ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ι ΕΙΣΑΓΩΓΗ. 1.1 ΤΟ ΕΙΔΟΣ S. cerevisiae ΚΑΙ ΟΙ ΖΥΜΩΣΕΙΣ ΣΤΟ ΚΡΑΣΙ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ι ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΤΟ ΕΙΔΟΣ S. cerevisiae ΚΑΙ ΟΙ ΖΥΜΩΣΕΙΣ ΣΤΟ ΚΡΑΣΙ. Το πιο γνωστό είδος ζύμης είναι το Saccharomyces cerevisiae λόγω της ικανότητας του να προκαλεί ζυμώσεις. Ανήκει στην οικογένεια των Saccharomycetaceae και είναι υπεύθυνο για την παραγωγή κρασιού, ψωμιού και μπύρας. Επιπλέον, το είδος αυτό αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για τους επιστήμονες, λόγω της ευκολίας που παρέχει στον χειρισμό του κατά τις γενετικές τροποποιήσεις. Μάλιστα, τα τελευταία χρόνια έχει ολοκληρωθεί η αποκωδικοποίηση του γονιδιώματός του, το οποίο αποτελείται από περίπου 6.000 γονίδια, αποτελώντας πλέον πρότυπο σύστημα μελέτης. Οι ζυμώσεις χρησιμοποιούνται εδώ και χιλιάδες χρόνια σαν αποτελεσματικός και χαμηλού κόστους τρόπος για να διατηρηθεί η ποιότητα και η ασφάλεια των τροφίμων. Ανάμεσα στους μικροοργανισμούς που παίρνουν μέρος στις ζυμώσεις οι ζύμες παίζουν σημαντικό ρόλο. 1.2 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΡΑΣΙΟΥ Το κρασί είναι ο χυμός που προκύπτει από την ζύμωση των σταφυλιών με κατάλληλες συνθήκες και επεξεργασία. Καλή ποιότητα κρασιού προϋποθέτει καλή ποιότητα σταφυλιών. Η επιφάνεια της κάθε ώριμης ράγας η οποία δεν είναι προσβεβλημένη από ευρώτα καλύπτεται από μικροοργανισμούς (Pasteur 1879), oι περισσότεροι από τους οποίους δεν «παράγουν κρασί» και αυξάνονται για μικρή χρονική περίοδο στο φρέσκο χυμό σταφυλιού και στη συνεχεία αντικαθίστανται από τις «ζύμες οινοποίησης» που και αυτές βρίσκονται στην επιφάνεια των σταφυλιών. Η ζύμη οινοποίησης (Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus) βρίσκονται αρχικά σε χαμηλούς αριθμούς αλλά επειδή αυξάνονται σχετικά εύκολα στον χυμό του σταφυλιού σε μικρό χρονικό διάστημα αποτελούν τα κυρίαρχα είδη. Οι ευρώτες, οι οποίοι πιθανόν να υπάρχουν στα σταφύλια, αποτελούν πρόβλημα παρότι η επίδραση τους στο κρασί δεν είναι τόσο σημαντική όσο θα αναμενόταν. Κρασί που έχει γίνει 1

από τέτοια σταφύλια είναι χαμηλότερης ποιότητας, παρότι τα μειονεκτήματα στην ποιότητα συνήθως προκύπτουν σαν γεύση ξυδιού παρά μούχλας (Corison et al. 1979) και είναι αποτέλεσμα πρόωρης αλκοολικής ζύμωσης και της μετατροπής στην συνέχεια της αλκοόλης σε οξικό οξύ και αιθυλ-οξικό οξύ (από τα βακτήρια που παράγουν το ξύδι). Σε μερικές περιπτώσεις ο ευρώτας έχει θετική επίδραση στην ποιότητα του κρασιού. Οι μολύνσεις με Botrytis cinerea προκαλούν αφυδάτωση των σταφυλιών και το αποτέλεσμα είναι κρασιά με άρωμα που αρέσουν πολύ. Για παράδειγμα το γερμανικό Trockenbeerenauslesen και το γαλλικό Sauternes. Τα δύο κύρια σάκχαρα που υπάρχουν στο σταφύλι (φρουκτόζη και γλυκόζη) δημιουργούνται σαν σουκρόζη και μεταφέρονται κατά την ωρίμανση από τα φύλλα στις ράγες όπου γίνεται η υδρόλυση και παράγονται οι εξόζες. Στις ράγες συναντούμε και δυο οργανικά οξέα, το ταρταρικό και το μηλικό οξύ. Το τελευταίο καταβολίζεται με αργούς ρυθμούς μέσα στην ράγα κατά την διάρκεια της ωρίμανσης. Κρασί καλύτερης ποιότητας προϋποθέτει τα σάκχαρα να είναι σε αρκετά υψηλή συγκέντρωση ώστε να παράγεται υψηλή συγκέντρωση αλκοόλης. Τα σταφύλια όμως δεν πρέπει να είναι πολύ ώριμα γιατί τότε η οξύτητα είναι χαμηλή. Συχνά ο λόγος συγκέντρωσης των σακχάρων προς την συγκέντρωση του οξέος χρησιμοποιείται σαν οδηγός ώστε να οριστεί ο χρόνος του τρυγητού. 1.3 ΣΥΝΘΛΙΨΗ ΚΑΙ «ΑΠΟΒΟΣΤΡΥΧΩΣΗ» Είναι σημαντικό όλα τα σταφύλια να είναι αποβοστρυχωμένα ώστε οι ζύμες να μπορούν να έρθουν σε επαφή με το χυμό για να κάνουν τη ζύμωση. Επίσης οι βόστρυχες πρέπει να απομακρύνονται διότι προσδίδουν δυσάρεστη γεύση στο κρασί. 1.4 ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΔΙΟΞΕΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΘΕΙΟΥ Η προσθήκη διοξειδίου του θείου χρησιμοποιείται στην παγκόσμια παραγωγή κρασιού για να παρεμποδίζει τις αντιδράσεις οξείδωσης, αλλά και σαν αντισηπτικό και πρέπει να προστίθεται πολύ νωρίς, κοντά στον χρόνο της σύνθλιψης των σταφυλιών. 2

