ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΥΠΕΡΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΣΤΑ ΔΟΜΙΚΑ ΚΑΙ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΑΚΤΙΝΙΔΙΝΗΣ

ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΥΠΕΡΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΣΤΑ ΔΟΜΙΚΑ ΚΑΙ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΑΚΤΙΝΙΔΙΝΗΣ Ζ.Αλεξανδράκης, Μ.Γιαννόγλου, Γ.Κατσαρός, Π.Ταούκης Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο Φ.Σταύρος, Γ.Νούνεσης Εργαστήριο Βιομοριακής Φυσικής, Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων και Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η μελέτη των μεταβολών της δραστικότητας και της δομής της ακτινιδίνης μετά από επεξεργασία με ΥΠ ή/και θερμοκρασία. Έγινε προσπάθεια συσχέτισης των αλλαγών στη δομή με την εναπομένουσα δραστικότητα του ενζύμου. Για την μελέτη της δομής πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καθαρισμός της ακτινιδίνης από χυμό ακτινιδίου με χρήση χρωματογραφίας ανιοντανταλλαγής και χρωματογραφίας μοριακής διήθησης. Η καθαρότητα του ενζυμικού διαλύματος ελέγχθηκε με χρήση SDS- Page και IEF ηλεκτροφόρηση. Η καθαρή ακτινιδίνη προσδιορίστηκε ως μια μονομερήs πρωτεΐνη με σχετική μοριακή μάζα 24kDa και ισοηλεκτρικό σημείο 3.5. Στο απομονωμένο και καθαρό ένζυμο μελετήθηκε η επίδραση της ΥΠ και της θερμοκρασίας στη δραστικότητά του και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αντίστοιχα που ελήφθησαν για αντίστοιχη επεξεργασία με ΥΠ χυμού ακτινιδίου. Ο ρυθμός απενεργοποίησης της ακτινιδίνης και στις δυο περιπτώσεις ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης. Υπολογίστηκαν οι κινητικές σταθερές απενεργοποίησης της καθαρής και μη καθαρής ακτινιδίνης και προσδιορίστηκε ένα συνολικό μαθηματικό μοντέλο με το οποίο είναι δυνατός ο υπολογισμός της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησής τους σε ένα μεγάλο εύρος πιέσεων (100 ως 900 Mpa) και θερμοκρασιών (25 ως 70ºC). Συνολικά, βρέθηκε ότι για την απενεργοποίηση της καθαρής ακτινδίνης απαιτούνται πιο έντονες συνθήκες επεξεργασίας συγκριτικά με την ακτινιδίνη σε χυμό ακτινιδίου. Μελετήθηκαν οι δομικές μεταβολές του καθαρού ενζύμου μετά από επεξεργασία με ΥΠ με τη φασματοσκοπία του κυκλικού διχροϊσμού στη περιοχή 190 260 nm καθώς και στην περιοχή (260 360 nm). Για σύγκριση των αποτελεσμάτων μελετήθηκε η μεταβολή στη δομή ενζύμου επεξεργασμένου σε διάφορους συνδυασμούς πίεσης και θερμοκρασίας. Τα ληφθέντα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τη δομή του ανεπεξέργαστου ενζύμου. Συνολικά, διαπιστώθηκαν σχεδόν πλήρως αντιστρεπτές μεταβολές της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής της ακτινιδίνης μετά από εφαρμογή της ΥΠ. Μικρές μεταβολές στη τριτοταγή δομή διαπιστώθηκαν μεταξύ των επεξεργασμένων και του ανεπεξέργαστου δείγματος, οι οποίες πιθανόν να συμβαδίζουν με την εναπομένουσα δραστικότητα του ενζύμου. