντοτε με προσδιορισμό των επιπέδων της LH πλάσματος, ώστε να γίνεται παράλληλα εντόπιση του επιπέδου της βλάβης. Εάν τα επίπεδα της ολικής τεστοστερόνης είναι οριακά και υπάρχει έντονη κλινική υπόνοια υπογοναδισμού συστήνεται η μέτρηση της ελεύθερης Τ ή ο προσδιορισμός της βιοδιαθέσιμης Τ που υπολογίζεται λαμβάνοντας υπόψη τη συγκέντρωση της δεσμευτικής σφαιρίνης των ορμονών του φύλου (SHBG) και της αλβουμίνης. Χαμηλά επίπεδα Τ σε συνδυασμό με χαμηλά ή και αταίριαστα φυσιολογικά επίπεδα γοναδοτροπινών υποδηλώνουν υπογοναδοτροπικό υπογοναδισμό ενώ η παρουσία αυξημένων επιπέδων LH και FSH τεκμηριώνουν τη διάγνωση του πρωτοπαθούς υπογοναδισμού. Η ανεύρεση φυσιολογικών συγκεντρώσεων Τ και LH και αυξημένων τιμών FSH υποδηλώνει εκλεκτική ανεπάρκεια της σπερματικού επιθηλίου. Αυξημένα επίπεδα Τ και LH είναι ενδεικτικά ύπαρξης συνδρόμου αντίστασης στα ανδρογόνα (41). Tέλος, η ανεύρεση ελαττωμένης LH σε άνδρα με υπογονιμότητα, παθολογικό σπερμοδιάγραμμα και απουσία κλινικών σημείων υπογοναδισμού θέτει την υπόνοια χρήσης αναβολικών στεροειδών ή ανδρογόνων (74). Η μέτρηση των επιπέδων της προλακτίνης είναι απαραίτητη κυρίως σε περιπτώσεις μείωσης της libido, στυτικής δυσλειτουργίας και υπογονιμότητας λόγω υπογοναδοτροπικού υπογοναδισμού. Η μέτρηση των θυρεοειδικών ορμονών δεν αποτελεί μέρος του ορμονικού ελέγχου ρουτίνας στη διερεύνηση της υπογονιμότητας αλλά πρέπει να γίνεται όταν υπάρχουν κλινικές ενδείξεις ύπαρξης θυρεοειδικής δυσλειτουργίας, στα πλαίσια 67

διερεύνησης της υπερπρολακτιναιμίας και ελέγχου της υποφυσιακής λειτουργίας, εφόσον διαγνωσθεί υπογοναδοτροπικός υπογοναδισμός. Πολλοί ερευνητές έχουν συμπεριλάβει στην ορμονική διερεύνηση της ανδρικής υπογονιμότητας και τη μέτρηση της Ιnh-Β η οποία εκκρίνεται από τα κύτταρα Sertoli και αποτελεί άριστο δείκτη της λειτουργικής ακεραιότητας του συμπλέγματος κύτταρο Sertoliσπερματικό επιθήλιο. Φαίνεται ότι η ελάττωση των επιπέδων της Ιnh-B στον ορό μπορεί να είναι εξίσου ή πιο ευαίσθητος δείκτης της βλάβης του σπερματικού επιθηλίου συγκριτικά με την αύξηση της FSH, αρκεί η μέτρησή της να γίνεται με ευαίσθητη και ειδική μέθοδο. Μελέτες δείχνουν ότι η συγκέντρωση της Inh-B στον ορό είναι χαμηλότερη σε υπογόνιμους άνδρες σε σχέση με τους γόνιμους και παρουσιάζει ισχυρή αρνητική συσχέτιση με τα επίπεδα της FSH και θετική συσχέτιση με το μέγεθος των όρχεων, τον αριθμό των σπερματοζωαρίων και την ιστολογική εικόνα του σπερματικού επιθηλίου (15,77-80). 2.3.5. Απεικονιστικός έλεγχος Στη διαγνωστική προσέγγιση της ανδρικής υπογονιμότητας σημαντική θέση κατέχει η διενέργεια του υπερηχογραφήματος οσχέου. Στον υπερηχογραφικό έλεγχο αξιολογούνται κυρίως οι όρχεις και το όσχεο και λιγότερο οι επιδιδυμίδες. Η υπερηχογραφική εξέταση ξεκινά με τον υπολογισμό του μεγέθους των όρχεων. Σε περίπτωση που υπάρχει κρυψορχία, μπορεί να εντοπισθεί ο όρχις, εάν βρίσκεται εντός του βουβωνικού πόρου. Η μελέτη της υφής του αδένα μπορεί να αποκαλύψει ανομοιογένεια, που συνδέεται μερικές φορές με κακοήθεια. Άλλωστε, η συχνότητα κακοήθειας των όρχεων στους υπογόνιμους άνδρες είναι πολλαπλάσια αυτής που παρατηρείται στο γενικό πληθυσμό. Επίσης, αναδεικνύεται η ύπαρξη υδροκήλης, η οποία συνήθως είναι χωρίς κλινική σημασία. Η μικρολιθίαση των όρχεων ανευρίσκεται και αυτή με το υπερηχογράφημα και η σημασία της έγκειται στην πιθανή σύνδεσή της με μελλοντική ανάπτυξη καρκίνου στους όρχεις. Ιδιαίτερα σημαντική είναι η αξία του Doppler υπερηχογραφήματος στη διερεύνηση της κιρσοκήλης. Έτσι, εκτός από το μέγεθος των διατεταμένων σπερματικών φλεβών που μετράται με την απλή υπερηχογραφία, η Doppler υπερηχογραφία μας επιτρέπει να διακρίνουμε την παλίνδρομη ροή του αίματος εντός των σπερματικών φλεβών κατά τη 68

δοκιμασία Valsalva με μεγάλη διακριτική ικανότητα. Η απεικόνιση των σπερματικών πόρων, των σπερματοδόχων κύστεων και του προστάτη απαιτούν τη χρησιμοποίηση της διορθικής κεφαλής. Η κύρια ένδειξη διενέργειας διορθικού υπερηχογραφήματος στον υπογόνιμο άνδρα είναι η παρουσία αζωοσπερμίας σε συνδυασμό με υποσπερμία, όξινο ph, χαμηλά επίπεδα φρουκτόζης σπέρματος και κλινικώς ψηλαφητούς σπερματικούς πόρους. Στη περίπτωση αυτή συμβάλλει στη διάγνωση απόφραξης των εκσπερματιστικών πόρων ανιχνεύοντας τη προστενωτική διάταση των σπερματοδόχων κύστεων. Τέλος σε άνδρες που διαπιστώνεται η παρουσία υπερπρολακτιναιμίας ή υπογοναδοτροπικού υπογοναδισμού κρίνεται απαραίτητος ο απεικονιστικός έλεγχος της περιοχής υποθαλάμουυποφύσεως με μαγνητική τομογραφία. 2.3.6. Εξέταση ούρων για ύπαρξη σπερματοζωαρίων Η ανεύρεση σπερματοζωαρίων στο ίζημα των ούρων αμέσως μετά την εκσπερμάτιση είναι παθογνωμονική της παλίνδρομης εκσπερμάτισης. Η εξέταση αυτή συστήνεται σε υπογόνιμους άνδρες με ασπερμία ή αζωοσπερμία με πολύ χαμηλό όγκο σπέρματος, στους οποίους έχει αποκλειστεί η διάγνωση του υπογοναδισμού ή της συγγενούς αγενεσίας των εκφορητικών οδών και υπάρχουν ενδείξεις ύπαρξης παλίνδρομης εκσπερμάτισης από το ιστορικό όπως εγχειρήσεις στην ουροδόχο κύστη ή στον προστάτη, σακχαρώδης διαβήτης και νευρολογική νόσος. 2.3.7. Γενετικός έλεγχος Ο γενετικός έλεγχος συμβάλλει στην αιτιολογική διερεύνηση της ανδρικής υπογονιμότητας και δίνει σημαντικές πληροφορίες για τη γενετική καθοδήγηση του υπογόνιμου ζευγαριού. Δεν αποτελεί τμήμα των εξετάσεων ρουτίνας αλλά διενεργείται όταν υπάρχουν οι κατάλληλες ενδείξεις. Περιλαμβάνει τις ακόλουθες εξετάσεις: 1. Καρυότυπος. Έχει βρεθεί ότι 5-7% των υπογόνιμων ανδρών εμφανίζει χρωμοσωμικές ανωμαλίες, που αφορούν τόσο τα φυλετικά χρωμοσώματα (80% των περιπτώσεων) όσο και τα αυτοσωματικά (20%). Η εμφάνιση διαταραχών των αυτοσωματικών και φυλετικών χρωμοσωμάτων είναι 6 και 15 φορές αντίστοιχα 69

συχνότερη στους υπογόνιμους άνδρες συγκριτικά με το γενικό πληθυσμό (41). Η συχνότητα ανεύρεσης καρυοτυπικών ανωμαλιών είναι αντιστρόφως ανάλογη με τον αριθμό των σπερματοζωαρίων: 10-15% σε άνδρες με αζωοσπερμία, 5% σε ολιγοσπερμία και < 1% σε νορμοζωοσπερμικούς. To σύνδρομο Klinefelter (τρισωμία ΧΧΥ) είναι η πιο συχνή χρωμοσωμική διαταραχή που προκαλεί υπογονιμότητα στόν άνδρα (81). Οι ανωμαλίες αυτές μπορεί να μεταβιβασθούν στους απογόνους μετά από επιτυχή εφαρμογή της ΙCSI. Ως εκ τούτου η διενέργεια καρυοτύπου συστήνεται σε κάθε υπογόνιμο άνδρα με πολύ μικρό μέγεθος όρχεων, διαγνωσθέντα πρωτοπαθή υπογοναδισμό καθώς και σε όλους με μή αποφρακτική αζωοσπερμία ή βαρεία ΟΤΑ που πρόκειται να προσφύγουν σε IVF-ICSI (41). Eπίσης, καρυοτυπικός έλεγχος συστήνεται και στους δύο συντρόφους όταν υπάρχει ιστορικό καθέξιν αποβολών μετά από αυτόματη σύλληψη ή εφαρμογή μεθόδων υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, ιστορικό γέννησης νεκρού εμβρύου ή παιδιού με σοβαρές συγγενείς ανωμαλίες (37). 2. Έλεγχος μεταλλάξεων του γονιδίου της κυστικής ίνωσης (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator gene - CFTR). Eίναι γνωστό ότι υπάρχει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της συγγενούς αμφοτερόπλευρης αγενεσίας των σπερματικών πόρων (Congenital Bilateral Agenesis of Vasa Deferentia - CBAVD) και της ύπαρξης μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 7 (82). Όλοι οι άνδρες με κυστική ίνωση έχουν CBAVD και αντιστρόφως τα δύο τρίτα των ανδρών με CBAVD εμφανίζουν μεταλλάξεις του CFTR. Θα πρέπει να τονιστεί ότι στους άνδρες αυτούς, η μη ανεύρεση διαταραχών στο γονίδιο CFTR δεν σημαίνει ότι δεν υπάρχουν, αλλά ότι δεν μπορούν να εντοπιστούν με τη παρούσα εργαστηριακή μεθοδολογία. Eπίσης, αζωοσπερμικοί άνδρες με συγγενή απόφραξη των επιδιδυμίδων ή ετερόπλευρη αγενεσία του σπερματικού πόρου μπορεί να έχουν μεταλλάξεις του γονιδίου αυτού. Επομένως, σε όλους τους υπογόνιμους άνδρες με αζωοσπερμία και αψηλάφητο τον ένα τουλάχιστον σπερματικό πόρο, ή αζωοσπερμία και ενδείξεις φυσιολογικής σπερματογένεσης (αποφρακτική αζωοσπερμία), πρέπει να συστήνεται η διενέργεια γενετικού ελέγχου γαι την εντόπιση μεταλλάξεων του CFTR. Eπίσης, όταν ο άνδρας έχει CBAVD ή 70

διαπιστωμένες μεταλλάξεις του CFTR και πρόκειται να εφαρμοσθεί IVF/ICSI, πρέπει να γίνεται ο ανάλογος έλεγχος και στη σύντροφό του, επειδή υπάρχει η πιθανότητα να είναι φορέας της κυστικής ίνωσης, ώστε να προσφέρεται η ανάλογη γενετική καθοδήγηση (83). 3. Έλεγχος για Υq-μικροελλείψεις. Ο ρόλος και η συχνότητα της εμφάνισης των Υq μικροελλείψεων στους υπογόνιμους άνδρες, ιδιαίτερα σε αυτούς με υποτιθέμενη ιδιοπαθή υπογονιμότητα, έχει ήδη αναφερθεί. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η γενετική αυτή διαταραχή μεταβιβάζεται στον άρρενα απόγονο μετά από επιτυχή εφαρμογή IVF ή ICSI και μπορεί να υποθηκεύσει το αναπαραγωγικό του μέλλον. Eπίσης, η ακριβής γενετική διάγνωση έχει σημασία, επειδή η μέθοδος ICSI με ενδοορχικά σπερματοζωάρια από βιοψία (Τesticular Sperm Extraction - TESE) δεν θα μπορεί να εφαρμοσθεί σε άνδρες με πλήρη έλλειψη της περιοχής AZFa ή AZFb που σχετίζεται με πλήρες σύνδρομο SCOS ή πλήρη διακοπή της σπερματογένεσης (74). Ως εκ τούτου πρέπει να γίνεται έλεγχος για τον εντοπισμό των μικροελλείψεων με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) σε όλους τους άνδρες με ιδιοπαθή μη αποφρακτική αζωοσπερμία ή σοβαρού βαθμού ολιγοσπερμία (< 5 εκατομμύρια/ ml) πριν την εφαρμογή μεθόδων υποβοηθούμενης αναπαραγωγής και να γίνεται στο ζευγάρι η ανάλογη γενετική συμβουλευτική και καθοδήγηση (84). 4. Έλεγχος μεταλλάξεων του γονιδίου CREM. O έλεγχος αυτός γίνεται σε εξειδικευμένα εργαστήρια, δεν αποτελεί εξέταση ρουτίνας και μπορεί να προταθεί σε υπογόνιμους άνδρες στους οποίους ιστολογικά διαπιστώνεται μετα-μειωτική διακοπή της σπερματογένεσης (41). 5. Έλεγχος γενετικών νοσημάτων που σχετίζονται με υπογονιμότητα. Γενετικός έλεγχος συστήνεται σε υπογόνιμους άνδρες που το ιστορικό, τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα συνηγορούν για ύπαρξη γενετικού νοσήματος, όπως είναι ο ιδιοπαθής υπογοναδοτροπικός υπογοναδισμός με (σ. Κallman) ή χωρίς ανοσμία (μεταλλάξεις των γονιδίων KAL-1 (ανοσμίνη), FGFR-1, GPR54, υποδοχέα GnRH, 71

GnRH-1, DAX-1 κ.λ.π), η ιδιοπαθής αιμοχρωμάτωση, οι αιμοσφαιρινοπάθειες (μεσογειακή και δρεπανοκυτταρική αναιμία) και η μυοτονική δυστροφία (μετάλλαξη του γονιδίου DMPK). Στις περιπτώσεις που επιβεβαιωθεί η γενετική διαταραχή, χρειάζεται να γίνει στο ζευγάρι η ανάλογη γενετική συμβουλευτική (41). 2.3.8. Ιστολογικός - κυτταρολογικός έλεγχος των όρχεων Η μελέτη του ορχικού ιστού μπορεί να επιτευχθεί με δύο είδη βιοψιών: την ανοικτή και τη διαδερμική. Η τελευταία, με τη σειρά της διαιρείται σε βιοψία με βελόνη μεγάλου διαμετρήματος (G 14-19) και βιοψία με βελόνη μικρού διαμετρήματος (G 21-23). Η βιοψία με βελόνη μεγάλου διαμετρήματος έχει πρακτικά εγκαταλειφθεί σήμερα, ενώ η διαδερμική βιοψία με βελόνη μικρού διαμετρήματος έχει καθιερωθεί ως αναρροφητική βιοψία με λεπτή βελόνη (Fine needle aspiration - FNA). Πληθώρα μελετών από το 1965 έως σήμερα δείχνουν ότι η FNA είναι απλή στην εφαρμογή της, αξιόπιστη, ελάχιστα τραυματική και εμφανίζει σπάνιες επιπλοκές. Πολλές μελέτες έχουν συγκρίνει την FNA με την ανοικτή βιοψία και διαπίστωσαν ότι υπάρχει συμφωνία στα αποτελέσματα τους σε ποσοστό 84-97% (85,86). Τα μεινεκτήματα της FNA είναι η δυσκολία στην αξιολόγηση των ευρημάτων και το γεγονός ότι εκτιμά μόνο το σπερματικό επιθήλιο και όχι τη συνολική ιστική δομή του ορχικού παρεγχύματος. Ωστόσο η μεγάλη ώθηση δόθηκε με την εισαγωγή της μεθόδου ICSI, η οποία άλλαξε ριζικά τη θεραπευτική αντιμετώπιση της ανδρικής υπογονιμότητας. H μέθοδος αυτή καθιστούσε ιδιαίτερα σημαντικά ορισμένα χαρακτηριστικά της FNA, όπως ο περιορισμένος τραυματισμός του όρχεως σε σχέση με την ανοιχτή βιοψία, η λήψη του ελάχιστου δυνατού υλικού και η δυνατότητα πολλαπλών παρακεντήσεων για εντοπισμό των σπερματοζωαρίων στον όρχι (87). Το υλικό από τη βιοψία μπορεί να μονιμοποιηθεί άμεσα. Συνήθως χρησιμοποιούνται οι χρώσεις κατά May Grünwald Giemsa και Παπανικολάου. Έως πρόσφατα, στην FNA όρχεων χρησιμοποιούνταν σχεδόν αποκλειστικά η συμβατική μέθοδος (Conventional Smear CS) επίστρωσης των παρασκευασμάτων. Τα τελευταία όμως έτη εισήχθη και άρχισε να χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο η κυτταρολογική μέθοδος υγρής φάσης [μέθοδος Thin Prep (ThinPrep Smear - TS)]. Το κύριο πλεονέκτημα της TS είναι η βελτιωμένη ποιότητα 72

