Επιλογή, ταυτοποίηση και κλωνισµός υψηλοαποδοτικών για ρητίνη γενοτύπων χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis Mill.)

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΑΣΙΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΔΑΣΟΠΟΝΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ Επιλογή, ταυτοποίηση και κλωνισµός υψηλοαποδοτικών για ρητίνη γενοτύπων χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis Mill.) Διδακτορική Διατριβή Μήτρας Κ. Δηµήτριος Θεσσαλονίκη 2011

ΠΕΡΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΓΕΝΙΚΑ-ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Γενικά 1 1. ΕΠΙΛΟΓΗ 3 1.1 Τεχνητή επιλογή 3 1.2 Συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας 4 1.3 Γενετικό κέρδος 6 1.4 Μέθοδοι τεχνητής επιλογής 7 1.4.1 Μαζική επιλογή 8 1.4.2 Επιλογή οικογενειών 10 1.4.3 Επιλογή από δοκιµή απογόνων 11 1.4.4 Επιλογή µέσα στις οικογένειες 11 1.4.5 Συνδυασµένη επιλογή 11 1.4.6 Επιλογή για πολλούς χαρακτήρες 11 1.4.7 Επανεπιλογή 13 1.5 Επιλογή µε γενετικούς δείκτες 13 1.6Μαζική επιλογή σε γνωρίσµατα που επιδεικνύουν σταθερότητα στο χρόνο 16 1.7 Εφαρµογή των µεθόδων επιλογής στη δασοπονία 19 1.7.1 Φυσική αναγέννηση 19 1.7.2 Συλλογή αναγεννητικού υλικού από φυσικά δάση και τεχνητές φυτείες 19

1.7.2.1 Συλλογή σπόρων από επιλεγµένα δέντρα 19 1.7.2.2 Συστάδες σποροπαραγωγής 20 1.7.3 Κήποι σποροπαραγωγής 20 1.7.3.1 Κήπος σποροπαραγωγής µε κλώνους 20 1.7.3.2 Σποροπαραγωγός κήπος σποροφύτων 21 1.7.4 Είδη που πολλαπλασιάζονται βλαστικά 22 1.7.5 Τράπεζα κλώνων 23 1.8 Η παραγωγικότητα σε ρητίνη και η χηµική σύσταση της, σε σχέση µε την ανθεκτικότητα απέναντι σε προσβολές από βιοτικούς παράγοντες 23 1.9 Βιβλιογραφική ανασκόπηση 25 2. ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΑΣΙΚΩΝ ΔΕΝΤΡΩΝ 2.1 Γενετικοί δείκτες, χρήσεις και χαρακτηριστικά 30 2.2 Μορφολογικοί δείκτες 30 2.3 Βιοχηµικοί δείκτες 31 2.3.1 Μονοτερπένια 31 2.3.2 Αλλοένζυµα 31 2.4 Μοριακοί δείκτες 32 2.4.1 Πολυµορφισµός Μήκους Περιοριστικού Τµήµατος Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 34 2.4.2 Δείκτες Πολυµορφισµού Μήκους Ενισχυµένου Θραύσµατος Amplified fragment length polymorphism (AFLP) 35

2.4.3Μικροδορυφόροι ή δείκτες επανάληψης απλής αλληλουχίας Microsatellites or simple sequence repeats (SSR) 36 2.4.4 Δείκτες Τυχαία Ενισχυµένου Πολυµορφικού DNA Rapid Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 36 2.4.4.1 Πλεονεκτήματα- Μειονεκτήματα των Δεικτών RAPD 40 2.4.4.2 Εφαρμογές των μοριακών δεικτών τύπου RAPD 42 3. ΒΛΑΣΤΙΚΟΣ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ ΚΛΩΝΙΚΗ ΔΑΣΟΠΟΝΙΑ 3.1 Βλαστικός πολλαπλασιασµός 46 3.2 Τεχνικές βλαστικού πολλαπλασιασµού 48 3.2.1 Μοσχεύµατα 49 3.2.1.1 Παράγοντες που επηρεάζουν τη ριζοβόληση των µοσχευµάτων 51 3.2.2 Καταβολάδες 52 3.2.3 Ιστοκαλλιέργεια- Μικροπολλαπλασιασµός 53 3.2.4 Εµβολιασµός 55 3.2.4.1 Πλάγιος εµβολιασµός 56 3.2.4.2 Εµβολιασµός µε σχισµή 58 3.2.4.3 Εµβολιασµός Αγγλικού τύπου 59 3.2.4.4 Ενοφθαλµισµός 59 3.2.4.5 Απαραίτητες προϋποθέσεις και παράγοντες που επηρεάζουν την επιτυχία των εµβολιασµών 60