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μια κατηγορία ενζύμων με εφαρμογές και στη βιομηχανία τροφίμων είναι οι κυστεϊνικές πρωτεάσες, όπως η παπαΐνη, η φικίνη, η βρωμελαΐνη και η ακτινιδίνη. Η ακτινιδίνη περιέχεται στο ακτινίδιο (Actinidia chinensis) και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές, όπως η πήξη του γάλακτος αντί της συνήθους προσθήκης ζωϊκής πυτιάς. Η παραλαβή της σε μορφή ξηρής σκόνης επιτυγχάνεται με κατάλληλη διεργασία που περιλαμβάνει διάφορα στάδια καταβύθισης πρωτεϊνών και απομόνωσης αυτών. Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχει ένας μικρός αριθμός αναφορών σχετικών με την εφαρμογή πρωτεολυτικών ενζύμων ως παράγοντες πήξης κατά την παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων [5,6]. Στις περισσότερες αναφορές, κυρίως στην περίπτωση της παραγωγής των

γαλακτοκομικών προϊόντων, η χρήση πρωτεολυτικών ενζύμων έδινε πολύ καλά αποτελέσματα, στη συνέχεια όμως η μη απενεργοποίησή τους είχε σαν αποτέλεσμα εκτεταμένο βαθμό υδρόλυσης των πρωτεϊνών των προϊόντων με επακόλουθη υποβάθμισή τους κυρίως λόγω παραγωγής «πικρών» πεπτιδίων [2]. Συνεπώς, απαραίτητος για τη χρήση της ως φυτικής πυτιάς είναι ο έλεγχος της πρωτεολυτικής δράσης της. Η αναστολή της δράσης τέτοιων ενζύμων συνήθως επιχειρείται με θερμική επεξεργασία που επηρεάζει αρνητικά τα ποιοτικά χαρακτηριστικά (κυρίως την δομή και την υφή του γαλακτοκομικού πήγματος). Μια εναλλακτική μη θερμική τεχνική που προσφέρει τη δυνατότητα μερικής ή ολικής απενεργοποίησης των ενζύμων είναι η τεχνολογία της Υπερυψηλής Πίεσης (ΥΠ). Η επεξεργασία με Υπερυψηλή Πίεση (ΥΠ) σε συνδυασμό με ήπιες θερμοκρασίες μπορεί να βρει ιδιαίτερες εφαρμογές στη βιοτεχνολογία τροφίμων λόγω της δυνατότητας επίδρασης σε ένζυμα και άλλους βιολογικούς παράγοντες, κατά τρόπο διαφορετικό από τις συμβατικές θερμικές επεξεργασίες. Όσον αφορά τις μελέτες που αφορούν τα πρωτεολυτικά ένζυμα, στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν περιορισμένες αναφορές σχετικές με την επίδραση της ΥΠ σε αυτά [3,4]. Αντικείμενο της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης συνδυασμού Υπερυψηλής Πίεσης (ΥΠ) και θερμοκρασίας στα καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά ακτινιδίνης προερχόμενης από χυμό ακτινιδίου. Παρόλο, που έχουν γίνει σημαντικά βήματα πάνω στη δομή και τον τρόπο λειτουργίας αρκετών φυτικών ενζύμων, για μια ολοκληρωμένη εικόνα και κατανόηση αυτών των ενζύμων είναι απαραίτητος ο συσχετισμός της λειτουργικότητας, των καταλυτικών και βιοχημικών τους χαρακτηριστικών με τη δομική τους διαφοροποίηση που προκαλείται από την ΥΠ. Τα αποτελέσματα της έρευνας συμβάλλουν στην μελέτη του μηχανισμού αδρανοποίησης του συγκεκριμένου ενζύμου με βάση τις μεταβολές που προκαλούνται στη δομή του σε διάφορες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας