ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ»

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ» ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΚΟΙΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΔΑΦΙΚΩΝ ΝΗΜΑΤΩΔΩΝ ΣΕ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΛΙΠΑΝΣΗΣ - ΑΡΔΕΥΣΗΣ ΚΟΥΣΕΡΑΣ ΘΩΜΑΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΡΓΥΡΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2009

Ευχαριστίες Για την παρούσα διατριβή, που εκπονήθηκε στον Τομέα Οικολογίας του Τμήματος Βιολογίας, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, θα ήθελα ειλικρινώς να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ κ. Διαμαντόπουλο Ιωάννη, που ήταν και ο εμπνευστής ετούτης της προσπάθειας, και την Επίκουρο Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ κ. Ευφημία Παπαθεοδώρου για την αρωγή τους, τον ελεγκτικό αλλά κυρίως συμβουλευτικό τους ρόλο σε όλη τη διάρκεια της προσπάθειας αυτής. Εξαιρετικά ευχαριστώ το τρίτο μέλος της εξεταστικής επιτροπής και επιβλέπον της αυτής της διατριβής, την Επίκουρο Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ, κ. Μαρία Αργυροπούλου, η οποία όχι απλά είχε σημαντική συνεισφορά στη διαμόρφωση και τελεσφόρηση αυτής της προσπάθειας, αλλά πολύ περισσότερο δίχως τις παραινέσεις δε θα είχε ολοκληρωθεί αυτή η διατριβή. Θερμά την ευχαριστώ επιπροσθέτως για την Ιώβεια υπομονή που επέδειξε σε όλους αυτούς του μήνες της «τριβής» με τον υποφενόμενο. Τέλος θέλω να ευχαριστήσω τους συμφοιτητές μου και τους υποψήφιους διδάκτορες του Τμήματος Οικολογίας, που εκτός από άψογοι συνεργάτες, υπήρξαν για μένα φίλοι και συναγωνιστές στον στίβο της γνώσης. 2

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ. 4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΙΣΑΓΩΓΗ...7. Έδαφος, βιοποικιλότητα και βιολογικοί δείκτες.7.2 Νηματώδεις..8.2. Γενικά χαρακτηριστικά.8.3 Σκοπός 4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5 2. Περιγραφή Περιοχής Μελέτης.5 2.2 Πειραματικός Σχεδιασμός 7 2.3 Μέθοδοι Δειγματοληψίας..20 2.4 Μέθοδοι Ανάλυσης..2 2.4. Εξαγωγή, Καταμέτρηση, Ταυτοποίηση και Μονιμοποίηση Νηματωδών..2 2.4.2 Προσδιορισμός Μηχανικής Σύστασης του Εδάφους (Bouyoucos 95)..23 2.4.3 Προσδιορισμός ph (Bates 964)..24 2.5 Ανάλυση και Στατιστική Επεξεργασία.25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.27 3. Χειρισμός Άρδευσης.27 3.2 Τροφικές Ομάδες..28 3.2. Αφθονίες Τροφικών Ομάδων 28 3.2.2 Ανάλυση Διακύμανσης Κατά Τρεις Παράγοντες..30 3.2.3 Ανάλυση Διακύμανσης Κατά Δύο Παράγοντες Μάρτιος 35 3.2.4 Ανάλυση Διακύμανσης Κατά Δύο Παράγοντες Ιούνιος. 38 3

3.2.5 Λογαριθμο- γραμμικό Μοντέλο..4 3.2.6 Διαφοροποιός Ανάλυση 43 3.2.7 Ομαδοποιός Ανάλυση 46 3.3 Δομή και Σύνθεση Βιοκοινότητας.. 47 3.4 Ποικιλότητα Βιοκοινότητας 53 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ...56 4. Υγρή Περίοδος (Δειγματοληψία Μαρτίου). 58 4.2 Ξηρή Περίοδος (Δειγματοληψία Ιουνίου)...6 4.3 Συμπεράσματα.62 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 64 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 4

Αν οι επιστήμονες του περιβάλλοντος έπρεπε να δημιουργήσουν μια ομάδα οργανισμών με σκοπό να τη χρησιμοποιήσουν στην παρακολούθηση αλλαγών των εδαφικών συνθηκών, στην εκτίμηση της βιοποικιλότητας και στην αποτίμηση των επιπτώσεων διάφορων διαταραχών, σίγουρα θα σχεδίαζαν οργανισμούς με τα χαρακτηριστικά των νηματωδών. Ζώα με μεγάλη οικολογική σημασία, οι νηματώδεις, έχουν συγκεντρώσει την προσοχή των επιστημόνων τα τελευταία 20 χρόνια, καθώς αντικατοπτρίζουν τις αλλαγές στη δομή και τη λειτουργία του εδάφους, με τρόπο περισσότερο αποτελεσματικό και προβλέψιμο απ ό, τι άλλες ομάδες ζώων ή φυτών. Στο διάστημα αυτό οι νηματώδεις έχουν χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτες για πληθώρα περιπτώσεων όπως η αποτίμηση επιπτώσεων διάφορων χρήσεων γης στο έδαφος, η ρύπανση από βαρέα μέταλλα, καθώς για την εκτίμηση της κατάστασης του εδάφους κάτω από διάφορες γεωργικές διαχειριστικές εφαρμογές, όπως για παράδειγμα η οργανική και η συμβατική κτηνοτροφία, η άροση, η αγρανάπαυση κ.λπ. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η μελέτη των μεταβολών της βιοκοινότητας των εδαφικών νηματωδών μετά από μια βιοτική και μια αβιοτική παρέμβαση, οι οποίες αφορούσαν προσθήκη οργανικού υλικού και αλλαγή των συνθηκών της υγρασίας του εδάφους αντίστοιχα. Η ανάλυση των δειγμάτων όσον αφορά την τροφική σύνθεση έδειξε ότι η πιο άφθονη τροφική ομάδα και στις δύο δειγματοληπτικές περιόδους είναι οι φυτοπαρασιτικοί νηματώδεις με ποσοστά συμμετοχής στη βιοκοινότητα από 26-48%, ακολουθούμενοι από τους βακτηριοφάγους, τους μυκητοφάγους και τους μη παρασιτικούς φυτοφάγους, ενώ οι θηρευτές και παμφάγοι παρουσίασαν πολύ μικρή συμμετοχή. Όσον αφορά τη μετάβαση από τη μια δειγματοληπτική περίοδο (υγρή εποχή) στην άλλη (ξηρή εποχή), διαπιστώθηκε ισχυρή επίδραση της εποχικότητας, καθώς αυξήθηκαν σημαντικά η ολική αφθονία και γενικότερα αυξήθηκαν οι αφθονίες όλων 5

σχεδόν των τροφικών ομάδων. Η επίδραση αυτή του χρονικού προτύπου αποδίδεται στη ραγδαία αύξηση της φυτοκάληψης στις δειγματοληπτικές επιφάνειες. Όσον αφορά τη μελέτη των αποτελεσμάτων κατά τη δειγματοληπτική περίοδο του Μαρτίου, η παρέμβαση στο επίπεδο της εδαφικής υγρασίας δεν έπαιξε κανένα ρόλο από μόνη της ενώ η προσθήκη οργανικής λίπανσης αποτέλεσε ισχυρότερο παράγοντα μεταβολής των αφθονιών των τροφικών ομάδων. Αντιθέτως στη δειγματοληπτική περίοδο του Ιουνίου οι δύο παρεμβάσεις (οργανική λίπανση και υγρασία) ήταν εξίσου σημαντικοί και επέβαλλαν συνδυαστικές αλλαγές στη βιοκοινότητα, αυξάνοντας την ποικιλότητα σε όλες της επιφάνειες και επιφέροντας αλλαγές στη σύνθεση της βιοκοινότητας, με σημαντικότερη τη μείωση της υπερκυριαρχίας του γένους pratylenchus. Η ανάλυση σε επίπεδο γένους έδειξε ότι ισχυρότερος παράγοντας ήταν το χρονικό πρότυπο, διαχωρίζοντας πρωτίστως τα δείγματα της πρώτης από τη δεύτερη δειγματοληψίας. Ειδικότερα σε κάθε δειγματοληψία διαχώρισε τα δείγματα με βάση τους χειρισμούς ανέδειξε όμως τη διαφορετική συμπεριφορά που έδειξαν στις παρεμβάσεις γένη της ίδιας τροφικής λειτουργικής ομάδας. Γενικότερα μπορούμε να πούμε ότι όσον αφορά τη τροφική δομή της βιοκοινότητας ότι οι φυτοπαρασιτικοί νηματώδεις αποτελούν την πιο άφθονη τροφική ομάδα, ενώ Η συμμετοχή των Βακτηριοφάγων με r στρατηγικές ζωής είναι εξαιρετικά χαμηλή ακόμη και στις εμπλουτισμένες με οργανική λίπανση επιφάνειες. Όσον αφορά τους χειρισμούς ο εμπλουτισμός με οργανικό υλικό επιβάλλει κάποιες αλλαγές στη βιοκοινότητα των νηματωδών στη δειγματοληψία της υγρής περιόδου (Μάρτιος), ενώ σ αυτήν της ξηρής (Ιουνίου) τόσο η λίπανση, όσο και το επίπεδο υγρασίας ασκούν εξίσου σημαντική επίδραση. Από τη δειγματοληψία του Μαρτίου σ αυτήν του Ιουνίου παρατηρήθηκε ένα ισχυρό χρονικό πρότυπο λόγω αύξησης της βλάστησης στο διάστημα που μεσολάβησε μεταξύ 6

των δύο εποχών. Χρονικό πρότυπο το οποίο αύξησε τις αφθονίες και την ποικιλότητα στη δεύτερη δειγματοληψία (Ιούνιο). Η μη εξαγωγή κάποιου άλλου καθαρού προτύπου επιβολής μεταβολών από την εφαρμογή των καταπονήσεων σε συνάρτηση με την εμφάνιση διαφορετικής συμπεριφοράς γενών της ίδιας τροφικής ομάδας καταδεικνύει την ανάγκη της μελέτης της συμπεριφοράς και σε επίπεδο γενών ή/και ειδών. 7

