ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Μεμβρανική Βιοφυσική Εισαγωγή Διδάσκων: Λέκτορας Χαράλαμπος Λαμπρακάκης 1
Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς. 2
Μεμβρανική Βιοφυσική Χ. Λαμπρακάκης 2014 1
Μεμβρανική Βιοφυσική: μελέτη των κυτταρικών μεμβρανών με φυσικοχημικές μεθόδους 2
Μεμβρανικοί δίαυλοι: Δομή και λειτουργία Κυτταρική φυσιολογία 3
λιπιδιακή διπλοστιβάδα (μηχανική, πιέσεις, ροή λιπιδίων και πρωτεϊνών, σύντηξη) μεμβρανικοί υποδοχείς (που δεν είναι δίαυλοι) αντλίες ιόντων και μεταφορείς μικρομορίων άλλες πρωτεΐνες 4
Ερωτήματα Είναι όλες οι μεμβράνες ίδιες; Διαφέρουν οι ιδιότητες της μεμβράνης απο κύτταρο σε κύτταρο; Διαφέρουν οι ιδιότητες της μεμβράνης σε περιοχές του ίδιου κυττάρου; Τι προσφέρουν στη λειτουργία των κυττάρων η μεγάλη πληθώρα διαύλων; Γιατί χρησιμοποιούνται διαφορετικά ιόντα; Πώς η κίνηση των ιόντων διαμέσου των διαύλων σε συδυασμό με το δυναμικό της μεμβράνης συμβάλλουν στη παράγωγή, διαχειρίση και επεξεργασία βιολογικής πληροφορίας Πως οι ιδιότητες της μεμβράνης και των διαύλων της επηρεάζουν τη λειτουργία των κυττάρων Πως η λειτουργία του κυττάρου επηρεάζει της ιδιότητες της μεμβράνης και των διαύλων Πως η δυσλειτουργία των διαύλων οδηγούν στη παθογένεση ασθενειών; Πως η ροή ιόντων και το δυναμικό της μεμβράνης επιτυγχάνουν στη δημιουργία πολύπλοκων λειτουργιών όπως η μνήμη ή η συνείδιση; 5
Προσωρινό πρόγραμμα Εισαγωγή. Τεχνικές και Μεθόδοι. Οι ηλεκτρικές ιδιότητες της κυτταρικής μεμβράνης. Η δομή των ιονικών διαύλων. εργαστηριακές ασκήσεις Χρήση του περιβάλλοντος προσομοίωσης NEURON για τη μελέτη μεμβρανών, διαύλων, κυττάρων και νευρικών δικτύων. Το δυναμικό ενέργειας και το μοντέλο των Hodgkin και Huxley. Ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά των διαύλων Ι. Τασεοελεγχόμενοι δίαυλοι. Ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά των διαύλων ΙI. Συνδεματικοί δίαυλοι. Φαρμακολογία ιονικών διαύλων. Μοριακή, κυτταρική και εξελικτικήβιολογία ιονικών διαύλων. 6
διαφάνειες παρακουλούθηση ερωτήσεις εργασία τεστ 7
Βιβλία Βιβλιογραφία απο ερευνητικά άρθρα και άρθρα ανσκόπησης Μοντέρνες ερευνητικές τεχνικές διαδίκτυο κ.α. 8
Βαθμολογία Τέστ (πρόοδος) αναθέσεις ασκήσεων προσομοίωσης 57 % 5% Προετοιμασία - παρουσίαση εργασίας 38 % 9
Εργασία Συνθετική εργασία με βάση 3 4 πρωτότυπων ερευνητικών άρθρων Προφορική παρουσίαση (20 min) επιλογή θέματος της αρεσκείας σας, αλλά σχετικό με το μάθημα αναζήτηση πρωτότυπων άρθρων παρουσίαση συμπερασμάτων απο την ανασκόπιση και σύνθεση των άρθρων. 10