ως συνάρτηση του χρόνου. Η καλύτερη κατανόηση της συμπεριφοράς των φυτικών ενζύμων σε υψηλές πιέσεις θα μπορούσε να συνεισφέρει πολύτιμη γνώση σε βασικές επιστήμες στο πεδίο της βιολογίας όπως η βιοχημεία, η φυσικοχημεία και η πρωτεϊνική μηχανική, ενώ επιπλέον θα μπορούσε να αποτελέσει το απαραίτητο γνωστικό υπόβαθρο για τη θεμελίωση και βελτιστοποίηση νέων διεργασιών στη βιοχημική μηχανική και στην μηχανική των τροφίμων. Συμπερασματικά, η εφαρμογή της ΥΠ για την απενεργοποίηση της ακτινιδίνης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως φυτικό μέσο πήξης του γάλακτος δίνει ενδιαφέρουσες προοπτικές, ιδιαίτερα αν απαιτείται να επιτευχθεί ενζυμική απενεργοποίηση μετά το πέρας της διαδικασίας παραγωγής θερμοευαίσθητων προϊόντων. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προετοιμασία δειγμάτων Κατά την εκτέλεση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε χυμός ακτινιδίου (ph 3.9) (Hayward cv., Actinidia chinensis) από τον οποίο παραλήφθηκε με διαδικασία χρωματογραφικού διαχωρισμού η καθαρή ακτινιδίνη. Για την εκχύλιση της ακτινιδίνης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος που περιγράφεται στη μελέτη των Brocklehurst et al [1].Αρχικά πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση 1kg χυμού αποφλοιωμένων και πολτοποιημένων ακτινιδίων με 500 ml διαλύματος 200 mm L-cysteine, με τιμή ph 5 που περιείχε 1 mm σε EDTA (ήπια ανάδευση για 60 min). Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 11.000 rpm (30 min) του θολού διηθήματος στους 4 C. Το ίζημα απορρίφθηκε και ελήφθη το υπερκείμενο και διατηρήθηκε υπό ψύξη (0 C) ώστε να αποφευχθεί τυχόν απώλεια δραστικότητας του ενζύμου. Ως αντιοξειδωτικό χρησιμοποιήθηκε το Na 2 O 5 S 2 σε συγκέντρωση 0,8 mm, το οποίο βρίσκει εφαρμογή σε διάφορες διεργασίες τροφίμων. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και ακολούθησε καταβύθιση των πρωτεϊνών παρουσία θεϊικού αμμωνίου (60% κορεσμό) σε χαμηλή θερμοκρασία (4 ο C) για 24 h υπό ήπια μαγνητική ανάδευση. Ακολούθησε φυγοκέντρηση του δείγματος. Το ίζημα συλλέχτηκε και αναδιαλύθηκε σε 300 ml 0,1 M ρυθμιστικού διαλύματος οξικού νατρίου (CH 3 COONa) με ph 4.4, με συγκέντρωση 1 mm σε EDTA. Το ανωτέρω ενζυμικό παρασκεύασμα διηθήθηκε υπό κενό με φίλτρα διαμέτρου 0.45 μm (Millipore, USA) και συμπυκνώθηκε σε συσκευή υπερδιήθησης Amicon P-8400 (Millipore, USA) με μεμβράνες

συγκράτησης μορίων με μοριακό βάρος 10 kda. Το ενζυμικό συμπύκνωμα (ανεπεξέργαστο δείγμα) αποθηκεύτηκε στους -40 ο C μέχρι τον περαιτέρω χρωματογραφικό του διαχωρισμό. Χρωματογραφικός διαχωρισμός Η χρωματογραφία ανιοντανταλλαγής (UNO-Q, Biorad, USA) και η χρωματογραφία μοριακής διήθησης (Sephacryl S-200, GE Healthcare, USA) χρησιμοποιήθηκαν για το διαχωρισμό της ακτινιδίνης του ενζυμικού συμπυκνώματος. Οι στήλες χρησιμοποιήθηκαν σε σύστημα Biologic LP (Biorad, USA) και η μέτρηση