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΙΣΑΓΩΓΗ. Έδαφος, βιοποικιλότητα και βιολογικοί δείκτες Στα περισσότερα χερσαία οικοσυστήματα η βιοποικιλότητα είναι μεγαλύτερη μέσα στο έδαφος απ ότι πάνω απ αυτό (Beard, 99; Giller at al., 997). Παρόλο που το έδαφος είναι ένας φυσικός πόρος που παίζει ζωτικό ρόλο στη λειτουργία και ισορροπία των οικοσυστημάτων (Doran & Parkin, 994) δεν υπάρχει νομικό πλαίσιο που να επιβάλλει την παρακολούθηση και προστασία του όπως συμβαίνει με το νερό και τον αέρα. Η αξιολόγηση της κατάστασης του εδάφους είναι απαραίτητο στοιχείο για την αποτίμηση ή την παρακολούθηση των αποτελεσμάτων οποιασδήποτε διαχειριστικής μεθόδου (Staben et al., 997). Η ποιότητα του εδάφους σύμφωνα με τους Doran & Parkin (994) αξιολογείται από την ικανότητα του να λειτουργεί, να υποστηρίζει τη βιολογική δραστηριότητα, να συμβάλει στη διατήρηση του περιβάλλοντος και να προάγει την «υγεία» των φυτών και των ζώων. Για την εκτίμηση της ποιότητας του εδάφους έχει προταθεί ένα πλήθος από φυσικούς και χημικούς δείκτες (Karlen et al., 994). Εναλλακτικά χρησιμοποιούνται και οι βιολογικοί δείκτες που πλεονεκτούν έναντι των χημικών, διότι δεν μεταβάλλονται όπως αυτοί από ημερήσιες ή ωριαίες διακυμάνσεις περιβαλλοντικών συνθηκών ή από τυχαία γεγονότα. Επίσης, οι περισσότερες εδαφικές λειτουργίες εξαρτώνται από βιολογικές δραστηριότητες και έτσι οι βιολογικοί δείκτες ενδείκνυνται περισσότερο για 8

την αξιολόγηση ή την παρακολούθηση της κατάστασης/ ποιότητας του εδάφους (π.χ. Pankhurst et al., 997). O van Straalen (998) αναφέρει χαρακτηριστικά ότι υπάρχουν τρείς βασικές καταστάσεις οι οποίες μας οδηγούν στη διερεύνηση βιολογικών παραμέτρων (που ίσως είναι περισσότερο περίπλοκες) έναντι χημικών (που κατά κανόνα είναι περισσότερο απλές). Οι περιπτώσεις αυτές είναι α) η χημική παράμετρος δεν μπορεί να μετρηθεί, β) αυτή μπορεί να μετρηθεί αλλά με δυσκολία, γ) αυτή μπορεί εύκολα να μετρηθεί, αλλά δύσκολα αξιολογείται. Η τρίτη περίπτωση είναι μάλλον και η πιο συνηθισμένη για τα εδαφικά οικοσυστήματα. Είναι συχνό το φαινόμενο να υπάρχουν δεδομένα από ένα πλήθος μετρήσεων διάφορων φυσικοχημικών παραμέτρων, ωστόσο να μην μπορεί να αξιολογηθεί η κατάσταση του εδάφους ή το αποτέλεσμα κάποιας διαχειριστικής πρακτικής πάνω στις βιολογικές λειτουργίες του, οι οποίες είναι αυτές που σε τελική ανάλυση μας ενδιαφέρουν. Από τους πολυάριθμους βιοδείκτες οι νηματώδεις (Nematoda) είναι ανάμεσα στους περισσότερο προτεινόμενους (van Straalen, 998). Επίσης είναι ανάμεσα στους πλέον αποτελεσματικούς για την αποτίμηση των επιπτώσεων διάφορων χρήσεων γης στο έδαφος (Bongers, 990; Bongers & Ferris, 999; Wasilewska, 997). Έτσι, οι νηματώδεις η πιο χαρακτηριστική και άφθονη ομάδα της εδαφικής μικροπανίδας, χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτες στο σύνολο της παρούσας διατριβής..2 Νηματώδεις.2. Γενικά χαρακτηριστικά Οι νηματώδεις είναι τα πληθυσμιακά πολυπληθέστερα ζώα στη γη. Με εξαίρεση τα έντομα, καμία άλλη ομάδα ζώων, καθ ότι παράσιτα στον άνθρωπο και στις καλλιέργειες δεν είχε τέτοια επίδραση στον πολιτισμό του ανθρώπου (Maggenti, 98). Το 25% του ανθρώπινου πληθυσμού υποφέρει από διάφορες μολύνσεις νηματωδών (Andersen, 992), ενώ οι φυτοπαρασιτικοί νηματώδεις είναι μια από τις μεγαλύτερες 9

κατηγορίες παρασίτων και προκαλούν ετησίως, σε παγκόσμιο επίπεδο, απώλειες αξίας 80 δισ. δολ. στον αγροτικό τομέα (Sasser & Freckman, 987). Η πλήρης συστηματική κατάταξη των νηματωδών σύμφωνα με το Systema Naturae 2000 είναι η ακόλουθη: Βασίλειο: Animalia Υποβασίλειο: Bilateria ( Αμφιπλευροσυμμετρικά) Διαίρεση: Protostomia ( Πρωτοστόμια) Υποδιαίρεση: Ecdysozoa ( Εκδυσόζωα) Υπερφύλο: Aschelminthes (Ασχέλμινθες) Φύλο: Nematoda (Νηματώδεις) Οι νηματώδεις καταλαμβάνουν πληθώρα οικοτόπων και εμφανίζουν μια συναρπαστική ποικιλία τρόπων διαβίωσης. Περίπου 20.000 είδη έχουν περιγραφεί αλλά πιθανολογείται ότι ο πραγματικός αριθμός ειδών κυμαίνεται μεταξύ 40.000 και 00 εκατομμυρίων (Dorris et al., 999; Lambshead, 993). Ορισμένα είδη νηματωδών ήταν γνωστά στην αρχαιότητα. Για παράδειγμα το παράσιτο Ascaris lumbricoides ήταν γνωστό στην Κίνα πριν από 5.000 χρόνια, ενώ το επίσης παράσιτο Dracunculus medinensis είχε αναφερθεί από τους Αιγύπτιους πριν από 3.500 χρόνια. Ο Ιπποκράτης και ο Αριστοτέλης ανέφεραν χαρακτηριστικά του είδους Enterobius vermicularis, ενώ ο Αριστοτέλης ήταν επίσης ο πρώτος που ασχολήθηκε με την περιγραφή των νηματωδών. Η συστηματική βέβαια μελέτη ξεκίνησε μόλις το 850 με τη χρήση του οπτικού μικροσκοπίου (Panesar & Marshall, 2003), ενώ απογειώθηκε με τη χαρτογράφηση του γονιδιώματος του Caenorhabditis elegans. Τα τελευταία 20 χρόνια οι νηματώδεις χρησιμοποιούνται ως δείκτες για την αξιολόγηση χερσαίων και υδάτινων οικοσυστημάτων. Οι εδαφικοί νηματώδεις που αποτελούν το αντικείμενο μελέτης, όπως και όλοι οι νηματώδεις βέβαια, είναι υδρόβια ζώα. Επιβιώνουν δηλαδή στην υδάτινη μεμβράνη που υπάρχει ανάμεσα στους πόρους του εδάφους. Ο τυπικός κύκλος ζωής των 0

εδαφικών, μη παρασιτικών νηματωδών, περιλαμβάνει 6 στάδια. Αυγό, 4 στάδια ανώριμου ατόμου και ώριμο άτομο. Τα παραπάνω στάδια ολοκληρώνονται συνήθως σε ένα μόνο περιβάλλον, σε αντίθεση με τους παρασιτικούς νηματώδεις, οι οποίοι σε κάποιο στάδιο του κύκλου τους αλλάζουν περιβάλλον. Η διάρκεια ζωής για τους περισσότερους εδαφικούς νηματώδεις είναι περίπου τρείς εβδομάδες. Μπορεί όμως να ποικίλει ανάμεσα στα είδη, για παράδειγμα σ αυτά που έχουν διαφορετική στρατηγική ζωής, ενώ επίσης μπορεί να επηρεάζεται από περιβαλλοντικές παραμέτρους όπως είναι η θερμοκρασία, το ph, κτλ. (Maggenti, 98). Το μέσο μέγεθος των εδαφικών νηματωδών τέλος είναι γύρω στο mm. Αν οι επιστήμονες του περιβάλλοντος έπρεπε να δημιουργήσουν μια ομάδα οργανισμών με σκοπό να τη χρησιμοποιήσουν στην παρακολούθηση αλλαγών των εδαφικών συνθηκών, στην εκτίμηση της βιοποικιλότητας και στην αποτίμηση των επιπτώσεων διάφορων διαταραχών, σίγουρα θα σχεδίαζαν οργανισμούς με τα χαρακτηριστικά των νηματωδών (Bongers & Ferris, 999). Συνοπτικά, η οικολογική σπουδαιότητα των νηματωδών έγκειται στη μεγάλη αφθονία τους, στο μεγάλο αριθμό ειδών και στην ποικιλία τροφικών τύπων και στρατηγικών ζωής (Yeates, 2003), καταλαμβάνουν θέσεις κλειδιά στο εδαφικό οικοσύστημα: συμμετέχουν σε διαδικασίες ανακύκλωσης και ανοργανοποίησης και απελευθερώνουν θρεπτικά σε μορφές που μπορούν να προσληφθούν από τα φυτά. Οι βακτηριοφάγοι και μυκητοφάγοι νηματώδεις για παράδειγμα, απελευθερώνουν αυξημένες ποσότητες αμμωνίου (ΝΗ4+) λόγω του ότι τα βακτήρια και οι μύκητες που καταναλώνουν περιέχουν περισσότερο Ν από αυτό που απαιτούν οι ίδιοι για τη διαβίωση τους. Επιπλέον, ενεργοποιούν τον πολλαπλασιασμό των βακτηρίων, ελέγχουν όμως και τον πληθυσμό τους. Βοηθούν τέλος στην εξάπλωση των μικροβίων και επηρεάζουν την κατανομή τους καθώς σε πολλές περιπτώσεις τα απελευθερώνουν άπεπτα (Bongers & Ferris, 999; Fiscus & Neher, 2002; Ingham, 2006). Τα τελευταία 20 χρόνια έχει δοθεί από τους ερευνητές ιδιαίτερη προσοχή στους νηματώδεις, καθ ότι ως αναπόσπαστα αυτά μέλη της εδαφικής βιοκοινότητας