Ποιές οι λειτουργίες της μεμβράνης; Η κυτταρική μεμβράνη περιβάλλει τα κύτταρα Τα οριοθετεί απο το εξωκυττάριο περιβάλλον Προστασία του ενδοκυτταρικού περιβάλλοντος. Αποτελεί φραγμό στην ελεύθερη διάχυση μορίων & ιόντων (επιτρέπει όμως την εκλεκτική μεταφορά). Μηχανική υποστήριξη. 11
Ιοντικοί Δίαυλοι* Πρωτεϊνικά μακρομόρια διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη Δημιουργούν δίαυλους (H 2 O) διαπερατά σε ιόντα Επικοινωνία ενδο-εξω-κυτταρικού περιβάλλοντος * = μεμβρανικοι δίαυλοι/κανάλια/πόροι 12
Πιστευόταν ότι έπαιζαν ρόλο μόνο σε διεγέρσιμες μεμβράνες (νευρικά & μυικά κύτταρα) Αλλά βέθηκαν καί σε μή διεγέρσιμα κύτταρα όπως: ηπατοκύτταρα εξωκρινή κύτταρα αδένων 13
Επιπλέον βρέθηκαν... Και σε φυτά Βακτήρια Μύκητες πρωτόζωα ηλεκτρική δραστηριότητα στο Ε. coli Μετάδωση κίνησης των φύλλων για μιμόζα Mimosa pudica 14
Εξελικτικό δένδρο διαύλων Οι ιοντικοί δίαυλοι σε όλο το φάσμα της εξέλιξης των ειδών 15
Σχέσεις συγγένειας μεταξύ μεμβρανικών δίαυλων απο την αλληλουχία γονίδιου/πρωτεϊνης Οικογένειες δίαυλων - όνομα 16
Η σημασία της μελέτης των μεμβρανικών δίαυλων Γνώση λειτουργίας βιολογικών συστημάτων Φυσιολογικής. Παθολογικής. Ευκαιρίες φαρμακευτικής αγωγής για θεραπείες Σημαντικό ρόλο στο νευρικό σύστημα Διάδοση του πληροφορίας (γρήγορα και πιστά) αισθητήρια -> εγκέφαλος -> μύες Μετάδοση πληροφορίας απο το ένα κύτταρο στο άλλο συνάψεις, διακυτταρική επικοινωνία Επεξεργασία πληροφορίας Κωδικοποίηση,υπολογιστική ικανότητα εγκεφάλου Βάση για: τη μάθηση, σκέψη, εμπειρία, συνείδηση... 17
Κανναλοπάθειες (Channelopathies) Ασθένειες που προκαλούνται απο διαταραχές στην λειτουργία των ιοντικών δίαυλων Εκ γενετής (πχ μεταλλάξεις στους δίαυλους) Επίκτητη (πχ αυτοανοσία κατα του δίαυλου) 18
19
20
21
Καρδιακές κανναλοπάθειες κυρίως καρδιακές αρρυθμίες Congenital long QT syndrome (LQTS) 22
Ευκαιρίες ανάπτυξης φαρμακευτικών ουσιών για τη θεραπεία νόσων Τά ζωικά δηλητήρια (π.χ. του σκορπιού) περιέχουν ουσίες που αλληλεπιδρούν με ιοντικούς διαύλους. Αλλάζουν τη λειτουργικότητα του καναλιού. Κάποιες ουσίες έχουν και θεραπευτική δράση. Παράδειγμα: Αγχολυτικά και ηρεμιστικά φαρμακά που επιδρούν σε δίαυλους GABA (γ-αμινοβουτυρικό οξύ, κύριος ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής), αυξάνοντας τη λειτουργικότητα τους. 23
Δομή Δίαυλος ιόντων καλίου 24
Κατηγορίες διαύλων Ψ Τασικοί. Ψ Συνδεματικοί. Ψ Μηχανοευαίσθητοι. Ψ Φωτοευαίσθητοι. Ψ Χασμικές συνδέσεις. Συνδεματικοί Φωτοευαίσθητοι δίαυλοι Ανακάλυψη 2002 (Chlamydomonas reinhard i) Channelrhodopsin ChR1, ChR2, VChR1 + συνθετικοί *Οψίνες = Φωτοϋποδοχείς, δεν είναι δίαυλοι Πρόσδεση μορίων αλλα G-protein-συνδεδ Εξωκυτταρικά (πχ Νευροδιαβιβαστές) Ενδοκυτταρικά (κυκλικά νουκλεοτίδια/c-amp, Ca2+) 25