απορρόφησης του ενζυμικού διαλύματος πραγματοποιήθηκε στα 280 nm. Η χρωματογραφία διεξήχθη σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και τα κλάσματα τοποθετήθηκαν στους 4 ο C αμέσως μετά τη συλλογή τους. Σε κάθε κλάσμα μετρήθηκε η δραστικότητα της ακτινιδίνης όπως περιγράφεται παρακάτω. Χρωματογραφία ανιονανταλλαγής Το ενζυμικό συμπύκνωμα εισήχθη σε στήλη UNO Q (2.5x10 cm), σε ρυθμιστικό διάλυμα 50mM acetate buffer ph=4.5 (κινητή φάση) με ροή 2.5 ml/min. Μετά την απομάκρυνση από τη στήλη των μη δεσμευμένων μορίων, ακολούθησε η έκλουση των δεσμευμένων στη στήλη μορίων που γίνεται με διαβαθμισμένη συγκέντρωση άλατος (NaCl) σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται εως και 0.5 Μ. Η ροή ρυθμίστηκε στα 2.5 ml/min και τα κλάσματα συλλέγονταν ανά 2 min. Τα κλάσματα, τα οποία περιείχαν την ακτινιδίνη συλλέχθηκαν, συμπυκνώθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -40 ο C. Η ανωτέρω χρωματογραφία ανιονανταλλαγής πραγματοποιήθηκε δύο φορές για την επίτευξη μεγαλύτερου βαθμού καθαρότητας του εξεταζόμενου ενζύμου. Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Το ενζυμικό συμπύκνωμα από τη χρωματογραφία ανιονανταλλαγής τροφοδοτήθηκε στη στήλη χρωματογραφίας μοριακής διήθησης Sephacryl S-200, η οποία είχε αρχικά ισορροπήσει με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm phosphate ph=6.0. Η ροή ρυθμίστηκε στo 1 ml/min και τα κλάσματα συλλέγονταν ανά 12 min.τα κλάσματα, τα οποία περιείχαν την ακτινιδίνη συλλέχθηκαν, συμπυκνώθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -40 ο C. Επεξεργασία με Υπερυψηλή Πίεση Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων επεξεργασίας της ακτινιδίνης με ΥΠ χρησιμοποιήθηκε η μονάδα Food Pressure Unit FPU 1.01, της Resato International ΒV (Roden, Holland) μέγιστης πίεσης και θερµοκρασίας λειτουργίας 1000 MPa και 100 C, αντίστοιχα, με μια συστοιχία έξι µικροθαλάµων όγκου 45 ml ο καθένας, όπου και συμπιέζονταν τα δείγματα. Σε αυτούς συμπιέστηκαν δείγματα ενζυμικού παρασκευάσματος, σε διάφορες πιέσεις διατηρώντας σταθερή την θερμοκρασία σε επιθυμητό επίπεδο. Ο χρόνος επεξεργασίας προσδιορίστηκε κατά τον σχεδιασμό των πειραμάτων και διαφοροποιήθηκε σε κάθε πείραμα ανάλογα με την εφαρμοζόμενη πίεση και τη θερμοκρασία. Για την διεξαγωγή των ισοβαρών και ισοθερμοκρασιακών πειραμάτων έξι δείγματα όγκου 150μL της καθαρής και μη μορφής του ενζυμικού παρασκευάσματος συσκευάστηκαν σε σακουλάκια από πολυστρωματικό υλικό (ΡΕ, φύλλο αλουμινίου, ΡΡ). Οι θάλαμοι είχαν ισορροπήσει στην κατάλληλη θερμοκρασία με τη χρήση συστήματος θέρμανσης-ψύξη. Όλα τα δείγματα μετά την επεξεργασία με ΥΠ αποθηκεύτηκαν υπό κατάψυξη έως τον πειραματικό προσδιορισμό της δραστικότητας και της ανάλυσης της δομής του ενζύμου σε κάθε συνθήκη. Μέτρηση δραστικότητας ακτινιδίνης Για τη μέτρηση της πρωτεολυτικής δραστικότητας των κλασμάτων ακτινιδίνης που προέκυψαν