του παρασκευάσματος και ειδικότερα η ομοιόμορφη κατανομή των κυττάρων και η μειωμένη εμφάνιση ερυθρών αιμοσφαιρίων που αποκρύπτουν το οπτικό πεδίο. Η αξιολόγηση του κυτταρολογικού υλικού γίνεται είτε με την πλέον κλασική μέθοδο κατά Foresta (88) είτε με τη νεότερη μέθοδο κατά Meng (89). Η κυτταρολογική διάγνωση γίνεται με βάση τον τύπο των κυττάρων που επικρατεί, ως εξής: 1. Φυσιολογική σπερματογένεση, όπου ανευρίσκονται κύτταρα από όλα τα στάδια της σπερματογένεσης. 2. Υποσπερματογένεση, όπου αν και ανευρίσκονται κύτταρα από όλα τα στάδια της σπερματογένεσης, ο αριθμός τους είναι σημαντικά μειωμένος. Σημειώνεται ότι σε περιπτώσεις υποσπερματογένεσης ανευρίσκονται σπερματοζωάρια μέσα στα σπερματικά σωληνάρια. 3. Διακοπή της σπερματογένεσης, όπου παρατηρείται αναστολή της διαδικασίας ωρίμανσης του σπερματικού επιθηλίου σε συγκεκριμένο στάδιο. Στο ιστολογικό παρασκεύασμα δεν ανευρίσκονται σπερματοζωάρια και συνήθως ούτε σπερματίδες, διότι η διακοπή εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στο στάδιο των σπερματοκυττάρων πρώτης τάξεως. 4. Απλασία του σπερματικού επιθηλίου (SCOS), όπου ανευρίσκονται μόνον κύτταρα Sertoli και Leydig, ενώ τα κύτταρα της γεννητικής σειράς απουσιάζουν παντελώς. Η μέθοδος Foresta αναγνωρίζει τις εξής ιστολογικές εικόνες: φυσιολογική σπερματογένεση, υποσπερματογένεση, διακοπή της σπερματογένεσης, απλασία του σπερματικού επιθηλίου (SCOS) και εικόνα στάσης. Η διακοπή της σπερματογένεσης διακρίνεται σε πρώιμη, που μπορεί να είναι πλήρης ή ατελής και σε όψιμη, που μπορεί επίσης να είναι πλήρης ή ατελής. Η μέθοδος κατά Meng αναγνωρίζει επίσης τις ίδιες ιστολογικές εικόνες με την κατά Foresta με τη διαφορά ότι, δεν περιλαμβάνει την εικόνα στάσης και η διακοπή της σπερματογένεσης διακρίνεται σε πρώιμη που είναι πάντοτε πλήρης και σε όψιμη που είναι πάντοτε ατελής (89). Οι κύριες κλινικές ενδείξεις διενέργειας βιοψίας των όρχεων (ανοικτής ή FNA) είναι οι εξής: 73

1. Διαφορική διάγνωση μεταξύ αποφρακτικής και μη αποφρακτικής αζωοσπερμίας, ιδιαίτερα σε άνδρες με φυσιολογικό ή οριακό μέγεθος όρχεων, ψηλαφητούς σπερματικούς πόρους και φυσιολογικά επίπεδα FSH στον ορό (83). Αποτελεί τη κύρια διαγνωστική ένδειξη της FNA. Στην αποφρακτική μορφή ανευρίσκεται ιστολογική/κυτταρολογική εικόνα φυσιολογικής σπερματογένεσης ή ήπιας υποσπερματογένεσης με εικόνα στάσης, ενώ στην μή αποφρακτική αζωοσπερμία, είτε είναι ιδιοπαθής, είτε οφείλεται σε κρυψορχία, χρωμοσωμικές / γονιδιακές διαταραχές, ορχίτιδα, ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία, η αντίστοιχη εικόνα ποικίλει από βαρεία υποσπερματογένεση και διακοπή της σπερματογένεσης έως SCOS. Επίσης χρησιμοποιείται σε άνδρες με συνύπαρξη απόφραξης και κιρσοκήλης για να βοηθήσει στην επιλογή της κατάλληλης θεραπευτικής παρέμβασης. Στις περιπτώσεις αυτές η ανεύρεση ιστολογικά φυσιολογικής εικόνας σπερματογένεσης τεκμηριώνει την απόφραξη ως την αιτία υπογονιμότητας και ο άνδρας αντιμετωπίζεται αναλόγως, ενώ η διαπίστωση υποσπερματογένεσης ή διακοπής της σπερματογένεσης υποδεικνύει βλαπτική επίδραση της κιρσοκήλης και θέτει την ένδειξη για τη χειρουργική της διόρθωση. Τέλος, στην περίπτωση της συνύπαρξης μή αποφρακτικής αζωοσπερμίας και κιρσοκήλης, η ανεύρεση με τη βιοψία εικόνας SCOS θέτει τη διάγνωση της πρωτοπαθούς ορχικής βλάβης και αποκλείει τη χειρουργική διόρθωση της κιρσοκήλης ως θεραπευτική επιλογή, ενώ αν η ιστολογική εικόνα είναι αυτή της διακοπής της σπερματογένεσης τότε πιθανολογείται επίδραση της κιρσοκήλης (1). 2. Ανεύρεση και λήψη σπερματοζωαρίων σε περιπτώσεις αζωοσπερμίας (αποφρακτικής ή μη) για τη χρησιμοποίησή τους στη μέθοδο ΙCSI (θεραπευτική βιοψία). Επίσης, σε άνδρες με αδυναμία εκσπερμάτισης, ο συνδυασμός FNA των όρχεων και ICSI αποτελεί εναλλακτική θεραπευτική επιλογή αντί της εκσπερμάτισης με ηλεκτρική διέγερση. Στους άνδρες με μή αποφρακτική αζωοσπερμία, ακόμα και όταν υπάρχει ιστολογική εικόνα SCOS ή διακοπής της σπερματογένεσης υπάρχει πιθανότητα ανεύρεσης περιοχών με σπερματογένεση (90). Η διαγνωστική FNA στους άνδρες αυτούς έχει υψηλή 74

θετική (70%) και αρνητική (90%) προγνωστική αξία όσον αφορά την ανεύρεση και λήψη σπερματοζωαρίων στην επακολουθούσα ανοικτή βιοψία των όρχεων (TESE) που αποτελεί βασικό στάδιο της μεθόδου ICSI. H πιθανότητα ανεύρεσης σπερματοζωαρίων σε αυτή την ομάδα ανδρών εξαρτάται από τη βαρύτητα της ιστολογικής διάγνωσης και είναι 16-33% (90,91). Σε άνδρες με αποφρακτική αζωοσπερμία ή αδυναμία εκσπερμάτισης το ποσοστό ανεύρεσης σπερματοζωαρίων αγγίζει το 100%. Στις περιπτώσεις αυτές προτείνεται να γίνεται λήψη σπερματοζωαρίων από τις επιδιδυμίδες-εάν είναι εφικτόδιαδερμικά με τη μέθοδο PESA (Percutaneous Epidydimal Sperm Aspiration) ή χειρουργικά με τη μέθοδο MESA (Microsurgical Epidydimal Sperm Aspiration). 3. Διερεύνηση ύπαρξης νεοπλασίας στον όρχι όταν υπάρχει απεικονιστικά ύποπτο μόρφωμα ή μικρολιθίαση. Στις περιπτώσεις αυτές συστήνεται η διενέργεια ανοικτής βιοψίας γιατί δίνει καλύτερη ιστολογική εικόνα και αποτυπώνει συγχρόνως την αρχιτεκτονική του διάμεσου ιστού. Βέβαια πολλοί ερευνητές συμφωνούν ότι και η FNA μπορεί κυτταρολογικά να θέσει την υπόνοια ή τη διάγνωση της ενδοσωληναριακής (in-situ) νεοπλασίας των κυττάρων της γεννητικής σειράς Συμπερασματικά, θα πρέπει να τονιστεί ότι παρά τις σημαντικές εξελίξεις στη διαγνωστική διερεύνηση του υπογόνιμου άνδρα, σε ένα σημαντικό ποσοστό αυτών η αιτιολογία του ελαττωμένου δυναμικού γονιμότητας παραμένει αδιευκρίνιστη. Αυτό έχει ωθήσει το ερευνητικό ενδιαφέρον της Ανδρολογίας στην προσπάθεια αποκρυπτογράφησης των γονιδίων που ελέγχουν τη σπερματογένεση και αποσαφήνισης της φυσιολογίας και παθοφυσιολογίας των αυτοκρινικών και παρακρινικών ρυθμιστών που δρουν στο ορχικό μικροπεριβάλλον. Το κύτταρο Sertoli, λόγω της κομβικής του θέσης στη διαδικασία της σπερματογένεσης, αποτελεί το επίκεντρο του ερευνητικού ενδιαφέροντος. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα αυτά παρέχουν δομική στήριξη στο σπερματικό επιθήλιο, δημιουργούν το κατάλληλο μικροπεριβάλλον με τον αιματο-ορχικό φραγμό, υποστηρίζουν μεταβολικά τα ωριμάζοντα γεννητικά κύτταρα, φαγοκυτταρώνουν τα αποπτωτικά κύτταρα, δέχονται τα 75

ορμονικά μηνύματα από την υπόφυση, μεταβολίζουν στεροειδείς ορμόνες και εκκρίνουν πληθώρα ουσιών με αυτοκρινική, παρακρινική και ενδοκρινική δράση. Επομένως, είναι φανερό ότι η διερεύνηση του ρόλου των εκκριτικών προιόντων του κυττάρου Sertoli στην ανδρική υπογονιμότητα, όπως είναι η ανασταλτίνη και η ανασταλτική ορμόνη των πόρων του Müller, παρουσιάζει ιδιαίτερο ερευνητικό και κλινικό ενδιαφέρον. 76

3. Ανασταλτική ορμόνη των πόρων του Müller 3.1. Εισαγωγή - Ιστορική αναδρομή Η ανασταλτική ορμόνη των πόρων του Müller (Antimüllerian Hormone [AMH] ή Müllerian Inhibiting Substance [MIS]) είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που ανήκει στην ευρύτερη οικογένεια του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης-β (Transforming Growth Factor-β / ΤGF-β) μαζί με την ακτιβίνη, την ανασταλτίνη, τις οστικές μορφογενετικές πρωτεΐνες (Bone Morphogenetic Proteins / ΒΜΡs) καθώς και άλλους αυξητικούς παράγοντες (92) (Σχήμα 5). Η ΑΜΗ αποτελεί ένα από τα πρωιμότερα ορμονικά προϊόντα των εμβρυικών κυττάρων Sertoli και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση του φύλου του άρρενος εμβρύου. Η ύπαρξή της πιθανολογήθηκε με τα πρωτοποριακά πειράματα του Γάλλου ερευνητή Alfred Jost στη δεκαετία του 1940. Ο Jost παρατήρησε ότι μία ουσία ορχικής προέλευσης, διαφορετική από την Τ, την οποία ονόμασε «l hormone inhibitrice» ήταν υπεύθυνη για την υποστροφή των πόρων του Müller σε θηλυκά έμβρυα κουνελιών (93). To 1969, η Régine Picon, μέλος της αρχικής ομάδας του Jost, ανέπτυξε μία βιολογική μέθοδο ανίχνευσης της ΑΜΗ χρησιμοποιώντας αδιαφοροποίητες ουρογεννητικές πτυχές από έμβρυα αρουραίων (94). Η μακρομοριακή φύση της ορμόνης καθώς και η σύνθεση και έκκριση της από τα εμβρυικά κύτταρα Sertoli αποδείχθηκε από μία άλλη μαθήτρια του Jost, τη Nathalie Josso (95), ενώ πέντε χρόνια αργότερα προέκυψαν οι πρώτες ενδείξεις της γλυκοπρωτεϊνικής διμερούς δομής της (96). Aκολούθησε η εντόπιση της ΑΜΗ στα κύτταρα της κοκκώδους στιβάδας των μετεμβρυικών ωοθηκών (97) και η απομόνωσή της από ορχικό ιστό σε καθαρή μορφή με ανοσοχρωματογραφία (98). 77

Σχήμα 5. Η οικογένεια του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης-β. Μεγάλη ώθηση στην έρευνα σχετικά με τη φυσιολογία της ΑΜΗ αλλά και τις μεταβολές της σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις έδωσαν η ανάπτυξη των μονοκλωνικών και πολυκλωνικών αντισωμάτων (99,100), η απομόνωση του γονιδίου της ΑΜΗ στον άνθρωπο και τα βοοειδή (101), καθώς και η αποκάλυψη του μηχανισμού δράσης της ορμόνης με την εντόπιση του ειδικού υποδοχέα της (ΑΜΗR2) (102,103). Καρπός της εντατικής έρευνας των 78

τελευταίων ετών ήταν η διεύρυνση των βιολογικών δράσεων της ΑΜΗ και η χρήση της στη κλινική πράξη τόσο ως διαγνωστικού εργαλείου στη μελέτη παθολογικών καταστάσεων του αναπαραγωγικού συστήματος, όσο και ως δυνητικά θεραπευτικού παράγοντα (104). 3.2. Η πρωτεΐνη και το γονίδιο της ΑΜΗ Η ΑΜΗ είναι γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος (ΜΒ) 140 kda και αποτελείται από δύο όμοιες υπομονάδες (ΜΒ: 70 kda) συνδεδεμένες μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς (96, 98). H κάθε υπομονάδα συντίθεται ως μια πρόδρομη μορφή (pre-pro-amh) με 560 αμινοξέα (Σχήμα 6). To ώριμο πεπτιδικό μονομερές της ΑΜΗ περιλαμβάνει 535 αμινοξέα. H καρβοξυτελική περιοχή του μορίου της ΑΜΗ εμφανίζει σημαντικές ομοιότητες με την ανάλογη περιοχή άλλων μελών της οικογένειας του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης τύπου β (TGF-β). Αν και το πλήρες μόριο της ορμόνης (ομοδιμερές) είναι ενεργό in-vitro, η πρωτεόλυσή του σε θέση που απέχει 109 αμινοξέα από το καρβοξυτελικό άκρο παράγει ένα αδρανές αμινοτελικό ομοδιμερές 110 kda και ένα καρβοξυτελικό τμήμα, μεγέθους 25 ΚDa που είναι το βιολογικά δραστικό (105) (Σχήμα 7). To ενεργό καρβοξυτελικό ομοδιμερές αποτελείται από δύο όμοια πεπτιδικά μονομερή, καθένα απο τα οποία περιλαμβάνει 109 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος 12,5 kda. To αμινοτελικό τμήμα, το οποίο αποτελείται από δύο όμοιες πεπτιδικές αλυσίδες (57 kda) μήκους 426 αμινοξέων, είναι εκείνο που υφίσταται τη γλυκοζυλίωση, προσφέρει σταθερότητα στο μόριο της ΑΜΗ και χαρακτηριστικά επάγει τη δραστικότητα του καρβοξυτελικού μέρους (106). Αν και εργαστηριακά η διάσπαση της ΑΜΗ επιτυγχάνεται με τη χρήση πλασμίνης (105, 106), υπάρχουν ενδείξεις από έρευνες σε πειραματόζωα ότι η πρωτεόλυση της ορμόνης in vivo γίνεται ενδοορχικά από τη PC5 (proprotein convertase 5) και τη furin, δύο ένζυμα της οικογένειας των προπρωτεϊνικών κονβερτασών (107). 79

Σχήμα 6. (Α) Το γονίδιο της ΑΜΗ και η περιοχή του επαγωγέα του. (Β) Το πεπτιδικό μονομερές της ΑΜΗ και η θέση πρωτεόλυσής του (108). Σχήμα 7. Δομή και μεταβολές του μορίου της ΑΜΗ (109). 80

Αν και η ΑΜΗ αποτελεί έναν από τους βασικούς παράγοντες διαφοροποίησης του φύλου του άρρενος, το γονίδιό της εντοπίστηκε σε αυτοσωματικό και όχι σε φυλετικό χρωμόσωμα και συγκεκριμένα στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 19 (επίτοπος 19p13.3) (110). Το γονίδιο της ΑΜΗ, το οποίο έχει μέγεθος 2,75 kbp και αποτελείται από πέντε εξόνια (Σχήμα 6), εντοπίσθηκε επίσης και σε άλλα είδη όπως τα βοοειδή, ο ποντικός, ο αρουραίος, o χoίρος και ο αλιγάτορας (108). Έρευνες έδειξαν ότι η περιοχή του επαγωγέα του γονιδίου της ΑΜΗ (σχήμα 6) περιέχει ένα λειτουργικό στοιχείο έναρξης της μεταγραφής (functional initiator element, Inr) που αναγνωρίζεται από τον παράγοντα TFII-I και θέσεις σύνδεσης του Sp1, των μεταγραφικών παραγόντων GATA και SF-1, των πρωτεινών SOX/SRY και πιθανά των οιστρογόνων (111-114). Πρόσφατα διαπιστώθηκε ότι στη περιοχή του επαγωγέα του γονιδίου της ΑΜΗ υπάρχει θέση σύνδεσης για τον υποδοχέα της βιταμίνης D, η οποία είναι λειτουργική σε καλλιέργειες προστατικών κυττάρων (115,116). 3.3. Σύνθεση και έκκριση της ΑΜΗ από τους όρχεις H AMH συντίθεται και εκκρίνεται αποκλειστικά από τα κύτταρα Sertoli των σπερματικών σωληναρίων και θεωρείται ο πρωιμότερος ορμονικός δείκτης λειτουργίας τους κατά την εμβρυογένεση (117). Η έναρξη της διαφοροποίησης της αρχέγονης γονάδας σε εμβρυικό όρχι πυροδοτεί τη σύνθεση της ΑΜΗ από τα διαφοροποιούμενα κύτταρα Sertoli, η οποία συμπίπτει με την μειορύθμιση (down regulation) της έκφρασης της κερατίνης 19 και της λαμινίνης α-5 (108). Aνοσοϊστοχημικές μελέτες έδειξαν ότι η ΑΜΗ εντοπίζεται αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων Sertoli και ειδικά στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο και στη συσκευή Golgi. Η έκκρισή της από τους εμβρυικούς όρχεις ξεκινά την έκτη εβδομάδα της κύησης (όγδοη εβδομάδα αμηνόρροιας) και προκαλεί μη αναστρέψιμη υποστροφή του σύστοιχου πόρου του Müller που ολοκληρώνεται στο τέλος της ένατης εβδομάδος (118). Οι πόροι του Müller παύουν να είναι ευαίσθητοι στη δράση της ΑΜΗ μετά το διάστημα αυτό. Η έκκριση της ΑΜΗ συνεχίζεται σε υψηλά επίπεδα μετά την ολοκλήρωση της υποστροφής των πόρων του Müller μέχρι τη γέννηση (Σχήμα 8). Μετά τη γέννηση παρατηρείται μία παροδική ελάττωση κατά τη περιγεννητική περίοδο (τέλος της κύησης έως και το τέλος της 81