Μηχανισμός λειτουργίας C O Ροή ιόντων μέσω Κατάσταση ιονικού δίαυλου κλειστή ανοιχτή του δίαυλου Εκλεκτικότητα στο είδος ιόντων 26
Εκλεκτικότητα: ό Κατιοντικά (+). ό Ανιοντικά (-). όνα+, Κ+, Ca2+ Ψ Η ροή των ιόντων μέσω του δίαυλου γίνετε παθητηκά... κατεύθυνση της ροής... Ψ άνοιγμα/κλείσιμο με αλλαγές στη τρισδιάστατη δομή. 27
Χαρακτηριστικά ιοντικών δίαυλων Φαρμακολογία. Σχέση ρεύματος-δυναμικού (αγωγιμότητα). 28
Άλλοι ρόλοι ιοντικών δίαυλων Ψ Οσμοτική ρύθμιση. Ψ Έκκριση. Ψ Κυτταρική κινητικότητα. Ψ Μορφογένεση. Ψ Μιτογένεση. Ψ Αισθητήριους υποδοχείς. 29
Θεμελιώδη ερωτήματα Χημικός μηχανισμός εκλεκτικότητας Πως επηρεάζουν τις κυτταρικές διεργασίες Πως επηρεάζονται απο τις βιολογικές διεργασίες. 30
[K + ] i =140 [Na + ] i =7 [Cl - ] i =7 [Ca 2+ ] i =0.0001 πρωτεϊνες [K + ] o =3 [Na + ] o =140 [Cl - ] o =140 [Ca 2+ ] o =1.5 πυρήνας Ενδοπλασματικό Δίκτυο - [Ca 2+ ] μιτοχόνδριο 31
Δυναμικό μεμβράνης V m =V in -V out Διαφορά δυναμικού Νευρικά κύτταρα: -60 ως -80 mv Εσωτερικό πιό αρνητικό Δυναμικό ηρεμίας = Δυναμικό μεμβράνης όταν δεν υπάρχει ηλεκτρική δραστηριότ (π.χ. Δυναμικά ενέργειας) Δημιουργία δυναμικού μεμβράνης: διαφορά στη συγκέντρωση ιόντων στις δύο πλευρές και διαφορετική διαπερατότητα καθε ιόντος. 32
Πως δημιουργείται/διατηρείται η διαβάθμιση ιοντικών συγκεντρώσεων; Αντλία ιόντων Η μεταφορά των ιόντων από τις αντλίες είναι ενεργητική Δηλ. Είναι απαραίτητη η κατανάλωση ενέργειας Γίνετε αντίθετα με τη φυσική τους ροή, 33
Η κίνηση ενός μορίου στο χώρο (αέρας, διάλυμα) 34
Brownian Mo on: Προσομοίωση της τυχαία κίνηση σωματιδίων σε υγρό ή αέριο περιβάλλον Είναι αποτέλεσμα συγκρούσεων με τα μόρια του υγρού/αέρα αλλά και των σωματισδίων μεταξύ τους Εικόνες απο wikipedia 35
Πως θα κινηθεί το αρνητικό ιόν; + + + + + + + + + - - - - - - - - - - Η ροή (J ηλ ) ενός φορτισμένου σωματιδίου σε ηλεκτρικό πεδίο επηρεάζεται: z = φορτίο του σωματιδίου. ΔV = διαφορά δυναμικού του πεδίου. 36
Πως θα κινηθεί το μόριο/ιόν στο κέντρο της εικόνας; Η ροή/διάχυση (J διαχ ) ενός σωματιδίου στο χώρο επηρεάζεται: Δ[C] = διαφορά της συγκέντωσης το σωματίδιο θα διαχυθεί απο την υψηλότερη στη χαμηλότερη συγκέντρωση (Νόμος του Fick). 37
Ηλεκτροχημική διαβάθμιση K + K + K + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + K - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - K + K + K + K + K + V m = - 60 mv K + K + K + K + K + K + K + K + K + K + K + K + καθαρή ροή J = J διαχ + J ηλ 38
Πότε δεν θα υπάρχει ροή μέσα απο τον δίαυλο; J = J ηλ + J διαχ 1. J = 0 J ηλ = 0 και J διαχ = 0 2. J = J ηλ χ + J δια = 0 J ηλ + J διαχ = 0 => J ηλ = -J διαχ 39