από το χρωματογραφικό διαχωρισμό, καθώς και των επεξεργασμένων δειγμάτων με ΥΠ χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα το αντιδραστήριο Na- Z N BOC L lysine 4 nitrophenyl ester (Fluka-Sigma Chemical Co. MI, USA) το οποίο αποτελεί ένα χαμηλού μοριακού βάρους υπόστρωμα. Ως μονάδα δραστικότητας του ενζύμου θεωρήθηκε η υδρόλυση ενός μmol του προαναφερθέντος υποστρώματος ανά λεπτό με βάση την απελευθέρωση του οξικού νιτροφαινυλεστέρα. Η υδρόλυση λάμβανε χώρα σε κυψελίδα χαλαζία όπου εισάγονταν κατά σειρά 50 μl διαλύματος υποστρώματος 10 mm σε DMSO και

2325 μl ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών συγκέντρωσης 100 mm σε ph 6. Η κυψελίδα εισαγόταν στην υποδοχή του φωτομέτρου (Helios Unicam, USA) και προγραμματιζόταν το όργανο να λαμβάνει μετρήσεις ανά τακτά χρονικά διαστήματα για περίπου 5 λεπτά σε μήκος κύματος 348 nm. Στη συνέχεια, εισάγονταν στην κυψελίδα 125 μl των ενζυμικών διαλυμάτων οπότε και άρχιζε η μέτρηση. Ανάλυση με κυκλικό διχροισμό (CD) Η δευτεροταγής και η τριτοταγής δομή της καθαρής ακτινιδίνης προσδιορίστηκε με φασματοσκοπία κυκλικού διχροισμού (CD). Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων με κυκλικό διχροισμό χρησιμοποιήθηκε το φασματοπολωσίμετρο JASCO-715 με σύστημα Peltier για τον έλεγχο της θερμοκρασίας. Για την λήψη των φασμάτων CD στη περιοχή 190 260 nm (far UV) και στην περιοχή 260 320 nm (near UV) χρησιμοποιήθηκαν κυψελίδες (Quartz SUPRASIL, Hellma) με μήκη διαδρομής 1 και 10 mm αντίστοιχα. Σε κάθε φάσμα αφαιρέθηκε το φάσμα του ρυθμιστικού διαλύματος. Για την ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα ORIGIN 8.0 (OriginLab Corporation, USA) και για τον υπολογισμό των επιμέρους κλασμάτων της δευτεροταγούς δομής χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα CDNN (Institut für Biotechnologie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Για τον έλεγχο των πιθανών μόνιμων αλλαγών της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής της ακτινιδίνης μετά από επεξεργασία με ΥΠ πραγματοποιήθηκε η απομόνωση και ο καθαρισμός του συγκεκριμένου ενζύμου από χυμό ακτινιδίου. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται τα γραφήματα που προέκυψαν από το χρωματογραφικό διαχωρισμό του ενζυμικού συμπυκνώματος τόσο με τη χρωματογραφία ανιοντανταλλαγής όσο και με τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης (Γραφήματα 1Α και 1Β). Γράφημα 1. Α. Χρωματογραφία ανιονανταλλαγής Ι (UNO Q σε 0.05M aceate buffer ph=4.5) της ακτινιδίνης. Α 280 ( ), Ενεργότητα ακτινιδίνης (...) και συγκέντρωση NaCl (M) (- - - -) με ρυθμό ροής 2.5 ml/min στους 25 ο C Β. Χρωματογραφία μοριακής διήθησης (Sephacryl S-200 σε 0.05M phosphate buffer ph=6.0) της ακτινιδίνης. Α 280 ( ) και δραστικότητα της ακτινιδίνης (units/ml) (..) με ρυθμό ροής 1 ml/min στους 25 ο C