3.2.4.6 Αλληλεπίδραση υποκειµένου-εµβολίου 63 3.2.4.7 Ασυµβίβαστο 65 3.3 Κλωνική Δασοπονία 67 3.4Διέγερση και ανάπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών βραχυκλαδίων στο γένος Pinus ως βασική προµεταχείρηση στο βλαστικό πολλαπλασιασµό επιλεγµένων ατόµων χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis Mill.) 68 4 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ - ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ΡΗΤΙΝΗΣ 4.1 Χαλέπιος Πεύκη (Pinus halepensis Mill.) 72 4.2 Ρητίνη 75 4.2.1 Γενικά 75 4.2.2 Συλλογή της ρητίνης 76 4.2.3 Παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή της ρητίνης 77 4.2.4 Επεξεργασία και χρήσεις της ρητίνης 78 4.2.5 Η ρητίνη και η ρητινοσυλλογή σήµερα 79 Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής 82 ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ 5.1 Επιλογή 84

5.1.1 Επιλογή άριστων σε παραγωγή ρητίνης φαινοτύπωνγενοτύπων χαλεπίου πέυκης µε τη µέθοδο της µαζικής επιλογής 84 5.1.2 Υπολογισµός του γενετικού κέρδους όσον αφορά στο γνώρισµα παραγωγή ρητίνης 84 5.2 Ταυτοποίηση µε µοριακούς δείκτες τύπου RAPD 86 5.2.1 Προετοιµασία φυτικού ιστού 86 5.2.1.1 Φύτρωση των σπόρων 86 5.2.1.2 Eκχύλιση και αποµόνωση του DNA 86 5.2.2 Προετοιµασία του µίγµατος της αντίδρασης PCR 88 5.2.3 Ενίσχυση DNA 89 5.2.4 Ηλεκτροφόρηση 89 5.2.5 Διερεύνηση της συµπεριφοράς των µοριακών δεικτών τύπου RAPDs ως γενετικοί δείκτες- Ταυτοποίηση επιλεγµένων ατόµων-στατιστική ανάλυση 90 5.3 Εµβολιασµός 91 5.3.1 Συλλογή και διατήρηση εµβολίων 91 5.3.2 Διενέργεια εµβολιασµών και µελέτη της επίδρασης της µεθόδου του εµβολιασµού, στο τελικό ποσοστό επιτυχίας 91 5.4 Διέγερση και ανάπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών βραχυκλαδίων των εµβολίων που προήλθαν από τα επιλεγµένα υψηλοαποδοτικά σε ρητίνη άτοµα χαλεπίου πεύκης 92

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 6.1 Επιλογή 95 6.2 Αποτελέσµατα των υπολογισµών του γενετικού κέρδους 99 6.3 Δοκιµή και επιλογή εκκινητών 105 6.4 Διαχωρισµός και κληρονόµηση των RAPD θραυσµάτων 106 6.5 Tαυτοποίηση των επιλεγµένων ατόµων 109 6.6 Επίδραση της µεθόδου εµβολιασµού στο ποσοστό επιβίωσης των επιλεγµένων εµβολιασµένων ατόµων χαλεπίου πεύκης 123 6.7 Διέγερση και ανάπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών βραχυκλαδίων των εµβολίων που προήλθαν από τα επιλεγµένα υψηλοαποδοτικά σε ρητίνη άτοµα χαλεπίου πεύκης 130 6.8 Συµπεράσµατα 138 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 139 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Σύσταση διαλυµάτων 169