πρώτης νεογνικής εβδομάδας) (119) για να ακολουθήσει μία εκκριτική αιχμή κατά τη διάρκεια του τρίτου μήνα της νεογνικής ζωής ( μικρή εφηβεία ) όπως έδειξε πρόσφατη μεγάλη μελέτη σε υγιείς εθελοντές από τη Δανία (120). Από το τρίτο μήνα έως τη συμπλήρωση του πρώτου έτους της νεογνικής ηλικίας παρατηρείται ελάττωση της έκκρισης της ΑΜΗ, η οποία στη συνέχεια, κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας, παραμένει σε αυξημένα και σταθερά επίπεδα έως την έναρξη της εφηβείας, οπότε η ωρίμανση των κυττάρων Sertoli συνοδεύεται από δύο χαρακτηριστικές αλλαγές στην εκκριτική δυναμική της ΑΜΗ: 1. Λόγω της ανάπτυξης του αιματο-ορχικού φραγμού η έκκριση της ΑΜΗ γίνεται κυρίως από το κορυφαίο τμήμα των κυττάρων προς τον αυλό των σπερματικών σωληναρίων και όχι προς το διάμεσο ιστό, με αποτέλεσμα μετά την εφηβεία τα επίπεδα της ορμόνης στο σπερματικό πλάσμα να είναι υψηλότερα από εκείνα του αίματος (Σχήμα 9) Ενδιαφέρον και ανεξήγητο είναι το γεγονός ότι η αλλαγή του προσανατολισμού έκκρισης της ΑΜΗ συμβαίνει παράλληλα με την επανεμφάνιση της λαμινίνης α-5 στη βασική μεμβράνη των σπερματικών σωληναρίων (121-124). 2. Παρατηρείται μεγάλη ελάττωση της έκκρισης της ορμόνης η οποία παραμένει σε χαμηλά και σχετικά σταθερά επίπεδα καθ όλη τη διάρκεια της ενηλίκου ζωής του άνδρα (99,100,120,125). Η συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό των ενηλίκων ανδρών μειώνεται στο 3-4% της αντίστοιχης συγκέντρωσης της ορμόνης στη νεογνική ηλικία. To φαινόμενο αυτό αποτελεί τη βάση για τη χρήση των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ στο πλάσμα ή του βαθμού ανοσοϊστοχημικής της έκφρασης ως δείκτη ωριμότητας των κυττάρων Sertoli (108). Η νυχθημερινή διακύμανση της έκκρισης της ΑΜΗ από τα κύτταρα Sertoli σε υγιείς άνδρες φαίνεται να είναι ελάχιστη (διάμεσος συντελεστής διακύμανσης: 5,3%, εύρος τιμών: 3,6-6,5%) (120). 82

Σχήμα 8. Η αντίστροφη σχέση που υπάρχει μεταξύ της ΑΜΗ και της ολικής Τ στη συστηματική κυκλοφορία μετά τη νεογνική περίοδο (104). Σχήμα 9. Αλλαγή του προσανατολισμού έκκρισης της ΑΜΗ από τα κύτταρα Sertoli μετά την εφηβεία (108). 83

3.4. Ρύθμιση της έκκρισης της ΑΜΗ Ο φυλετικός διμορφισμός και ο χρονικός περιορισμός της δράσης της ΑΜΗ που απαιτούνται για τη φυσιολογική διαφοροποίηση του άρρενος εμβρύου επιβάλλουν την αυστηρή ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της. Κατά την εμβρυική περίοδο, η μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της ΑΜΗ επάγεται από τους μεταγραφικούς παραγόντες SOX9 (SRY-box protein-9), SF-1 (Steroidogenic Factor-1), WT-1 (Wilms Τumor suppressor gene 1) και GATA-4 και αναστέλλεται απο τους DAX-1, FOG-1 και FOG-2 (126). Διάφορες μελέτες έδειξαν ότι ο πιο σημαντικός παράγοντας για την έναρξη της έκφρασης της ΑΜΗ από τα αρχέγονα κύτταρα Sertoli είναι ο SOX-9 (112,127). Οι κύριοι παράγοντες που επηρεάζουν τη σύνθεση και έκκριση της ΑΜΗ από τα κύτταρα Sertoli- ιδιαίτερα μετά τη γέννηση- είναι η Τ, η FSH και τα γεννητικά κύτταρα και ειδικότερα τα σπερματοκύτταρα που έχουν εισέλθει στη πρόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης. 3.4.1. Ο ρόλος της Τεστοστερόνης Η μείωση της ΑΜΗ στην εφηβεία σχετίζεται κυρίως με το στάδιο κατά Tanner παρά με την ηλικία του αγοριού. Έτσι η μεγαλύτερη ελάττωση συμβαίνει μεταξύ των σταδίων ΙΙ και ΙΙΙ κατά Tanner συμβαδίζοντας χρονικά με την αύξηση της ενδοορχικής συγκέντρωσης Τ η οποία προηγείται της αύξησής της στη συστηματική κυκλοφορία (Σχήμα 10) (128). Η σημασία της ενδοορχικής συγκέντρωσης Τ στη καταστολή της ΑΜΗ φαίνεται και από μελέτες που δείχνουν ότι σε ασθενείς με συγγενή υπογοναδοτροπικό υπογοναδισμό η θεραπεία με χοριακή γοναδοτροπίνη (hcg)-η οποία προκαλεί αύξηση στα ενδοορχικά επίπεδα της Τ- σχετίζεται με μεγαλύτερη ελάττωση των επιπέδων ΑΜΗ στον ορό συγκριτικά με τη χορήγηση εξωγενώς Τ η οποία συνεπάγεται την αύξηση των ανδρογόνων στη συστηματική κυκλοφορία και λιγότερο ενδοορχικά (129). Τα δεδομένα αυτά σε συνδυασμό με την αρνητική συσχέτιση που υπάρχει μετά τη νεογνική περίοδο μεταξύ των επιπέδων ΑΜΗ και Τ στο αίμα υποδηλώνουν τον πρωτεύοντα ανασταλτικό ρόλο που παίζει η Τ στη ρύθμιση της ΑΜΗ ιδιαίτερα κατά την εφηβεία (Σχήμα 8). Η αρνητική συσχέτιση διατηρείται και σε καταστάσεις πρώιμης ήβης είτε αληθούς (GnRH-εξαρτώμενης), είτε 84

ψευδούς (GnRH-μη εξαρτώμενης) γεγονός που υποδηλώνει ότι η Τ ευθύνεται για την καταστολή της ΑΜΗ στην εφηβεία και όχι οι γοναδοτροπίνες (128). Σε αυτό συνηγορούν και μελέτες που έδειξαν αυξημένη έκκριση ΑΜΗ σε ασθενείς με διαταραχές στη σύνθεση ή τη δράση των ανδρογόνων (130,131). H ανασταλτική επίδραση της Τ δεν είναι εμφανής κατά την εμβρυϊκή και πρώιμη νεογνική περίοδο, αν και η ενδοορχική συγκέντρωση της είναι υψηλή, εξαιτίας της ανεπαρκούς έκφρασης του ανδρογονικού υποδοχέα στα κύτταρα Sertoli σε αυτές τις χρονικές φάσεις (132). Όλα τα ανωτέρω δείχνουν ότι τα επίπεδα της ΑΜΗ είναι ένας αξιόπιστος δείκτης της ανδρογονικής δράσης στα «κύτταρα-στόχους» των όρχεων. Σχήμα 10. Μεταβολές των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ στα διάφορα στάδια της φυσιολογικής εφηβείας και σε καταστάσεις υπογοναδοτροπικού υπογοναδισμού ή ελαττωμένης σύνθεσης ή δράσης της Τ (108). 85

3.4.2. Ο ρόλος της FSH Η FSH προκαλεί μέτρια αύξηση της έκκρισης ΑΜΗ από τους όρχεις. Επειδή όμως η ανασταλτική επίδραση της Τ υπερκαλύπτει τη ευοδωτική δράση της FSH, αυτή η δράση γίνεται εμφανής είτε κατά την εμβρυική και πρώιμη νεογνική περίοδο, είτε σε άρρενες με διαταραχές στη σύνθεση ή στη δράση των ανδρογόνων (132-134) (Σχήμα 11). H FSH δρα στα κύτταρα Sertoli μέσω διέγερσης του συστήματος Gs-πρωτεϊνών και αδενυλικής κυκλάσης προκαλώντας ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA), η οποία μέσω των μεταγραφικών παραγόντων NF-kB (nuclear factor kb) και AP2 (activated protein 2) επάγει τη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της ΑΜΗ (135). Η FSH προκαλεί επίσης προεφηβικά πολλαπλασιασμό των κυττάρων Sertoli, η μιτωτική δραστηριότητα των οποίων συμβαδίζει με τα επίπεδα της ΑΜΗ (136). Μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η χορήγηση ανασυνδυασμένης FSH (recombinant FSH, rfsh) σε φυσιολογικά προεφηβικά ποντίκια προκαλεί σημαντική αύξηση της έκκρισης AMH και σε διαγονιδιακά πειραματόζωα με έλλειψη της β-υπομονάδας της FSH αποκαθιστά στα φυσιολογικά επίπεδα τον αριθμό των κυττάρων Sertoli, το μέγεθος των όρχεων και τα επίπεδα της ΑΜΗ στη συστηματική κυκλοφορία (132,135). Tα προαναφερθέντα δεδομένα δείχνουν ότι η ΑΜΗ είναι ένας αξιόπιστος δείκτης του αριθμού των κυττάρων Sertoli στους προεφηβικούς όρχεις. Στο σχήμα 11 φαίνεται συνολικά η αλληλεπίδραση των ορμονικών μηχανισμών ρύθμισης της έκκρισης AMH μετά την γέννηση. Η βασική παραγωγή της ορμόνης υπάρχει ανεξάρτητα της επίδρασης των γοναδοτροπινών κατά τη φυσιολογική παιδική ηλικία και σε ασθενείς με επίκτητο υπογοναδοτροπικό υπογοναδισμό (ΥΥ). Σε ασθενείς με συγγενή ΥΥ όμως, οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ είναι ελαττωμένες στη παιδική ηλικία, λόγω της μείωσης του αριθμού των κυττάρων Sertoli που είναι απότοκος της έλλειψης διέγερσής τους από την FSH κατά την εμβρυική και νεογνική περίοδο. Όταν τα κύτταρα Sertoli εκτεθούν στη δράση της Τ και της FSH, όπως συμβαίνει στη φυσιολογική εφηβεία και ενήλικο ζωή, τότε υπερτερεί η κατασταλτική επίδραση των ανδρογόνων στην έκκριση της ΑΜΗ με την προϋπόθεση ότι υπάρχει φυσιολογική έκφραση λειτουργικών ανδρογονικών υποδοχέων. Αντίθετα, επί απουσίας ανδρογονικής δράσης και ύπαρξης αυξημένων επιπέδων FSH, η έκκριση της ΑΜΗ επάγεται σημαντικά όπως συμβαίνει φυσιολογικά στην εμβρυική και 86

νεογνική ζωή (απουσία έκφρασης ανδρογονικών υποδοχέων στα κύτταρα Sertoli) και σε ασθενείς εφηβικής ηλικίας με σύνδρομο αντίστασης στα ανδρογόνα ή διαταραχές σύνθεσης της Τ. Σχήμα 11. Η ορμονική ρύθμιση της έκκρισης της ΑΜΗ. Αλληλεπίδραση της FSH και της Τ σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις (108). 3.4.3. Ο ρόλος των γεννητικών κυττάρων H ελάττωση της παραγωγής της ΑΜΗ στην εφηβεία συμβαίνει ταυτόχρονα με την έναρξη της πρώτης μειωτικής διαίρεσης των γεννητικών κυττάρων. Μελέτες με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους ανίχνευσης της ΑΜΗ σε τομές ορχικού ιστού από την εμβρυϊκή ζωή έως την εφηβεία έδειξαν ότι η ελάττωση έκφρασης της ορμόνης δεν συμβαίνει ταυτόχρονα σε όλα τα σπερματικά σωληνάρια αλλά μόνο σε εκείνα στα οποία έχουν ήδη εμφανισθεί τα πρώτα μειωτικά σπερματοκύτταρα (125,137). Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με πειραματικές παρατηρήσεις σε αρσενικά ποντίκια ΧΧsxr b (ένα μοντέλο των ΧΧ αρρένων) συνηγορεί για 87

τον ρόλο των μειωτικών σπερματοκυττάρων στην αναστολή έκφρασης της ΑΜΗ ο οποίος είναι ανεξάρτητος των ανδρογόνων (132). H επίδραση αυτή φαίνεται ότι γίνεται με την παρακρινική δράση του TNF-α, ο οποίος στα κύτταρα Sertoli αναστέλλει, μέσω του πυρηνικού παράγοντα NF-kB, την ενεργοποίηση του γονιδίου της ΑΜΗ που εξαρτάται από τον SF-1 (138). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι πιθανώς η βιταμίνη D έχει ρυθμιστικό ρόλο στην έκκριση της ΑΜΗ. Όπως προαναφέρθηκε, στον επαγωγέα του γονιδίου της ΑΜΗ εντοπίστηκε στοιχείο σύνδεσης του υποδοχέα της βιταμίνης D (Vitamin D Response Element, VDRE). Η χορήγηση καλσιτριόλης επάγει την έκφραση του γονιδίου της ΑΜΗ σε καλλιέργειες προστατικών κυττάρων (115). Eπιπλέον, σε πρόσφατη μελέτη διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα της ΑΜΗ στον ορό ενηλίκων ανδρών, αλλά όχι αγοριών παιδικής ηλικίας, συσχετίζονται θετικά με τα επίπεδα της 25-υδροξυβιταμίνης D 3 (25[ΟΗ]D 3 ). H ίδια μελέτη έδειξε ότι δεν υπήρχε συσχέτιση των επιπέδων της 25(OH)D 3 με άλλα εκκριτικά προιόντα των κυττάρων Sertoli όπως η Inh-Β, εύρημα που υποδηλώνει ότι η βιταμίνη D αποτελεί ευοδωτικό ρυθμιστικό παράγοντα ειδικά της ΑΜΗ (139). 3.5. Μηχανισμός δράσης της ΑΜΗ Η ΑΜΗ, όπως και τα άλλα μέλη της οικογένειας του TGF-β, δρα μέσω δύο τύπων υποδοχέων (1 και 2) που είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες μονής αλύσου με δραστηριότητα κινάσης σερίνης / θρεονίνης. Ο υποδοχέας τύπου 2 (ΑΜΗR2) είναι ειδικός για την ΑΜΗ και το γονίδιό του στον άνθρωπο εντοπίσθηκε στο χρωμόσωμα 12q13 (140). Αποτελείται από 573 αμινοξέα και εμφανίζει μία εξωκυττάρια περιοχή με την οποία συνδέεται με την ορμόνη, μία μικρή διαμεμβρανική περιοχή και την ενδοκυττάρια περιοχή που λειτουργεί ενζυμικά ως κινάση σερίνης / θρεονίνης (109). O AMHR2 στους άρρενες εκφράζεται στα όργανα - στόχους της ΑΜΗ και συγκεκριμένα στο μεσέγχυμα που περιβάλλει το επιθήλιο του πόρου του Μüller, και μάλιστα μόνο κατά το χρονικό διάστημα της υποστροφής του (141), στα κύτταρα Sertoli (103) και στα κύτταρα Leydig κατά την ενηλικίωση (142). Επίσης έχει αναφερθεί εντόπιση του υποδοχέα AMHR2 σε εμβρυϊκό πνεύμονα αρουραίου (143), σε κυτταρικές σειρές από προστάτη (144), στα γοναδοτρόπα κύτταρα της υπόφυσης 88