Ο κύριος ρόλος της ζύμης κατά την παραγωγή αλκοολούχων ποτών είναι η γρήγορη και πλήρης μετατροπή των σακχάρων του σταφυλιού σε αιθανόλη, CO 2 και άλλους δευτερεύοντες μεταβολίτες χωρίς να παράγονται ταυτόχρονα ενώσεις που δημιουργούν άσχημο άρωμα ή γεύση. Όπως συμβαίνει και στις υπόλοιπες βιομηχανικές λειτουργίες, τα κύτταρα των ζυμών δεν βρίσκονται σε ιδανικές περιβαλλοντικές συνθήκες κατά την χρήση τους για την παραγωγή κρασιού. Στην πραγματικότητα είναι εκτεθειμένες σε ένα συνεχές μείγμα πολλών περιβαλλοντικών πιέσεων. Η πλειονότητα των ζυμών παράγουν αιθανόλη σε χαμηλό ποσοστό 3-4% και κατά συνέπεια μπορούν να αναπτύσσονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης. Οι ζύμες οι οποίες βρίσκονται στην επιφάνεια των σταφυλιών ανήκουν στα γένη Cloackera, Hanseniaspora, Candida, Metschnikwia και Pichia, και αυτές συναντώνται κατά την οινοποίηση όταν η συγκέντρωση της αλκοόλης είναι 3-4%. Στα επόμενα στάδια οινοποίησης και όταν η συγκέντρωση της αλκοόλης είναι περίπου 15% κυριαρχούν τα ανθεκτικά στην αλκοόλη στελέχη του Saccharomyces cerevisiae. Τα είδη του Saccharomyces δείχνουν διαφορετική ανθεκτικότητα στην συγκέντρωση αιθανόλης. Για παράδειγμα, στελέχη του S. bayanus και S. mikatae δεν αναπτύσσονται σε συγκεντρώσεις αλκοόλης πάνω του 12%. Αντίθετα, στελέχη του S. paradoxus και του S. kudriavzevii αναπτύσσονται στο 15%. Η χρήση του SO 2 είναι σημαντική, ειδικά για την αποθήκευση του κρασιού αλλά και στο μούστο, ώστε να παρεμποδίζονται οι «άγριοι» μικροοργανισμοί ειδικά όταν δεν χρησιμοποιείται εμβόλιο ζύμης ή όταν τα σταφύλια είναι μολυσμένα με ευρώτες. Το SO 2 καταναλώνει οξυγόνο με αργούς ρυθμούς αλλά έχει πολύ γρήγορη δράση στην παρεμπόδιση των ενζύμων «οξειδάσες της φαινόλης», που αλλοιώνουν το χρώμα. Για την οινοποίηση λευκού κρασιού, πρέπει να διαχωρίζονται τα γίγαρτα και οι φλοιοί, επιτρέποντας στο μούστο να διαχωριστεί και στη συνεχεία χρησιμοποιείται πίεση, ώστε να αποστραγγιστεί το υπόλοιπο του χυμού. Για καλύτερο άρωμα στο κρασί, οι περισσότεροι οινοπαραγωγοί απομακρύνουν τα στερεά συστατικά του χυμού πριν την οινοποίηση και αφήνουν το υλικό να καθιζάνει ή χρησιμοποιούν φυγόκεντρηση. Στην περίπτωση που χρησιμοποιηθεί 3

καθίζηση, πρέπει να γίνεται σε χαμηλή θερμοκρασία, ώστε να παρεμποδίζεται η ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Για την παραγωγή κόκκινων κρασιών, δεν απομακρύνονται οι φλούδες και έτσι δεν χρειάζεται πίεση ή καθίζηση παρά μόνο στο τέλος της ζύμωσης. 1.5 ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΖΥΜΩΣΗ Ο χυμός του σταφυλιού είναι ιδανικό υλικό για την ανάπτυξη της ζύμης του κρασιού. Επιπλέον, η ζύμη μπορεί να αναπτυχθεί σε πολύ απλά υλικά και είναι ικανή να παράγει όλα τα κυτταρικά συστατικά, που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη της, με εξαίρεση την βιταμίνη βιοτίνη. Ο χυμός του σταφυλιού έχει ph 3.5±0.5. Το ιδανικό ph για την ανάπτυξη της ζύμης και των βακτηρίων είναι 5-6, παρότι η ζύμη αναπτύσσεται καλά και σε πιο όξινο περιβάλλον. Πολύ λίγοι μικροοργανισμοί μπορούν να αναπτυχθούν σε τόσο χαμηλό ph. Το ph μαζί με την υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης καθιστούν το κρασί μικροβιακά σταθερό. Ο χυμός φρεσκοσυνθλιμμένων σταφυλιών περιέχει κατά μέσο όρο 10 5 cfu/ml ζύμης (Seifert, 1938) και απ αυτά, μόνο το 1% είναι Saccharomyces (Cruess 1918, Barnett et al. 1972). Η ζύμη που επικρατεί στο τέλος, S.cerevisiae, δεν βρίσκεται σε υψηλά ποσοστά στα σταφύλια. Γενικά οι πληθυσμοί είναι μικρότεροι των 10-10 2 cfu/gr. Ορισμένοι ερευνητές δεν έχουν καταφέρει να απομονώσουν ζύμες από ώριμα σταφύλια και αυτό οδηγεί σε ερωτηματικά, για την προέλευση του κατά την παραγωγή του κρασιού. Οι ζύμες του κρασιού S. cerevisiae και S. bayanus ανταγωνίζονται με τις άλλες ζύμες, που ανήκουν στα γένη Cloackera, Hanseniaspora, Hansenula, Candida και Metschnikowia. Οι ζύμες αυτές παρουσιάζουν ποικίλες αντοχές στην αιθανόλη και έτσι παρατηρείται εναλλαγή στα είδη κατά τη ζύμωση. Οι ζύμες που δεν «παράγουν κρασί», φαίνεται να έχουν μικρή επίδραση στο άρωμα του τελικού προϊόντος και παρεμποδίζονται από το SO 2 και την αιθανόλη. Όταν χρησιμοποιείται εμβόλιο ζύμης, η αρχική συγκέντρωσή της στο κρασί μετά τον εμβολιασμό είναι συνήθως 10 6 cfu/ml και ο συνολικός χρόνος ζύμωσης μειώνεται. Η χρήση εμβολίων είναι ένα μέσο, με το οποίο η ζύμωση τελειώνει σε συντομότερο χρονικό διάστημα. Στην αρχή της οινοποίησης, ο χυμός πρέπει να έχει 4