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Με την ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής αισθάνοµαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω θερµά, τον επιστηµονικό µου υπεύθυνο Καθηγητή Σκαλτσογιάννη Α. για την επιλογή του θέµατος και τη συνολική καθοδήγηση κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής. Επίσης, τους επιστηµονικούς υπεύθυνους Καθ. Αραβανόπουλο Φ. και Επίκ. Καθ. Μπάρµπα Ε. για την καθοδήγηση τους και τις συζητήσεις κατά τη διάρκεια της έρευνας. Ακόµη θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή Βουλγαρίδη Η., την καθηγήτρια Δηµάση- Θεριού Κ. καθώς και τις Επίκ. καθηγήτριες Τσακτσίρα Μ. και Τσουλφά Π., µέλη της εξεταστικής επιτροπής, για τον χρόνο που αφιέρωσαν στη διόρθωση του κειµένου. Όσον αφορά στη συλλογή του υλικού έρευνας, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους φίλους και συναδέλφους Καρανίκα Χ. και Νικολάου Π. που βοήθησαν στην ανεύρεση και τη συλλογή των εµβολίων και των κώνων της χαλεπίου πεύκης. Πολύ σηµαντική ήταν και η συνεισφορά στην επιλογή των ατόµων που µελετήθηκαν, του Προέδρου του συνεταιρισµού της Κασσάνδρας Χαλκιδικής, Κρητικού Α., όπως επίσης και του Προέδρου του αντίστοιχου συνεταιρισµού στη Εύβοια, Λαδογίαννη Γ. Παράλληλα, θα ήθελα να ευχαριστήσω και τον φίλο και συνάδερφο Μιαούλη Μ. για τη σηµαντική βοήθεια του στις µοριακές αναλύσεις. Τέλος, ένα µεγάλο ευχαριστώ προς την οικογένεια µου, για την αµέριστη συµπαράσταση, εµπιστοσύνη και υποµονή που µου έδειξαν όλα αυτά τα χρόνια.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ρητίνη αποτελεί ένα δευτεργενές δασικό προϊόν µε ιδιαίτερη οικονοµική σηµασία. Τα επιµέρους συστατικά της χρησιµοποιούνται ευρέως σε διάφορους τοµείς της βιοτεχνίας και βιοµηχανίας. Η παραγωγή της προέρχεται από διάφορα είδη κωνοφόρων δέντρων. Στην Ελλάδα τα είδη που ρητινεύονται είναι αυτά της χαλεπίου, της τραχείας και της µαύρης πεύκης, µε τη χαλέπιο να αποτελεί το κύριο ρητινοπαραγωγό είδος. Η παραγωγή ρητίνης της χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis) στην Ελλάδα, παρουσιάζει µια ετήσια τιµή της τάξης των 2,7 Kg κατ άτοµο. Παρόλα αυτά, έχουν εντοπιστεί άτοµα των οποίων η παραγωγή ξεπερνά τα 12 Kg. Πρώτoς στόχος της παρούσας έρευνας, ήταν ο εντοπισµός υψηλοαποδοτικών σε παραγωγή ρητίνης ατόµων, στις περιοχές της Κασσάνδρας Χαλκιδικής και της Κιρύνθου στην Εύβοια. Κατόπιν υποδείξεων των ντόπιων ρητινοσυλλεκτών, εντοπίστηκαν και επιλέχθηκαν τελικά 22 άτοµα στη Χαλκιδική, µε µέση ετήσια παραγωγή περίπου 18 Kg και 11 άτοµα στην Εύβοια, µε µέση ετήσια παραγωγή περίπου 24Kg. Παράλληλα έγινε και υπολογισµός του γενετικού κέρδους στις διάφορες περιπτώσεις. Η ταυτοποίηση και ο διαχωρισµός των επιλεγµένων ατόµων έγινε µε τη µέθοδο του Τυχαία Πολλαπλασιαζόµενου Πολυµορφικού DNA (RAPD), που εφαρµόστηκε σε ενδοσπέρµια των ατόµων αυτών. Μετά την αποµόνωση του DNA και τη βελτιστοποίηση της αντίδρασης PCR, ακολούθησε δοκιµή εκκινητών. Από τους 30 τυχαίους εκκινητές που δοκιµάστηκαν, επιλέχθηκαν τελικά 6 οι οποίοι χρησιµοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση και ένας έβδοµος που χρησιµοποιήθηκε στη µελέτη του διαχωρισµού των RAPD θραυσµάτων. Οι RAPD δείκτες, όταν προέρχονται από ανάλυση σε απλοειδή µεγαγαµετόφυτα, ανάγονται σε συγκυρίαρχους µε αποτέλεσµα, η γενετική ταυτοποίηση των επιλεγµένων ατόµων να προκύπτει από τα αλληλόµορφα που εµφανίζει το κάθε ένα από αυτά, για τις 68 γονιδιακές θέσεις που εντοπίστηκαν. Με βάση τις αναλύσεις και τα 4 άτοµα που µελετήθηκαν, παρουσιάζουν διαφορετικό γενότυπο. Ο πλήρης διαχωρισµός των επιλεγµένων ατόµων, επιτυγχάνεται αν ληφθούν υπόψη 9 γονιδιακές θέσεις. Η πιθανότητα να βρεθούν δυο άτοµα µε ταυτιζόµενο γενότυπο είναι ίση µε 7,3x10-4, ενώ για το σύνολο των 68 γονιδιακών θέσεων ίση µε 2,7x10-20.