Κατά τις χρωματογραφίες ιοντο-ανταλλαγής παρατηρήθηκε ότι η έκλουση της ακτινιδίνης με τη μέγιστη ενεργότητα πραγματοποιήθηκε σε συγκέντρωση 0.17 0.3 Μ NaCl. Ακολούθησε περαιτέρω διαχωρισμός του συγκεκριμένου ενζύμου, με χρωματογραφία μοριακής διήθησης με τη στήλη Sephacryl S-200. Η έκλουση της ακτινιδίνης παρατηρήθηκε ως μια μονή κορυφή στα 220 min (Γράφημα 1Β). Τέλος, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση για τον έλεγχο καθαρότητας του ενζυμικού διαλύματος, το αποτέλεσμα της οποίας έδειξε την ύπαρξη μόνο της ακτινιδίνης ως μιας μονομερούς πρωτεΐνης με σχετική μοριακή μάζα 24 kda και ισοηλεκτρικό σημείο pi 3.5 (Γράφημα 2) Γράφημα 2.. (a) SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση της καθαρής ακτινιδίνης; στήλη A, MW standards; στήλη B, MW της καθαρής ακτινιδίνης, (b) IEF ηλεκτροφόρηση της καθαρής ακτινιδίνης; στήλη C, pi της καθαρής ακτινιδίνης; στήλη D, pi standards Μετά την επεξεργασία της καθαρής και της μη καθαρής ακτινιδίνης με ΥΠ, βρέθηκε ότι ο ρυθμός απενεργοποίησής και των δύο ενζυμικών διαλυμάτων ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης. Για την κάθε πίεση και θερμοκρασία επεξεργασίας υπολογίστηκαν οι σταθερές του ρυθμού απενεργοποίησης. Παρατηρήθηκε ότι το καθαρό ένζυμο ήταν αρκετά πιο ανθεκτικό στην πίεση συγκριτικά με το μη καθαρό (ενζυμικό διάλυμα πριν το χρωματογραφικό διαχωρισμό) φανερώνοντας ότι το ph και ο βαθμός καθαρισμού του ενζύμου παίζουν σημαντικό ρόλο στην βαθμό απενεργοποίησής του (Γράφημα 3). Γράφημα 3. Επίδραση της θερμοκρασίας και της ΥΠ στη καθαρή και ανεπεξέργαστη Γράφημα 4. Επίδραση της θερμοκρασίας και της ΥΠ στη

Στo Γράφημα 4 παρουσιάζεται η επίδραση της πίεσης επεξεργασίας (600-900 MPa) κατά την απενεργοποίηση της καθαρής ακτινιδίνης σε συνδυασμό με θερμοκρασία (50-70ºC). Αύξηση της επιβαλλόμενης πίεσης και της θερμοκρασίας οδήγησε σε γρηγορότερη απενεργοποίηση του ενζύμου. Στο πλαίσιο της συγκεκριμένης έρευνας χρησιμοποιήθηκε ένα συνολικό μαθηματικό μοντέλο (εξίσωση 1) που περιγράφει τη συνδυασμένη επίδραση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση της ακτινιδίνης λαμβάνοντας υπόψη την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από την πίεση και τη θερμοκρασία. k = k refp, T EaP exp R exp A R [ B( P P )] ( T T ) + V ( P P ) ref at ref 1 1 T Tref T ref (Εξ.1) Όπου T (Κ) και P (MPa) η θερμοκρασία και η πίεση, και η πίεση και η θερμοκρασία αναφοράς αντίστοιχα, η σταθερά του ρυθμού στη θερμοκρασία και την πίεση αναφοράς, η ενέργεια ενεργοποίησης στην πίεση αναφοράς, ο όγκος ενεργοποίησης στην θερμοκρασία αναφοράς, R (J mol -1 K -1 ) η σταθερά των αερίων και A (ml mol -1 K -1 ), B (MPa -1 ) παράμετροι που εκφράζουν την επίδραση της θερμοκρασίας στον όγκο ενεργοποίησης και την επίδραση της πίεσης στην ενέργεια ενεργοποίησης αντίστοιχα. Με το μοντέλο αυτό είναι δυνατός ο υπολογισμός της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της ακτινιδίνης και κατ επέκταση και του απαιτούμενου χρόνου επεξεργασίας με ΥΠ, σε ένα μεγάλο εύρος πιέσεων και θερμοκρασιών, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα ελέγχου της επεξεργασίας προϊόντων με την τεχνολογία της ΥΠ. Στον πίνακα 1 εμφανίζονται οι εκτιμώμενες παράμετροι του συνολικού μαθηματικού μοντέλου απενεργοποίησης της καθαρής και της μη καθαρής ακτινιδίνης. Πίνακας 1.