αντικατοπτρίζουν αλλαγές στη δομή και τη λειτουργία του εδάφους, με τρόπο περισσότερο αποτελεσματικό και προβλέψιμο απ ό, τι άλλες ομάδες ζώων ή φυτών (Fiscus & Neher, 2002), για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται ευρέως ως βιοδείκτες στην αξιολόγηση των χερσαίων οικοσυστημάτων. Έχουν χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτες για την αποτίμηση επιπτώσεων διάφορων χρήσεων γης στο έδαφος (Urzelai, 2000), τη ρύπανση από βαρέα μέταλλα (Korthals et al., 2000), τις κλιματικές αλλαγές (Bakonyi & Nagy, 2000; Papatheodorou et al.,2004; Stamou et al.,2003), καθώς και για την περιγραφή των οικοτόνων μεταξύ των οικοσυστημάτων (Imaz et al., 2002). Περισσότερο συχνά έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της κατάστασης του εδάφους κάτω από διάφορες γεωργικές διαχειριστικές εφαρμογές, όπως για παράδειγμα η οργανική και η συμβατική κτηνοτροφία (Mulder et al., 2003), η άροση (Fu et al., 2000), η αγρανάπαυση (Villenave et al., 200), τα διαφορετικά καλλιεργούμενα είδη (Widmer et al., 2002), η χρήση παρασιτοκτόνων (Liang et al., 200), η χρήση μυκητοκτόνων (Villenave et al.,2004) και η χρήση ζιζανιοκτόνων (Yeates et al., 999). Τα πλεονεκτήματα των νηματωδών στη χρήση τους στην εκτίμηση οικολογικών συστημάτων έγκεινται στο γεγονός ότι διαβιούν σε όλα τα εδάφη όπου υπάρχει έστω και ελάχιστη υγρασία και σε μεγάλες αφθονίες, παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία σε διατροφική συνήθειες και στρατηγικές ζωής, οι οποίες έχουν διαφορετικές αποκρίσεις στη ρύπανση και στις διαταραχές του εδάφους, βρίσκονται σε μεγάλες αφθονίες και συλλέγονται σχετικά εύκολα και σε όλες τις εποχές (Bongers, 990; Bongers & Ferris, 999), ενώ τέλος η συλλογή και ταυτοπίηση τους είναι σχετικά απλή και επιτυγχάνεται με προσιτά μέσα. Εκτός όμως από αυτού του είδους τα γνωρίσματα, που χαρακτηρίζουν ένα εύχρηστο βιολογικό υλικό, οι νηματώδεις έχουν και κάποια άλλα χαρακτηριστικά γνωρίσματα, τα οποία οδήγησαν στη χρήση τους σε εργασίες βιοπαρακολούθησης και αξιολόγησης οικοσυστημάτων. Μια από τις ιδιαίτερες ιδιότητες των νηματωδών, είναι ότι καλύπτουν όλες τις πιθανές κατηγορίες του εδαφικού τροφικού πλέγματος (Yeates, 998). Το κάθε γένος 2

νηματωδών κατατάσσεται σύμφωνα με τα μορφολογικά χαρακτηριστικά του στόματος, του κεφαλιού και του φάρυγγα, σε μία από τις 5 βασικές τροφικές ομάδες (Yeates et al., 993). Η σχετική αφθονία των τροφικών ομάδων των νηματωδών επηρεάζει τον κύκλο των θρεπτικών τόσο στις διαδικασίες αποικοδόμησης όσο και στις διαδικασίες πρωτογενούς παραγωγής (Fiscus & Neher, 2002 και εν τούτω αναφορές). Οι βασικές τροφικές ομάδες είναι: Φυτοφάγοι νηματώδεις: οι φυτοφάγοι νηματώδεις τρέφονται από αγγειώδη φυτά χρησιμοποιώντας ένα στοματικό εξάρτημα το «στιλέτο» (stylet) που διαπερνά τα φυτικά κύτταρα. Υπάρχουν ποικίλες μορφές αυτού του οργάνου, οι οποίες καθορίζουν τη σχέση του νηματώδους με το φυτό. Λόγω αυτής της σχέσης, υπάρχουν αρκετές υποκατηγορίες φυτοφάγων νηματωδών. Οι δύο βασικές ωστόσο είναι αύτη των μη παρασιτικών φυτοφάγων και αυτή των φυτοπαρασιτικών νηματωδών. Οι μη παρασιτικοί τρέφονται μόνο από τα επιδερμικά κύτταρα των ριζικών τριχιδίων και δεν προκαλούν καταστροφές στα φυτά ενώ οι φυτοπαρασιτικοί μπορούν να διαπεράσουν βαθύτερα στρώματα των ριζών, να εισέλθουν στο φυτό και να περάσουν κάποιο στάδιο του κύκλου τους μέσα σ αυτό. Μπορούν επίσης ανάλογα με το συνδυασμό είδος νηματώδους φυτού να προκαλέσουν σημαντικές καταστροφές. 2 Μυκητοφάγοι νηματώδεις: οι μυκητοφάγοι νηματώδεις διαπερνούν τις μυκητιακές υφές επίσης με ένα στιλέτο από το εσωτερικό του οποίου γίνεται η αναρρόφηση ουσιών. 3 Βακτηριοφάγοι νηματώδεις: η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει τους νηματώδεις που τρέφονται από οποιαδήποτε πηγή προκαρυωτικών οργανισμών. Δεν διαθέτουν στιλέτο στο στόμα, αλλά ένα σωληνοειδές άνοιγμα μέσα από το οποίο περνάει η τροφή. 4 Θηρευτές νηματώδεις: οι θηρευτές νηματώδεις τρέφονται από πρώτιστα, άλλους νηματώδεις, τροχόζωα και ενχυτρίδες (Enchytreidae). Μπορούν να απομυζούν σωματικά τμήματα μέσω ενός στοματικού εξαρτήματος που μοιάζει με λόγχη 3

(spear) ή να καταπίνουν τη λεία τους ολόκληρη στη περίπτωση που διαθέτουν ένα ευρύ άνοιγμα στόματος. 5 Παμφάγοι νηματώδεις: οι παμφάγοι νηματώδεις τρέφονται από ποικίλες πηγές και μορφολογικά μοιάζουν αρκετά με τους θηρευτές. Ένα άλλο ιδιαίτερο γνώρισμα των νηματωδών, είναι ότι οι διάφορες οικογένειες τους παρουσιάζουν διαφορετική ευαισθησία στη ρύπανση και στη διαταραχή του εδάφους και έχουν ποικίλες στρατηγικές ζωής, καλύπτοντας όλο το φάσμα r-k (Bongers, 990; Bongers & Ferris, 999). Ο Bongers (990) κατέταξε τις οικογένειες των νηματωδών σε μία πενταβάθμια κλίμακα στρατηγικών ζωής (colonizer persister gradient: c-p) στο ένα άκρο της οποίας τοποθετούνται οι νηματώδεις με r στρατηγική (νηματώδεις που εποικίζουν εύκολα: cp=) και στο άλλο άκρο οι νηματώδεις με Κ στρατηγική (νηματώδεις που προτιμούν τα σταθερά περιβάλλοντα: c-p=5). Τις ενδιάμεσες θέσεις (τιμές c-p =2-4) κατέχουν οι οικογένειες των νηματωδών με ενδιάμεσα χαρακτηριστικά. Όπως απεικονίζεται και στον Πίνακα, στη μικρότερη τιμή c-p κατατάσσονται μόνο βακτηριοφάγοι νηματώδεις, καθ ότι είναι αυτοί που μπορεί να εποικίσουν γρήγορα ένα ενδιαίτημα. Η ικανότητά τους αυτή οφείλεται στους γρήγορους ρυθμούς εγγενούς αναπαραγωγής, αλλά και στο ότι ορισμένες οικογένειες μπορεί να αναπαράγονται παρθενογενετικά (όπως για παράδειγμα η οικογένεια Rhabditidae). Αντίθετα στις υψηλές τιμές c-p κατατάσσονται οι παμφάγοι, θηρευτές και φυτοφάγοι νηματώδεις. Μόνο οικογένειες από τις τρεις τελευταίες ομάδες έχουν σχετικά μεγάλα μεγέθη, αργούς κύκλους αναπαραγωγής και χαρακτηρίζουν τα πιο ώριμα στάδια διαδοχής μιας βιοκοινότητας. Μια τέτοια τροφική ομάδα συγκεκριμένης στρατηγικής ζωής (ΒΑ-2, ΘΗ4 κ.λπ.) ονομάζεται λειτουργική ομάδα (functional guild). Τα μέλη μιας λειτουργικής ομάδας θεωρείται ότι αποκρίνονται με τον ίδιο τρόπο σε διάφορες περιστάσεις, όπως για παράδειγμα σε έναν εμπλουτισμό με θρεπτικά ή σε μία διαταραχή. 4

Πίνακας. Πιθανοί συνδυασμοί τροφικών ομάδων και στρατηγικών ζωής (από Bongers & Bongers, 998). Φυτοφάγοι Βακτηριοφάγοι Μυκητοφάγοι Θηρευτές Παμφάγοι cp- cp-2 cp-3 cp-4 cp-5 ΒΑ- - ΦΥ-2 ΒΑ-2 ΜΥ-2 - ΦΥ-3 ΒΑ-3 ΜΥ-3 ΘΗ-3 - ΦΥ-4 ΒΑ-4 ΜΥ-4 ΘΗ-4 ΠΑ-4 ΦΥ-5 ΘΗ-5 ΠΑ-5 ΦΥ-2, ΦΥ-3, ΦΥ-4, ΦΥ-5: φυτοφάγοι με τιμή cp ίση με 2, 3, 4 και 5 αντίστοιχα ΒΑ-, ΒΑ-2, ΒΑ-3, ΒΑ-4: βακτηριοφάγοι με τιμή cp ίση με, 2, 3 και 4 αντίστοιχα ΜΥ-2, ΜΥ-3, ΜΥ-4: μυκητοφάγοι με τιμή cp ίση με 2, 3 και 4 αντίστοιχα ΘΗ-3, ΘΗ-4, ΘΗ-5: θηρευτές με τιμή cp ίση με 3, 4 και 5 αντίστοιχα ΠΑ-4, ΠΑ-5: παμφάγοι με τιμή cp ίση με 4 και 5 αντίστοιχα Εν κατακλείδι, σημαντικό είναι να καταγραφεί ό, τι σε ότι αφορά τους νηματώδεις, οι ίδιοι οι συγγραφείς των εργασιών αναφέρουν ότι τα αποτελέσματα τους μπορεί να επηρεάζονται από άλλους παράγοντες περισσότερο από τις ίδιες τις υπό μελέτη γεωργικές πρακτικές. Τέτοιοι παράγοντες μπορεί να είναι το καλλιεργούμενο είδος και η διάρκεια της καλλιέργειας (Yeates et al., 999), ο τύπος του εδάφους (Yeates et al., 997), καθώς το μικροκλίμα (Stamou et al., 2005)..3 Σκοπός Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η μελέτη των μεταβολών της βιοκοινότητας των εδαφικών νηματωδών μετά: από μια βιοτική παρέμβαση και συγκεκριμένα προσθήκη οργανικού υλικού και μια αβιοτική και συγκεκριμένα αλλαγή των συνθηκών της υγρασίας του εδάφους. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5