επαρκές οξυγόνο. Η ζύμη χρησιμοποιεί το διαλυμένο οξυγόνο και πρέπει να αποφεύγεται η είσοδος νέου οξυγόνου στο μούστο. Αυτό επιτυγχάνεται με τη δημιουργία στρώματος CO 2 πάνω από το χυμό. Το οξυγόνο είναι χρήσιμο γιατί επάγει την αναπνοή, όταν οι υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης αναστέλλουν τον μηχανισμό της. Ακόμη και κατά την παρουσία οξυγόνου, ο κύριος μεταβολισμός της ζύμης είναι η ζύμωση. Το οξυγόνο επιτρέπει την σύνθεση των συστατικών των λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης (Adreason and Stier, 1953, Larue et al., 1980, Kirsop, 1982), έτσι ώστε τα κύτταρα να αντέχουν την αλκοόλη. Αυτά τα λιπιδικά συστατικά (στερόλες και ακόρεστα λιπαρά οξέα), ονομάζονται «παράγοντες επιβίωσης», μιας και επιτρέπουν την βιωσιμότητα της καλλιέργειας στο τέλος των ζυμώσεων αλκοόλης (Larue et al., 1980, Ohta and Hayashida, 1983). Η σύνθεση των λιπιδίων αυτών δεν παρεμποδίζεται από τη γλυκόζη. Έτσι, για να μπορέσουμε να έχουμε πλήρη οινοποίηση είναι σημαντικό οι ζύμες εκτός από την πηγή του αζώτου, που πρέπει να έχουν, να έχουν και οξυγόνο για την ανάπτυξη τους. Χρησιμοποιώντας την δραστική ξηρή ζύμη σαν εμβόλιο, συνήθως, δεν υπάρχει πρόβλημα, γιατί οι βιομηχανικές ζύμες αυξάνονται σε αερόβιες συνθήκες. Ο κλασσικός οινοποιός, ο οποίος χρησιμοποιεί τη φυσική ζύμη κρασιού, που πρέπει να διεκπεραιώσει 18 γενιές πριν αναπτυχθεί τελείως, έχει καταλάβει την αναγκαιότητα για τον αερισμό του μούστου τις πρώτες 1-2 μέρες της οινοποίησης. 1.6 ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΗΝ ΑΛΚΟΟΛΗ Η μετατροπή των σακχάρων σε αλκοόλη και CO 2 είναι μέγιστη, όταν η βιομάζα της ζύμης είναι μεγάλη (Boulton, 1979) και στη συνέχεια, μειώνεται λόγω της συγκέντρωσης της αιθανόλης και πιθανόν άλλων τοξικών ουσιών. Η ερώτηση γιατί οι ζύμες του κρασιού είναι πιο ανθεκτικές στην αιθανόλη από άλλες ζύμες, και γιατί δεν έχουν γίνει ακόμα πιο ανθεκτικές, είναι δύσκολο να απαντηθεί και πιθανόν εμπλέκει παράγοντες επιβίωσης που υπάρχουν στην μεμβράνη, την μεταφορά σακχάρων μέσα στο κύτταρο και τη δραστικότητα των ένζυμων του γλυκολυτικού κύκλου. 5

1.7 ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΑΠΟ Acetobacter Στο τέλος της αλκοολικής ζύμωσης, το κρασί διαχωρίζεται από το ίζημα που κατακάθεται κατά την διάρκεια της ζύμωσης και μεταφέρεται σε εντελώς γεμάτες δεξαμενές ή προστίθεται αδρανές αέριο στο κενό πάνω από το κρασί. Η λειτουργία αυτή έχει σκοπό να προστατεύσει το κρασί από τα βακτήρια που παράγουν ξύδι (Acetobacter), τα οποία βρίσκονται παντού και είναι υποχρεωτικά αερόβιοι μικροοργανισμοί. Ανάλογα με τις δραστηριότητες, που γίνονται στο χώρο φύλαξης, μπορεί να χρειαστεί μία ακόμα προσθήκη SO 2 στο κρασί στο στάδιο αυτό και στη συνέχεια να αποθηκευτεί σε χαμηλή θερμοκρασία (15 C περίπου). Κατά την διάρκεια της φύλαξης, αδιάλυτα συστατικά συνεχίζουν να κατακάθονται. Τα συστατικά αυτά περιλαμβάνουν δι-ταρταρικό κάλιο, υπολείμματα σταφυλιού και νεκρά ή απενεργοποιημένα κύτταρα ζύμης. Η καθίζηση των κυττάρων της ζύμης ξεκινά κατά το μέσον της αλκοολικής ζύμωσης και συνεχίζει, σε πολλές περιπτώσεις, για πολλούς μήνες μετά την λήξη της. Η ταχύτητα της καθίζησης και η πυκνότητα του ιζήματος σχετίζονται με την ικανότητα της ζύμης να δημιουργεί συσσωματώματα. Η χρήση στελέχους με αυτή την ικανότητα μειώνει την ανάγκη για φυγοκέντρηση και φιλτράρισμα. Η ιδιότητα της δημιουργίας συσσωμάτων είναι ιδιαιτέρα σημαντική στην παραγωγή αφρωδών οίνων με τη «methode champenoise», μιας και τα κύτταρα της ζύμης απομακρύνονται από το μπουκάλι γιατί καθιζάνουν. 1.8 ΓΕΥΣΗ Η μετατροπή του χυμού του σταφυλιού σε κρασί έχει σαν αποτέλεσμα την πλήρη αλλαγή της γεύσης. Περίπου 200 συστατικά στο κρασί προέρχονται από το σταφύλι και άλλα 200 είναι αποτέλεσμα της ζύμωσης. Το κύριο νέο συστατικό είναι η αιθανόλη, η οποία αλλάζει τη γεύση και το άρωμα στο κρασί. Μετά την αιθανόλη (ποσοτικά) παράγονται μεγάλου μοριακού βάρους αλκοόλες και γλυκερόλες, καμιά από τις οποίες δεν επιδρά σημαντικά στη γεύση του κρασιού. Η γεύση του κρασιού προέρχεται από τους πτητικούς εστέρες και ακετάλες, που δημιουργούνται κατά την ζύμωση σε μικρές ποσότητες (Schreier, 1979). Η δημιουργία ορισμένων πτητικών εστέρων εξαρτάται από το στέλεχος της ζύμης (Soles et al 1982), αν και η ποσοτική διαφορά που υπάρχει στο προϊόν που 6

παράγουν τα διάφορα στελέχη είναι πολύ μικρή για να ανιχνευτεί οργανοληπτικά. Επιπλέον, δεν συμφωνούν όλοι οι παραγωγοί και οι οινολόγοι με το γεγονός αυτό. 1.9 ΜΗΛΟΓΑΛΑΚΤΙΚΗ ΖΥΜΩΣΗ Η μηλογαλακτική ζύμωση συμβαίνει αρκετούς μήνες μετά την αλκοολική ζύμωση. Κατά την ζύμωση αυτή, το L-μηλικό οξύ μετατρέπεται σε L-γαλακτικό οξύ και CO 2 από στελέχη του Leuconostoc, Lactobacillus, ή Pediococcus. Τα στελέχη αυτά έχουν την ιδιαιτερότητα ότι μπορούν να αναπτυχθούν στις υψηλές συγκεντρώσεις αλκοόλης, που υπάρχουν στο κρασί και σε χαμηλό ph. Μέχρι πρόσφατα, πιστεύανε, ότι η ζύμωση αυτή συμβαίνει μόνο στο κρασί. Έχει βρεθεί όμως ότι συμβαίνει και σε αλλά τρόφιμα (πίκλες, soy sauce), όπου την διεκπεραιώνουν σχετικοί και όχι ακριβώς ίδιοι μικροοργανισμοί. Την μηλογαλακτική ζύμωση την συναντάμε κυρίως στα κόκκινα κρασιά που έχουν κατάλληλο ph, και περιέχουν περισσότερα θρεπτικά συστατικά λόγω της παρουσίας φλούδων σταφυλιού. Το πιο αξιοσημείωτο αποτέλεσμα της ζύμωσης αυτής, είναι η μείωση της οξύτητας, που συμβαίνει από την αποκαρβοξυλίωση του μηλικού οξέος. Αυτή αποτελεί πλεονέκτημα σε περιοχές με χαμηλές θερμοκρασίες, όπου τα κρασιά είναι συνήθως πιο όξινα. Η ζύμωση αυτή επιπλέον προσφέρει στο κρασί σταθερότητα γιατί κρασιά στα οποία έχει συμβεί μηλογαλακτική ζύμωση, εμφιαλώνονται χωρίς να υπάρχει πρόβλημα να συνεχίζεται η ζύμωση μέσα στο εμφιαλωμένο κρασί. Τρίτη επίπτωση της μηλογαλακτικής ζύμωσης είναι η αλλαγή στην γεύση λόγω της μείωσης της οξύτητας. Συμβαίνουν όμως και άλλες αλλαγές στη γεύση που σχετίζονται με το στέλεχος του μικροοργανισμού, και ανιχνεύονται από εκπαιδευμένους γευσιγνώστες. Η αλλαγή της γεύσης λόγω μηλογαλακτικής ζύμωσης σε λευκό κρασί, είναι πιο εμφανής απ ότι στο κόκκινο. 7