Εκτίμηση των παραμέτρων του συνολικού μαθηματικού μοντέλου απενεργοποίησης της καθαρής και μη καθαρής ακτινιδίνης υπό την επίδραση συνδυασμένης πίεσης και θερμοκρασίας Παράμετροι Εκτιμώμενες τιμές για μη καθαρή ακτινιδίνη Εκτιμώμενες τιμές για καθαρή ακτινιδίνη P ref (MPa) 600 600 T ref (K) 313 323 k ref P.T (min -1 ) 0.169±0.011 0.007±0.002 E ap (kj/mol) 104±14 59.2±10.3 V at (ml/mol) -12.8±1.4-9±1.9 B (MPa -1 ) 0.2529±0.0012-0.0020±0.0005 A (ml/molk) 0.0007±0.0003-0.265±0.0064 R 2 0.99 0.99 Τέλος, εξετάστηκαν οι δομικές μεταβολές της καθαρής ακτινιδίνης μετά από επεξεργασία με ΥΠ και θερμική επεξεργασία με τη φασματοσκοπία του κυκλικού διχροισμού στην άπω υπεριώδη περιοχή 190 260 nm καθώς και στην εγγύς υπεριώδη περιοχή (260 360 nm). Όπως παρατηρείται από το γράφημα 5A διαπιστώθηκαν σχεδόν πλήρως αντιστρεπτές μεταβολές της δευτεροταγούς δομής της ακτινιδίνης μετά από εφαρμογή της ΥΠ (500,750 και 900 ΜPa) στους 60 ο C για 20 min. Η θερμοκρασία που εφαρμόστηκε στα πειράματα αυτά είναι

μικρότερη της θερμοκρασίας που συμβαίνει η θερμική αποδιάταξη του συγκεκριμένου ενζύμου (<Τ m ). Στο γράφημα 5Β παρουσιάζονται οι αλλαγές στη τριτοταγή δομή του ενζύμου αυξανομένης της πίεσης. Παρατηρήθηκαν μικρές μεταβολές στη τριτοταγή δομή μεταξύ των επεξεργασμένων δειγμάτων με ΥΠ και του ανεπεξέργαστου δείγματος, οι οποίες πολύ πιθανόν να είναι υπεύθυνες για την σημαντική μείωση της δραστικότητας του ενζύμου (εναπομένουσα δραστικότητα ακτινιδίνης μετά από επεξεργασία στα 500, 750 και 900 ΜPa (60 o C, 20 min) υπολογίστηκε ίση με επί 80, 62 και 45 % επί της αρχικής, αντίστοιχα). Στη κατάσταση που το ένζυμο θεωρείται ενεργό πιστεύεται ότι το ανιόν της θειολικής ομάδας είναι συνδεδεμένο με το θετικά φορτισμένο άζωτο της ομάδας ιμιδαζολίου που υπάρχει στο ενεργό κέντρο του ενζύμου (Gomes et al., 1997). Με εφαρμογή πίεσης ενδεχομένως συμβαίνουν μικρές μεταβολές στο περιβάλλον του ενεργού κέντρου και πιθανόν αυτό το ζεύγος ιόντων να σπάει και οι ελεύθερες φορτισμένες ομάδες (S - και N + ) να ενυδατώνονται με ταυτόχρονη μείωση του όγκου του ενζυμικού διαλύματος. Συνεπώς, η ελεύθερη θειολική ομάδα μπορεί να οξειδωθεί με αποτέλεσμα την απενεργοποίηση του ενζύμου. θ*10-3 (deg cm 2 dmol -1 ) 30 20 10 0-10 untreated A 60 o C, 20min 500MPa, 60 o C, 20min 750MPa, 60 o C, 20min 900MPa, 60 o C, 20min θ(mdeg) 6 4 2 untreated 60 o C, 20min 500MPa, 60 o C, 20min 750MPa, 60 o C, 20min 900MPa, 60 o C, 20min B -20 0 200 220 240 260 λ(nm) 260 280 300 320 340 360 