NMR ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΣΤΗΝ Ιατρική Φαρµακευτική Χηµεία Βιοχηµεία Χηµεία τροφίµων και ποτών Ασκήσεις πολλαπλής επιλογής και λύσεις αυτών
Copyright 2006 Γιάννης Β. Παρισιάνος Πρώτη έκδοση: Μάρτιος 2006 Στοιχειοθεσία-σελιδοποίηση: Πάραλος, 210/ 3827314 Επιµέλεια: Σταύρος Ξηρουχάκης Τυπογραφική διόρθωση: Σταύρος Ξηρουχάκης Εκτύπωση: Αφοί Χριστοδούλου Ο.Ε. Βιβλιοδεσία: Χαράλαµπος Μπιλάλης ISBΝ 960-88751-5-3 ΕΚ ΟΣΕΙΣ Γιάννης Β. Παρισιάνος Μικράς Ασίας 76 - Γουδή 115 27 Αθήνα Τηλ. & Fax: 210 74 82 996 Κινητό: 6944 861 193 email: parisianos @jb-designs.gr -www.jb-designs.gr/parisianos Aπαγορεύεται η ολική ή τµηµατική αντιγραφή αυτού του έργου µε οποιαδήποτε µέθοδο χωρίς τη γραπτή έγκριση του εκδότη.
Θ. ΜΑΥΡΟΜΟΥΣΤΑΚΟΣ - Ι. ΜΑΤΣΟΥΚΑΣ NMR ΑΣΚΗΣΕΙΣ - ΛΥΣΕΙΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΣΤΗΝ: Ιατρική Φαρµακευτική Χηµεία Βιοχηµεία Χηµεία τροφίµων και ποτών JB P Eκδόσεις Γιάννης Β. Παρισιάνος
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος 11 Αντί προλόγου 13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Αρχές Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού και Οργανολογίας 13-42 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Χηµική µετατόπιση 43-72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: Σύζευξη αυτοστροφών 73-108 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: Συµµετρία και δυναµική στον Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισµό 109-146 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: Φασµατοσκοπία Άνθρακα -13 147-168 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6: Ετεροπυρηνική Φασµατοσκοπία και Φασµατοσκοπία δύο διαστάσεων 169-214 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7: Πυρηνικό φαινόµενο Overhauser (NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT-NOE) 215-238 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8: Χρόνοι εφησυχασµού 239-256 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9: Υπολογιστική χηµεία ως ανεκτίµητο εργαλείο στο σχεδιασµό Φαρµακευτικών µορίων 257-276 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10: Μελέτη ευνοϊκών διαµορφώσεων βιοδραστικών µορίων µε συνδυασµό υπολογιστικής χηµείας και Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού 277-300 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11: ιαµορφωτική ανάλυση Βιοµορίων - Πεπτίδια 301-348 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12: ιαµορφωτική ανάλυση Βιοµορίων-Νουκλεϊνικά Οξέα 349-370
8 ΑΡΧΕΣ NMR ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13: ιαµορφωτική ανάλυση Βιοµορίων-Σάκχαρα 371-390 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14: Λιπίδια Αιθερολιπίδια - Μελέτη ευνοϊκών διαµορφώσεων βιοδραστικών µορίων µε συνδυασµό υπολογιστικής χηµείας και Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού 391-406 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 15: ιαµορφωτική ανάλυση Φαρµακευτικών Μορίων-Στεροειδή 407-430 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 16: ιαµορφωτική ανάλυση Φαρµακευτιών Μορίων-Αλκαλοειδή 431-444 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 17: ιαµορφωτική ανάλυση Φαρµακευτιών Μορίων-Τερπενοειδή 445-458 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 18: ιαµορφωτική ανάλυση Φαρµακευτιών Μορίων- Φλαβονοειδή 459-470 