τρωκτικών (145) και στους κινητικούς νευρώνες ενήλικων ποντικών (146). Ο μοναδικός παράγοντας που έχει αποδειχθεί ότι επάγει την έκφραση του AMHR2 στους ιστούς είναι ο μεταγραφικός παράγοντας SF-1 (147), ενώ η ΑΜΗ αναστέλλει την έκφραση του ΑΜΗR2 (148). Όσον αφορά τον υποδοχέα τύπου 1, οι μέχρι τώρα έρευνες δεν μπόρεσαν να εντοπίσουν ειδικό υποδοχέα για την ΑΜΗ και φαίνεται πως η ορμόνη χρησιμοποιεί υποδοχείς τύπου 1 από κοινού με άλλα μέλη της οικογένειας TGF-β και συγκεκριμένα τις BMPs και τους αυξητικούς και διαφοροποιητικούς παράγοντες (Growth Differentiation Factors / GDFs). Ο ALK-2 (Activin Receptor-Like Kinase-2), o ALK-3 και ο ALK-6 έχουν προταθεί ως υποψήφιοι υποδοχείς τύπου 1 για την ΑΜΗ. Ο τύπος αυτός είναι υπεύθυνος για την ενδοκυττάρια μετάδοση του ορμονικού σήματος και πιθανολογείται ότι η ΑΜΗ χρησιμοποιεί διαφορετικούς τύπου 1 υποδοχείς με «ιστο-εκλεκτικό» τρόπο. Μελέτες έδειξαν ότι στην υποστροφή των πόρων του Μüller ο κύριος διαμεσολαβητής της δράσης της ΑΜΗ είναι ο ΑLK-2 (109). O μηχανισμός δράσης της ΑΜΗ στα «κύτταρα - στόχους» ακολουθεί το πρότυπο των άλλων μελών της οικογένειας του TGF-β και συγκεκριμένα της ομάδας των ΒΜΡs και GDFs: το ομοδιμερές της ορμόνης συνδέεται εκλεκτικά με την εξωκυττάρια περιοχή του ΑΜΗR2 προκαλώντας το σχηματισμό ενός τετραμερούς συμπλέγματος που αποτελείται από δύο μόρια ΑΜΗR2 και δύο υποδοχείς τύπου 1 (R1). Mε τη σύνδεση ο AMHR2 ενεργοποιείται και φωσφορυλιώνει μόρια σερίνης και θρεονίνης κοντά στη διαμεμβρανική περιοχή του R1 καθιστώντας ενεργό το τμήμα του υποδοχέα που δρα ως κινάση, το οποίο με τη σειρά του φωσφορυλιώνει ενδοκυττάριες πρωτεΐνες, τις Smad-1, Smad-5 ή Smad-8 που δρουν ως αγγελιοφόροι του ορμονικού σήματος στον πυρήνα του κυττάρου, αφού σχηματίσουν ετεροδιμερή με τη Smad-4. To διμερές των πρωτεϊνών Smad συνδέεται στο πυρήνα με τις ρυθμιστικές περιοχές των «γονιδίων στόχων» της ΑΜΗ, επάγοντας ή αναστέλλοντας την έκφρασή τους. Ο Smad-6 δρα ανασταλτικά στην προαναφερθείσα οδό σηματοδότησης. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η ΑΜΗ για την εκδήλωση των βιολογικών της δράσεων, μπορεί να χρησιμοποιεί και άλλα συστήματα ενδοκυττάριων αγγελιοφόρων εκτός των Smad πρωτεϊνών (Σχήμα 12). Στο μεσέγχυμα των πόρων του Μüller η ορμόνη δρα μέσω του 89

συστήματος β-catenin / Lymphoid Enhancer Factor-1 (149), ενώ σε κυτταρικές σειρές μαστού (150) και προστάτη (144) ενεργοποιεί την ενδοκυττάρια οδό του πυρηνικού παράγοντα κβ (NF-kΒ). Σχήμα 12. Ενδοκυττάριοι οδοί μετάδοσης του σήματος της ΑΜΗ (109). Τα κυριότερα «γονίδια στόχοι» της δράσης της ΑΜΗ είναι αυτά της P450 αρωματάσης (CYP19), του υποδοχέα της LH (LHCGR), της 3β-υδροξυστεροειδικής αφυδρογονάσης (HSD3B1), της P450 17α-υδροξυλάσης / λυάσης (CYP17), της P450scc (CYP11A), του p16 αναστολέα της εξαρτώμενης από τη κυκλίνη κινάσης CDKN2A, του υποδοχέα AMHR2, της μεταλλοπρωτεϊνάσης MMP2 και του Smad-6 (109). 90

3.6. Βιολογικές δράσεις της ΑΜΗ Αν και αρχικά η ΑΜΗ θεωρούνταν ένας παρακρινικός παράγοντας με δράση μόνο στους πόρους του Müller του άρρενος εμβρύου, οι μελέτες που έδειξαν τη συνεχιζόμενη παραγωγή της και μετά τη γέννηση αλλά και την έκκρισή της από τις ωοθήκες διεύρυναν το φάσμα των φυσιολογικών δράσεων της ορμόνης. Όσον αφορά το άρρεν φύλο, έχει προταθεί ότι η ΑΜΗ συμμετέχει και σε άλλες λειτουργίες όπως η κάθοδος των όρχεων, η ανάπτυξη των πνευμόνων, η ανάπτυξη και λειτουργία των όρχεων πριν και μετά τη γέννηση και η λειτουργία της υπόφυσης και του προστάτη. Eπίσης, μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η ΑΜΗ μπορεί να έχει ρόλο σε λειτουργίες του Κ.Ν.Σ όπως η επιβίωση και διαφοροποίηση των κινητικών νευρώνων στο νωτιαίο μυελό και ο σεξουαλικός διμορφισμός του εγκεφάλου. 3.6.1. Υποστροφή των πόρων του Μüller H χαρακτηριστική και καλύτερα μελετημένη δράση της ΑΜΗ είναι η πρόκληση της υποστροφής των πόρων του Müller στο άρρεν έμβρυο. Είναι γνωστό ότι στα έμβρυα των θηλαστικών δεν υπάρχει αρχικά διαφορά στο αναπαραγωγικό σύστημα των δύο φύλων. Σε κάθε πλευρά υπάρχει μια αδιαφοροποίητη γονάδα και δύο πόροι εκ των οποίων ο πόρος του Μüller αποτελεί την καταβολή των σαλπίγγων, της μήτρας και του άνω τριτημορίου του κόλπου στα θήλεα άτομα και ο πόρος του Wolff που εξελίσσεται σε επιδυδιμίδες, σπερματικούς πόρους και σπερματοδόχες κύστεις στα άρρενα. Όταν η αρχέγονη γονάδα διαφοροποιείται σε όρχι υπό την επίδραση του SRY (sex determining region of the Y chromosome), πρώτα τα αρχέγονα κύτταρα Sertoli εκκρίνουν την ΑΜΗ που προκαλεί την εξαφάνιση του επιθηλίου των πόρων του Müller, ενώ στη συνέχεια τα κύτταρα Leydig εκκρίνουν Τ που προκαλεί την ανάπτυξη των πόρων του Wolff και την αρρενοποίηση των έξω γεννητικών οργάνων. Η αλληλουχία αυτή των γεγονότων είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική διαφοροποίηση και ανάπτυξη του άρρενος εμβρύου και στηρίζεται στην ύπαρξη αυστηρά καθορισμένου χρονικού ορίου ευαισθησίας των πόρων του Müller στη δράση της ΑΜΗ, που στον άνθρωπο φτάνει μέχρι την ένατη εβδομάδα της κύησης. Η ΑΜΗ δεν δρα απευθείας στο επιθήλιο των πόρων αλλά στα μεσεγχυματικά κύτταρα που το περιβάλλουν τα οποία και εκφράζουν τον υποδοχέα τύπου 2 (AMHR2) (102,103). Στην 91

ενδοκυττάρια μετάδοση του ορμονικού σήματος στα μεσεγχυματικά κύτταρα φαίνεται να παίζει ρόλο η β-catenin η οποία ρυθμίζει τη μεταγραφική δραστηριότητα γονιδίων μέσω παραγόντων της οικογένειας του Lymphocyte Enhancer Factor-1 (LEF-1). Στη συνέχεια, τo μεσέγχυμα μέσω παρακρινικών σημάτων προκαλεί την υποστροφή του επιθηλίου με τους μηχανισμούς της απόπτωσης τύπου Ι και ΙΙ. Συγκεκριμένα, η ΑΜΗ προκαλεί αρχικά απόπτωση τύπου Ι δηλαδή αυξημένη φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών επιθηλιακών κυττάρων από γειτονικά υγιή και στη συνέχεια επάγει τους μηχανισμούς της τύπου ΙΙ απόπτωσης όπου διασπάται η βασική μεμβράνη και τα επιθηλιακά κύτταρα προβάλλουν στο μεσέγχυμα και φαγοκυτταρώνονται. Παράλληλα, τα υγιή κύτταρα μεταναστεύουν στο μεσεγχυματικό ιστό, υφίστανται επιθηλιο-μεσεγχυματική μεταμόρφωση και σχηματίζουν μία στιβάδα που περιβάλλει τον εκφυλιζόμενο πόρο. Η αλληλουχία αυτή των βιολογικών γεγονότων συμβαίνει αρχικά στο κεφαλικό τμήμα του πόρου και προχωρεί με κατεύθυνση κεφαλοουραία συμβαδίζοντας με την εντονότερη και πρωιμότερη εμφάνιση τoυ AMHR2 και της β-catenin στο τμήμα αυτό (151). 3.6.2. Κάθοδος των όρχεων Είναι γνωστό ότι η κάθοδος των όρχεων στο όσχεο είναι ένα πολύπλοκο φαινόμενο στο οποίο συμμετέχουν μηχανικοί και ορμονικοί παράγοντες. Η πρώτη φάση της ενδοκοιλιακής καθόδου είναι το αθροιστικό αποτέλεσμα της υποστροφής του κρεμαστήρα συνδέσμου των όρχεων υπό την επίδραση των ανδρογόνων και της διόγκωσης του ουραίου τμήματος του οσχεο-ορχικού συνδέσμου που μπορεί να ελέγχεται από την ΑΜΗ. Οι μέχρι τώρα μελέτες έδειξαν αντιφατικά αποτελέσματα όσον αφορά το ρόλο της ΑΜΗ στη διαδικασία αυτή. Υπέρ της συμμετοχής της ορμόνης συνηγορεί το γεγονός ότι στο σύνδρομο παραμονής των πόρων του Müller (PMDS) που οφείλεται σε ελλιπή παραγωγή ή δράση της ΑΜΗ, παρατηρείται κρυψορχία και ανώμαλη ανάπτυξη του οσχεο-ορχικού συνδέσμου. Eπίσης, κρυψορχία συνυπάρχει με παραμονή των πόρων του Müller σε ασθενείς με άλλες διαταραχές διαφοροποίησης του φύλου και σε διαγονιδιακά ποντίκια με έλλειψη ΑΜΗ και αντίσταση στα ανδρογόνα. Αντίθετα, σε διαγονιδιακά ποντίκια με έλλειψη ΑΜΗ αλλά φυσιολογικά επίπεδα ανδρογόνων, η θέση των όρχεων είναι φυσιολογική, όπως επίσης και σε κουνέλια που είχαν εμβολιαστεί με αντι-αμη ορό. Συνεπώς φαίνεται να υπάρχει 92

συμμετοχή της ΑΜΗ στη κάθοδο των όρχεων χωρίς αυτή όμως να έχει διευκρινισθεί πλήρως (152). 3.6.3. Ανάπτυξη των πνευμόνων Πειραματικά δεδομένα σε αρουραίους δείχνουν ότι ο υποδοχέας AMHR2 εκφράζεται στον εμβρυϊκό πνεύμονα, όπου η ΑΜΗ αναστέλλει τη μορφογένεση των βρόγχων μέσω επαγωγής της απόπτωσης και συγχρόνως ελαττώνει τη συγκέντρωση φωσφατιδυλχολίνης που είναι βασικό συστατικό της επιφανειοδραστικής ουσίας. Η γειτνίαση των εμβρυϊκών όρχεων με τους πνεύμονες οδηγεί στο συμπέρασμα ότι πιθανώς η ορμόνη ασκεί τις προαναφερθείσες δράσεις της με παρακρινικό τρόπο (143,153). H επίδραση της ΑΜΗ στον πνεύμονα, μπορεί να εξηγήσει τη μεγαλύτερη νοσηρότητα και θνησιμότητα του συνδρόμου αναπνευστικής δυσχέρειας στα άρρενα νεογνά (154). 3.6.4. Ανάπτυξη και λειτουργία των όρχεων Αν και η ΑΜΗ δεν φαίνεται να συμμετέχει στην αρχική διαφοροποίηση της πολυδύναμης γονάδος σε όρχι, πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι επηρεάζει τη μετέπειτα ανάπτυξη και λειτουργία του (155). H AMH με αυτοκρινικό μηχανισμό δρα στα κύτταρα Sertoli και αναστέλλει τη δραστηριότητα της αρωματάσης (156). Eπίσης έχει αποδειχθεί, ότι δρά παρακρινικά στα κύτταρα Leydig επηρεάζοντας τη διαφοροποίηση και τη στεροειδογένεσή τους. Είναι γνωστό ότι ο εμβρυϊκός πληθυσμός των κυττάρων Leydig φθίνει και εξαφανίζεται μετά τη γέννηση συμβαδίζοντας με τα χαμηλά επίπεδα Τ που παρατηρούνται στη παιδική ηλικία. Στους όρχεις των ενηλίκων τα κύτταρα Leydig προέρχονται από τη διαφοροποίηση ενός πληθυσμού πρόδρομων μεσεγχυματικών κυττάρων τα οποία εξελίσσονται στα προγονικά Leydig προεφηβικά και στη συνέχεια σε ανώριμα και ώριμα κύτταρα κατά την εφηβεία υπό την επίδραση της LH. Πειραματικά δεδομένα σε διαγονιδιακά ποντίκια που είτε υπερεκφράζουν το γονίδιο της ΑΜΗ (157), είτε είχαν απάλειψη του γονιδίου της ορμόνης ή του υποδοχέα της, δείχνουν ότι η ΑΜΗ δρα ανασταλτικά στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων Leydig. Επίσης, τα ίδια πειράματα σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της επίδρασης ΑΜΗ σε καλλιέργειες κυττάρων Leydig (142) έδειξαν ότι η ΑΜΗ αναστέλλει και τη σύνθεση της Τ. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της ανασταλτικής δράσης της ορμόνης στην έκφραση της 17 α - 93

υδροξυλάσης / 17-20-λυάσης (Ρ450C17), της 3β-υδροξυστεροειδικής αφυδρογονάσης / Δ5- Δ4-ισομεράσης και της 20-22 υδροξυλάσης / δεσμολάσης (P450scc). Η ΑΜΗ επηρεάζει κυρίως το ένζυμο Ρ450C17 που καταλύει το καθοριστικό βήμα στη βιοσυνθετική οδό της Τ. Πειραματικά δεδομένα σε τρωκτικά δείχνουν ότι η ορμόνη αναστέλλει κυρίως τη δραστηριότητα λυάσης του ενζύμου αυτού και ελάχιστα επηρεάζει τη 17α-υδροξυλίωση (158). H ΑΜΗ επηρεάζει τη στεροειδογένεση των κυττάρων Leydig τόσο στον ενήλικα, όσο και στο έμβρυο (156). Από τα ανωτέρω συμπεραίνεται ότι υπάρχει ένα κύκλωμα αμφίδρομης αρνητικής αλληλορύθμισης μεταξύ ΑΜΗ και Τ που εξηγεί και την αντίστροφη σχέση που υπάρχει μεταξύ των συγκεντρώσεων τους στον ορό μετά τη νεογνική περίοδο. O ακριβής ρόλος της ΑΜΗ στη σπερματογένεση δεν είναι γνωστός. Η ορμόνη έχει ανιχνευθεί στο σπερματικό υγρό γόνιμων ανδρών και μάλιστα σε επίπεδα υψηλότερα εκείνων του αίματος (121,122). Αν και δεν έχει εντοπισθεί έκφραση των υποδοχέων AMHR2 στις στρογγύλες σπερματίδες (103), η χρήση ανοσοϊστοχημικών μεθόδων απέδειξε τη δυνατότητα δέσμευσης της ΑΜΗ στην κυτταρική μεμβράνη αλλά και σε ενδοκυττάριες δομές των σπερματοζωαρίων όπου φαίνεται να δρα στην διαδικασία της ακροσωμιακής αντίδρασης (159). Επίσης, η ΑΜΗ επηρεάζει πιθανώς την κινητικότητα των σπερματοζωαρίων αν και οι μελέτες που υπάρχουν έδειξαν αντιφατικά αποτελέσματα όσον αφορά το ανασταλτικό (121) ή τον ευοδωτικό χαρακτήρα (160) της δράσης της. Tέλος, έχει διαπιστωθεί ότι χαμηλά επίπεδα της ΑΜΗ στο σπερματικό υγρό ή στο αίμα σχετίζονται με δυσλειτουργία της σπερματογένεσης (122,123,161). Δεν είναι ξεκάθαρο όμως αν υπάρχει άμεση αιτιολογική σχέση ή αν τα χαμηλά επίπεδα της ορμόνης είναι έμμεσος δείκτης της δυσλειτουργίας των κυττάρων Sertoli που προκαλεί τη διαταραχή στη σπερματογένεση. Είναι αναγκαία επομένως η διενέργεια περισσότερων μελετών που θα διευκρινίσουν τον ακριβή ρόλο της ορμόνης στη σπερματογένεση και την κλινική σημασία της σε διάφορες καταστάσεις ανδρικής υπογονιμότητας. 3.6.5. Δράση στην υπόφυση και τον προστάτη Πρόσφατη μελέτη έδειξε την έκφραση του υποδοχέα AMHR2 στην υπόφυση αρουραίων και σε καλλιέργεια γοναδοτρόπων κυττάρων τρωκτικών (LβT2), καθώς και την ευοδωτική δράση της ΑΜΗ στην έκφραση του γονιδίου της β-υπομονάδας τόσο της FSH, όσο και της 94