1.10 ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΠΑΙΡΝΟΥΝ ΜΕΡΟΣ ΣΤΗ ΖΥΜΩΣΗ ΤΟΥ ΚΡΑΣΙΟΥ Η πρώτη χρήση καθαρής καλλιέργειας ζύμης έγινε στην Γερμάνια, στην περιοχή του Ρήνου από τον Muller Thorn to 1890. Αναγνωρίζοντας ότι οι ζύμες οι οποίες δεν παίρνουν μέρος στη ζύμωση είναι αυτές που κυριαρχούν στα σταφύλια πρότεινε στους οινοπαραγωγούς να προετοιμάζουν εμβόλια συνθλίβοντας ώριμα σταφύλια λίγες μέρες πριν την κανονική συγκομιδή ώστε η ζύμη του κρασιού να κυριαρχεί στο μούστο. Από αυτού του είδους την καλλιέργεια απομόνωσε το στέλεχος «Steinberg». Εξ αρχής, ο Muller Thorn αναγνώρισε την χρησιμότητα των εμβολίων και διαπίστωσε ότι η χρήση τους οδηγούσε σε έντονη ζύμωση χωρίς να υπάρχει κίνδυνος ανεπιθύμητων γεύσεων και αρωμάτων που δημιουργούνται από κάποιους μικροοργανισμούς που υπάρχουν φυσικά στο σταφύλι. Έτσι η επιλογή καθαρών καλλιεργειών στόχευε σε μικροοργανισμούς με υψηλή αντοχή στην αλκοόλη, στο SO 2 και διεκπεραίωση της ζύμωσης σε χαμηλές θερμοκρασίες. Οι απομονώσεις δεν μπορούσαν να γίνουν από κρασί του οποίου η γεύση ή το άρωμα δεν ήταν το επιθυμητό. Η χρήση καθαρών καλλιεργειών ζύμης στο κρασί ξεκινά περίπου δυο δεκαετίες μετά την έρευνα του Pasteur «Etude sur le vin»1866. Πειράματα με τις καλλιέργειες αυτές που έγιναν στη Γαλλία απέδωσαν στη ζύμη ιδιότητες οι οποίες ξέρουμε σήμερα ότι δεν ισχύουν. Για παράδειγμα πίστευαν ότι η χρήση ζύμης κρασιού από την περιοχή Champagne σαν εμβόλιο σε μούστο άλλων περιοχών είχε σαν αποτέλεσμα προϊόν καλύτερης ποιότητας και με άρωμα σαμπάνιας. Την εποχή εκείνη κανένας δεν δούλευε με καθαρές καλλιέργειες αλλά με μείγμα στελεχών. Τα πρώτα καθαρά στελέχη δημιουργηθήκαν από τον Jacqueline ένα από τους πιο σημαντικούς διανομείς εμβολίων ζύμης. Με την πάροδο των χρόνων η χρήση καθαρών καλλιεργειών στη Γερμανία και Γαλλία άρχισε να μειώνεται και να περιορίζεται στους αφρώδεις οίνους. Επί του παρόντος υπάρχουν μόνο τέσσερεις εταιρίες στον κόσμο που παράγουν ζύμες κρασιού. Τα στελέχη καλλιεργούνται γενικά από συλλογές που έχουν διατηρηθεί για πολλά χρόνια, είναι γενετικά σταθερά και έχουν: γρήγορο ρυθμό ανάπτυξης και ζύμωσης, μικρές απαιτήσεις σε θρεπτικά συστατικά, ζύμωση σε χαμηλή θερμοκρασία, ανθεκτικότητα σε SO 2, καλή συσσωμάτωση και δημιουργία μικρής ποσότητας αφρού. 8

Το κρασί που προκύπτει πρέπει να είναι ευχάριστο και χωρίς ανεπιθύμητα αρώματα. Η απόδοση της μετατροπής του σακχάρου σε αλκοόλη φαίνεται να μην είναι το πιο σημαντικό κριτήριο, και τα στελέχη που υπάρχουν είναι σε γενικές γραμμές αρκετά όμοια. 1.11 ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ ΤΗΣ ΜΗΛΟΓΑΛΑΚΤΙΚΗΣ ΖΥΜΩΣΗΣ Η χρήση βακτηριακού εμβολίου για τη μηλογαλακτική ζύμωση στη βιομηχανική παραγωγή κρασιού είναι σχετικά καινούργια. Άρχισε όμως να γίνεται ευρέως διαδεδομένη στις Η.Π.Α. τα τελευταία δέκα χρόνια. Ο πρώτος μικροοργανισμός που χρησιμοποιήθηκε για το κρασί είναι ο L. οenos ο οποίος απομονώθηκε από πολλά κρασιά στην Καλιφορνία. Εξαιτίας των πολλών θρεπτικών απαιτήσεων που έχει ο μικροοργανισμός αυτός, μόνο λίγα από τα στελέχη του είναι ικανά να προκαλέσουν μηλογαλακτική ζύμωση όταν εμβολιαστούν στο κρασί. Παρότι ο χρόνος χρήσης των βακτηρίων αυτών σε εμβόλια είναι αρκετά μικρός, η επιτυχία με την οποία τα βακτηριακά εμβόλια πραγματοποιούν τη μηλογαλακτική ζύμωση τα κάνει αποδεκτά. Άλλα κριτήρια τα οποία είναι σημαντικά για την επιλογή βακτηρίων είναι η ευκολία με την οποία αναπτύσσονται στα υλικά και η βιωσιμότητα τους κατά την διάρκεια της φύλαξης, η γρήγορη ανάπτυξη στο κρασί και η ουδέτερη επίδραση στη γεύση. 1.12 ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΡΑΣΙΟΥ Είναι σχεδόν αδύνατο να ταξινομήσουμε τα στελέχη των ζυμών και βακτηρίων που χρησιμοποιούνται, επειδή η επιλογή τους γίνεται βάση της ζυμωτικής τους ικανότητας. Αυτό θα έπρεπε να είναι το κριτήριο για την ταξινόμηση τους. Οι επιμέρους ζυμωτικές ικανότητες εξαρτώνται όμως και από τις συνθήκες ζύμωσης. Οι μεθοδολογίες που υπάρχουν (τεχνικές DNA, μορφολογία, θρεπτικές απαιτήσεις) συνήθως δεν μας επιτρέπουν να διαχωρίσουμε τα στελέχη. Με την συνεχώς αυξανόμενη χρήση των εμβολίων στις οινοπαραγωγικές περιοχές του κόσμου η δυνατότητα της ταξινόμησης των στελεχών γίνεται επιτακτική. 9