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 19: ιαµορφωτική ανάλυση Φαρµακευτιών Μορίων-Κανναβινοειδή 471-492 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 20: ιαµορφωτική ανάλυση Φαρµακευτιών Μορίων - Παράγωγα Αδαµαντανίου 493-506 ΚΕΦΑΛΑΙΟ21: Εφαρµογές Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού στην Ιατρική και Βιοχηµεία 507-540 ΚΕΦΑΛΑΙΟ22: Εφαρµογές Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού στον ποσοτικό προσδιορισµό, νοθεία και γεωγραφική προέλευση ποτών και τροφίµων 541-562 ΠΙΝΑΚΕΣ 563-578 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ 579-588 ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ 589-606 ΓΛΩΣΣΑΡΙ 607-616 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 617-623
ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Φασµατοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού αποτελεί µία α- πό τις σηµαντικότερες µεθοδολογίες για την ταυτοποίηση, διαµορφωτική α- νάλυση και µελέτη δυναµικών ιδιοτήτων καινοτόµων χηµικών ενώσεων οι οποίες βρίσκουν εφαρµογές στην χηµεία, βιοχηµεία, ιατρική και φαρµακευτική. Για το λόγο αυτό αποτέλεσε ανάγκη από την επιστηµονική κοινότητα η συγγραφή βιβλίου που να περιγράφει τόσο τη µέθοδο όσο και τις εφαρ- µογές της. Στο αίτηµα αυτό ανταποκρίθηκαν οι Θ. Μαυροµούστακος και Ι. Ματσούκας δύο συνάδελφοι που µε µεγάλη επιτυχία έχουν αξιοποιήσει τη µεθοδολογία αυτή στον τοµέα της Οργανικής και Φαρµακευτικής Χηµείας µε τη συγγραφή της µονογραφίας που φέρει τον τίτλο «Αρχές και Εφαρµογές Φασµατοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού». Στα πρώτα οκτώ από τα συνολικά είκοσι δύο κεφάλαια, παραθέτονται οι βασικές αρχές της Φασµατοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού σε υγρή κατάσταση. Ακολουθούν δύο κεφάλαια τα οποία τονίζουν το ρόλο της Υπολογιστικής Χηµείας στο Σχεδιασµό Φαρµακευτικών Ουσιών καθώς και το συνδυασµό Υπολογιστικής Χηµείας και Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού για τη µελέτη των ευνοϊκών διαµορφώσεων βιοδραστικών µορίων. Στα επόµενα δέκα κεφάλαια, περιγράφεται η διαµορφωτική ανάλυση βιοµορίων και φαρµακευτικών ουσιών, όπως πεπτιδίων, νουκλεϊνικών οξέων, σακχάρων, στεροειδών, φλαβονοειδών κ.ά. Στα τελευταία δύο κεφάλαια αναπτύσσονται εφαρµογές του πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού στην Ιατρική και Βιοχηµεία, καθώς και και στην Χηµεία Τροφίµων και Ποτών µε την ανίχνευση και τον Ποσοτικό Προσδιορισµό της νοθείας. Η µονογραφία περιέχει εκτενή βιβλιογραφία και χρήσιµο γλωσσάρι, και συµπληρώνεται µε επαναληπτικές ασκήσεις για την εφαρµογή και εµπέδωση των γνώσεων που αποκτήθηκαν. Η παρούσα µονογραφία έχει συγγραφεί µε σαφήνεια και απλότητα. Σίγουρα θα αποτελέσει απαραίτητο βοήθηµα όχι µόνο για προπτυχιακούς και µεταπτυχιακούς φοιτητές, αλλά και για πανεπιστηµιακούς δασκάλους και ε- ρευνητές, χηµικούς, βιολόγους και ιατρούς, που θα θελήσουν να ενηµερωθούν ή και να χρησιµοποιήσουν τις παρεχόµενες γνώσεις στην διδασκαλία ή την έρευνα.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΑΡΧΕΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Purcell Edward Mills (1912-1997) Bloch Felix (1905-1983) Το έτος 1952 οι φυσικοί E. Purcell (Harvard, USA) και F. Bloch (Stanford, USA) τιµήθηκαν µε το βραβείο Νόµπελ για την ανακάλυψη του Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού.