LH (145). Tα αποτελέσματα αυτά, αν και πρέπει να επιβεβαιωθούν και με άλλες μελέτες, υποδεικνύουν έναν ενδοκρινικό ρόλο της ΑΜΗ στη ρύθμιση του άξονα «υποθάλαμος υπόφυση γονάδες» παρόμοιο με αυτόν άλλων μελών της οικογένειας του TGF-β, όπως η ακτιβίνη και η ανασταλτίνη. Έχει αποδειχθεί επίσης η παρουσία λειτουργικών AMHR2 και υποδοχέων τύπου 1 σε φυσιολογικό προστατικό ιστό αλλά και σε κύτταρα προστατικού αδενοκαρκινώματος (144). Στη μελέτη αυτή φάνηκε ότι η ΑΜΗ αναστέλλει την αύξηση τόσο των φυσιολογικών, όσο και των καρκινικών κυττάρων in vitro μέσω διέγερσης του πυρηνικού παράγοντα NF-kB αλλά και ανταγωνιζόμενη την ανδρογονοεξαρτώμενη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού τους. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν ένα φυσιολογικό ρόλο της ΑΜΗ στη ρύθμιση της αύξησης του προστάτη και δίνουν το έναυσμα για περισσότερες μελέτες που θα αξιολογήσουν τη χρήση της ΑΜΗ ως θεραπευτικού εργαλείου σε ασθενείς με προστατικό καρκίνο (144). 3.6.6. Δράση στο ΚΝΣ Μελέτες σε πειραματόζωα (ενήλικα ποντίκια) έδειξαν ότι οι κινητικοί νευρώνες συνθέτουν ΑΜΗ και εκφράζουν σε σημαντικό βαθμό τον ειδικό υποδοχέα της ΑΜΗR2. Επίσης οι κινητικοί νευρώνες εκφράζουν και τρείς υποτύπους του υποδοχέα τύπου 1 της ορμόνης (AMHR1), ο οποίος είναι υπεύθυνος για την ενδοκυττάρια μετάδοση του σήματος μετά τη σύνδεσή της με τον AMHR2. H έκθεση των νευρώνων σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις ΑΜΗ in vitro συμβάλλει στην επιβίωση και διαφοροποίησή τους. Τα προαναφερθέντα ευρήματα συνηγορούν στο γεγονός ότι η ΑΜΗ μπορεί να χρησιμοποιείται από τους ώριμους κινητικούς νευρώνες ως παράγοντας επιβίωσης ή προστασίας σε περιπτώσεις βλάβης του ΚΝΣ και ως μέσο παρακρινικής επικοινωνίας μεταξύ τους (146). 3.7. Η ΑΜΗ στην κλινική πράξη Η ανάπτυξη ειδικών και ευαίσθητων ενζυμικών μεθόδων ανοσοπροσρόφησης (ELISA) που επιτρέπουν τη μέτρηση της ΑΜΗ σε διάφορα βιολογικά υγρά και η δυνατότητα ελέγχου του γονιδίου της ορμόνης ή του υποδοχέα της AMHR2 έδωσαν μεγάλη ώθηση στη μελέτη της δράσης και των συγκεντρώσεων της ορμόνης τόσο σε φυσιολογικές, όσο και σε παθολογικές καταστάσεις του αναπαραγωγικού συστήματος του άνδρα και της γυναίκας. 95

3.7.1. Συγκεντρώσεις της ΑΜΗ στον ορό φυσιολογικών ανδρών και γυναικών Το φυσιολογικό εύρος τιμών της ΑΜΗ στον ορό ανδρών και γυναικών παρουσιάζεται στον Πίνακα 6. Οι τιμές αυτές βασίζονται στις εργασίες των Rey et al. και Long et al. και εκτός μικρών αποκλίσεων συμφωνούν με τις υπόλοιπες μελέτες που υπάρχουν στη διεθνή βιβλιογραφία (119,133,162-165). Σε μία πρόσφατη μεγάλη πληθυσμιακή μελέτη χρονικής στιγμής σε 1027 υγιείς εθελοντές από τη Δανία (120) προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ΑΜΗ στον ορό ανδρών από τη γέννησή τους μέχρι την ηλικία των 69 ετών με τη χρήση υπερευαίσθητης μεθόδου ELISA. H διάμεση τιμή της συγκέντρωσης της ΑΜΗ στο ομφάλιο αίμα ήταν 148 pmol/l (1 ng/ml = 7,14 pmol/l) και αυξήθηκε στη μέγιστη παρατηρηθείσα τιμή στη διάρκεια του τρίτου μήνα της νεογνικής ζωής (διάμεση τιμή: 1047 pmol/l, εύρος τιμών: 749-1930 pmol/l). Στη συνέχεια παρατηρήθηκε ελάττωση των επιπέδων της στο τέλος του πρώτου έτους και παρέμειναν σταθερά κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας (διάμεση τιμή: 755 pmol/l, εύρος τιμών: 395-1355 pmol/l). Στη διάρκεια της εφηβείας παρατηρήθηκε σταδιακή πτώση της συγκέντρωσης της ΑΜΗ ανάλογα με το στάδιο εφηβείας κατά Tanner: G1a (διάμεση τιμή ΑΜΗ: 697 pmol/l), G1b (585 pmol/l), G2 (253 pmol/l), G3 (66 pmol/l), G4 (43 pmol/l) και G5 (49 pmol/l). Στη διάρκεια της ενήλικης ζωής των ανδρών (21,6-64,4 ετών) τα επίπεδα της ΑΜΗ ήταν σχετικά σταθερά (διάμεση τιμή: 42 pmol/l, εύρος: 13-98 pmol/l). Ο χρόνος ημίσειας ζωής (Τ1/2) της ΑΜΗ στη συστηματική κυκλοφορία προσδιορίστηκε πρόσφατα σε μελέτη που εκτίμησε τη μεταβολή των επιπέδων της ορμόνης σε προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μετά την ολική αφαίρεση των έσω γεννητικών τους οργάνων (166). Η ελάττωση της συγκέντρωσης της ΑΜΗ ακολούθησε φαρμακοκινητικό μοντέλο πρώτης τάξης. Τα επίπεδά της μειώθηκαν κατά 95% στις πέντε ημέρες μετά την επέμβαση και ήταν μη ανιχνεύσιμα περίπου ύστερα από οκτώ ημέρες. Η μέση τιμή του χρόνου ημίσειας ζωής της ορμόνης ήταν 27,6 ± 0,8 ώρες (εύρος: 12,3-39,9 ώρες). Aντίστοιχες μελέτες σε άνδρες δεν υπάρχουν, αν και οι ερευνητές της προαναφερθείσας εργασίας συμπεραίνουν ότι είναι απίθανο να διαφέρει ο Τ 1/2 της ΑΜΗ μεταξύ των δύο φύλων. Η πρώτη προσπάθεια προσδιορισμού του χρόνου ημίσειας ζωής της ΑΜΗ έγινε σε βοοειδή άρρενος φύλου μετά τον ευνουχισμό τους και διαπιστώθηκε ότι ήταν 48 ώρες περίπου (167). 96

Η βιβλιογραφία δείχνει ότι η συγκέντρωση της ΑΜΗ στα αγόρια είναι σαφώς υψηλότερη των κοριτσιών μέχρι τη εφηβεία, μετά την οποία, η διαφορά μειώνεται σημαντικά. Η συγκέντρωση της ΑΜΗ στη συστηματική κυκλοφορία θεωρείται ένας πολύ ευαίσθητος δείκτης της ύπαρξης λειτουργικών κυττάρων Sertoli στα νεογνά και τα παιδιά προεφηβικής ηλικίας και έχει χρησιμοποιηθεί στη διερεύνηση και διαφορική διάγνωση παθολογικών καταστάσεων του γεννητικού συστήματος σε αυτές τις ηλικίες. Όσον αφορά τις γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας υπάρχει πλήθος μελετών που τεκμηρίωσαν τη κλινική αξία του προσδιορισμού της ΑΜΗ στον ορό ως ευαίσθητου δείκτη ωοθηκικής επάρκειας, διαγνωστικού κριτηρίου για το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών και προγνωστικού δείκτη για την απάντηση των ωοθηκών κατά τη πρόκληση ωοθυλακιορρηξίας στα πλαίσια εφαρμογής μεθόδων υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (168). Αντίθετα, στους ενήλικες άνδρες υπάρχουν πολύ λιγότερες μελέτες που διερευνούν το ρόλο της ΑΜΗ σε παθολογικές καταστάσεις του αναπαραγωγικού συστήματος και ιδιαίτερα στην ανδρική υπογονιμότητα. Πίνακας 6. Συγκεντρώσεις ΑΜΗ στον ορό φυσιολογικών ανδρών και γυναικών με τη χρήση ELISA (133). Φυσιολογικό εύρος τιμών * Ηλικία pmol/l ng/ml Άνδρες < 15 ημερών 76-381 10-53 15 ημερών - 1 έτους 251-679 35-95 1-4 ετών 360-638 50-90 4-7 ετών 309-566 43-79 7-9 ετών 234-438 33-61 > 9 ετών Tanner I 194-304 27-42 Tanner II 107-211 15-30 Tanner III ΜΑ-145 0-20 Tanner IV-V ΜΑ-81 0-11 ενήλικες ΜΑ-79 0-11 Γυναίκες Προεφηβικές ΜΑ-74 0-10 Ενήλικες ΜΑ-75 0-10 Μετεμμηνοπαυσιακές ΜΑ ΜΑ * To φυσιολογικό εύρος τιμών αντιπροσωπεύει το 99% του διαστήματος εμπιστοσύνης της μέσης τιμής. ΜΑ: μη ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις. 97

3.7.2. Σύνδρομο παραμονής των πόρων του Müller (PMDS) Είναι μία σπάνια μορφή άρρενος ψευδερμαφροδιτισμού που κληρονομείται κατά τον υπολειπόμενο αυτοσωματικό τύπο και χαρακτηρίζεται από τη παρουσία παραγώγων των πόρων του Müller, δηλαδή σαλπίγγων και μήτρας, σε ένα φυσιολογικό γονοτυπικά και φαινοτυπικά άρρεν άτομο (169). Οφείλεται στο 85% των περιπτώσεων σε μεταλλάξεις του γονιδίου της ΑΜΗ ή του ΑΜΗR2 και στο υπόλοιπο 15% σε άγνωστα αίτια. Ο φαινότυπος του συνδρόμου είναι ο ίδιος, ανεξάρτητα από το είδος της γενετικής βλάβης. Τα άτομα αυτά έχουν φυσιολογικά έξω γεννητικά όργανα άρρενος, κρυψορχία ή/και βουβωνοκήλη, εμφανίζουν φυσιολογική εφηβεία και μπορεί να είναι γόνιμα εφόσον γίνει έγκαιρα ορχεοπηξία. Τα επίπεδα της ΑΜΗ είναι μη ανιχνεύσιμα σε περίπτωση που η μετάλλαξη αφορά το γονίδιο της ορμόνης και φυσιολογικά όταν αφορά το γονίδιο του υποδοχέα τύπου 2. Έτσι η μέτρησή τους μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ανιχνευτική δοκιμασία προκειμένου να αποφασισθεί ποιο γονίδιο να υποβληθεί σε μοριακή ανάλυση (170). Τα άτομα με PMDS έχουν φυσιολογικά επίπεδα Inh-Β και Τ, σε αντίθεση με τα άτομα με ανορχία τα οποία εμφανίζουν επίσης αμφοτερόπλευρη απουσία των όρχεων και μη ανιχνεύσιμα επίπεδα ΑΜΗ, αλλά μηδενικά επίπεδα Τ και Inh-Β (133). 3.7.3. Κρυψορχία Η απόδειξη της ύπαρξης λειτουργικού ορχικού ιστού σε καταστάσεις με αμφοτερόπλευρη κρυψορχία είναι κριτικής σημασίας για τη διάγνωση και την αντιμετώπιση τόσο ατόμων με φυσιολογικά, όσο και ατόμων με αμφίβολα έξω γεννητικά όργανα. Οι απεικονιστικές μέθοδοι μπορεί να μην εντοπίσουν έκτοπους ή μικρούς όρχεις και γι αυτό έχει χρησιμοποιηθεί η μέτρηση των επιπέδων των γοναδοτροπινών και της Τ που όμως είναι διαγνωστικά μόνο κατά την νεογνική και εφηβική ηλικία. Κατά την παιδική ηλικία λόγω ενδογενούς καταστολής του άξονα «υποθάλαμος υπόφυση όρχεις» χρειάζεται διέγερση με ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη (hcg) προκειμένου να αξιολογηθούν τα επίπεδα Τ ως δείκτης ύπαρξης των όρχεων. Αντίθετα, η μέτρηση της ΑΜΗ στον ορό έχει μεγάλη ευαισθησία (98%) και ειδικότητα (91%) για την ανίχνευση ορχικού ιστού κατά τη βρεφική και παιδική ηλικία (171) και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαφορική διάγνωση μεταξύ συγγενούς ανορχίας και αμφοτερόπλευρης κρυψορχίας σε αγόρια με φυσιολογικά έξω γεννητκά όργανα και μη ψηλαφητές γονάδες. Φυσιολογικά ή ελαττωμένα αλλά σαφώς 98

ανιχνεύσιμα επίπεδα ΑΜΗ συνηγορούν για ύπαρξη όρχεων και επιτάσσουν τη χειρουργική διερεύνηση, ενώ μη ανιχνεύσιμα επίπεδα της ορμόνης παρατηρούνται στη συγγενή ανορχία με μοναδική εξαίρεση το PMDS που οφείλεται σε μετάλλαξη του γονιδίου της ΑΜΗ (171, 172). Είναι γνωστό ότι η κρυψορχία αποτελεί κλινικό σημείο και οφείλεται σε ποικίλα αίτια. Μπορεί να είναι μέρος του συνδρόμου ορχικής δυσγενεσίας, το οποίο αποτελεί μορφή πρωτοπαθούς ορχικής βλάβης λόγω περιβαλλοντικών (ενδοκρινικοί διαταράκτες) ή γενετικών παραγόντων (χρωμοσωμικές ανωμαλίες). Οι κλινικές εκδηλώσεις του συνδρόμου περιλαμβάνουν, εκτός της κρυψορχίας, τον υποσπαδία, τις διαταραχές σπερματογένεσης και τον αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου των όρχεων (173). Επιπλέον, η κρυψορχία μπορεί να οφείλεται σε ανατομικές διαταραχές των κοιλιακών τοιχωμάτων ή των βουβωνικών πόρων, σε υπογοναδοτροπικό υπογοναδισμό και σε διαταραχές του INSL-3 ή του υποδοχέα του. Τα επίπεδα της ΑΜΗ είναι ελαττωμένα σε ποσοστό 75% των παιδιών με αμφοτερόπλευρη κρυψορχία και αψηλάφητες γονάδες και στο 25% εκείνων με ψηλαφητούς όρχεις στη βουβωνική περιοχή, αντανακλώντας δυσλειτουργία των κυττάρων Sertoli (174). Αντίθετα, η συγκέντρωση της ΑΜΗ αναμένεται φυσιολογική στις περιπτώσεις κρυψορχίας που οφείλεται σε ανατομικό πρόβλημα ή διαταραχές στη σύνθεση ή δράση του INSL-3, εκτός αν οι όρχεις παραμείνουν στην έκτοπη θέση για μεγάλο χρονικό διάστημα οπότε μπορεί να επηρεαστεί δυσμενώς η λειτουργία των κυττάρων Sertoli. Σε υπογόνιμους άνδρες με κρυψορχία υπάρχει μία μόνο μελέτη που διερεύνησε τα επίπεδα της ΑΜΗ στη συστηματική κυκλοφορία και διαπίστωσε ότι δεν διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά συγκριτικά με άνδρες που έχουν φυσιολογική συγκέντρωση σπερματοζωαρίων ή ιδιοπαθή ολιγοσπερμία (175). 3.7.4. Διαταραχές διαφοροποίησης του φύλου Οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ μπορούν να χρησιμοποιηθούν επίσης για τη διερεύνηση παιδιών με διαταραχές στη διαφοροποίηση του φύλου και αμφίβολα έξω γεννητικά όργανα. Οι καταστάσεις αυτές σε γονοτυπικά ΧΥ άτομα είναι το αποτέλεσμα είτε γοναδικής δυσγενεσίας που επηρεάζει συγχρόνως τη λειτουργία των κυττάρων Leydig και Sertoli, είτε 99

μεμονωμένης βλάβης των κυττάρων Leydig ή ακόμη και διαταραχής στη δράση της Τ. Στη πρώτη περίπτωση, οι συγκεντρώσεις της ορμόνης είναι χαμηλές έως μη ανιχνεύσιμες συμβαδίζοντας με τη βαρύτητα των δυσγενετικών αλλοιώσεων των όρχεων, καθώς οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ είναι ενδεικτικές του αριθμού των λειτουργικών κυττάρων Sertoli. Αντίθετα, σε περιπτώσεις που το ορχικό παρέγχυμα είναι φυσιολογικό αλλά υπάρχει διαταραχή στη σύνθεση ή τη δράση της Τ, οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ είναι φυσιολογικές ή και αυξημένες. Αυξημένες συγκεντρώσεις της ορμόνης κατά τη βρεφική και εφηβική ηλικία και φυσιολογικές στην παιδική παρατηρούνται στο σύνδρομο πλήρους αντίστασης στα ανδρογόνα, στην ανεπάρκεια της 5α-αναγωγάσης και σε ενζυμικές ελλείψεις της βιοσυνθετικής οδού των ανδρογόνων. Συγκεντρώσεις εντός του φυσιολογικού εύρους τιμών αρρένων κατά τη βρεφική ηλικία υποδηλώνουν τη παρουσία φυσιολογικών όρχεων και συνηγορούν για υποθαλαμική / υποφυσιακή ανεπάρκεια, σύνδρομο μερικής αντίστασης στα ανδρογόνα ή ιδιοπαθή άρρενα ψευδερμαφροδιτισμό. Επίσης, σε σπάνιες καταστάσεις μερικής γοναδικής δυσγενεσίας ή αληθούς ερμαφροδιτισμού όπου είναι αναγκαία η χειρουργική αφαίρεση των γονάδων, η μέτρηση της ΑΜΗ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της πληρότητας της χειρουργικής επέμβασης (171). Σε καταστάσεις μεμονωμένου υποσπαδία ή μικρού φαλλού τα επίπεδα της ΑΜΗ είναι στη πλειονότητα των περιπτώσεων εντός του φυσιολογικού εύρους τιμών (165,174), αν και έχει αναφερθεί ότι σε παιδιά με υποσπαδία τα επίπεδα της ορμόνης είναι υψηλότερα από εκείνα φυσιολογικών παιδιών ανάλογης ηλικίας (176). Αντίθετα, όταν ο μικρός φαλλός συνδυάζεται με κρυψορχία τα επίπεδα της ορμόνης είναι χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα οπότε χρειάζεται περαιτέρω έλεγχος για να αποκλεισθεί η συγγενής ανορχία (165). 3.7.5. Πρώιμη ήβη Σε αγόρια με πρώιμη ήβη αληθή ή ψευδή οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ είναι χαμηλές για την ηλικία λόγω της καταστολής από την αυξημένη ενδοορχική συγκέντρωση Τ. Μετά τη θεραπεία οι τιμές της ορμόνης στο πλάσμα επανέρχονται αργά στα προεφηβικά επίπεδα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας της αγωγής ιδιαίτερα όταν χρησιμοποιούνται αντιανδρογόνες ουσίες (π.χ. τεστολακτόνη) που δεν ελαττώνουν τη συγκέντρωση της Τ (128, 133). 100