2. Περιγραφή Περιοχής Μελέτης Η περιοχή μελέτης βρίσκεται στη Βορειοδυτική Ελλάδα και συγκεκριμένα στο Νομό Κοζάνης, στην Περιφέρεια της Δυτική Μακεδονία. Το αγροτεμάχιο (40 ο9β,2ο47ε) στο οποίο στήθηκαν οι πειραματικές επιφάνειες βρίσκεται στο Δημοτικό Διαμέρισμα των Κοίλων, από την έδρα και ομώνυμο οικισμό του οποίου απέχει περίπου km, ενώ περίπου 4km απέχει από την πόλη της Κοζάνης. Το αγροτεμάχιο στο οποίο στήθηκαν οι πειραματικές επιφάνειες βρίσκεται σε υψόμετρο 70 μέτρων πάνω από τη στάθμη της θάλασσας και περιβάλλεται από τις εγκαταστάσεις του ΤΕΙ Κοζάνης και λοιπά αγροτεμάχια, τα οποία αποτελούν καλλιεργήσιμες εκτάσεις σίτου (Εικόνα ). ΚΟΙΛΑ ΤΕΙ ΚΟΖΑΝΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΡΟΣ ΚΟΖΑΝΗ Εικόνα. Θέση της περιοχής μελέτης στην περιοχή Κοίλα Κοζάνης. Σύμφωνα με στοιχεία του μετεωρολογικού σταθμού Κοζάνης της Εθνικής Μετεωρολογικής Υπηρεσίας (ΕΜΥ) το κλίμα στην περιοχή χαρακτηρίζεται ως ήπιο 6

Μεσογειακό προς Ηπειρωτικό με υγρή περίοδο που διαρκεί από τον Οκτώβρη μέχρι τον Απρίλη και ξηρή από το Μάη μέχρι τον Σεπτέμβρη. Η μέση ετήσια θερμοκρασία ανέρχεται στους 3ο C, με τη χαμηλότερη μέση μηνιαία θερμοκρασία να παρατηρείται το μήνα Φεβρουάριο (0,4ο C ) και την υψηλότερη τον Ιούλιο (29,5ο C). Η μέση ετήσια βροχόπτωση ανέρχεται στα 497 mm, με ελάχιστο μηνιαίο ύψος βροχής το μήνα Αύγουστο με 28,8 mm και μέγιστο το Νοέμβριο με 59,9 mm (Σχήμα ). Όπως φαίνεται και στο σχήμα η υγρή περίοδος διαρκεί από τον Οκτώβριο έως τον Απρίλιο και η ξηρή από τον Μάιο έως το Σεπτέμβριο. Οι επικρατούντες άνεμοι πνέουν κυρίως σε διευθύνσεις Βόρειες (Β), μέσης έντασης 3 4 beaufort. Σχήμα. Ομβροθερμικό διάγραμμα της περιοχής μελέτης για την περίοδο 995-200 (πηγή: ΕΜΥ μετεωρολογικός σταθμός Κοζάνης). Το έδαφος στις πειραματικές επιφάνειες είναι αλκαλικό (ph = 7,87) και κατατάσσεται στην κατηγορία των αργιλωδών αργιλοπηλώδων εδαφών, ενώ στο γεωλογικό υπόστρωμα της ευρύτερης περιοχής περιλαμβάνονται οι σύγχρονες προσχώσεις κοιλάδων, πεδιάδων και ακτών του Ολοκαίνου, οι λιμναίες, χερσαίες και θαλάσσιες αποθέσεις του Πλειστόκαινου και οι αδιαίρετοι χερσαίοι και θαλάσσιοι σχηματισμοί του Τεταρτογενούς (Ε.Γ.Σ.Α, 987). 2.2 Πειραματικός Σχεδιασμός 7

Σε εγκαταλελειμμένο σιταγρό επιφάνειας 790,65 m2 εφαρμόστηκε βιοτική και αβιοτική παρέμβαση, με οργανική λίπανση και τεχνητή βροχόπτωση. Η βιοτική παρέμβαση όπως αναφέρθηκε αφορούσε την προσθήκη οργανικής λίπανσης (Ορ.Λ) και συγκεκριμένα κοπριάς βοοειδών σε αναλογία 4 κιλών ανά τετ. μέτρο και φυσικά επιφάνειες μάρτυρες (Μα) δίχως κοπριά. Σημειώνεται εδώ ότι στις επιφάνειες που προστέθηκε κοπριά ακολούθησε ένα επιφανειακό σκάλισμα (ελαφριά άρωση), που ισοδυναμεί με μια επιπλέον μηχανική παρέμβαση, για την ομογενοποίηση της κοπριάς στην επιφανειακή στιβάδα του εδάφους. Η αβιοτική καταπόνηση αφορούσε 2 επίπεδα άρδευσης (εδαφικής υγρασίας), με το υψηλό επίπεδο να αντιστοιχεί στο 50% της μέσης μηνιαίας βροχόπτωσης δηλαδή σε 20 λιτ ανά τετ. μέτρο ανά βδομάδα και το χαμηλό στο 50% δηλαδή σε 7 λιτ. ανά τετ. μέτρο. Για να εξασφαλισθεί αυτό το επίπεδο υγρασίας όλες οι δειγματοεπιφάνειες σκεπάστηκαν με αδιάβροχο πλαστικό υλικό. Ακολουθήθηκε πλήρης παραγοντικός σχεδιασμός με τους δύο χειρισμούς κάθε παρέμβασης να συνδυάζονται, με 4 επαναλήψεις για κάθε συνδυασμό χειρισμών όπως αποτυπώνεται και στο σχήμα 2, όπου: με το πράσινο χρώμα απεικονίζονται οι επιφάνειες που εμπλουτίστηκαν με οργανική λίπανση (Ορ.Λ), με το κίτρινο οι μη εμπλουτισμένες επιφάνειες ή μάρτυρες (Μα), με τα καθαρά χρώματα οι επιφάνειες με χαμηλή υγρασία ή ξηρές (50%) και με τα σκιασμένα αυτές με υψηλή υγρασία ή υγρές (50%). Έτσι κατανεμήθηκαν τυχαίως στο χώρο του αγροτεμαχίου 6 (2 επίπεδα λίπανσης x 2 επίπεδα εδαφικής υγρασίας x 4 επαναλήψεις) δειγματοληπτικές επιφάνειες 8

διαστάσεων x (σχήμα 3), η κάθε μια με το κάλυμμα της, με ελάχιστη μεταξύ τους απόσταση 3 m (εικόνες 2,3). Σχήμα 2. Σχηματική απεικόνιση του πειραματικού σχεδιασμού. Στο σχήμα καταγράφονται και οι συνδυασμοί των χειρισμών που εφαρμόσθηκαν. Εικόνα 2. Άποψη της πειραματικής περιοχής. Εικόνα 3. Δειγματοληπτική επιφάνεια. 9

Σχήμα 3. Κατανομή των δειγματοληπτικών επιφανειών και των επαναληπτικών χειρισμών που εφαρμόσθηκαν. Η εφαρμογή του οργανικού λιπάσματος έγινε στα μέσα του Ιανουάριου του 2008 και αμέσως μετά ακολούθησε άροση της επιφανειακής στιβάδας του εδάφους (0cm), μόνο για τις επιφάνειες που περιελάμβαναν χειρισμό με λίπανση, προκειμένου να ενσωματωθεί το οργανικό υλικό. Ακολούθησε η εφαρμογή τεχνητής βροχής ποτίσματος, η οποία γινόταν ανά διαστήματα των 7-0 ημερών έως τη λήξη του πειράματος. Στις επιφάνειες όπου εφαρμόσθηκε ο παράγοντας της τεχνητής βροχόπτωσης, αυτή επιτεύχθηκε χειρωνακτικά με χρήση πλαστικών δοχείων και πλαστικής εφαρμογής τεχνητής βροχής (πότισμα) ενώ όλες οι επιφάνειες προστατεύτηκαν από τα φυσικά κατακρημνίσματα με κατασκευές ξύλου και αδιάβροχης πλαστικής μεμβράνης (Εικόνα 4). 20

m m Εικόνα 4. Προστατευτική κατασκευή δειγματοληπτικής επιφάνειας. Πραγματοποιήθηκαν δύο δειγματοληπτικά γεγονότα. Το πρώτο έγινε στις 8 Μαρτίου μετά την πραγματοποίηση 7 ποτισμάτων και αφορούσε τη ψυχρή περίοδο, ενώ το δεύτερο έγινε στις 8 Ιουνίου μετά την πραγματοποίηση 2 ποτισμάτων. 2.3 Μέθοδοι Δειγματοληψίας Από κάθε δειγματοληπτική επιφάνεια συλλέχθηκαν τρία δείγματα. Το κάθε δείγμα ήταν σύνθεση τριών υποδειγμάτων πυρήνων εδάφους διαμέτρου 2cm και βάθους 20cm οι οποίοι εξήχθησαν με δειγματολήπτη τύπου Auger. Αμέσως μετά τα δείγματα συσκευάστηκαν σε συνθετικές σακούλες και τοποθετήθηκαν απευθείας σε μεταφερόμενο ψυγείο. Η διατήρηση των δειγμάτων μέχρι τη πραγματοποίησης της εξαγωγής τους έγινε σε ψυκτικό θάλαμο θερμοκρασίας 6ο C. Η φύλαξη των νηματωδών σε χαμηλές θερμοκρασίες αποσκοπούσε στη μείωση του ποσοστού θνησιμότητάς και στην παρεμπόδιση του ανεπιθύμητου πολλαπλασιασμού των. 2

Για τον προσδιορισμό της μηχανικής σύστασης και του ph συλλέχθηκε επίσης ικανός αριθμός δειγμάτων από αντιπροσωπευτικά σημεία του αγροτεμαχίου επίσης με δειγματολήπτη τύπου Auger. 2.4 Μέθοδοι Ανάλυσης 2.4. Εξαγωγή, Καταμέτρηση, Ταυτοποίηση και Μονιμοποίηση Νηματωδών Οι νηματώδεις εξήχθησαν από 200ml κάθε σύνθετου δείγματος και αφού προηγουμένως το χώμα ομογενοποιήθηκε φροντίζοντας να διασπασθούν τα διάφορα συσσωματώματα. Για την εξαγωγή χρησιμοποιήθηκε η τροποποιημένη μέθοδος κοσκινίσματος και μετάγγισης του Cobb (98), όπως τροποποιήθηκε στο τελευταίο στάδιο από τους s Jacob & van Bezooijen (984) (Σχήμα 4), σύμφωνα με την οποία χρησιμοποιείται βαμβακερό-μάλλινο φίλτρο στο τελευταίο στάδιο. Αφού έγινε η καταμέτρηση της συνολικής αφθονίας των νηματωδών, ακολούθησε μονιμοποίηση τους σε διάλυμα φορμαλδεΰδης πυκνότητας 4%. Αργότερα από κάθε μονιμοποιημένο δείγμα αναγνωρίσθηκαν, τα πρώτα τυχαία τουλάχιστον 50 άτομα σε επίπεδο γένους, χρησιμοποιώντας την κλείδα αναγνώρισης του Bongers (994) και μικροσκοπική ανάλυση σε μεγέθυνση 40Χ 00Χ. Με βάση το γένος κάθε ατόμου καθορίστηκε η τροφική ομάδα στην οποία ανήκε, σύμφωνα με τους Yeats et al., (993). Ο διαχωρισμός σε τροφικές ομάδες περιελάμβανε τις εξής 6: Βακτηριοφάγοι (Βα) Παρασιτικοί φυτοφάγοι (Πρ) Μη παρασιτικοί Φυτοφάγοι (Μπρ) Μυκητοφάγοι (Μυ) Θηρευτές (Θη) Παμφάγοι (Πα) 22