1.13 ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΖΥΜΗΣ Πρόκειται για χρήσιμη ιδιότητα της μείωσης των διαδικασιών και του χρόνου της οινοποίησης για την διαύγαση του κρασιού που συμβαίνει όταν παραμένει στο κελάρι. Τα χαρακτηριστικά της συσσωμάτωσης ποικίλουν πολύ ανάμεσα στα στελέχη. Στις δεξαμενές ζύμωσης είναι απαραίτητος, επιπλέον κενός χώρος ώστε να μπορεί να δημιουργείται ο αφρός και είναι δύσκολο να μεταφερθεί μούστος με πολύ αφρό μέσω αντλίας. Δεν είναι σίγουρο αν το πρόβλημα του αφρού οφείλεται στο στέλεχος της ζύμης ή στην ποικιλία του σταφυλιού. Όπου κι αν οφείλεται θα μπορούσε να διορθωθεί η κατάσταση με μετατροπή των πρωτεασών (ενζύμων που διασπούν πρωτεΐνες), ώστε να μειωθεί η πρωτεΐνη στο μούστο. Αυτό έχει ένα επιπλέον ευεργετικό αποτέλεσμα: Το κρασί ίσως χρειάζεται λιγότερη σταθεροποίηση των πρωτεϊνών του. 1.14 ΑΙΘΑΝΟΛΗ Η πραγματική απόδοση σε αιθανόλη ανά μονάδα μάζας σακχάρου δεν είναι η μέγιστη λόγω της πτητικότητας η οποία εξαρτάται από τη θερμοκρασία (Williams and Boulton, 1983) και λόγω της δημιουργίας άλλων τελικών προϊόντων αντί της αλκοόλης (Amerine et all, 1980). Η ύπαρξη στελεχών με αυξημένη απόδοση σε αλκοόλη δεν φαίνεται να απασχολεί ιδιαίτερα τον οινοπαραγωγό (τέτοια στελέχη είναι πιο χρήσιμα για την παρασκευή οινοπνευματωδών ποτών ή απεριτίφ). Φυσικά το χαρακτηριστικό μειωμένης απόδοσης σε αλκοόλη του στελέχους πρέπει να είναι ανεξάρτητο της ανθεκτικότητας σε αυτήν. Μελέτες στην πολυμορφία που παρατηρήθηκαν ως προς την απόδοση της αιθανόλης σε πολλά στελέχη ζύμης κατέληξαν ότι ο έλεγχος αυτός οφείλεται σε πολλά γονίδια (Thornton, 1982). Σε συγκεκριμένες περιπτώσεις είναι πιθανό να αναπτυχθούν δυσάρεστες γεύσεις όπως οξικό οξύ, οξικός αιθυλεστέρας και H 2 S. Το τελευταίο παράγεται όταν υπάρχει στον μούστο στοιχειώδες θείο που χρησιμοποιείται στα αμπέλια. Οι οινοποιοί θα επιθυμούσαν να χρησιμοποιούν ζύμες που δεν παράγουν τις ουσίες αυτές αν και ακολουθώντας σωστές πρακτικές κατά την οινοποίηση θα έλυναν τα προβλήματα αυτά. Οι δυσάρεστες γεύσεις συνήθως 10

προέρχονται από ζύμες που προκαλούν επιμολύνσεις όπως για παράδειγμα στελέχη του Brettanomyces. Για τον έλεγχο τέτοιων ανεπιθύμητων μικροοργανισμών έχει προταθεί η χρήση του παράγοντα «killer» παρότι στελέχη ζύμης που παράγουν τον παράγοντα αυτό δεν έχουν δείξει μέχρι τώρα ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη των ζυμών που προκαλούν τις αλλοιώσεις. Οι ζύμες του κρασιού παράγουν πολλούς πτητικούς εστέρες και ακετάλες, πολλές από τις οποίες είναι σημαντικά συστατικά της γεύσης του κρασιού. Πολλοί από τους κύκλους παραγωγής των ουσιών αυτών είναι γνωστοί. Ένα από τα πιο ενδιαφέροντα θέματα είναι η πιθανότητα της μετατροπής της ζύμης ώστε να παράγει ένα νέο προϊόν (νέο κρασί με διαφορετικά αρώματα). Σε κάτι τέτοιο υπάρχουν τρεις κύριες δυσκολίες: Αποδοχή από τον καταναλωτή (και τον οινοποιό). Η πηγή των γονιδίων που πρέπει να μεταφερθεί στη μαγιά. Η ανίχνευση και η επιλογή των κλωνοποιημένων κυττάρων που παράγουν τα νέα αρώματα. Πιθανές πηγές για το γενετικό αυτό υλικό θα μπορούσαν να είναι φυτά ίσως και το ίδιο το σταφύλι που παράγει αφθονία αρωματικών και γευστικών συστατικών. 1.15 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΟ ΑΡΩΜΑ ΤΟΥ ΚΡΑΣΙΟΥ To άρωμα του κρασιού είναι προσωπική εκτίμηση που ποικίλει ανάλογα με το άτομο, την εμπειρία και την χημική σύσταση του προϊόντος. Η τελική αντίδραση είναι το αποτέλεσμα σύνθετων αντιδράσεων που είναι δύσκολο να προβλεφθούν γιατί επηρεάζονται από πολλές μεταβλητές. Στη χημική σύσταση του κρασιού οφείλεται η γεύση και το άρωμα και καθορίζεται από πολλούς παράγοντες όπως η ποικιλία σταφυλιού, η γεωγραφική θέση, οι καλλιεργητικές συνθήκες του αμπελώνα, η μικροβιακή οικολογία του σταφυλιού, η λειτουργία της ζύμωσης και οι πρακτικές οινοποίησης. Οι μικροοργανισμοί έχουν σημαντικό ρόλο για τον καθορισμό της σύστασης του κρασιού επιδρούν στην ποιότητα του σταφυλιού πριν τον τρύγο και κατά τη ζύμωση μεταβολίζουν σάκχαρα του σταφυλιού και άλλα συστατικά σε αιθανόλη, CO 2 και εκατοντάδες δευτερογενή τελικά προϊόντα που όλα μαζί καθορίζουν τον χαρακτήρα του κρασιού. Οι ζύμες, τα βακτήρια και οι ευρώτες συνεισφέρουν στην μικροβιακή οικολογία παραγωγής κρασιού και στη χημική 11