3.7.6. Υπογοναδοτροπικός υπογοναδισμός Η συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό νεογνών, βρεφών και προεφηβικών παιδιών με συγγενή ΥΥ είναι ελαττωμένη. Mελέτη έδειξε ότι στις περιπτώσεις αυτές, η χορήγηση αγωγής με rhfsh αμέσως μετά τη γέννηση οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων της ΑΜΗ και του μεγέθους των όρχεων, πιθανώς μέσω επαγωγής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Sertoli (177). Σε εφήβους με ΥΥ οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ είναι υψηλές για την ηλικία λόγω της έλλειψης της ανασταλτικής δράσης των ανδρογόνων, αλλά χαμηλότερες απ'ότι αναμένεται για το στάδιο Tanner ή τα επίπεδα της Τ λόγω του ελαττωμένου πληθυσμού των κυττάρων Sertoli εξαιτίας της έλλειψης της διεγερτικής δράσης της FSH. Οι τιμές της ΑΜΗ επανέρχονται πλήρως στα φυσιολογικά επίπεδα μετά τη θεραπεία με ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη (hcg), ενώ ελαττώνονται μερικώς όταν χορηγείται εξωγενώς Τ γεγονός που σημαίνει ότι με το τρόπο αυτό δεν επιτυγχάνεται φυσιολογική ενδοορχική συγκέντρωση ανδρογόνων (129). Σε παιδιά με ιδιοπαθή καθυστέρηση της εφηβείας η συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό είναι εντός φυσιολογικών ορίων, εύρημα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαφορική διάγνωση από τον ΥΥ (178, 179) Σε άνδρες με συγγενή ΥΥ χωρίς αγωγή, η χορήγηση εξωγενώς rhfsh οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της ΑΜΗ ύστερα από 10-20 ημέρες τα οποία όμως κατεστάλησαν μετά τη προσθήκη hcg. Αυτό συνεπάγεται ότι η FSH μπορεί να επάγει την έκκριση της AMH κατά τη προεφηβική ηλικία όπως έχουν δείξει και μελέτες σε πειραματόζωα. Είναι πιθανό η μέτρηση της ΑΜΗ μετά από διέγερση με rhfsh να μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης λειτουργικής εφεδρείας των κυττάρων Sertoli και σπερματογενετικής απάντησης στη θεραπεία με γοναδοτροπίνες ασθενών με ΥΥ (134). Σε μία πρόσφατη μελέτη που περιελάμβανε άνδρες με προεφηβικής έναρξης ΥΥ, η μακροχρόνια χορήγηση rhfsh σε συνδυασμό με hcg προκάλεσε μεγαλύτερη αύξηση της συγκέντρωσης της ΑΜΗ στο σπερματικό υγρό συγκριτικά με τη μονοθεραπεία με hcg και διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση της συγκέντρωσης ΑΜΗ στο σπέρμα με τη σπερματογενετική απάντηση στην αγωγή και την αύξηση του μεγέθους των όρχεων. Επίσης, στη προαναφερθείσα μελέτη ο συνδυασμός rhfsh και hcg προκάλεσε παροδική μόνο αύξηση στη συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό κατά τον 3ο μήνα της αγωγής (180). Tέλος, σε άνδρες με καρκίνο του προστάτη που λαμβάνουν αγωγή με GnRH-ανάλογα με στόχο τη πρόκληση λειτουργικού ΥΥ η μέτρια 101

αύξηση των επιπέδων της ΑΜΗ υποδηλώνει επαρκή καταστολή της παραγωγής των ανδρογόνων (129). 3.7.7. Σύνδρομα με καρυοτυπικές ανωμαλίες (47 ΧΧΥ, 46 ΧΧ άρρεν, τρισωμία 21) Σε νεογνά και παιδιά με σύνδρομο Κleinefelter (ΚS) τα επίπεδα της ΑΜΗ δεν διαφέρουν από αυτά ατόμων με φυσιολογικό καρυότυπο (181,182). Κατά την έναρξη της εφηβείας παρατηρείται ανοσοϊστοχημικά μεγάλη ελάττωση της έκφρασης της ΑΜΗ, εύρημα συμβατό με ωριμότητα των κυττάρων Sertoli, και μείωση των συγκεντρώσεών της στη συστηματική κυκλοφορία, παρά την απουσία μειωτικών σπερματοκυττάρων. Καθώς εξελίσσεται η εφηβεία, η λειτουργία των κυττάρων Sertoli επιδεινώνεται ραγδαία, με αποτέλεσμα οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ στον ορό εφήβων με KS να είναι ιδιατέρως χαμηλές ή μη ανιχνεύσιμες, ιδιαίτερα μετά το μέσο της εφηβείας (~13 ετών), σε σύμπτωση με τις μη ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις Inh-Β, τις πολύ αυξημένες συγκεντρώσεις FSH και το μικρό μέγεθος των όρχεων (183). Σε μία πρόσφατη μελέτη μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ στον ορό 95 ατόμων με μη μωσαικό KS, ηλικίας 0,2 έως 64,5 ετών και συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα επίπεδα φυσιολογικών ατόμων ίδιας ηλικίας (184). Διαπιστώθηκε ότι στη νεογνική και παιδική ηλικία η συγκέντρωση της ΑΜΗ δεν διέφερε μεταξύ των ατόμων με KS και των φυσιολογικών, εύρημα που συμφωνεί με τις παλαιότερες μελέτες. Επιπλέον φάνηκε ότι η ελάττωση των επιπέδων της ΑΜΗ κατά την εφηβεία καθυστερεί στα παιδιά με KS συγκριτικά με τα υγιή, πιθανόν λόγω των σχετικά χαμηλότερων συγκεντρώσεων ανδρογόνων και της έλλειψης μειωτικών γεννητικών κυττάρων. Μετά την ηλικία των 20 ετών, τα επίπεδα της ΑΜΗ στη πλειονότητα των ανδρών με KS (~ 85%) ήταν ιδιαιτέρως χαμηλά και συγκεκριμένα απείχαν δύο σταθερές αποκλίσεις από τη μέση τιμή φυσιολογικών ανδρών από το γενικό πληθυσμό. Στους άνδρες με KS δεν υπήρχε διαφορά στα επίπεδα της ΑΜΗ μεταξύ ασθενών που ελάμβαναν αγωγή με Τ και εκείνων που ήταν χωρίς αγωγή. Επίσης δεν διαπιστώθηκε διαφορά στις συγκεντρώσεις της ΑΜΗ μεταξύ ανδρών με KS και κρυψορχία και ανδρών με KS χωρίς κρυψορχία, με εξαίρεση την ομάδα ασθενών χωρίς αγωγή ηλικίας 10-14 ετών, όπου η συγκέντρωση της ΑΜΗ ήταν υψηλότερη στους ασθενείς με κρυψορχία. 102

Σε προεφηβικά παιδιά με σύνδρομο άρρενος 46 ΧΧ οι συγκεντρώσεις της ΑMH και της Τ είναι οι αναμενόμενες για την ηλικία τους, εύρημα ενδεικτικό της ακεραιότητας των κυττάρων Sertoli και Leydig (163). Κατά την εφηβεία όμως, δεν παρατηρείται έναρξη της σπερματογένεσης και ο πληθυσμός των σπερματογονίων ελαττώνεται γρήγορα λόγω αυξημένης απόπτωσής τους. Δυστυχώς, δεν υπάρχουν δεδομένα σχετικά με τη συγκέντρωση της ΑΜΗ σε μετεφηβικά άτομα με καρυότυπο 46 ΧΧ. Αντίθετα, σε νεογνά και παιδιά με τρισωμία 21 η συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό ελαττώνεται πολύ γρήγορα, ήδη από τη νεογνική ηλικία, η συγκέντρωση της Τ είναι στα κατώτερα φυσιολογικά όρια ή χαμηλότερα και η συγκέντρωση της LH αυξάνει, υποδηλώνοντας την εμφάνιση υπεργοναδοτροπικού υπογοναδισμού αρκετά πρώιμα στη ζωή των ατόμων με τη συγκεκριμένη καρυοτυπική διαταραχή (185). 3.7.8. Kιρσοκήλη Σε μελέτη που περιελάμβανε αγόρια προεφηβικής και εφηβικής ηλικίας με κιρσοκήλη ΙΙ ή ΙΙΙ βαθμού διαπιστώθηκε ότι η συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό ήταν υψηλότερη από την αντίστοιχη αγοριών χωρίς κιρσοκήλη σε ανάλογο στάδιο εφηβείας κατά Tanner (186). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ίσως μία πρώιμη διέγερση των κυττάρων Sertoli από την κιρσοκήλη, πιθανότατα μέσω ελάττωσης της λειτουργίας των κυττάρων Leydig. Σε πρόσφατη μελέτη διαπιστώθηκε ότι οι συγκεντρώσεις της ΑΜΗ στο περιφερικό αίμα 61 ανδρών με κιρσοκήλη δεν διέφεραν στατιστικώς σημαντικά συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα 31 γόνιμων ανδρών. Το ενδιαφέρον και μή αναμενόμενο εύρημα της μελέτης ήταν ότι η συγκέντρωση της ΑΜΗ στο περιφερικό αίμα των ανδρών με κιρσοκήλη ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη συγκριτικά με την αντίστοιχη στη σπερματική φλέβα (187). Ωστόσο μελέτες που να διερευνούν τις μεταβολές της ΑΜΗ σε υπογόνιμους άνδρες με κιρσοκήλη πριν και μετά τη χειρουργική επέμβαση δεν έχουν δημοσιευθεί. 3.7.9. Παχυσαρκία και μεταβολικό σύνδρομο Τα τελευταία χρόνια δημοσιεύθηκαν αρκετές μελέτες που δείχνουν ότι η παχυσαρκία στους άνδρες επηρεάζει αρνητικά την αναπαραγωγική τους υγεία. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι το υπερβάλλον σωματικό βάρος σχετίζεται με υπογονιμότητα και διαταραχές στις 103

παραμέτρους του σπερμοδιαγράμματος (188-190) αν και το τελευταίο δεν επιβεβαιώθηκε σε πρόσφατη μετα-ανάλυση (191). Σε δύο πρόσφατες μελέτες βρέθηκε ότι η συγκέντρωση της ΑΜΗ είναι χαμηλότερη σε άνδρες με παχυσαρκία. Στη πρώτη μετρήθηκε η συγκέντρωση της ΑΜΗ σε 64 ζευγάρια φυσιολογικών δίδυμων ανδρών (23 μονοζυγωτικά, 41 διζυγωτικά) από τη Δανία και διαπιστώθηκε ότι οι άνδρες με φυσιολογικό δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ) είχαν υψηλότερη συγκέντρωση ΑΜΗ (9,7 ± 1,2 ng/ml) συγκριτικά με τους παχύσαρκους (6,7 ± 0,9 ng/ml, p = 0,04). Επίσης βρέθηκε αρνητική συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων της ΑΜΗ και του ΔΜΣ και μεταξύ της ΑΜΗ και της λιπώδους μάζας των ανδρών (192). Η δεύτερη μελέτη διερεύνησε 20 παχύσαρκους άνδρες με μεταβολικό σύνδρομο και 20 άνδρες αντίστοιχης ηλικίας με φυσιολογικό ΔΜΣ και βρήκε ότι η συγκέντρωση της ΑΜΗ ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα των παχύσαρκων ανδρών (30,84 ± 13,14 vs. 43,14 ± 9,06 pmol/l, p = 0,002). Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι οι άνδρες με διαταραχή στο μεταβολισμό των υδατανθράκων είχαν τα χαμηλότερα επίπεδα ΑΜΗ (193). H απώλεια βάρους μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της συγκέντρωσης της ΑΜΗ όπως έδειξε μελέτη με 43 υγιείς παχύσαρκους άνδρες (ΔΜΣ > 33 kg/m 2 ) ηλικίας 20 έως 59 ετών οι οποίοι ακολούθησαν πρόγραμμα ολιγοθερμιδικής δίαιτας 14 εβδομάδων και έχασαν το 15% του αρχικού τους βάρους (194). Το εύρημα αυτό δεν επιβεβαιώθηκε σε πιο πρόσφατη μελέτη, η οποία έδειξε ότι η απώλεια βάρους (% του αρχικού βάρους: 18,8 ± 5,2%) που επιτεύχθηκε με βαριατρική επέμβαση σε 33 άνδρες με νοσογόνο παχυσαρκία (ΔΜΣ: 50,35 ± 6,1 kg/m 2 ) δεν προκάλεσε στατιστικά σημαντική αλλαγή στη συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό (195). Στη τελευταία μελέτη διαπιστώθηκε ότι πρίν την επέμβαση οι παχύσαρκοι άνδρες με ελαττωμένα επίπεδα ελεύθερης Τ (FT < 65 pg/ml) είχαν στατιστικώς σημαντικά χαμηλότερη συγκέντρωση ΑΜΗ συγκριτικά με τους παχύσαρκους ευγοναδικούς άνδρες. 3.7.10. Διαταραχές της σπερματογένεσης - Ανδρική υπογονιμότητα Eίναι γνωστό ότι η ΑΜΗ εκκρίνεται και προς τον αυλό του σπερματικού σωληναρίου ιδιαίτερα μετά την εφηβεία. Τα επίπεδά της στο σπέρμα γόνιμων ανδρών είναι υψηλότερα 104

εκείνων του ορού (122). Tα επίπεδα της ορμόνης στο σπέρμα υπογόνιμων ανδρών με ολιγοζωοσπερμία είναι χαμηλότερα από τα αντίστοιχα ανδρών με φυσιολογικές σπερματικές παραμέτρους και σχετίζονται θετικά με τον αριθμό των σπερματοζωαρίων και το μέσο όγκο των όρχεων (123). Στην αποφρακτική αζωοσπερμία η συγκέντρωση της ΑΜΗ στο σπέρμα είναι μη ανιχνεύσιμη, επιβεβαιώνοντας την ορχική προέλευση της, ενώ σε άνδρες με μη αποφρακτική αζωοσπερμία, υψηλότερες συγκεντρώσεις ΑΜΗ στο σπέρμα σχετίζονται θετικά με την πιθανότητα ανεύρεσης σπερματοζωαρίων στη βιοψία των όρχεων (122). Γι αυτό το λόγο είχε προταθεί η μέτρηση της ΑΜΗ στο σπέρμα ως ένας δείκτης εστιακής σπερματογένεσης σε καταστάσεις μη αποφρακτικής αζωοσπερμίας που προβλέπει την ανεύρεση σπερματοζωαρίων στη βιοψία όρχεων και τη χρήση τους σε τεχνικές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Πρόσφατες μελέτες, εκτός από μία (161), επιβεβαίωσαν τα ελαττωμένα επίπεδα της ΑΜΗ στο σπέρμα υπογόνιμων ανδρών με ολιγοσπερμία ή αζωοσπερμία συγκριτικά με γόνιμους, διαπίστωσαν όμως ότι η προγνωστική τους αξία όσον αφορά την ανεύρεση σπερματοζωαρίων στη TESE είναι κλινικά μη σημαντική (196-198). Σε μία εξ αυτών φάνηκε ότι ο συνδυασμός τριών παραμέτρων (FSH ορού, ανασταλτίνη και ΑΜΗ σπέρματος) είχε καλύτερη προγνωστική αξία από την κάθε παράμετρο ξεχωριστά (197). Oι μελέτες που εξετάζουν τις μεταβολές της ΑΜΗ στον ορό υπογόνιμων ανδρών είναι πολύ λίγες και δίνουν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Η συγκέντρωση της ΑΜΗ βρέθηκε στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη στη συστηματική κυκλοφορία υπογόνιμων ανδρών με ολιγοσπερμία ή μη αποφρακτική αζωοσπερμία σε σχέση με γόνιμους άνδρες ή υπογόνιμους με αποφρακτική αζωοσπερμία (161,199). Tο εύρημα αυτό δεν επιβεβαιώθηκε σε δύο επόμενες μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό υπογόνιμων ανδρών (175,200). Στη μελέτη των Tüttelmann et al., η συγκέντρωση της ΑΜΗ δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ ανδρών με φυσιολογικό σπερμοδιάγραμμα, υπογόνιμων ανδρών με ιδιοπαθή ολιγοσπερμία και υπογόνιμων ανδρών με κρυψορχία αλλά στην ομάδα της κρυψορχίας βρέθηκε σημαντική θετική συσχέτιση της ΑΜΗ με το μέγεθος των όρχεων και σπερματολογικές παραμέτρους και αρνητική με την FSH (175). Επίσης, δύο πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό δεν διέφερε στατιστικά σημαντικά μεταξύ ανδρών με φυσιολογική συγκέντρωση σπερματοζωαρίων, ολιγοσπερμία ή αζωοσπερμία (201,202). Koινό 105