Υπο ποιές συνθήκες οι παράγοντες που επηρεάζουν τη ροή των ιόντων δεν θα προκαλούν καθαρή ροή ιόντων; J ηλ = -J διαχ z ΔV = - [C] o / [C] i *οι εξισώσεις αυτές δεν είναι πραγματικές αλλά ελλειπές και δίνονται μόνο για εκπαιδευτικούς σκοπούς ΔV = - (1/z) [C] o / [C] i Σημαίνει ότι για συγκεκριμένες συγκεντρώσεις και φορτίο, αν το δυναμικό της μεμβράνης λάβει τιμή ΔV δεν θα υπάρχει καθαρή ροή ιόντων. ή η ροή λόγω ηλεκτρικού πεδίου με δυναμικό ΔV είναι ισοδύναμη και αντίθετη με τη ροή διάχυσης που προκαλείται απο τη συγκεκριμένη αναλογία συγκεντρώσεων σε κάθε άλλο δυναμικό η καθαρή ροή δεν θα είναι 0 (ανάλογα με το δυναμικό μπορεί να είναι προ τα μέσα ή προς τα έξω). 40
Η διαβάθμιση της συγκέντρωσης ώς ηλεκτρικό δυναμικό Η εξίσωση του Nernst RT [ion] E ion = ln( o ) zf [ion] i 58 [ion] E ion = log( o ) z [ion] i E ion = δυναμικό ισορροπίας (mv) R = σταθερά ιδανικού αερίου T = θερμοκρασία (Kelvin) z = φορτίο ιόντος F = σταθερά Faraday (Coulomb/mol) [ion] o = συγκέντρωση έξω (mm) [ion] i = συγκέντρωση μέσα (mm) ln = λογάριθμος με βάση το e (= 2.303 log) Είναι το δυναμικό εκείνο που θα προκαλέσει κίνηση των ιόντων λόγω του ηλεκτρικού πεδίου με κατεύθυνση αντίθετη της κίνηση τους λόγω της διάχυσης (=διαφορ. συγκ.) Τα ιόντα ρέουν ισότιμα προς το εσωτερικό και εξωτερικό με καθαρή ροή = 0. 41
Ηλεκτρισμός: Νόμος του Ohm dv = I R I= g dv dv = διαφορά δυναμικού I = ρεύμα R = αντίσταση g = αγωγιμότητα g=1/r 42
Ο νόμος του Ohm στους διαύλους I= g dv Δηλαδή, V m = E ion ΰ I ion = 0 E ion = δυναμικό ισορροπίας (mv) g = αγωγιμότητα RT [ion] E ion = ln( o ) zf [ion] i 43
(π.χ. η ροή ιόντων Na+ απο το εξωτερικό προς το εσωτερικό του κυττάρου δημιουργεί αρνητικό ρεύμα) Ερώτηση: Ποιό είναι το πρόσιμο του ρεύματος που δημιουρήται με την εκροή ιόντων χλωρίου; Σχεδιαγραμματικά, το αρνητικό ρεύμα παριστάνεται ως μεταβολή προς τα κάτω: 0 pa ρεύμα -10 pa Σχεδιάγραμμα: καταγραφές ρεύματος Αξονας Χ: χρόνος Αξονας Υ: ένταση ρεύματος 44
Ηλεκτρισμός: Η αρχή διατήρησης του Transporters φορτίου I1 I 1 = I 2 + I 3 I3 I2
Η εξίσωση Goldman-Hodgkin-Katz P K [K+] o + P Na [Na + ] o + P Cl [Cl - ] i RT E GHK = ln( ) zf P K [K+] i + P Na [Na + ] i + P Cl [Cl - ] o E GHK = δυναμικό ισορροπίας (ηρεμίας) της μεμβράνης p = σχετική διαπερατότητα K, Na, Cl = τα ιόντα στα οποία είναι περατή η μεμβράνη στη κατάσταση ηρεμίας. Ισχύει μόνε σε σταθερή κατάσταση (όταν δεν μεταβάλλεται η τάση) Χ 46
Δυναμικό ισορροπίας ιόντος Δυναμικό ισορροπίας δίαυλου ΨΑν είναι διαπερατό σε ένα μόνο ιόν = δυναμικό ισορροπίας ιόντος ΨΑν είναι διαπεράτό σε περισσοτερα ιόντα = εξίσωση Goldman-Hodgkin-Katz Δυναμικό ηρεμίας μεμβράνης νευρικού κυττάρου 47