Για τη µελέτη της επίδρασης της µεθόδου εµβολιασµού στο ποσοστό επιβίωσης, εφαρµόστηκαν οι µέθοδοι του Αγγλικού, του Πλάγιου και του εµβολιασµού σε Σχισµή. Αποτελεσµατικότερος αποδείχθηκε ο Αγγλικός τύπος, µε µέσο ποσοστό επιβίωσης 92,83±3,33, ενώ ακολουθούν ο εµβολιασµός µε Σχισµή (72,18±5,786) και ο Πλάγιος (62,66±6,244). Όσον αφορά στη διέγερση και ανάπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών των βραχυκλαδίων, τόσο η επίδραση της κυτοκινίνης (BAP) όσο και η αποκοπή των επάκριων οφθαλµών, επέδρασαν ευεργετικά, δίνοντας έναν συνολικό µέσο όρο νέων βλαστών ίσο µε 19,33±0,589. Συµπερασµατικά, θα µπορούσαµε να πούµε ότι η προσπάθεια για την αναγέννηση της ρητινοσυλλογής θα πρέπει να συνεχιστεί. Πειράµατα κοινού περιβάλλοντος για την αποµόνωση της επίδρασης του, ώστε να εξακριβωθεί ποιοί από τους επιλεγµένους φαινοτύπους είναι και άριστοι γενότυποι, καθώς και ελεγχόµενες διασταυρώσεις µεταξύ των επιλεγµένων ατόµων για παραγωγή απογόνων µε ακόµη µεγαλύτερη απόδοση, αποτελούν ουσιαστικά βήµατα προς το στόχο αυτό. Τέλος, ο εντοπισµός και άλλων ατόµων και ο πολλαπλασιασµός τους µε τις τεχνικές του βλαστικού πολλαπλασιασµού, θα συµβάλουν στη δηµιουργία τεχνητών φυτειών, που θα έχουν ως σκοπό την αυξηµένη παραγωγή ρητίνης.