χαρακτηριστικό όλων των προαναφερθέντων μελετών είναι ο σχετικά μικρός αριθμός των υπογόνιμων ανδρών και το γεγονός ότι, με εξαίρεση την εργασία των Tüttelmann et al., δεν μελετήθηκαν τα επίπεδα της ΑΜΗ με κριτήριο τη κλινική αιτιολογική διάγνωση της υπογονιμότητας. Επίσης, δεν φαίνεται να έχει διερευνηθεί σε υπογόνιμους άνδρες η απάντηση της AMH στην εφάπαξ χορήγηση εξωγενώς FSH, όπως έχει γίνει για έναν άλλο λειτουργικό δείκτη των κυττάρων Sertoli, την ανασταλτίνη-β (203). Όσον αφορά τη προγνωστική αξία των συγκεντρώσεων της AMH στο αίμα σε σχέση με την ανεύρεση σπερματοζωαρίων στην TESE, μία μόνο μελέτη έχει δημοσιευθεί, με μικρό αριθμό ατόμων, στην οποία δε βρέθηκε καμία διαφορά μεταξύ των ομάδων (204). Eπίσης, δύο μελέτες έδειξαν ότι η συγκέντρωση της ΑΜΗ στον ορό υπογόνιμων ανδρών δεν μπορεί να προβλέψει την επίτευξη εγκυμοσύνης με τη μέθοδο της εξωσωματικής μικρογονιμοποίησης (IVF-ICSI) (201, 202). 3.7.11. Η ΑΜΗ ως δυνητικά θεραπευτικός παράγοντας Η ανασταλτική δράση της ΑΜΗ στη στεροειδογένεση των κυττάρων Leydig θα μπορούσε να αποτελέσει τη βάση για τη θεραπευτική χρήση της ορμόνης σε καταστάσεις όπου απαιτείται καταστολή της παραγωγής των ανδρογόνων, όπως η πρώιμη ήβη, η καλοήθης υπερπλασία και το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη (104). Τα αποτελέσματα από in vitro και in vivo μελέτες, όπου φαίνεται η ανασταλτική επίδραση της ορμόνης στο πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων από προστατικό καρκίνωμα (144), οφθαλμικό μελάνωμα (205) και άλλα νεοπλάσματα (206), ενισχύουν την προοπτική χρήσης της ΑΜΗ ως θεραπευτικού εργαλείου στην ογκολογία, αρκεί βέβαια να εξασφαλισθεί η δυνατότητα παραγωγής και χορήγησης κεκαθαρμένης ορμόνης σε φαρμακευτικές ποσότητες. Mία δυνητικά χρήσιμη εφαρμογή της ΑΜΗ στο τομέα της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής βασίζεται στα αποτελέσματα μελέτης που έδειξε ότι η επώαση του σπέρματος - φρέσκου ή συντηρημένου - με την ορμόνη, βελτιώνει την κινητικότητα και τη βιωσιμότητα των σπερματοζωαρίων στις 5 και 22 ώρες (160). 106

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 107

1. Σκοπός Σκοποί της παρούσας μελέτης είναι οι εξής: 1. H εκτίμηση των βασικών συγκεντρώσεων της ΑΜΗ στον ορό περιφερικού αίματος ανδρών με διάφορα αίτια υπογονιμότητας και η διερεύνηση της συσχέτισής τους με κλινικές, ορμονικές και παραμέτρους του σπερμοδιαγράμματος. 2. Η εκτίμηση των μεταβολών της συγκέντρωσης της ΑΜΗ στον ορό γόνιμων και υπογόνιμων ανδρών μετά την εφάπαξ χορήγηση ανθρώπινης, ανασυνδυασμένης FSH. 109

2. Ασθενείς και μέθοδοι 2.1. Ασθενείς Οι άνδρες που μελετήθηκαν εισήχθησαν προοπτικά στη μελέτη και προήλθαν από υπογόνιμους άνδρες που εξετάστηκαν στο ιατρείο ανδρικής υπογονιμότητας της Μονάδας Ενδοκρινολογίας Αναπαραγωγής της Α Μαιευτικής- Γυναικολογικής Κλινικής του ΑΠΘ κατά τα έτη 2005 έως 2009. Η Μονάδα Ενδοκρινολογίας Αναπαραγωγής αποτελεί κέντρο αναφοράς για τη Βόρειο Ελλάδα με αντικείμενο μελέτης τόσο την ανδρική όσο και τη γυναικεία υπογονιμότητα. Οι άνδρες που μελετήθηκαν προσήλθαν για προληπτικό έλεγχο γονιμότητας ή στα πλαίσια διερεύνησης υπογόνιμου ζευγαριού είτε εξαιτίας κάποιου συμπτώματος ή σημείου που παρέπεμπε σε υπογονιμότητα. Αρκετοί προσήλθαν απευθείας στη Μονάδα, ενώ άλλοι παραπέμφθηκαν από τους θεράποντες ιατρούς τους. Το δείγμα ήταν συνεχές και το είδος της μελέτης ήταν χρονικής στιγμής (cross-sectional). Συνολικά μελετήθηκαν 144 υπογόνιμοι άνδρες. Τα κριτήρια εισόδου στη μελέτη ήταν: 1. Η παρουσία υπογονιμότητας οριζόμενη ως αδυναμία επίτευξης κύησης μετά από τουλάχιστον ένα έτος ελεύθερων επαφών ή/και 2. η παρουσία τουλάχιστον δύο παθολογικών σπερμοδιαγραμμάτων με χρονική απόσταση μεταξύ τους μεγαλύτερη ή ίση με 70 ημέρες. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν 44 δυνητικά ή αποδεδειγμένα γόνιμοι άνδρες από το γενικό πληθυσμό, οι οποίοι δεν έπασχαν από χρόνια νοσήματα και δεν λάμβαναν ορμονικά σκευάσματα, όπως αναβολικά στεροειδή. Τα κριτήρια εισόδου ήταν: 1. Η αναφερόμενη κύηση της συζύγου μετά από αυτόματη σύλληψη το τελευταίο έτος ή/και 2. φυσιολογικό σπερμοδιάγραμμα 110

2.2. Μέθοδοι Όλοι οι υπογόνιμοι άνδρες υποβλήθηκαν σε κλινικοεργαστηριακό έλεγχο που περιελάμβανε: Ιστορικό Κλινική εξέταση Σπερμοδιάγραμμα (τουλάχιστον δύο με απόσταση 70 ημερών) Ορμονικό έλεγχο με μέτρηση των FSH, LH, PRL, ολικής Τ, ανασταλτίνης-β (Inh- B) και ΑΜΗ Υπερηχογράφημα και Doppler οσχέου Ανάλογα με τα κλινικά ευρήματα και τα αποτελέσματα των προαναφερθέντων εξετάσεων και στα πλαίσια τεκμηρίωσης της αιτιολογικής διάγνωσης της υπογονιμότητας οι άνδρες υποβάλλονταν σε περαιτέρω έλεγχο: 1. Καλλιέργεια σπέρματος για αερόβια και αναερόβια μικρόβια, χλαμύδια, μυκόπλασμα και ουρεόπλασμα 2. Βιοχημικό έλεγχο σπέρματος με μέτρηση φρουκτόζης ή α-γλυκοσιδάσης σε υπόνοια αποφρακτικής αζωοσπερμίας 3. MRI υποθαλάμου-υπόφυσης σε περίπτωση υπεπρολακτιναιμίας ή υπογοναδοτροπικού υπογοναδισμού. 4. Γενετικό έλεγχο (ανάλυση καρυοτύπου) και 5. FNA όρχεων Επίσης, σε όλους τους άνδρες της ομάδας ελέγχου έγινε λήψη του ιστορικού, κλινική εξέταση, διενεργήθηκε σπερμοδιάγραμμα και ορμονικός έλεγχος, ανάλογος αυτού της ομάδας των υπογόνιμων. Σε 32 υπογόνιμους άνδρες και επτά άνδρες από την ομάδα ελέγχου που έδωσαν τη συγκατάθεσή τους, διενεργήθηκε η δοκιμασία ΕFSERT (Εxogenous FSH Sertoli Reserve Test). Στη δοκιμασία αυτή έγινε μέτρηση της συγκέντρωσης ΑΜΗ στο περιφερικό αίμα πριν, 24 και 48 ώρες μετά τη εφάπαξ χορήγηση rhfsh. 111

Ακολούθως, περιγράφεται αναλυτικά η μεθοδολογία των επιμέρους ελέγχων. 2.2.1. Ιστορικό Σε ειδικό φύλλο ιστορικού - ερωτηματολόγιο καταγράφονταν τα δημογραφικά στοιχεία του ασθενούς (ηλικία, επάγγελμα, τόπος κατοικίας), η αιτία προσέλευσης, το αναπαραγωγικό ιστορικό (επίτευξη κύησης στο παρελθόν με την ίδια ή άλλη σύντροφο, συχνότητα επαφών), η χρονική διάρκεια της υπογονιμότητας, η ηλικία εμφάνισης των σημείων εφηβείας και η εξέλιξή τους, η ύπαρξη διαταραχών της ερωτικής επιθυμίας ή της στυτικής λειτουργίας, η παρουσία άλλων συμπτωμάτων ενδεικτικών υπογοναδισμού (κόπωση-μείωση της ενεργητικότητας, υπνηλία, μυική αδυναμία, ελάττωση της συχνότητας ξυρίσματος), το ιστορικό παρωτίτιδας, υποσπαδία, κρυψορχίας, συστροφής όρχεων, τραυματισμών, λομώξεων ή χειρουργικών επεμβάσεων στο ουρογεννητικό σύστημα, η εμφάνιση εμπυρέτου το τελευταίο τρίμηνο, η παρουσία άλλων συστηματικών νοσημάτων (κυστική ίνωση, σακχαρώδης διαβήτης, υπερλιπιδαιμία, αρτηριακή υπέρταση, στεφανιαία νόσος, νεφρική ή ηπατική νόσος, νευρολογικά νοσήματα, συγγενείς αιμοσφαιρινοπάθειες, νεοπλάσματα, ενδοκρινοπάθειες), η λήψη φαρμακευτικών σκευασμάτων, η χορήγηση χημειοθεραπείας ή ακτινοθεραπείας στο παρελθόν, οι συνήθειες και έξεις της προσωπικής ζωής (κάπνισμα, κατανάλωση αλκοόλ, εξαρτησιογόνες ουσίες, σωματική άσκηση) και η έκθεση σε βλαπτικούς περιβαλλοντικούς παράγοντες (αυξημένη θερμοκρασία, εντομοκτόνα, βαρέα μέταλλα, φυτοοιστρογόνα κ.λ.π). Επίσης καταγράφονταν στοιχεία από το οικογενειακό ιστορικό όπως η ύπαρξη άλλων συγγενών με πρόβλημα γονιμότητας ή συστηματικά νοσήματα. 2.2.2. Κλινική εξέταση Η φυσική εξέταση του υπογόνιμου άνδρα περιελάμβανε τη καταγραφή των σωματομετρικών παραμέτρων (βάρος σώματος, ύψος, άνοιγμα χεριών), τη μέτρηση της αρτηριακής πιέσεως, την εκτίμηση της ύπαρξης και του βαθμού ανάπτυξης των δευτερογενών χαρακτήρων του φύλου, τον έλεγχο για ουλές από επεμβάσεις, την εξέταση του πέους, τη ψηλάφηση των όρχεων και τη καταγραφή της θέσης και της σύστασής τους και την εκτίμηση του μεγέθους τους με το ορχιδόμετρο του Prader. Καταγραφόταν ο όγκος κάθε όρχι εκφρασμένος σε ml, ενώ ως φυσιολογικό μέγεθος θεωρήθηκε τιμή 15 ml.. Επιπλέον στη κλινική εξέταση 112

γινόταν έλεγχος για ύπαρξη κιρσοκήλης σε ορθία θέση και με δοκιμασία Valsalva, ψηλάφηση των επιδιδυμίδων και των σπερματικών τόνων και εφόσον υπήρχαν ενδείξεις, δακτυλική εξέταση του προστάτη από ουρολόγο. Τέλος, και ανάλογα με τα στοιχεία του ιστορικού, γινόταν επισκόπηση και ψηλάφηση του θυρεοειδούς αδένα. 2.2.3. Σπερμοδιάγραμμα Στους άνδρες της ομάδας ελέγχου γινόταν τουλάχιστον ένα σπερμοδιάγραμμα, ενώ στους υπογόνιμους τουλάχιστον δύο, με χρονική απόσταση μεταξύ τους ίση ή μεγαλύτερη των 70 ημερών. Η συλλογή του σπέρματος γινόταν μετά από περίοδο σεξουαλικής αποχής 3-4 ημερών και τα σπερμοδιαγράμματα αξιολογούνταν σύμφωνα με τα κριτήρια του ΠΟΥ (68) από το Βιοχημικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου «Παπαγεωργίου» της Θεσσαλονίκης. Σε περίπτωση αναφερόμενης λήψης ορμονικών σκευασμάτων ή εμπυρέτου κατά το τελευταίο τρίμηνο, τα σπερμοδιαγράμματα γίνονταν μετά την πάροδο τριών μηνών από τη λήξη της θεραπείας ή του εμπυρέτου αντίστοιχα. Τα σπερμοδιαγράμματα κατατάχθηκαν στις εξής κατηγορίες: Αζωοσπερμία, όταν υπήρχε παντελής έλλειψη σπερματοζωαρίων στο δείγμα και στο ίζημα μετά τη φυγοκέντρηση. H φυγοκέντρηση του δείγματος γινόταν στα 1000 g για 15 λεπτά. Η τεκμηρίωση της διάγνωσης της αζωοσπερμίας στηριζόταν στην ύπαρξή της σε τουλάχιστον δύο συνεχόμενα σπερμοδιαγράμματα. Κρυπτοζωοσπερμία, όταν δεν υπήρχαν σπερματοζωάρια στο δείγμα κατά την αρχική εξέταση του, αλλά εντοπιζόταν ελάχιστα στο ίζημα μετά τη φυγοκέντρηση του δείγματος. Βαρεία ΟΤΑ, όταν η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων ήταν 5 x 10 6 /ml, η συνολική προωθητική κινητικότητα (ζωηρή και νωθρή) 50% και η φυσιολογική μορφολογία 15%. Μέτρια ήπια ΟΤΑ, όταν η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων ήταν > 5 και < 20 x 10 6 /ml, η προωθητική κινητικότητα 50% και η φυσιολογική μορφολογία 15%. 113

Ασθενο-τερατοσπερμία, όταν η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων ήταν 20 x 10 6 /ml, η προωθητική κινητικότητα < 50% και η φυσιολογική μορφολογία < 15%. Ασθενοσπερμία, όταν η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων ήταν 20 x 10 6 /ml, η προωθητική κινητικότητα < 50% και η φυσιολογική μορφολογία 15%. Τερατοσπερμία, όταν η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων ήταν 20 x 10 6 /ml, η προωθητική κινητικότητα 50% και η φυσιολογική μορφολογία < 15%. Ολιγοσπερμία, όταν η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων ήταν < 20 x 10 6 /ml, η προωθητική κινητικότητα 50% και η φυσιολογική μορφολογία 15%. Φυσιολογικό σπερμοδιάγραμμα, όταν ο όγκος του σπέρματος ήταν > 2 ml, η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων 20 Χ 10 6 /ml, η συνολική προωθητική κινητικότητα 50% και το ποσοστό φυσιολογικών μορφολογικά σπερματοζωαρίων 15% Ως υποσπερμία χαρακτηριζόταν η ελάττωση του όγκου του σπερματικού υγρού < 2 ml, ενώ η απουσία σπέρματος κατά την εκσπερμάτιση, παρά τη φυσιολογική στύση και την ύπαρξη οργασμού, χαρακτηριζόταν ως ασπερμία. Σε υπογόνιμους άνδρες με παρουσία τουλάχιστον 1Χ10 6 /ml λευκών αιμοσφαιρίων στο σπερμοδιάγραμμα ή εμφάνιση ενδεικτικής κλινικής συμπτωματολογίας ή σημειολογίας (εμπύρετο, άλγος στους όρχεις, δυσουρία, καύσος στην εκσπερμάτιση, αιμοσπερμία, ευαισθησία και διόγκωση του προστάτη στην δακτυλική) γινόταν καλλιέργεια σπέρματος. Σε αζωοσπερμικούς άνδρες με υποσπερμία, όξινο ph σπέρματος (< 7,2), φυσιολογικό μέγεθος όρχεων ή/και αψηλάφητους σπερματικούς πόρους διενεργούνταν μέτρηση φρουκτόζης και ουδέτερης α-γλυκοσιδάσης στο σπερματικό υγρό. Ο βιοχημικός έλεγχος του σπέρματος γινόταν στο Βιοχημικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου «Παπαγεωργίου» της Θεσσαλονίκης. 2.2.4 Ορμονικός έλεγχος Σε όλους τους άνδρες της μελέτης -υπογόνιμους και ομάδα ελέγχου- έγινε μέτρηση των βασικών συγκεντρώσεων στον ορό της FSH, LH, PRL, ολικής Τ, Inh-B και ΑΜΗ. Η αιμοληψία για τους ορμονικούς προσδιορισμούς γινόταν πρωινές ώρες (08:30-09:30) μετά από οκτάωρη νηστεία. Οι προσδιορισμοί των FSH, LH, PRL και ολικής Τ γινόταν στο 114