Στη συνέχεια έγινε διαχωρισμός - ταξινόμηση στη κλίμακα ευκαιριακών εποικιστών μη εποικιστών (colonizer-persister scale: c-p scale -5) σύμφωνα με τους Bongers (990), όπου ως: cp κατατάσσονται νηματώδεις εποικιστές με γρήγορους ρυθμούς αναπαραγωγής (r στρατηγική), οι οποίοι αυξάνονται μετά από εμπλουτισμό ή διαταραχή και στο άλλο άκρο, cp 5 αυτοί που προτιμούν σταθερά περιβάλλοντα, έχουν μεγάλα μεγέθη, αργούς κύκλους, χαρακτηρίζουν τα ώριμα στάδια διαδοχής μιας βιοκοινότητας (K στραγηγική), και τελικά τοποθετήθηκαν σε λειτουργικές ομάδες σύμφωνα με τους Bongers & Bongers (998) και Ferris et al., (200). 23

Σχήμα 4. Μέθοδος εξαγωγής νηματωδών εδάφους κατά s Jacob & van Bezooijen (984). 2.4.2 Προσδιορισμός Μηχανικής Σύστασης του Εδάφους (Bouyoucos 95) Στη μέθοδο αυτή, χρησιμοποιούνται ειδικώς βαθμολογημένα πυκνόμετρα, τα οποία δίνουν απ' ευθείας την εκατοστιαία αναλογία των σε αιώρηση ευρισκομένων τεμαχιδίων του αιωρήματος. Η ειδική αυτή βαθμολόγηση του πυκνόμετρου γίνεται 24

συνήθως για μέσης μηχανικής σύστασης εδάφη και κατά συνέπεια η χρησιμοποίηση τους για τα βαριά αργιλώδη εδάφη και τα ελαφρά αμμώδη μπορεί να περικλείει σφάλματα. Χρησιμοποιούνται 50 gr εδάφους σε ποτήρι ζέσεως. Γίνεται μηχανικός διαμερισμός της αργίλου σε ειδικούς μηχανικούς αναδευτήρες (mixer). Ακολούθως μεταφέρουμε το έδαφος με τη βοήθεια υδροβολέα σε ειδικούς γυάλινους κυλίνδρους Bouyoucos και προστίθεται νερό μέχρι τη χαμηλότερη χαραγή του κυλίνδρου. Κατά την προσθήκη του νερού θα πρέπει το πυκνόμετρο να βρίσκεται μέσα στο αιώρημα. Εάν κατά τη διάρκεια της ανάδευσης και της μεταφοράς του αιωρήματος σχηματίζεται αφρός, τότε προστίθενται μερικές σταγόνες βουτανόλης ή καπρυλικής ή αμυλικής αλκοόλης ή γλυκόζης. Αναδεύεται το δείγμα με τη βοήθεια αναδευτήρα για 5-6 φορές. Μετά την εξαγωγή του αναδευτήρα από το αιώρημα, μπαίνει σε λειτουργία το χρονόμετρο. Προσεκτικά και μετά από πάροδο 40 δευτερολέπτων, γίνεται ανάγνωση του πυκνομέτρου, ενώ παράλληλα μετράται η θερμοκρασία του αιωρήματος. Οι ίδιες μετρήσεις γίνονται και μετά από την πάροδο δύο ωρών. Εάν Α είναι η διορθωμένη πρώτη ανάγνωση του πυκνόμετρου με βάση τις τιμές θερμοκρασίας, Β η ανάγνωση μετά από 2 ώρες και Γ είναι το βάρος του δείγματος του εδάφους τότε: άργιλος % = Β / Γ * 00 ιλύς % = (Α - Β) / Γ * 00 άμμος % = ( Α / Γ) * 00 2.4.3 Προσδιορισμός ph (Bates 964) Σε ποτήρι ζέσεως των 50 ml τοποθετούνται 0 gr κοσκινισμένου και ξηραμένου δείγματος εδάφους και προστίθενται 20 ml αποσταγμένο νερό σε αναλογία :. Περιοδικώς και για διάστημα 30 λεπτών το αιώρημα αναδεύεται με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου. Μετά την παρέλευση του διαστήματος των 30 λεπτών αφήνεται το 25

αιώρημα σε ηρεμία για άλλα 30 λεπτά για μερική καθίζηση. Έπειτα εισέρχονται προσεκτικά στο αιώρημα τα ηλεκτρόδια υάλου-καλομέλανος και μετράται το ph με τη βοήθεια πεχαμέτρου, το οποίο έχει προηγουμένως ρυθμιστεί με τη βοήθεια διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης. 2.5 Ανάλυση και Στατιστική Επεξεργασία Για τον έλεγχο τυχόν σημαντικών διαφορών στο υδατικό περιεχόμενο, στις αφθονίες των διαφορετικών τροφικών και λειτουργικών ομάδων νηματωδών και στις τιμές των δεικτών βιοκοινότητας νηματωδών ανάμεσα στα επίπεδα της βιοτικής και αβιοτικής καταπόνησης στο χρόνο δειγματοληψίας, χρησιμοποιήθηκε η πολυπαραγοντική ανάλυση διακύμανσης τριών παραγόντων (Three-Way ANOVA) και δύο παραγόντων (Two-Way ANOVA) κάτω από το γενικευμένο γραμμικό μοντέλο (GLM module). Ένας παράγοντας αφορούσε το επίπεδο λίπανσης (Οργανική Λίπανση, Μάρτυρας) και ένας παράγοντας το επίπεδο τεχνητής βροχόπτωσης (50% και 50% της ψυχρής περιόδου) στην περίπτωση ελέγχου της επίδρασης των δύο παραγόντων εντός ενός δειγματοληπτικού γεγονότος και το χρόνο δειγματοληψίας (η και 2η δειγματοληψία) ως τρίτο παράγοντα στην περίπτωση ελέγχου της επίδρασης και των τριών παραγόντων ανάμεσα στα δύο γεγονότα δειγματοληψίας. Πριν από τις αναλύσεις διακύμανσης έγινε στα δεδομένα ο απαιτούμενος έλεγχος ως προς την κανονικότητα της κατανομής τους, ως προς την ομοιογένεια διακύμανσης (έλεγχος Levene) και ως προς την ανεξαρτησία ανάμεσα στη διακύμανση και το μέσο όρο. Όπου δεν πληρούντο τα παραπάνω κριτήρια εφαρμόσθηκαν οι κατάλληλοι μετασχηματισμοί, προκειμένου να επιτευχθούν. Για την ανάλυση συχνοτήτων των τροφικών ομάδων στους διάφορους χειρισμούς, χρησιμοποιήθηκε η λογαριθμο-γραμμική μέθοδος (log-linear analysis of categorical data). Η μέθοδος αυτή εφαρμόζει λογαριθμο-γραμμικά μοντέλα σε κάθε συνδυασμό 26

κατηγορικών μεταβλητών (στην παρούσα περίπτωση μιας τροφικής ομάδας και ενός χειρισμού) με σκοπό την εύρεση πιθανών συναφειών ανάμεσά τους. Για την ταξιθέτηση των δειγμάτων των δύο δειγματοληπτικών περιόδων χρησιμοποιήθηκε η Διαφοροποιός Ανάλυση (Discriminant Analysis) και για την ομαδοποίηση των μέσων όρων των δειγμάτων όμοιων χειρισμών η Ομαδοποιός Ανάλυση (Cluster Analysis). Τα διαγράμματα σειράς αφθονίας (rank abundance) κατασκευάστηκαν με βάση τις αφθονίες των γενών για κάθε χειρισμό. Για την εκτίμηση της ποικιλότητας των βιοκοινοτήτων των νηματωδών στους διάφορους συνδυασμούς χειρισμών χρησιμοποιήθηκε ο παραμετρικός δείκτης του Renyi (96). Ο παραμετρικός αυτός δείκτης παράγει για κάθε βιοκοινότητα μια καμπύλη και υπολογίζεται από τον τύπο: S logσpiα i= Ηα = -α Ο δείκτης δείχνει διαφορετική ευαισθησία από τα σπάνια προς τα πιο άφθονα γένη καθώς οι τιμές της παραμέτρου α αυξάνουν (Ricotta, 2000). Για κάθε βιοκοινότητα δίνει μια καμπύλη τιμών ποικιλότητας στις οποίες συμπεριλαμβάνονται οι περισσότεροι κοινοί δείκτες. Για α=0 ο δείκτης είναι ίσος με τον λογάριθμο του αριθμού των γενών, για α= είναι ίσος με τον δείκτη του Shannon, για α=2 είναι ίσος με τον δείκτη του Simpson. Όταν οι τιμές της παραμέτρου α τείνουν στο άπειρο ο δείκτης είναι περισσότερο ευαίσθητος στα κυρίαρχα γένη της βιοκοινότητας. Έτσι όταν δυο καμπύλες διαφέρουν στις χαμηλές τιμές τις παραμέτρου α αυτό οφείλεται στον αριθμό των γενών, ενώ όταν διαφέρουν στις μεγαλύτερες τιμές της παραμέτρου α οφείλεται στην παρουσία των περισσότερο άφθονων γενών. Για τους υπολογισμούς χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό DivOrd (Tothmeresz, 995). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 27

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3. Χειρισμός Άρδευσης Για να εξεταστεί εάν η αβιοτική παρέμβαση στο πειραματικό πεδίο με τα δύο επίπεδα άρδευσης (50 και 50 λίτρα) προκάλεσε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα της εδαφικής υγρασίας, εφαρμόστηκε ανάλυση διακύμανσης κατά δύο παράγοντες. Η ανάλυση αυτή διεξήχθη για κάθε δειγματοληψία ξεχωριστά με παράγοντες το επίπεδο υγρασίας και το επίπεδο λίπανσης. Από τον πίνακα 2 και τα σχήματα 5. και 5.2 εξάγουμε ότι μόνο στην δειγματοληψία του Ιουνίου το αποτέλεσμα της αβιοτικής παρέμβασης έδωσε στατιστικά σημαντική διαφορά στο υδατικό περιεχόμενο ανάμεσα στις υγρές (50 λίτρα) και ξηρές επιφάνειες (50 λίτρα). Πίνακας 2. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά δύο παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης)) για τις τιμές του υδατικού περιεχομένου του εδάφους σε κάθε δειγματοληπτική περίοδο (: Μη Σημαντικό, *:P<0,05, **:P<0,00, MS: μέσο άθροισμα τετραγώνων). Επίπεδο Υγρασίας MS F P 5,629 2,568,577 7,339 * Μάρτιος Ιούνιος 6,4,8 6,2,6 6,0,4,2,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4 3,0 9,8 9,6 9,4,0 9,2,8 9,0 28 X Ε Y π ί π ε δ ο Αλληλεπίδραση MS F P,75 0,799 2,27 3,40 Ι ο ύ ν ι ο ς ( F = 7, 3, p 3 < 9 05 ), 0 ς Υδατικό Περιεχόμενο (%) Υδατικό Περιεχόμενο (%) Μ ά ρ τ ι ο ( F 2 =, 5 6, p > 80, 5 )0 Επίπεδο Λίπανσης MS F P 0,68 0,077 0,2 0,299 X Υ γ ρ α σ ί α ς Ε Y π ί π ε δ ο Υ γ ρ α σ ί α ς