Åñù ôþóåéò Να απαντήσετε µε Σ αν είναι ορθές ή Λ αν είναι λανθασµένες οι προτάσεις που ακολουθούν. 1. Η πρόσφατη εγκατάσταση στο Scripps των Ηνωµένων Πολιτειών Αµερικής του µαγνήτη «Γορίλλα» 900 MHz µπορεί να στοχεύει στη δυνατότητα µελέτης βιοµορίων. Σ 2. Ο µετασχηµατισµός κατά Fourier είναι αργή διαδικασία και δεν γίνεται αυτόµατα. Λ 3. Η δειγµατοληψία πρέπει να γίνεται µε επαρκή σηµεία, ώστε στο λαµβανόµενο φάσµα να έχει επαρκή διακριτικότητα. Σ 4. Τα πειράµατα µίας διάστασης NMR λαµβάνονται µε χρήση πολλών σαρώσεων, για να επιτευχθεί ικανοποιητικός λόγος σήµατος/θόρυβο. Σ 5. Η διαφορά συντονισµού των πρωτονίων µίας ένωσης είναι της τάξεως των GHz.
14 ΑΡΧΕΣ NMR Λ 6. Οι πυρήνες 12 C 6 και 32 S 16 δεν είναι ενεργοί στη φασµατοσκοπία NMR. Σ 7. Ο διαλύτης για το κλείδωµα του πεδίου δεν πρέπει να περιέχει δευτέριο. Λ 8. Η κλίµακα, που χρησιµοποιείται στο φάσµα και στην οποία αυθαίρετα το TMS ορίζεται να έχει τιµή δ=0,0 ppm, εκφράζεται σε ppm. Σ 9. Ο χρόνος λήψης µεταξύ δύο σηµείων σε ένα πείραµα NMR είναι της τάξεως των δευτερολέπτων. Λ 10. Η οµογενοποίηση του πεδίου συντελεί στην λήψη καλύτερης ποιότητας φασµάτων. Σ Áí ôéóôï é Þóåéò Να αντιστοιχήσετε: ΑQ = DW SI 1 SR = DW SW= SR 2 ΑQ = DW SI SR = 1 DW SW= SR 2
Κεφ. 1 ΑΡΧΕΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 15 Ασκήσεις 1. Σε µαγνητικό πεδίο έντασης 2,349 Τ η συχνότητα συντονισµού του 15 Ν είναι 10,13 ΜΗz. Ποια είναι η συχνότητα συντονισµού του 15 Ν σε µαγνήτη έντασης 11,745 Τ; Με διαίρεση κατά µέλη των παρακάτω σχέσεων 1.1 και 1.2 προκύπτει η σχέση 1.3 f f f 1 1 2 = γ 2π Β = γ f 2 2π Β B = B 1 2 1 2 (1.1) (1.2) (1.3) Η σχέση 1.3 µετασχηµατίζεται στην 1.4 f 2 f1 B2 = B 1 (1.4) Λύνοντας ως προς f2 και θέτοντας τις τιµές Β1=2,349 Τ, Β2=11,745 Τ και f1=10,13 MHz προκύπτει ότι f2=50,65 MHz. 2. Σε πόσα λεπτά θα επαναληφθεί ένα πείραµα 1 Η NMR στο οποίο χρησιµοποιήθηκαν οι παράµετροι AQ=2s, DE=30µς, PW=5µς και RD=1s; Χρ. Πειρ.=PW + DE + AQ + RD= 5.10-6 + 30.10-6 + 2 + 1= 3,00003 s 3. Ο γυροµαγνητικός λόγος του 2 Η είναι περίπου 6,5 φορές µικρότερος από αυτόν του πρωτονίου. Σε µαγνήτη, όπου το φάσµα 1 Η µπορεί
14 ΑΡΧΕΣ NMR να παρατηρηθεί στα 400 ΜΗz, σε ποια συχνότητα αναµένετε να παρατηρηθεί το φάσµα 2 Η NMR; Με χρήση των τύπων 1.5 και 1.6: f o f o, = γ Η H Β 2 π γ D, = D Β 2 π 0 0 (1.5) (1.6) προκύπτει µε διαίρεση κατά µέλη η σχέση 1.7 f f 0, Η 0, D = γ γ D Η 1.7 µετασχηµατίζεται στην 1.8 f O, D = Η γ H f O, H γ D (1.7) (1.8) Θέτοντας στην σχέση 1.8 τις τιµές γ Η /γ D προκύπτει ότι f 0,D =61,54 MHz. =6,5 και f 0,Η =400 ΜΗz 4. Ποια είναι η διαφορά σε Ηz δύο πυρήνων υδρογόνου, οι οποίοι σε φασµατογράφο 600 MHz συντονίζονται στα 4 και 8 ppm; 4 ppm διαφορά σε φασµατογράφο 600 ΜΗz αντιστοιχεί σε 4.600=2400 Ηz. 5. Για τη λήψη ενός φάσµατος 1 Η NMR χρησιµοποιήθηκαν οι ακόλουθοι χρόνοι: PW=5µς, DE=30µς, AQ=3s και RD=3s. Επίσης για να αυξηθεί ο λόγος S/N χρησιµοποιήθηκαν 32 σαρώσεις. Ποιος ήταν ο πειραµατικός χρόνος; Αρχικά υπολογίζεται ο πειραµατικός χρόνος (ίδε άσκηση 3) να είναι 6,00035 s. O ολικός χρόνος πειράµατος είναι 32. 6,00035 s=192,00112s ή 3 min και 12,00112s.