Αλλαγές στο δυναμικό της μεμβράνης (V m ) Το V m δεν είναι σταθερό αλλάζει ανάλογα με τη δραστηριότητα (πχ δίαυλοι) Εκπόλωση = το V m είναι πιό θετικό (λιγότερο αρνητικό) από το δυναμικό ηρεμίας Υπερπόλωση = το V m γίνετε πιό αρνητικό από το δυναμικό ηρεμίας. -40 Εκπόλωση επαναπόλωση -60-70 Δυναμικό ηρεμίας Υπερπόλωση mv 48
Πειραματική αλλαγή δυναμικού ηρεμίας Εκπόλωση Υπερπόλωση 1. Αύξηση συκγέντρωσης Κ+ εξωτερικά. 2. Φαρμακολογική ουσία που ανοίγει κανάλια (πχ Να + ). 3. Εφαρμογή θετικού ρευματος στο εσωτερικό. 1. Φαρμακευτική ουσία που ανοίγει κανάλια (πχ Κ + ). 2. Εφαρμογή αρνητικού ρεύματος στο εσωτερικό. 49
Δυναμικό Μεμβράνης = διαφορά δυναμικού μεταξύ εσωτερικού και εξωτερικού του κυττάρου Δυναμικό ηρεμίας = Το σταθερό διαμεμβρανικό δυναμικό ενος κυττάρου όταν δέν παράγει ηλεκρτικό σήμα Δυναμικό ισορροπίας (ιόντος) = διαφορά δυναμικού που παράγει ροή ιόνων ιση αλλά αντίθετης φοράς από τη ροή που οφείλεται στη διαβάθμιση της συγκέντρωσης Δυναμικό ενέργειας = Σύντομη «όλα ή τίποτα» εκπόλωσητης μεμβράνης που αναστρέφει την πολικότητα (>0 mv) στους νευρώνες. Έχει ουδό και δέν φθίνει καθώς άγεται. Κλιμακωτό δυναμικό = αλλαγή του δυναμικού μεμβράνης ποικίλου εύρους και διάρκειας, δεν έχει ουδό και φθίνει καθώς άγεται συναπτικό αισθητήρα βηματοδότη Δυναμικό ηρεμίας Δυναμικό ενέργειας Κλιμακωτό δυναμικό 50
Το νευρικό κύτταρο Δενδρίτες Πυρήνας Σώμα Συναπτικές απολήξεις AIS Αρχικό τμήμα άξονα Άξονας μυελίνη 51
Τέλος Ενότητας 54
Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους. 55
Σημειώματα 56
Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ. http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1290. 57
Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκων: Λέκτορας Χαράλαμπος Λαμπρακάκης. «Μεμβρανική Βιοφυσική. Εισαγωγή». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1290. 58
Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Μη Εμπορική Χρήση Όχι Παράγωγα Έργα, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1] https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Ως Μη Εμπορική ορίζεται η χρήση: που δεν περιλαμβάνει άμεσο ή έμμεσο οικονομικό όφελος από την χρήση του έργου, για το διανομέα του έργου και αδειοδόχο. που δεν περιλαμβάνει οικονομική συναλλαγή ως προϋπόθεση για τη χρήση ή πρόσβαση στο έργο. που δεν προσπορίζει στο διανομέα του έργου και αδειοδόχο έμμεσο οικονομικό όφελος (π.χ. διαφημίσεις) από την προβολή του έργου σε διαδικτυακό τόπο. Ο δικαιούχος μπορεί να παρέχει στον αδειοδόχο ξεχωριστή άδεια να χρησιμοποιεί το έργο για εμπορική χρήση, εφόσον αυτό του ζητηθεί. 59