Σχήματα 5.-5.2. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά δύο παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης)) και διαγράμματα μέσων όρων με τυπικό σφάλμα, για τις τιμές του υδατικού περιεχομένου του εδάφους σε κάθε δειγματοληπτική περίοδο, όπου Χ: χειρισμοί με χαμηλό επίπεδο άρδευσης και Υ: χειρισμοί με υψηλό. 3.2 Τροφικές Ομάδες 3.2. Αφθονίες Τροφικών Ομάδων Η αφθονίες των τροφικών ομάδων για κάθε χειρισμό και για τις δύο δειγματοληψίες παρουσιάζονται στο σχήμα 6, ενώ η ποσοστιαία αναλογία των τροφικών ομάδων στη σύσταση της βιοκοινότητας για κάθε χειρισμό παρουσιάζονται στο σχήμα 7. για την δειγματοληψία του Μαρτίου 2008 και στο 7.2 για τον Ιούνιο 2008. Στην δειγματοληψία του Μαρτίου οι παρασιτικοί φυτοφάγοι είναι η πιο άφθονη τροφική ομάδα στους χειρισμούς με οργανική λίπανση, με τους βακτηριοφάγους να ακολουθούν, ενώ το αντίστροφο πρότυπο παρατηρήθηκε στις μη εμπλουτισμένες επιφάνειες. Οι μυκητοφάγοι είναι η τρίτη σε αφθονία ομάδα σε όλους τους χειρισμούς εκτός των χειρισμών με υψηλό επίπεδο υγρασίας μάρτυρα (50%-Μα), όπου τους ξεπερνούν οι μη παρασιτικοί φυτοφάγοι, οι οποίοι ακολουθούν τους μυκητοφάγους σε αφθονίες στους υπόλοιπους χειρισμούς. Οι θηρευτές συμμετέχουν στη βιοκοινότητα με περίπου ένα 2% σε όλους τους χειρισμούς εκτός των υγρών μη εμπλουτισμένων με οργανική λίπανση επιφανειών (50%-Μα), όπου διπλασίασαν τη συμμετοχή τους (4%). Ελάχιστη συμμετοχή παρατηρήθηκε για τους παμφάγους νηματώδης, με το μεγαλύτερο επίπεδο αφθονίας να παρουσιάζεται για τις ξηρές εμπλουτισμένες 29

επιφάνειες (50%-Ολ), όπου η συμμετοχή τους στη βιοκοινότητα έφθασε το %, η οποία ήταν και η μεγαλύτερη τιμή που παρατηρήθηκε για όλους τους χειρισμούς στο σύνολο των δειγματοληψιών. Στη δειγματοληψία του Ιουνίου παρατηρούμε ότι όλες οι τροφικές ομάδες αύξησαν τις αφθονίες τους σε σχέση με την πρώτη δειγματοληψία, εκτός των παμφάγων οι οποίοι διατηρηθήκαν στα ίδια χαμηλά επίπεδα. Οι παρασιτικοί φυτοφάγοι, με τους βακτηριοφάγους παρέμειναν η πιο άφθονες τροφικές ομάδες, με τους πρώτους να είναι πιο άφθονοι στις ξηρές μη εμπλουτισμένες επιφάνειες (50%- Μα) και στις υγρές εμπλουτισμένες (50%- Ολ) με τους δεύτερους να ακολουθούν. Ενώ οι βακτηριοφάγοι ήταν η πιο άφθονη τροφική ομάδα στις ξηρές εμπλουτισμένες (50%-Ολ) και στις υγρές μη εμπλουτισμένες επιφάνειες (50%-Μα) επιφάνειες, με τους παρασιτικούς να ακολουθούν. Οι μυκητοφάγοι και οι μη παρασιτικοί φυτοφάγοι ακολούθησαν σε αφθονία σε όλους τους χειρισμούς, ενώ οι θηρευτές αύξησαν τις αφθονίες τους και τη συμμετοχή τους στη βιοκοινότητα κυρίως στις μη εμπλουτισμένες επιφάνειες. Μάρτιος Ιούνιος Σχήμα 6. Αφθονία τροφικών ομάδων ανά χειρισμό και δειγματοληψία. 30

Σχήμα 7.. Ποσοστιαία αναλογία τροφικών ομάδων Σχήμα 7.2. Ποσοστιαία αναλογία τροφικών ομάδων ανά ανά χειρισμό το Μάρτιο του 2008. χειρισμό τον Ιούνιο του 2008. 3.2.2 Ανάλυση Διακύμανσης Κατά Τρεις Παράγοντες Τα αποτελέσματα της Ανάλυσης Διακύμανσης κατά τρεις παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης) x εποχή δειγματοληψίας) και της μη παραμετρικής ανάλυσης διακύμανσης Kruskal Wallis παρουσιάζονται στον πίνακα 3 και στα σχήματα 8. 8.8, με τα διαγράμματα μέσου όρου τυπικού σφάλματος, για την ολική αφθονία και τις τροφικές ομάδες. Κατά τον πίνακα 3 οι μόνες αφθονίες που εμφάνισαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ήταν η συνολική αφθονία (f=24,39, p<0,00), η οποία αυξήθηκε από την πρώτη στη δεύτερη δειγματοληψία, η αφθονία των βακτηριοφάγων (f=3,25, p<0,05) και η αφθονία των μυκητοφάγων (f=30,27, p<0,00), οι οποίες επίσης επηρεάστηκαν από την εποχή δειγματοληψίας καθώς παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές αυξήσεις από το Μάρτιο στον Ιούνιο του 2008. Όπως παρατηρούμε από τα σχήματα 8.4, 8.7, 8.6, το εποχικό πρότυπο αυτό επηρέασε και τις υπόλοιπες τροφικές ομάδες αυξάνοντας τις αφθονίες τους στη δειγματοληψία του Ιουνίου, αλλά όχι σημαντικά σύμφωνα με την ανάλυση διακύμανσης. Άξιο λόγου είναι επίσης το γεγονός ότι ούτε η ολική αφθονία, ούτε αυτές των τροφικών ομάδων διαφοροποιήθηκαν σημαντικά από τον παράγοντα της λίπανσης και από αυτόν της υγρασίας. 3

Πίνακας 3. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά τρεις παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης) x μήνα δειγματοληψίας) για τις τιμές ολικής αφθονίας και αφθονίας τροφικών ομάδων (: Μη Σημαντικό, *:P<0,05, **:P<0,00, MS: μέσο άθροισμα τετραγώνων). Ολική Αφθονία Φυτοπαρασιτικοί Βακτηριοφάγοι Μυκητοφάγοι Φυτοφάγοι μη παρασιτικοί Θηρευτές Επίπεδο Λίπανσης MS F P 5826 0,42 0,90 3,7 0,08 0,43 0,26 2,05 Επίπεδο Υγρασίας MS F P 925 0,4 0,49 0,4 0,07 0,36 0,02 0,9 Εποχή Δειγματοληψίας MS F P 339609 24,39 ** 6,53,89 2,46 3,26 * 3,79 30,27 ** 0,7 0,40 0,56,33,77 4,8 7,88 3,4 6,38 2,54 2,7 0,86 Στον πίνακα 4 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της ανάλυσης διακύμανσης τριών παραγόντων για τη συνδυασμένη αλληλεπίδραση των παραγόντων στην ολική αφθονία και τις αφθονίες των τροφικών ομάδων. Σύμφωνα με αυτόν την αφθονία των μυκητοφάγων διαφοροποίησε σημαντικά η αλληλεπίδραση και των τριών παραγόντων (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης) x μήνα δειγματοληψίας). Καμία, τέλος από τις υπόλοιπες τροφικές ομάδες, αλλά ούτε και η ολική αφθονία δε διαφοροποιήθηκαν στατιστικά σημαντικά από τη συνδυασμένη αλληλεπίδραση των τριών παραγόντων. Πίνακας 4. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά τρεις παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης) x μήνα δειγματοληψίας) για τις τιμές ολικής αφθονίας και αφθονίας τροφικών ομάδων (: Μη Σημαντικό, *:P<0,05, **:P<0,00, MS: μέσο άθροισμα τετραγώνων). Ολική Αφθονία Φυτοπαρασιτικοί Βακτηριοφάγοι Λίπανση x Δειγμ. MS F P 5826 0,42 0,90 3,7 Υγρασία x Δειγμ. MS F P 925 0,4 0,49 0,4 0,08 0,07 0,43 0,36 32 Λίπανση x Υγρασία MS F P 339609 24,39 ** 6,53,89 2,46 3,26 * Δειγμ x Υγρ. x Λιπ. MS F P 7 0,005 3,3 0,96 0,00 0,02 4

Μυκητοφάγοι Φυτοφάγοι μη παρασιτικοί Θηρευτές 0,26 2,05 0,02 0,9 3,79 30,27 ** 0,74 5,94 * 0,7 0,40 0,56,33,77 4,8 0,08 0,88 7,88 3,4 6,38 2,54 2,7 0,86 0,95 0,38 33

ΕΠΟΧΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ Ο ( F ΕΠΙΠΕΔΟ ΛΙΠΑΝΣΗΣ λ ι κ ή Α φ θ ο ν ί α = 2 4 p, <3 08 ), 9 0 0, ΕΠΙΠΕΔΟ ΥΓΡΑΣΙΑΣ Ο λ ι κ ή Α φ θ ( F 0 =4,, 8 >p 0 ), 0 5 ο ν ί α Ο λ ι κ ή Α φ θ ( F 0 =, 3, 8 >p 0 ), 0 5 5 2 0 6 0 0 ο ν ί α 5 2 0 5 8 0 5 6 0 5 0 0 5 0 0 5 2 0 5 0 0 4 8 0 4 6 0 4 4 0 4 2 0 4 0 0 3 8 0 αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml 5 4 0 4 8 0 4 6 0 4 4 0 4 2 0 3 6 0 4 6 0 4 4 0 4 2 0 4 0 0 3 4 0 4 8 0 3 2 0 3 0 0 3 8 0 M a r c h Π n Ο α ρ α σ ι τ ι κ,, >p8 09 ), 5 0 5 = ο. λ. Μ α X Π α ρ α σ ιτ ικ ο ί ( F = 3, 6 5, p > 0,0 5 ) ί 2 0 0 2 2 0 200 9 0 8 0 6 0 4 0 αρ. ατόμων / 00 ml 220 2 0 0 80 60 40 20 a r c h J u n Ο.λ. e Μ η Π α ρ α σ ( F 4 =,, 8 >p 0 ), 0 5 ι τ ι κ ο ί Μ η Π α ρ α σ ( F 0 =, 4, 0 >p 3 0 ), 0 5 8 0 7 5 αρ. ατόμων / 00 ml 7 0 6 5 6 0 5 5 5 0 4 5 r c h J u n e 5 0 X ι τ ι κ ο ί 7 0 6 8 6 8 6 6 6 6 6 4 6 2 6 0 5 8 5 6 5 4 5 2 Y Μ η Π α ρ α σ ( F =, 3, 3>p 0 ), 0 5 7 0 6 4 6 2 6 0 5 8 5 6 5 4 5 2 5 0 4 8 4 6 34 4 4 a 6 0 7 2 4 6 M 7 0 7 2 4 8 3 5 8 0 7 4 5 0 4 0 ί 3 0 Μ α αρ. ατόμων / 00 ml M ο 4 0 00 0 0 Y Π α ρ α σ ι τ ι κ ( F 0 =,, 4 >p 3 0 ), 0 5 2 4 0 2 0 αρ. ατόμων / 00 ml 4 0 0 e αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00 ml ( F J u Ο. λ. 4 4 4 2 Μ α X Y ι τ ι κ ο ί

ΕΠΟΧΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ Μ υ κ η τ ο ( F 3 = 0,, p2 < 6 0, ) 0 φ 0 ά ΕΠΙΠΕΔΟ ΛΙΠΑΝΣΗΣ γ ο ι Μ υ κ η τ ο ( F 2 =, 0, >p5 0 ), 0 ΕΠΙΠΕΔΟ ΥΓΡΑΣΙΑΣ φ 5 ά γ ο Μ υ κ η τ ο φ ά ( F 0 =,, 9 >p 0 ), 0 5 ι γ ο ι 0 0 3 0 0 5 2 0 0 0 9 6 0 9 5 9 4 9 2 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 9 0 8 5 8 0 7 5 7 0 5 0 6 5 4 0 6 0 M a r c h Β α κ τ ( F = 3,, p 2< J u n η ρ ι ο 50 ), 0 5 e φ αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml 9 8 γ ο ι 8 2 8 0 7 8 7 6 7 2 7 0. λ. Μ X α Β α κ τ η ρ ι ο φ ( F 0 =, 4, 2 >p 9 0 ), 0 5 2 0 0 8 6 8 4 7 4 Ο ά 9 0 8 8 ά γ ο ι Y Β α κ τ η ρ ι ο φ ( F 0 =, 3, 5 >p 7 0 ), 0 5 6 0 6 0 5 5 5 5 5 0 5 0 6 0 4 0 2 0 αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml 8 0 4 5 4 0 3 5 3 0 2 5 4 5 4 0 3 5 3 0 2 5 0 0 2 0 8 0 M a r c h J u n e Ο Θ η ρ ε υ τ έ ς ( F 0 =, 8, 6 >p 4 0 ), 0 5. λ. 5 Μ X α Θ η ρ ε υ τ έ ς ( F 3 =,, >p4 0 ), 0 5 2 0 8 8 8 4 2 0 8 αρ. ατόμων / 00 ml 2 0 6 6 4 2 0 Σχήματα 3. 8 M a r c h J u n e 6 4 2 0 8 35 6 6 Y Θ η ρ ε υ τ έ ς ( F 2 =, 5, >p4 0 ), 0 5 2 0 αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml 2 0 5 6 Ο. λ. Μ α X Y ά γ ο ι

Σχήματα 8.-8.8. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά τρεις παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης) x μήνα δειγματοληψίας) και διαγράμματα μέσων όρων με τυπικό σφάλμα, για τις τιμές ολικής αφθονίας και αφθονίας τροφικών ομάδων. Όπου Ο.λ : επιφάνειες εμπλουτισμένες με Οργανική Λίπανση, Μα: επιφάνειες μη εμπλουτισμένες με Οργανική Λίπανση, Χ: επιφάνειες με χαμηλό επίπεδο άρδευσης (ξηρές), Υ: επιφάνειες με υψηλό επίπεδο άρδευσης (υγρές). 3.2.3 Ανάλυση Διακύμανσης Κατά Δύο Παράγοντες - Μάρτιος Η Ανάλυση Διακύμανσης έγινε και κατά δύο παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης)), για τον έλεγχο τυχόν σημαντικών διαφορών τόσο στις αφθονίες των τροφικών ομάδων, όσο και στην ολική αφθονία, για κάθε δειγματοληψία ξεχωριστά. Τα αποτελέσματα της για τη δειγματοληψία του Μαρτίου, παρουσιάζονται στον πίνακα 5 και στα σχήματα 9. 9.2. Στατιστικά σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε μόνο στην αφθονία των φυτοπαρασιτικών νηματωδών (f=7,33, p<0,05) ανάμεσα στους χειρισμούς που διέφεραν στο επίπεδο λίπανσης. Έτσι λοιπόν η αφθονίες των φυτοπαρασιτικών φυτοφάγων ήταν σημαντικά μεγαλύτερες στους χειρισμούς όπου εφαρμόσθηκε οργανική λίπανση σε σχέση με αυτούς του μάρτυρα. Καμιά σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε για τις υπόλοιπες τροφικές ομάδες και την ολική αφθονία τόσο ανάμεσα στα επίπεδα λίπανσης, όσο και στα επίπεδα υγρασίας, αλλά και στην αλληλεπίδραση των δύο παραγόντων. Πίνακας 5. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά δύο παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης)) για τις τιμές ολικής αφθονίας και αφθονίας τροφικών ομάδων της δειγματοληπτικής περιόδου του Μαρτίου 2008 (: Μη Σημαντικό, *:P<0,05, **:P<0,00, MS: μέσο άθροισμα τετραγώνων). Ολική Αφθονίαα Φυτοπαρασιτικοί Βακτηριοφάγοι Μυκητοφάγοι Φυτοφάγοι μη παρασιτικοί Θηρευτές α Επίπεδο Λίπανσης MS F P 2,62 56,09 7,33 * 0,08 0,30 0,9 2,23 Επίπεδο Υγρασίας MS F P 0,00 0,2 0,02 0,4 0,50 0,7 2,02 Αλληλεπίδραση MS F P 0,02 0,003 0,05 0,8 0,25 3,00 0,00 0,002,50 3,04 0,00 0,00 0,008 0,07 0,45 0,3 0,34 0,73 αφορά μη παραμετρική ανάλυση διακύμανσης με τη μέθοδο Kruskal Wallis. 36

ΕΠΙΠΕΔΟ ΛΙΠΑΝΣΗΣ Ο λ ικ ή Α φ ( H =, 2 6, p >8 0, 5 0) ΕΠΙΠΕΔΟ ΥΓΡΑΣΙΑΣ θ ο ν ί α Ο λ ι κ ή Α φ ( H = 0, 0, p0 > 0, 5 0) 4 2 0 4 2 0 4 0 0 4 0 0 αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml θ ο ν ί α 3 8 0 3 6 0 3 4 0 3 2 0 3 8 0 3 6 0 3 4 0 3 2 0 3 0 0 2 8 0 3 0 0 Ο. λ. Μ X α Π α ρ α σ ιτ ικ ( F 7 =, 3 3, p< 02, 0) 5 ο ί Y Π α ρ α σ ιτ ικ ο ί ( F = 0,0 5 7, p > 0,0 5 ) 2 0 0 70 60 αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00 ml 8 0 6 0 4 0 2 0 0 0 40 30 20 0 8 0 00 6 0 Ο. λ. Μ X α Β α κ τ η ρ ιο φ ά ( F = 0, p2 >9 06 ), 0, 5 γ ο ι Y Β α κ τ η ρ ιο φ ά ( F = 0, p4 >9 06 ), 0, 5 3 0 3 0 2 0 2 0 αρ. ατόμων / 00 ml αρ. ατόμων / 00 ml 50 0 0 0 9 0 8 0 0 0 0 9 0 8 0 7 0 7 0 Ο. λ. Μ X α 37 Y γ ο ι

ΕΠΙΠΕΔΟ ΛΙΠΑΝΣΗΣ ΕΠΙΠΕΔΟ ΥΓΡΑΣΙΑΣ Μ υ κητο φ ά γοι (F = 2,2 2 7, p > 0,0 5 ) Μ υ κητο φ ά γοι (F = 2,0 6, p > 0,0 5 ) 68 66 66 64 64 62 αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00ml 62 60 58 56 54 52 50 48 60 58 56 54 52 50 48 46 46 44 44 42 42 Ο.λ. Μ α X Y Μ η Π α ρ α σ ιτ ικ ο ί Φ υ τ ο φ ά γ ο ι (F = 3,0 3 5 8, p> 0,0 5 ) Μ η Π α ρ α σ ιτ ικ ο ί Φ υ τ ο φ ά γ ο ι (F = 0,0 0 2 3, p> 0,0 5) 70 80 65 αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00ml 70 60 55 50 45 40 60 50 40 30 35 30 20 Ο.λ. Μ α X Θ η ρ ευ τές ( F = 0,0 7 4, p > 0,0 5) Θ η ρευ τές ( F = 0,3 0 4, p > 0,0 5) 4 5 3 4 3 αρ. ατόμων / 00ml 2 αρ. ατόμων / 00ml Y 0 9 8 7 2 0 9 8 7 6 6 5 5 Ο.λ. Μ α X Y Σχήματα 9.-9.2. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά τρεις παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης) x εποχή δειγματοληψίας) και διαγράμματα μέσων όρων με τυπικό σφάλμα, για τις τιμές ολικής αφθονίας και αφθονίας τροφικών ομάδων (όπου F: ανάλυση διακύμανσης, H: μη παραμετρική ανάλυσης διακύμανσης Kruskal Wallis). 38