λ(nm) Γράφημα 5. Φάσματα στο A) far-uv και B) near-uv της ανεπεξέργαστης και της επεξεργασμένης ακτινιδίνης με ΥΠ και θερμοκρασία ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Με χρήση χρωματογραφίας ανιοντανταλλαγής και χρωματογραφίας μοριακής διήθησης απομονώθηκε η ακτινιδίνη από χυμό ακτινιδίου. Το καθαρό ένζυμο προσδιορίστηκε ως μια μονομερήs πρωτεΐνη με σχετική μοριακή μάζα 24kDa και ισοηλεκτρικό σημείο 3.5. Στο απομονωμένο και καθαρό ένζυμο μελετήθηκε η επίδραση της ΥΠ και της θερμοκρασίας στη δραστικότητά του και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αντίστοιχα που ελήφθησαν για αντίστοιχη επεξεργασία με ΥΠ σε χυμό ακτινιδίου. Ο ρυθμός απενεργοποίησης της ακτινιδίνης και στις δυο περιπτώσεις ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης. Παρατηρήθηκε ότι για την απενεργοποίηση της καθαρής ακτινδίνης απαιτούνται πιο έντονες συνθήκες επεξεργασίας συγκριτικά με την ακτινιδίνη σε χυμό ακτινιδίου φανερώνοντας ότι το ph και ο βαθμός καθαρισμού του ενζύμου παίζουν σημαντικό ρόλο στην βαθμό απενεργοποίησής του. Στη συνέχεια μελετήθηκαν οι δομικές μεταβολές του καθαρού ενζύμου μετά από επεξεργασία με ΥΠ με τη φασματοσκοπία του κυκλικού διχροϊσμού. Συνολικά, διαπιστώθηκαν σχεδόν πλήρως αντιστρεπτές μεταβολές της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής της ακτινιδίνης μετά από εφαρμογή της ΥΠ. Διαπιστώθηκε ότι οι μικρές μεταβολές που συμβαίνουν στο περιβάλλον της τριτοταγούς δομής του ενζύμου πιθανόν να συμβαδίζουν με την μείωση της δραστικότητας του μετά από εφαρμογή ΥΠ. Τα αποτελέσματα της πραγματοποιηθείσας έρευνας συμπληρώνουν κενά στη διεθνή βιβλιογραφία σχετικά με την μελέτη και συσχέτιση του μηχανισμού αδρανοποίησης του συγκεκριμένου ενζύμου με τις

μεταβολές που προκαλούνται στη δομή του σε διάφορες συνθήκες επεξεργασίας με ΥΠ και θερμοκρασία. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1)Brocklehurst, K., Baines, B.S., Malthouse, J.P.G. (1981). Differences in the interactions of the catalytic groups of the active centres of actinidin and papain. Biochemical Journal 197, 739 746. 2)Fadyloglou S., 2001, Immobilization and Characterization of Ficin, Nahrung Food 45, No.2, p.143-146 3)Gomes M.R.A., Sumner G., 1997, Effects of high pressure on papain activity and structure, J.Sci.Argic., Vol.75 4)Katsaros, G., Katapodis, P., Taoukis, P.S. (2009). High hydrostatic pressure inactivation kinetics of the plant proteases ficin and papain. Journal of Food Engineering 91 (1), 42 48. 5)Katsaros, G. I., Tavantzis, G., & Taoukis, P. S. (2010). Production of novel dairy products using actinidin and high pressure as enzyme activity regulator. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 11, 47-51. 6)Lo Piero A., Puglisi I., Petrone G. (2011). "Characterization of the puriwed actinidin as a plant coagulant of bovine milk", Eur Food Res Technol,233:517 524