Εργαστήριο Ανοσολογίας του Γενικού Νοσοκομείου «Παπαγεωργίου» της Θεσσαλονίκης με τη μέθοδο της ανοσοχημειοφωταύγειας (αναλυτής Immulite 2000, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA) την ίδια ημέρα. Οι τιμές αναφοράς του εργαστηρίου ήταν για την FSH 0,7-11,1 miu/ml, την LH 0,8-7,6 miu/ml, την PRL 2,5-17 ng/ml και την ολική Τ 262-1593 ng/dl. Οι προσδιορισμοί της Inh-Β και ΑΜΗ έγιναν σε δεύτερο χρόνο, σε δείγμα ορού που είχε καταψυχθεί στους μείον είκοσι βαθμούς Κελσίου (-20 ο C) μετά από φυγοκέντρηση του αρχικού δείγματος αίματος για 25 λεπτά στο 80% της φυγοκέντρου. Η συγκέντρωση της Inh-B μετρήθηκε με ανοσοενζυμική μέθοδο (Εnzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) και χρησιμοποιήθηκε το εμπορικά διαθέσιμο kit της εταιρείας DSL (Diagnostic System Laboratories Inc., Webster, TX, USA): DSL-10-84100 ACTIVE Inhibin-B ELISA kit. Η μέθοδος χρησιμοποιεί δύο διαφορετικά αντισώματα για την ορμόνη (μέθοδος «sandwich»).το πρώτο αντίσωμα με το οποίο επωάζονται τα δείγματα είναι ειδικό για την ββ υπομονάδα και βρίσκεται ακινητοποιημένο στα τοιχώματα των πηγαδιών της μικροπλάκας. Μετά από επώαση 14-18 ωρών και πλύσιμο των πηγαδιών προστίθεται το δεύτερο αντίσωμα που είναι ειδικό για την α υπομονάδα της Inh-B και είναι συνδεδεμένο με βιοτίνη. Ακολουθεί πλύσιμο μετά από επώαση 90 λεπτών και προσθήκη στρεπταβιδίνης συζευγμένης με υπεροξειδάση. Η στρεπταβιδίνη έχει τη χαρακτηριστική ιδιότητα να συνδέεται στενά με τη βιοτίνη. Μετά από επώαση 20 λεπτών και τρίτο πλύσιμο προστίθεται το διάλυμα του χρωμογόνου υποστρώματος τετραμεθυλοβενζιδίνη. Μετά από 15-30 λεπτά προστίθεται διάλυμα οξέος για να σταματήσει η αντίδραση και μέσα στην επόμενη μισή ώρα μετράται η απορρόφηση στα 450 nm και 620 nm. Η καταγεγραμμένη απορρόφηση είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωση της Inh-β. Η ευαισθησία της μεθόδου, που υπολογίζεται ως ο μέσος όρος συν δύο τυπικές αποκλίσεις επαναλαμβανόμενων μετρήσεων για το διάλυμα με γνωστή συγκέντρωση 0 pg/ml είναι τα 7 pg/ml. Oι συντελεστές μεταβλητότητας (Coefficient of Variation, CV) όσον αφορά την ακρίβεια των μετρήσεων στο ίδιο kit ( Ιntra-Assay Precision) και σε διαφορετικά kit (Inter- Assay precision) της μεθόδου ήταν 3,5-5,6% και 6,2-7,6% αντίστοιχα. Η ανάκτηση της μεθόδου ήταν 97-114%. 115

Η μέτρηση της συγκέντρωσης της ΑΜΗ έγινε με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) δύο αντισωμάτων (μέθοδος sandwitch ) και το kit που χρησιμοποιήθηκε ήταν το DSL-10-14400 ACTIVE Müllerian Inhibiting Substance / Anti-Müllerian Hormone (MIS / AMH) ELISA kit της εταιρείας DSL (Diagnostic System Laboratories Inc., Webster, TX, USA). Τα δείγματα πρoς μέτρηση αποψύχονταν και μετά την επαναφορά τους σε θερμοκρασία δωματίου (~25 ο C), τοποθετούνταν σε πηγαδάκια μικροστοιχειομετρίας, στο τοίχωμα των οποίων ήταν καθηλωμένο το πρώτο αντίσωμα έναντι της ΑΜΗ. Επωάζονταν για μία ώρα περίπου και τα πηγαδάκια ξεπλένονταν. Ακολουθούσε η προσθήκη του δεύτερου αντισώματος το οποίο είναι συζευγμένο με βιοτίνη, γινόταν επώαση με ήπια ανάδευση για άλλη μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και δεύτερο ξέπλυμα. Στη συνέχεια προστίθονταν διάλυμα που περιέχει στρεπταβιδίνη συζευγμένη με το ένζυμο υπεροξειδάση (Horseradish Peroxidase, HRP), γινόταν επώαση για μισή ώρα, ξέπλυμα της μικροπλάκας και προσθήκη του χρωμογόνου διαλύματος τετραμεθυλβενζιδίνης (Tetramethylbenzidine, TMB). Αφού γινόταν επώαση για 10-15 λεπτά, η ενζυμική μετατροπή του χρωμογόνου υποστρώματος διακόπτονταν με τη προσθήκη ενός όξινου διαλύματος και στην επόμενη μισή ώρα γινόταν η μέτρηση της απορρόφησης του διαλύματος σε δύο μήκη κύματος, στα 450 nm και 600-630 nm. Ο βαθμός της καταγραφείσας απορρόφησης ήταν ευθέως ανάλογος της συγκέντρωσης ΑΜΗ στα δείγματα. Η θεωρητική ευαισθησία της μεθόδου υπολογίσθηκε στα 0,017 ng/ml. Αυτό καθορίσθηκε από την πρόσθεση δύο σταθερών αποκλίσεων στη μέση τιμή της οπτικής πυκνότητας που καταγράφηκε όταν το διάλυμα αναφοράς με μηδενική περιεκτικότητα ΑΜΗ μετρήθηκε οχτώ φορές. Δείγματα από τρείς γνωστές συγκεντρώσεις της ορμόνης μετρήθηκαν οχτώ φορές στο ίδιο kit για να υπολογιστεί ο συντελεστής μεταβλητότητας (CV) που εκφράζει την ενδοαναλυτική ακρίβεια των μετρήσεων της μεθόδου (intra-assay precision): Δείγμα n Μέση τιμή (ng/ml) Σταθερή απόκλιση (ng/ml) CV (%) 1 2 3 8 8 8 0,144 0,843 4,408 0,006 0,020 0,147 4,6 2,4 3,3 116

Επίσης τρία δείγματα με γνωστές συγκεντρώσεις μετρήθηκαν εις διπλούν σε δέκα διαφορετικούς προσδιορισμούς για να υπολογιστεί ο CV που εκφράζει την διαναλυτική ακρίβεια των μετρήσεων της μεθόδου (inter-assay precision): Δείγμα n Μέση τιμή (ng/ml) Σταθερή απόκλιση (ng/ml) CV(%) 1 2 3 10 10 10 0,149 0,850 4,279 0,012 0,041 0,290 8,0 4,8 6,7 H ανάκτηση της μεθόδου υπολογίστηκε ότι είναι 98-109%, ενώ για τον καθορισμό της γραμμικότητας χρησιμοποιήθηκαν δύο δείγματα ορών τα οποία αναμείχθηκαν σε διαφορετικούς βαθμούς αραίωσης με πρότυπο διάλυμα ΑΜΗ μηδενικής συγκέντρωσης και στη συνέχεια μετρήθηκαν: 2.2.5. Δοκιμασία EFSERT Η δοκιμασία EFSΕRT είναι μία δυναμική δοκιμασία εκτίμησης των εφεδρειών των κυττάρων Sertoli χρησιμοποιώντας ως δείκτες ορμονικά τους προιόντα όπως η Inh-B και η ΑΜΗ. Η δοκιμασία έγινε σε 7 άνδρες από την ομάδα ελέγχου και σε 32 υπογόνιμους μετά την λήψη της συγκατάθεσής τους. Βασική προυπόθεση για την διενέργεια της δοκιμασίας 117

ήταν η απουσία οποιουδήποτε ορμονικού θεραπευτικού χειρισμού (χορήγηση Τ, γοναδοτροπινών ή αντι-οιστρογόνων) το τελευταίο τρίμηνο. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: 1η επίσκεψη: Η διαδικασία ξεκινούσε για κάθε άνδρα ημέρα Δευτέρα, Τρίτη ή Τετάρτη, ώστε να ολοκληρώνεται πριν το Σαββατοκύριακο. Το πρωί (9:00-9:30) και μετά από οκτάωρη νηστεία τουλάχιστον, γινόταν λήψη 20ml φλεβικού αίματος το οποίο τοποθετούνταν σε αιματολογικό σωληνάριο χωρίς αντιπηκτικό. Μετά την αιμοληψία ακολουθούσε η χορήγηση εφάπαξ 300 IU ανθρώπινης ανασυνδυασμένης FSH (rhfsh) από προγεμισμένη πένα (Gonal-F pen 900IU, Serono, Bari, Italy). H ένεση της rhfsh γινόταν ενδομυικά, στο δελτοειδή μυ. Στη συνέχεια γινόταν φυγοκέντρηση του ληφθέντος δείγματος αίματος στο 80% της φυγόκεντρου για 25 λεπτά, και ο παραγόμενος ορός μοιραζόταν σε πλαστικά σωληνάρια τύπου Beckmann, περιεκτικότητας 2 ml έκαστο. Δύο πλαστικά σωληνάρια στέλνονταν άμεσα στο Εργαστήριο Ανοσολογίας του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης Παπαγεωργίου για τη μέτρηση των FSH, LH, PRL και ολικής Τ. Τα υπόλοιπα σωληνάρια καταψύχονταν στους -20 ο C, ώστε να χρησιμοποιηθούν σε δεύτερο χρόνο για τη μέτρηση των βασικών συγκεντρώσεων Inh-B και AMH. 2η επίσκεψη: Την επόμενη ημέρα (24 ώρες μετά τη χορήγηση της rhfsh), το πρωί (9:00-9:30) και μετά από οκτάωρη νηστεία γινόταν η δεύτερη αιμοληψία. Μετά τη φλεβοκέντηση και τη λήψη 10 ml αίματος σε σωληνάριο χωρίς αντιπηκτικό, ακολουθούσε φυγοκέντρηση, τοποθέτηση του ορού σε πλαστικά σωληνάρια τύπου Beckmann, κατάψυξή τους στους μείον 20ºC και σε δεύτερο χρόνο μέτρηση της συγκέντρωσης της ΑΜΗ. 3η επίσκεψη: Η δοκιμασία ολοκληρωνόταν 48 ώρες μετά τη χορήγηση της FSH, με την τρίτη αιμοληψία για τη μέτρηση της ΑΜΗ, η οποία γινόταν όπως περιγράφηκε στη 2η επίσκεψη. 2.2.6 Απεικονιστικός και γενετικός έλεγχος Σε όλους τους υπογόνιμους άνδρες έγινε υπερηχογράφημα και Doppler οσχέου. Σκοπός του ελέγχου ήταν η εντόπιση της θέσης των όρχεων σε περίπτωση μη ψηλάφησής τους στο 118

όσχεο και η απεικόνιση της υφής και σύστασής τους με ιδιαίτερη έμφαση στην εντόπιση ύποπτων μορφωμάτων ή μικρολιθίασης. Το doppler οσχέου γινόταν με τον άνδρα σε ορθία θέση και μετά από δοκιμασία Valsalva για τη διαπίστωση ή επιβεβαίωση κλινικά εμφανούς κιρσοκήλης. Επίσης, στους άνδρες με αποφρακτική αζωοσπερμία και ψηλαφητούς άμφω τους σπερματικούς πόρους γινόταν και διορθικό υπερηχογράφημα για να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη απόφραξης των εκσπερματιστικών πόρων. Σε 23 υπογόνιμους άνδρες έγινε καρυοτυπικός έλεγχος. Τα κριτήρια παραπομπής για γενετικό έλεγχο ήταν η παρουσία κλινικού και βιοχημικού πρωτοπαθούς υπογοναδισμού ή η ύπαρξη μικρού μεγέθους όρχεων, αυξημένων συγκεντρώσεων FSH και αζωοσπερμίας ή βαρείας ΟΤΑ στο σπερμοδιάγραμμα. Για την ανάλυση του καρυοτύπου γινόταν φλεβοκέντηση και λήψη 5 ml φλεβικού αίματος σε σωληνάριο με αντιπηκτικό (ΕDTA) το οποίο καταψύχονταν, χωρίς φυγοκέντρηση, στους -20ºC μέχρι την ημέρα της γενετικής ανάλυσης. 2.2.7. FNA όρχεων Σε 96 υπογόνιμους άνδρες με αζωοσπερμία, κρυπτοζωοσπερμία ή βαρεία OTA έγινε αμφοτερόπλευρα βιοψία των όρχεων δια λεπτής βελόνης (FNAB), μετά από λήψη της συγκατάθεσής τους. Σκοπός της FNA ήταν η τεκμηρίωση της αιτιολογίας της υπογονιμότητας και ιδιαίτερα η διαφορική διάγνωση μεταξύ αποφρακτικής και μη αζωοσπερμίας και μεταξύ κιρσοκήλης και πρωτοπαθούς ορχικής βλάβης. Επίσης, σε αρκετούς αζωοσπερμικούς άνδρες η FNA έγινε για τη διερεύνηση ύπαρξης σπερματοζωαρίων στους όρχεις στα πλαίσια αντιμετώπισής τους με ICSI. Αντενδείξεις για τη διενέργεια της FNAB ήταν η παρουσία αιμορραγικής διάθεσης και η λήψη αντιπηκτικής ή αντιαιμοπεταλιακής αγωγής. Η FNA όρχεων γινόταν με τοπική αναισθησία. Μετά από προσεκτικό καθαρισμό του οσχέου και της περιοχής των έξω γεννητικών οργάνων με αντισηπτικό διάλυμα, αποστειρωμένα οθόνια χρησιμοποιούνταν για την απομόνωση του χειρουργικού πεδίου. Ακολουθούσε χορήγηση τοπικού αναισθητικού στο όσχεο, στα ακριβή σημεία των παρακεντήσεων και καθήλωση του όρχι μεταξύ του αντίχειρα και του δείκτη, ακριβώς κάτω από το όσχεο 119

προκειμένου να αποφευχθεί πιθανή βλάβη στην επιδιδυμίδα. Μια βελόνη βιοψίας 23 G (πεταλούδα) εισαγόταν σε δύο ή τρία σημεία κάθε όρχεως προκειμένου να ληφθούν τα δείγματα. Η βελόνη της βιοψίας συνδεόταν με μια σύριγγα 20 ml μιας χρήσης. Κατά την εισαγωγή της βελόνης στον ορχικό πόλο, η απόσυρση του εμβόλου της σύριγγας δημιουργούσε συνεχή αρνητική πίεση έτσι ώστε το υλικό να λαμβάνεται αδιάλειπτα. Στους περισσότερους άνδρες παρακεντήθηκαν ο άνω και ο κάτω πόλος και σε μικρό ποσοστό και η μεσότητα του όρχεως. Επομένως λήφθηκαν συνολικά 4 με 6 δείγματα από κάθε άνδρα. Το υλικό που αναρροφήθηκε είτε επιστρώθηκε σε αντικειμενοφόρο πλάκα και μονιμοποιήθηκε άμεσα σύμφωνα με τη συμβατική μέθοδο επίστρωσης των παρασκευασμάτων είτε τοποθετήθηκε σε φιαλίδιο ThinPrep (Cytyc Corporation, Boxborough, MA) σύμφωνα με την τεχνική στρώσης λεπτής στιβάδας. Το φιαλίδιο ThinPrep περιέχει ειδικό διάλυμα (CytoLyt solution), με κύριο συστατικό τη μεθανόλη, η οποία προκαλεί λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων (αιμόλυση), προλαμβάνει την καθίζηση των πρωτεϊνών, προκαλεί βλεννόλυση και διατηρεί τη μορφολογία των κυττάρων. Επομένως, η προετοιμασία στρώσης με την τεχνική της λεπτής στιβάδας είναι ανώτερη της συμβατικής ως προς την επάρκεια του δείγματος, τη διατήρηση των κυττάρων, την παρουσία ή μη ερυθρών αιμοσφαιρίων, καθώς και την ευκολία αναγνώρισης των κυττάρων και κατά την τελευταία πενταετία προτιμάται έναντι της συμβατικής στη Μονάδα Ενδοκρινολογίας Αναπαραγωγής της Α Μαιευτικής - Γυναικολογικής Κλινικής του ΑΠΘ. Σε άνδρες που παρακεντήθηκαν 4 σημεία των όρχεων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ThinPrep, ενώ σε άνδρες που παρακεντήθηκαν 5 ή 6 σημεία στα 4 από αυτά χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ThinPrep και στα εναπομείναντα 1 ή 2 η συμβατική μέθοδος επίστρωσης σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Όλα τα τελικά παρασκευάσματα χρωματίσθηκαν με την κλασική χρώση κατά Παπανικολάου. Η αξιολόγηση έγινε από ομάδα δύο έμπειρων κυτταρολόγων και ενός παθολογοανατόμου σύμφωνα με την ταξινόμηση κατά Meng. Αρχικά αξιολογήθηκε σε μικρή μεγέθυνση η επάρκεια του υλικού και στη συνέχεια, σε μεγαλύτερες μεγεθύνσεις γινόταν η αναγνώριση των κυττάρων και η ταξινόμηση των ευρημάτων. Οι κυτταρολογικές διαγνώσεις που τέθηκαν ταξινομήθηκαν σε οχτώ κατηγορίες: 1. Φυσιολογική σπερματογένεση 2. Μέτρια υποσπερματογένεση 120

3. Βαρεία υποσπερματογένεση 4. Πλήρης διακοπή της σπερματογένεσης, όταν διαπιστώνεται διακοπή της σπερματογένεσης σε όλα τα σημεία της βιοψίας 5. Ατελής διακοπή της σπερματογένεσης, όταν τουλάχιστον σε ένα σημείο από τα παρακεντηθέντα διαπιστώνεται η παρουσία σπερματοζωαρίων (εστιακή σπερματογένεση) 6. Πλήρης απλασία του σπερματικού επιθηλίου (πλήρες SCOS), όταν απουσιάζουν πλήρως τα κύτταρα της γεννητικής σειράς σε όλα τα σημεία παρακέντησης 7. Ατελής απλασία του σπερματικού επιθηλίου (ατελές SCOS), όταν τουλάχιστον σε ένα σημείο διαπιστώνεται η παρουσία εστιακής σπερματογένεσης και 8. Ανεπαρκές υλικό. 2.2.8. Μεθοδολογία αιτιολογικής κατάταξης των υπογόνιμων ανδρών Σκοπός των επιμέρους ελέγχων ήταν να τεθεί για κάθε υπογόνιμο άνδρα η ακριβής αιτιολογική διάγνωση. Συνοπτικά, η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε στη παρούσα μελέτη για την αιτιολογική ταξινόμηση των ανδρών, φαίνεται στο σχήμα 1. Σχήμα 1. Τυποποιημένο σχήμα διαγνωστικής προσέγγισης των υπογόνιμων ανδρών. 121