3.2.4 Ανάλυση Διακύμανσης Κατά Δύο Παράγοντες - Ιούνιος Τα αποτελέσματα της Ανάλυσης Διακύμανσης κατά δύο παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης)), για τον έλεγχο διαφορών στις αφθονίες τροφικών ομάδων στη δειγματοληψία του Ιουνίου, παρουσιάζονται στον πίνακα 6. Καμία από τις τροφικές ομάδες που μελετήθηκαν δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές στην αφθονία ανάμεσα στο επίπεδο υγρασίας, ενώ στο επίπεδο λίπανσης η μόνη τροφική Ο λ ικ ή Α φ θ ο ν ία Ο λ ικ ή Α φ θ ο ν ία ομάδα που στατιστικά σημαντική διαφορά είναι( F =οι0, 0 θηρευτές νηματώδεις ( F = 0, 0 παρουσίασε, p > 0,05 ) 7, p > 0,05 ) 580 600 μεγαλύτερες αφθονίες στους χειρισμούς που περιελάμβαναν οργανική λίπανση σε σχέση 580 με τους χειρισμούς του μάρτυρα. 560 540 520 500 Ολική Αφθονία Π α ρ α σ ιτ ικ ο ί Φυτοπαρασιτικοί (F = 0,2 5, p > 0,0 5 ) Βακτηριοφάγοι Μυκητοφάγοι Φυτοφάγοι μη παρασιτικοί Θηρευτέςα 220 200 α 80 560 540 Πίνακας 6. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά δύο παράγοντες (επίπεδο 520 λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης)) για 5 τις τιμές ολικής αφθονίας και αφθονίας 00 τροφικών ομάδων της δειγματοληπτικής περιόδου του Ιουνίου του 2008 (: Μη 480 Ο.λ. Μ α X Y Σημαντικό, *:P<0,05, **:P<0,00, MS: μέσο άθροισμα τετραγώνων). 240 αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00ml 600 620 (h=5.66, p<0,05), οι οποίοι σύμφωνα και με τα σχήματα 6 και 7.2 παρουσίασαν Επίπεδο Λίπανσης MS F P 0,0003 0,0 0,5 0,25 0,0 0,3 0,08 0,49 0,38 -,08 5,66 Επίπεδο Υγρασίας Αλληλεπίδραση MS F P MS F P 0,004 0,07 0,00 0,03 ικ ο ί 0,20 0,35 Π α ρ α σ ι τ 0,70,9 (F = 0,3 5, p > 0,0 5 ) 0,00 0,0004 0,02 0,20 260 0,04 0,22 0,5 3,0 240 * 0,03 αρ. ατόμων / 00ml 620 220-0,7 0,49 2,04 - - - αφορά μη παραμετρική ανάλυση διακύμανσης με τη μέθοδο Kruskal Wallis. 60 40 200 80 60 40 20 20 Ο.λ. Μ α X Β α κ τ η ρ ιο φ ά γ ο ι ( F = 0,0 3, p > 0,0 5 ) Y Β α κ τ η ρ ιο φ ά γ ο ι (F = 0,0 0 0 4, p > 0,0 5 ) 200 200 90 90 αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00ml 0,08 80 70 39 60 50 80 70 60 50 40 40 Ο.λ. Μ α X Y

ΕΠΙΠΕΔΟ ΛΙΠΑΝΣΗΣ ΕΠΙΠΕΔΟ ΥΓΡΑΣΙΑΣ Μ υ κ η το φ ά γ ο ι (F = 0,4 9, p > 0,0 5 ) Μ υ κη τοφ ά γοι (F = 0,2 2, p > 0,0 5 ) 35 50 30 40 αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00ml 25 30 20 0 00 20 5 0 05 00 95 90 90 80 85 Ο.λ. X Μ α Μ η Π α ρ α σ ιτ ικ ο ί Φ υ τ ο φ ά γ ο ι (F =,0 8, p> 0,0 5) Y Μ η Π α ρ α σ ιτ ικ ο ί Φ υ τ ο φ ά γ ο ι (F = 0,0 8, p> 0,0 5) 00 95 90 90 αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00ml 85 80 70 60 80 75 70 65 60 50 55 40 50 Ο.λ. Μ α X Θ η ρ ευτές ( H = 5,6 6 6 9, p < 0,0 5 ) Y Θ η ρ ευ τές (H = 2,0 4 0, p > 0,0 5) 28 24 26 22 20 22 αρ. ατόμων / 00ml αρ. ατόμων / 00ml 24 20 8 6 4 40 2 0 8 6 4 2 0 8 8 6 4 6 Ο.λ. Μ α X Y

ΕΠΙΠΕΔΟ ΛΙΠΑΝΣΗΣ ΕΠΙΠΕΔΟ ΥΓΡΑΣΙΑΣ Σχήματα 0.-0.2. Αποτελέσματα ανάλυσης διακύμανσης κατά τρεις παράγοντες (επίπεδο λίπανσης x επίπεδο υγρασίας (άρδευσης) x εποχή δειγματοληψίας) και διαγράμματα μέσων όρων 4

με τυπικό σφάλμα, για τις τιμές ολικής αφθονίας και αφθονίας τροφικών ομάδων (όπου F: ανάλυση διακύμανσης, H: μη παραμετρική ανάλυσης διακύμανσης Kruskal Wallis). 3.2.5 Λογαριθμο- γραμμικό Μοντέλο Για την ανάλυση των συχνοτήτων των τροφικών ομάδων (βακτηριοφάγοι, μυκητοφάγοι, φυτοπαρασιτικοί, μη φυτοπαρασιτικοί, θηρευτές και παμφάγοι) στους τέσσερις χειρισμούς που εφαρμόστηκαν χρησιμοποιήθηκε η λογαριθμο-γραμμική ανάλυση (log linear analysis of categorical data). Όταν το διάστημα εμπιστοσύνης περιέχει την τιμή 0, ο πληθυσμός των νηματωδών στο συγκεκριμένο τύπο χειρισμού δε διαφέρει από το συνολικό μέσο όρο. Οι θετικές τιμές συντελεστών υποδηλώνουν την «προτίμηση» μιας τροφικής ομάδας για έναν τύπο χειρισμού, ενώ το αντίστροφο συμβαίνει στις αρνητικές τιμές (Τσιαφούλη 2007). Σημειώνεται ότι καθώς η συμμετοχή των παμφάγων νηματωδών στη βιοκοινότητα ήταν πολύ μικρή, για τις ανάγκες τις ανάλυσης αυτής προστέθηκαν στην τροφική ομάδα των θηρευτών οι οποίοι επίσης είχαν μικρή συμμετοχή, αλλά σημαντικότερη αυτής των παμφάγων. Από τα αποτελέσματα του λογαριθμο-γραμμικού μοντέλου για τη δειγματοληψία του Μαρτίου (σχήμα 7) φάνηκε ότι οι παρασιτικοί φυτοφάγοι νηματώδεις παρουσίασαν σημαντικά μεγαλύτερη από το μέσο όρο συχνότητα εμφάνισης στις εμπλουτισμένες με οργανική λίπανση επιφάνειες (50%-OL, 50%-ΟL), ενώ οι μυκητοφάγοι είχαν σημαντικά μεγαλύτερη από το μέσο όρο συχνότητα εμφάνισης στις μη εμπλουτισμένες επιφάνειες (Μa), επιδεικνύοντας το αντίστροφο πρότυπο, αλλά μόνο για τις ξηρές επιφάνειες (50%). Δηλαδή στις επιφάνειες με χαμηλή υγρασία προτίμησαν τις μη λιπασμένες (50%-Μa). Στην πρώτη περίπτωση ο χειρισμός της οργανικής λίπανσης και στη δεύτερη ο συνδυασμένος χειρισμός της οργανικής λίπανσης για τις ξηρές επιφάνειες επέφεραν κάποιες αλλαγές στη συχνότητα εμφάνισης των εν λόγω τροφικών ομάδων ενώ ο χειρισμός της εδαφικής υγρασίας από μόνος τους δεν επέφερε καμία μεταβολή. 42

βακτηριοφάγοι μυκητοφάγοι μη παρασιτικοί παρασιτικοί θηρευτές - παμφάγοι Σχήμα. Συντελεστές του λογαριθμο-γραμμικού μοντέλου για κάθε συνδυασμό τροφικής ομάδας χειρισμού για τη δειγματοληψία του Μάρτιου. Από τα αποτελέσματα του λογαριθμο-γραμμικού μοντέλου για τη δειγματοληψία του Ιουνίου (σχήμα 8) παρατηρείται ότι όλες οι τροφικές ομάδες πλην των βακτηριοφάγων αποκρίθηκαν στο συνδυασμό των χειρισμών. Εν αντιθέσει με τη δειγματοληψία του Μαρτίου ούτε η βιοτική, ούτε η αβιοτική παρέμβαση συνέτεινε στη διαφοροποίηση της συχνότητας εμφάνισης των τροφικών ομάδων. Αναλυτικότερα, οι μυκητοφάγοι μεταξύ των χειρισμών με οργανική λίπανση παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερη του μέσου όρου συχνότητα εμφάνισης στις ξηρές λιπασμένες (50%OL) έναντι των υγρών (50%-OL). Οι παρασιτικοί φυτοφάγοι μεταξύ των χειρισμών με υψηλή εδαφική υγρασία (50%), παρουσίασαν σημαντικά μεγαλύτερη του μέσου όρου συχνότητα εμφάνισης στις υγρές εμπλουτισμένες με οργανική λίπανση επιφάνειες (50%-OL) έναντι των μη εμπλουτισμένων (50%-Μa). Οι μη παρασιτικοί φυτοφάγοι εμφάνισαν σημαντικά μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης στις ξηρές εμπλουτισμένες επιφάνειες (50%-OL) έναντι των υγρών μη εμπλουτισμένων (50%-Μa). 43

Τέλος η ομάδα των θηρευτών - παμφάγων εμφάνισε σημαντικά μεγαλύτερη συχνότητα στις υγρές μη εμπλουτισμένες με οργανική λίπανση επιφάνειες (50%-Μa), έναντι των ξηρών εμπλουτισμένων (50%-OL). βακτηριοφάγοι μυκητοφάγοι μη παρασιτικοί παρασιτικοί θηρευτές - παμφάγοι Σχήμα 2. Συντελεστές του λογαριθμο-γραμμικού μοντέλου για κάθε συνδυασμό τροφικής ομάδας χειρισμού για τη δειγματοληψία του Ιουνίου. 3.2.6 Διαφοροποιός Ανάλυση Η διαφοροποιός ανάλυση (Discriminant Analysis) εφαρμόστηκε για το σύνολο των δειγματοληψιών τόσο σε επίπεδο λειτουργικών ομάδων (σχήμα 3) όσο και σε επίπεδο γενών (σχήμα 4), ώστε να ανιχνευθούν τυχόν διαφοροποιήσεις της βιοκοινότητας των νηματωδών προκύπτουσες είτε από την εποχικότητα είτε από την επίδραση των καταπονήσεων (βιοτική αβιοτική) χειρισμών. Η διαφοροποιός ανάλυση με βάση τις λειτουργικές ομάδες διαχώρισε σημαντικά τα δείγματα ως προς τον πρώτο άξονα (σχήμα 3). Σύμφωνα με τη διαφοροποίηση αυτή τα δείγματα της πρώτης (Μάρτιος) δειγματοληψίας τοποθετούνται δεξιά στο γράφημα ενώ της δεύτερης (Ιούνιος) αριστερά υπογραμμίζοντας το ισχυρό εποχικό πρότυπο το, το οποίο παρατηρήθηκε και στην τριπλή ανάλυση διακύμανσης. Δευτερευόντως στη δεύτερη δειγματοληψία το επίπεδο της λίπανσης διακρίνει τα δείγματα καθώς οι εμπλουτισμένες με οργανική λίπανση επιφάνειες (,5-OL, 0,5-OL) διαχωρίζονται από τις μη εμπλουτισμένες (,5-Μα, 0,5-Μa), ενώ και το επίπεδο υγρασίας διακρίνει τα δείγματα στις εμπλουτισμένες 44