Κεφ. 1 ΑΡΧΕΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 15 6. Πόσες φορές ο ποµπός και ο δέκτης είναι ανοικτοί (ΟΝ), σε ένα πείραµα µίας διάστασης στο οποίο χρησιµοποιούνται 64 σαρώσεις; Σε κάθε πείραµα είναι µία φορά ON ο ποµπός και µία φορά ο δέκτης. Εποµένως, σε 64 πειράµατα θα είναι 64 φορές ON ο ποµπός και 64 φορές ο δέκτης. 7. Έστω ότι λαµβάνετε φάσµα 1 Η NMR ουσίας που συνθέσατε. Οι παρατηρούµενες κορυφές έχουν πλάτος µεγαλύτερο του αναµενό- µενου. Πού µπορεί να οφείλεται αυτό; Μπορεί ν' οφείλεται σε διάφορους λόγους. Οι κυριότεροι είναι: (α) παρουσία ακαθαρσιών στην συντιθέµενη ουσία. (β) ανοµοιογένεια στο µαγνητικό πεδίο (γ) µη σταθερή περιστροφή του δείγµατος (δ) παρουσία παραµαγνητικών ουσιών 8. Ποιος είναι ο χρόνος λήψης των πειραµατικών δεδοµένων αν χρησιµοποείται SR=6420 σηµεία ανά λεπτό και SI=4k; Από τον τύπο: AQ = SI SR (1.9) Θέτοντας SI=4k=4.1024=4096 σηµεία και SR=6420 σηµεία ανά λεπτό προκύπτει ότι ΑQ=0,638 min. 9. Εάν σε ένα πείραµα ο χρόνος λήψης που χρησιµοποιήθηκε ήταν 4,1 S, πόσα Ηz ήταν η διακριτικότητα; Εάν στο πείραµα αυτό χρειαζό- µασταν διακριτικότητα µικρότερη από 0,24 Hz σε ποιες ενέργειες θα προβαίνατε, για να το πετύχετε; Με απλή εφαρµογή του τύπου:
18 ΑΡΧΕΣ NMR 1 R = Q (1.10) και θέτοντας AQ=4,1 s προκύπτει ότι R=0,244 Hz. Για να επιτευχθεί R<0,24 θα πρέπει ν' αυξηθεί ο χρόνος λήψης του πειράµατος (AQ) δηλαδή ν' αυξηθεί ο χρόνος δειγµατοληψίας ( DW). 10. Σύµφωνα µε το θεώρηµα του Nyquist πρέπει να ισχύει: Από τον τύπο 1 DW = 2 SW (1.11) και δια αντικαταστάσεως του προκύπτει ότι DW = 1 SR SR SW = 2 Θέτοντας ότι SR=6410 σηµεία.s- 1 (1.12) 1.13) προκύπτει ότι SW=3205 Hz
Κεφ. 1 ΑΡΧΕΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 19
20 ΑΡΧΕΣ NMR