σύσταση, αν και οι ζύμες έχουν τον κυρίαρχο ρόλο, λόγω της εμπλοκής τους στην αλκοολική ζύμωση. Πολλοί παράγοντες επηρεάζουν την μικροβιακή οικολογία του κρασιού από τους οποίους οι πιο σημαντικοί είναι η χημική σύσταση του χυμού του σταφυλιού και η λειτουργία της ζύμωσης. Σε πολύπλοκα μικροβιακά οικοσυστήματα όπου υπάρχουν μίγματα διαφόρων ειδών και στελεχών υπάρχει πιθανότητα να αντιδρούν οι μικροοργανισμοί μεταξύ τους και το αποτέλεσμα να καθορίζει την τελική οικολογία. Η παραγωγή του κρασιού είναι ένα τέτοιο σύστημα όπου υπάρχουν επιδράσεις ζυμών σε ζύμες, σε ευρώτες και σε βακτήρια. Η ποικιλότητα και η σημασία των αντιδράσεων αυτών που αφορά την παραγωγή κρασιού εξετάζονται στη συνέχεια: 1.16 Η ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ ΣΤΑΦΥΛΙΟΥ Τα σταφύλια είναι η κύρια πηγή από την οποία οι ζύμες εισέρχονται στα οινοποιεία. Κατά συνέπεια οι αλληλεπιδράσεις που υπάρχουν στα σταφύλια είναι υπεύθυνες για την ποικιλία των ειδών που υπάρχουν στα οινοποιεία. Γενικά πολύ λίγες ζύμες (10-10 3 cfu/gr) ανιχνεύονται σε άγουρα σταφύλια, αλλά ο πληθυσμός τους αυξάνεται σε 10 4-10 6 cfu/gr όταν τα σταφύλια είναι ώριμα. Κατά την ωρίμανση τα σάκχαρα διαχέονται από το εσωτερικό της ράγας στην επιφάνεια υποβοηθώντας έτσι την ανάπτυξη των ζυμών. Στα άγουρα σταφύλια βρίσκονται κυρίως οι ζύμες Rhodotorulla, Cryptococcus, και Candida και η ζύμη με ψευδομυκήλιο Aureobasidium pullulans 12

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 ΣΤΟΧΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Στόχος της πειραματικής έρευνας ήταν η απομόνωση του σακχαρομύκητα S. cerevisiae από τα στερεά υπόλοιπα της οινοποίησης του μούστου Μαυροδάφνης που παράγεται στο νομό Κεφαλληνίας και η μελέτη της ανθεκτικότητας τους στην αλκοόλη. 2.2 ΣΥΛΛΟΓΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ S. cerevisiae Για την πραγματοποίηση του πειράματος, απαραίτητη προϋπόθεση ήταν η συλλογή στελεχών S. cerevisiae από στερεά υπόλοιπα οινοποίησης. Επόμενο βήμα, ήταν η ομογενοποίηση 1gr στερεών υπολοίπων σε 9 ml πεπτόνης, από όπου πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές αραιώσεις 1:10, που χρησιμοποιήθηκαν για την καταμέτρηση του αριθμού των ζυμών. 2.3 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ S. cerevisiae Πρωτεύων στόχος του πειράματος ήταν η απομόνωση καθαρών στελεχών του σακχαρομύκητα S. cerevisiae από άλλους μικτούς πληθυσμούς μικροοργανισμών, απομόνωση που πραγματοποιήθηκε στο μικροβιολογικό εργαστήριο, με τρεις διαδοχικές καλλιέργειες. Χρησιμοποιήθηκαν 350 δείγματα με πιθανά στελέχη του σακχαρομύκητα που προέρχονταν από σταθερά υπόλοιπα οινοποίησης του μούστου Μαυροδάφνης. Καλλιέργεια πρώτη: Η πραγματοποίηση της καλλιέργειας των 350 δειγμάτων έγινε με εμβολιασμό σε τρυβλία Petri με αποστειρωμένο θρεπτικό υπόστρωμα YEPD με τη μέθοδο των παράλληλων γραμμών. Η επώαση των δειγμάτων έγινε σε ειδικό επωαστικό κλίβανο στους 30 ο C για 48 ώρες. Καλλιέργεια δεύτερη: Από κάθε μεμονωμένη αποικία των τρυβλίων της πρώτης καλλιέργειας, πάρθηκε μικρή ποσότητα κυττάρων (με κρίκο εμβολιασμού) και ανακαλλιεργήθηκε σε νέα τρυβλία. Τα δείγματα επωάστηκαν στον επωαστικό κλίβανο για 48 ώρες στους 30 o C. 13

Καλλιέργεια τρίτη : Από κάθε μεμονωμένη αποικία των τρυβλίων της δεύτερης καλλιέργειας, πάρθηκε μικρή ποσότητα κυττάρων (με κρίκο εμβολιασμού) και ανακαλλιεργήθηκε σε νέα τρυβλία. Τα δείγματα επωάστηκαν στον επωαστικό κλίβανο για 48 ώρες στους 30 ο C. Μετά το τέλος και της τρίτης ανακαλλιέργειας το κάθε δείγμα (τρυβλίο) εξετάστηκε μακροσκοπικά και μικροσκοπικά. Δείγματα τα οποία κατά τη μικροσκοπική εξέταση αποδείχθηκαν καθαρά, (ύπαρξη κυττάρων ζύμης και μόνο), τοποθετήθηκαν εντός ψυγείου, για να χρησιμοποιηθούν μετέπειτα για τη μελέτη της ανθεκτικότητας τους στην αλκοόλη. Σε όσα δείγματα δεν παρατηρήθηκε γενικώς ανάπτυξη μακροσκοπικά ή παρατηρήθηκε η ύπαρξη άλλου μικροοργανισμού και όχι του σακχαρομύκητα, μικροσκοπικά, απορρίφθηκαν. Στις περιπτώσεις όπου η καλλιέργεια που προέκυψε μετά την τρίτη ανακαλλιέργεια ήταν μικτή (δεν ήταν καθαρή καλλιέργεια) είτε βάση του τρυβλίου είτε μικροσκοπικά έγιναν επιπλέον ανακαλλιέργειες μέχρις ότου προκύψουν καθαρά στελέχη. Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν και αυτά με τη σειρά τους στο ψυγείο. 2.4 ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΤΟΥ S. cerevisiae ΣΤΗΝ ΑΙΘΥΛΙΚΗ ΑΛΚΟΟΛΗ Δεύτερος στόχος του πειράματος ήταν η πειραματική μελέτη για την αντοχή στελεχών του S. cerevisiae σε συγκεντρώσεις EtOH (αιθυλική αλκοόλη) 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, και 17%. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε μόνο στα δείγματα που κατά την τελευταία ανακαλλιέργεια, ήταν μακροσκοπικά και μικροσκοπικά αμιγή (παρουσίαζαν χαρακτηριστικά του σακχαρομύκητα). Αρχικά δημιουργήθηκε αποστειρωμένο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα με αναλογία : 1.5% άγαρ, 2% δεξτρόζη, 2% πεπτόνη και 1% yeast extract. Παρασκευάστηκαν ίσα μέρη θρεπτικού υλικού, όπου στο ένα προστέθηκε 0% αιθυλική αλκοόλη (καθόλου αλκοόλη), και στα υπόλοιπα 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, και 17% αιθυλική αλκοόλη, αντίστοιχα. Το θρεπτικό υλικό με 0% αλκοόλη χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Έπειτα, τοποθετήθηκε σε τρυβλία Petri που αμέσως μετά τοποθετήθηκαν σε ψυγείο μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Στη συνέχεια δημιουργήθηκε εναιώρημα με την χρήση τρυβλίων ELISA. Από κάθε δείγμα (της τελευταίας ανακαλλιέργειας), πάρθηκε μια μεμονωμένη αποικία, με την βοήθεια κρίκου εμβολιασμού, και διαλύθηκε σε 400μl πεπτόνης σε τρυβλίο ELISA. Από τα 400μl εναιωρήματος από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν 80μl για 14

κάθε συγκέντρωση αλκοόλης. Με την βοήθεια της γυάλινης ράβδου το εναιώρημα απλώθηκε σε όλη την στερεοποιημένη επιφάνεια του θρεπτικού υποστρώματος, έτσι ώστε να διαχωριστούν τα κύτταρα. Στο τέλος και της τελευταίας διαδικασίας, τα δείγματα μπήκαν σε επωαστικό κλίβανο, σε θερμοκρασία 20 0 C, ως μια μέση θερμοκρασία ανάπτυξης, για διάστημα πέντε ημερών. Τελικός στόχος ήταν η παρατήρηση και η μελέτη της ανάπτυξης κάθε μικροβιακού δείγματος και στις τέσσερις συγκεντρώσεις αιθυλικής αλκοόλης. Τα δείγματα που δεν αναπτύχθηκαν σε κάποιες από τις συγκεντρώσεις 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%,16% ή 17%. φανέρωναν την μη αντοχή τους στην αντίστοιχη συγκέντρωση. 2.5 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.5.1 ΥΛΙΚΑ Τρυβλία Petri Μικροβιακό θρεπτικό υπόστρωμα Κρίκος εμβολιασμού Γυάλινη ράβδος Λύχνος Bunsen Κλίβανος αποστείρωσης Επωαστικός κλίβανος 2.5.2 Μέθοδος παράλληλων γραμμών σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα Η μέθοδος αυτή, χρησιμοποιήθηκε για τον διαχωρισμό και την αραίωση των κυττάρων ενός μικροοργανισμού, με σκοπό την δημιουργία μίας καθαρής, αμιγούς καλλιέργειας, κατά το πρώτο πειραματικό μέρος. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται πάντα σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα και αφορά αερόβιους μικροοργανισμούς, όπως ζυμομύκητες και βακτήρια και όχι νηματώδης, μύκητες. Απαραίτητο εργαλείο αυτής της μεθόδου είναι ο κρίκος εμβολιασμού. Τα βήματα που ακολουθούνται είναι ως εξής: Με την βοήθεια του κρίκου εμβολιασμού, μετά από αποστείρωση του σε λύχνο Bunsen, μικρή ποσότητα κυττάρων μεμονωμένης αποικίας μεταφέρεται στο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα του τρυβλίου και 15

διαγράφοντας απαλές και ελικοειδείς, παράλληλες γραμμές, καλύπτεται το πρώτο τεταρτημόριο του τρυβλίου. Γίνεται ξανά αποστείρωση του κρίκου και εν συνεχεία αυτός μεταφέρεται, αφού ψυχθεί, στην άκρη της τελευταίας ελικοειδούς γραμμής του πρώτου τεταρτημόριου. Έπειτα, σύροντας το με παρόμοιο τρόπο καλύπτεται και το δεύτερο τεταρτημόριο. Η ίδια διαδικασία ακολουθείται και για το τρίτο τεταρτημόριο. 2.5.3 Μέθοδος διασποράς μικροοργανισμών σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε κατά το δεύτερο πειραματικό μέρος, για τη διασπορά και τον διαχωρισμό των κυττάρων του σακχαρομύκητα σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα, με στόχο τη δημιουργία μιας καθαρής καλλιέργειας. Εφαρμόζεται τόσο σε αναερόβιους, όσο και σε αερόβιους μικροοργανισμούς, κυρίως όμως, στους δεύτερους. Απαραίτητο εργαλείο αυτής της μεθόδου είναι μία γυάλινη ράβδος, σε σχήμα L. Η διαδικασία είναι ως εξής: Μικρή ποσότητα εναιωρήματος μικροοργανισμών μεταφέρεται σε στερεοποιημένο θρεπτικό υπόστρωμα YEPD (στο οποίο έχει ενσωματωθεί αιθυλική αλκοόλη σε 0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16% και 17% ). Με την βοήθεια της γυάλινης ράβδου απλώνεται απαλά και με κυκλικές κινήσεις σε όλη την επιφάνεια του θρεπτικού υποστρώματος. Ακολουθεί επώαση σε επωαστικό κλίβανο για συγκεκριμένες μέρες, σε συγκεκριμένη σταθερή θερμοκρασία (Καραγκούνη- Κύρτσου, 1999α, 2001β). 2.5.4 Δημιουργία εναιωρήματος σε τρυβλία ELISA Είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται αφενός, για την δημιουργία εναιωρήματος ενός μικροοργανισμού, και αφετέρου γιατί η χρήση του καθίσταται εύκολη, γρήγορη και ακριβής. Κατά τη διαδικασία αυτή, μία αποικία από κάθε δείγμα προστέθηκε σε αραιωτικό υγρό πεπτόνης 400μl σε τρυβλίο ELISA. Από την ποσότητα αυτή, τα 80μl χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό σε τρυβλία Petri, σε κάθε συγκέντρωση (0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%,16% και 17%). 16

Πλήθος ζυμών ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ S. cerevisiae Μετά την απομόνωση των στελεχών του Saccharomyces cerevisiae, έγινε μακροσκοπική παρατήρηση των μορφολογικών χαρακτηριστικών των αποικιών και μικροσκοπική εξέταση των κυττάρων της ζύμης. Τα αποτελέσματα αυτά που αναφέρονται αναλυτικά στο Παράρτημα, σχηματικά παρουσιάζονται στα επόμενα Γραφήματα 3.1, 3.2, 3.3 και 3.4 3.2 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΑΠΟΙΚΙΩΝ Κατά τη μακροσκοπική εξέταση παρατηρήθηκαν αποικίες διαφόρων μεγεθών όπως παρουσιάζεται στο Γράφημα 3.1. 350 300 250 200 150 100 50 0 Μορφολογία αποικίας Πολύ Μεγάλο Μεγάλο Μεσαίο Μικρό Πολύ μικρο Μέγεθος αποικίας Γράφημα 3.1. Πλήθος ζυμών που εμφάνισαν αποικίες πολύ μεγάλης, μεγάλης, μεσαίας, μικρής και πολύ μικρής διαμέτρου Η μορφολογία όλων των αποικιών ήταν κυκλική, με κυρτή ανύψωση, κυκλικό περιθώριο, κρέμ χρώμα και βουτυρώδη υφή. 17

Πλήθος ζυμών Πλήθος ζυμών 3.3 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ Κατά το μικροσκοπικό έλεγχο των κυττάρων μιας μεμονωμένης αποικίας κάθε καθαρού δείγματος, παρατηρήθηκαν κύτταρα ελλειψοειδή προς σφαιρικά, μικρού, μεσαίου και μεγάλου μεγέθους. Η αναπαραγωγή τους πραγματοποιήθηκε με εκβλάστηση και όχι με σπορογονία, όπως αποδεικνύεται και από το φωτογραφικό υλικό του Παραρτήματος. Σχηματικά αυτά τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Γράφημα 3.2. 350 300 250 200 150 100 50 0 Κύτταρα ελλειψοειδή Μικροσκοπικά χαρακτηριστκά Αναπαραγωγή με εκβλάστηση Χαρακτηριστικά Μεγάλου μεγέθους Μετρίου μεγέθους Μικρού μεγέθους Γράφημα 3.2. Πλήθος ζυμών ανά μικροσκοπικό χαρακτηριστικό. Τέλος χρησιμοποιώντας το API C Aux System, ταυτοποιήσαμε τα στελέχη του σακχαρομύκητα σε S. cerevisiae 1 ή S. cerevisiae 2 με τα παρακάτω αποτελέσματα. 350 300 250 200 150 100 50 0 Saccharomyces cerevisiae 1 Saccharomyces cerevisiae 2 Τύπος Saccharomyces cerevisiae Γράφημα 3.3. Πλήθος ζυμών ανά τύπο σακχαρομύκητα 18

3.4 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΤΗΝ ΑΙΘΥΛΙΚΗ ΑΛΚΟΟΛΗ Όπως παρατηρείται στο Γράφημα 3.4, συμπεραίνεται ότι και τα 350 στελέχη αναπτύχθηκαν σε ποσοστό αλκοόλης 8%. Στη συνέχεια παρουσιάστηκε μια φθίνουσα πορεία όπου 347 στελέχη ήταν ανθεκτικά σε συγκέντρωση 10% αλκοόλη, 321 σε 12%, 199 σε 14%, 111 σε 16% και 55 σε 17%. Τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζονται στο Γράφημα 3.4. Γράφημα 3.4 Αριθμός ζυμών που αναπτύσσονται στις διαφορετικές συγκεντρώσεις αλκοόλης. 19

3.5 ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Εξετάζοντας την μικροβιολογία των κλασικών οινοποιήσεων βλέπουμε ότι οι μικροοργανισμοί του κρασιού λειτουργούν καλά. Οι ενδογενείς μικροοργανισμοί έχουν επιλεγεί από τη φύση μέσα σε χιλιάδες χρόνια και έτσι μπορούν να αναπτύσσονται και να ζυμώνουν εύκολα και γρήγορα στο όχι και τόσο φιλικό περιβάλλον (υψηλή συγκέντρωση σακχάρων, αλκοόλης και υψηλής οξύτητας) του μούστου ώστε να παράγουν τελικά προϊόντα που δίνουν την χαρακτηριστική γεύση του κρασιού και καμία άλλη. Τα στελέχη των ζυμών που χρησιμοποιούνται σήμερα σαν εμβόλια έχουν επιλεχθεί από τους οινολόγους εμπειρικά και με βάση των κριτηρίων που έχουν αναφερθεί. Η πρώτη απαίτηση ενός παραγωγού ως προς τη βελτίωση είναι η αύξηση αυτών των χαρακτηριστικών που διακρίνουν τα στελέχη που χρησιμοποιούνται ήδη ώστε η παραγωγή του κρασιού να είναι πιο αποτελεσματική και με λιγότερα έξοδα. Έτσι η δημιουργία μικροοργανισμών του κρασιού με αυξημένη αντοχή στην αιθανόλη και λιγότερες απαιτήσεις ως προς τα θρεπτικά συστατικά θα ήταν καλοδεχούμενη. Επιπλέον τα συστατικά γεύσης του κρασιού που συνήθως παράγονται θα μπορούσαν να αυξηθούν ενώ παράλληλα να ανασταλεί η παραγωγή δυσάρεστων ουσιών. Η επιθυμία να δημιουργηθούν τέτοιοι μικροοργανισμοί κομμένοι και ραμμένοι στις ανάγκες αυτές δεν είναι προφανής σε πολλούς οινοποιούς παρότι στις βιομηχανικές ζυμώσεις όπου ανήκει και η παραγωγή κρασιού η «επιθυμία» αυτή σίγουρα θα μετατρέπεται σε «ανάγκη». Υπάρχει επιπλέον και η πιθανότητα για επιλογή και μετατροπή μικροοργανισμών που θα μπορούσαν να παράγουν τελείως νέα γευστικά συστατικά και έτσι εντελώς καινούργια είδη κρασιού. Η πραγματοποίηση όμως αυτών των μεγάλων προσδοκιών εξαρτάται από τις δυνάμεις ανταγωνισμού μεταξύ παράδοσης και αγοράς. 20

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Amerine, M. A., Berg, H. W., Kunkee, R. E., Ough, C. S., Singleton, V. L. and Webb, A. D.(1980) The technology of wine making (4th edn). Westport, Connecticut, Avi Publishing. Andreason, A. A. and Stier, J. B. (1953) Anaerobic nutrition of Sacchromyces cerevisiae. I.Ergosterol requirements for growth in a defined medium. J. Cell. Comp. Physiol. 41,23-36. Barnett, J. A., Delaney, M. A., Jones, E., Magson, A. B. and Winch, B. (1972) The number ofyeasts associated with wine grapes of Bordeaux. Arch. Mikrobiol. 83,52-55. Boulton, R. B. (1979) Kinetic model for the control of wine fermentations. BiotechnoZ. Bioeng.Symp. 9, 167-177. Corison, C. A., Ough, C. S., Berg, H. W. and Nelson, K. E. (1979) Must acetic acid and ethylacetate as mold and rot indicators in grapes? Am. J. EnoZ. Vitic. 30, 130-134. Cruess, W. V. (1918) The fermentation organisms of California grapes. Univ. Calif Publ.Agric. Sci. 4, l-66. Kirsop, B. H. (1982) Developments in beer fermentation. Top. Enz. Ferment. Biotechnol. 6.79-131. Larue, F., Lafon-Lafourcade, S. and Ribereau-Gayon, P. (1980) Realtionship between thesterol content of yeast cells and their fermentation activity in grape must. Appl. Enoiron.Microbial. 39, 808-811. 21

Ohta, H. and Hayashida, S. (1983) Role of Tween 80 and monoolein in a lipid-sterolproteincomplex which enhances ethanol tolerance of sake yeast. Appl. Environ. Microbial. 46.821-825. Pasteur, L (1879) Studies on fermentation. The diseases of beer their causes, and the means of prevending them, p.54, 219, 228, London, MacMillan Schreier, P. (1979) Flavor composition of wines: a review. CRC C.R.F.S. 12,59-111. Seifert, W. (1938) Die Chemie des Mostes und Weines, p. 64. Mainz, J. Diemer. Soles, R. M., Ough, C. S. and Kunkee, R. E. (1982) Ester concentration differences in winefermented by various species and strains of yeast. Am. J. Enol. Vitic. 33, 94-98. Thornton, R. J. (1982) Genetic investigation and modification of wine yeast characteristics. InUniversity of California, Davis Grape and Wine Centennial Symposium Proceedings (Ed.Webb, A. D. pp. 97-102). Williams, L. A. and Boulton, R. B. (19831 Modeling and prediction of evaporative ethanol loss during wine fermentations. Am. J. Enol. Vitic. 34, 234-242. 22

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 23

24

25

26