ABSTRACT Resin is a secondary forestry product of significant economic value. Its individual components are used in several different sectors of craft and industry. Resin is produced from different species of conifer trees. In Greece, the resin producing species are Aleppo pine, Brutia and Black pine, with Aleppo pine being the most productive species. The annual resin production from Aleppo pine (Pinus Halepensis) in Greece, is 2,7 kg per tree. Nevertheless, there are trees with resin yield over 12 kg. The first aim of this particular research was the localization of high-yielding, oleoresin trees, in two regions, in Kassandra, Chalkidiki and Kyrinthos, Euboia. Following the suggestions of the local resin collectors, there were spotted and, finally, chosen, 22 high yielding trees in the region of Chalkidiki and 11 from Euboia with an average annual resin yield of approximately 18 kg and 24 Kg, respectively. Also, we calculated the genetic gain for each case. The identification and separation of the selected individual trees was made with the Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) method, which was applied to the endosperm of those specific trees. After the extraction of DNA and the optimization of PCR reaction conditions, followed the selection of suitable primers. Thirty randomly selected primers were tested, from which, finally the 6 were chosen to be used for the identification and another one for the segregation study of the RAPD fragments. When the RAPD markers derive from analysis in haploid megagametophyte, they are converted into co-dominant markers. The genetic identification of the chosen individuals resulted from the alleles that each of the individual displays, for all the 68 gene loci determined. Based on the analyses all 4 individuals that were studied pose a different genotype. Complete separation of the chosen individuals can be achieved if we take under consideration 9 gene loci. The possibility of finding two individuals with identical genotype is 7.3x10-4, whereas for the total amount of the 68 gene loci the possibility is 2.7x10-20. For the study of grafting technique and survival rate, we applied the Splice, the Veneer and the Cleft grafting techniques. The splice technique proved to be the most efficient with a mean survival rate of 92,83±3,33. Next was the cleft (72,18±5,786)

and third the veneer grafting technique (62,66±6,244). The application of BAP (400mg/lit) and the removal of the terminal and lateral buds had a very positive effect in the stimulation and growth of the axillary buds of the brachyblasts, with a mean number of newly formed shoots 19,33±0,589 per grafted plant. In conclusion, we could say that the effort to regenerate the resin harvesting profession should continue. Experiments in common environment in order to determine which of the selected phenotypes are at the same time excellent genotypes, as well as controlled crosses between the chosen individual trees in order to produce offsprings with even greater yield, constitute vital steps towards this goal. Finally, identifying more individual trees and multiplying them vegetatively, will contribute to the creation of new plantations with an increased production of resin.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α. Γενικά- Βιβλιογραφική Ανασκόπηση

Γενικά Γενικά Η ρητίνη αποτέλεσε και αποτελεί ένα δευτερογενές δασικό προϊόν που απασχόλησε για δεκαετίες ένα µεγάλο µέρος των παραδασόβιων ελληνικών πληθυσµών. Tα τελευταία 30 χρόνια παρατηρείται µια φθίνουσα πορεία στον αριθµό των εργατών που απασχολούνται µε τη συλλογή της ρητίνης, γεγονός που συνεπάγεται µείωση της παραγωγής της. Οι κυριότερες αιτίες του φαινόµενου αυτού είναι: 1. Η ικανότητα παραγωγής πετροχηµικών υποκατάστατων των συστατικών της ρητίνης. 2. Η εισαγωγή στην αγορά νέων χωρών-παραγωγών µε ιδιαίτερα ανταγωνιστικούς όρους, όπως η Κίνα. 3. Ο υψηλός βαθµός δυσκολίας και επικινδυνότητας του επαγγέλµατος του ρητινοσυλλέκτη. Οι αρκετές δυσκολίες και ιδιαιτερότητες που παρουσιάζει το επάγγελµα του ρητινοσυλέκτη, σε συνάρτηση µε τα περιορισµένα περιθώρια κέρδους, οδήγησαν τους παραγωγούς στη ρητίνευση επιλεγµένων δέντρων (τα αποκαλούµενα γαλάρια) µε παραγωγή µεγαλύτερη των 7-8 Kg ανά έτος, προκειµένου να αυξήσουν την πρόσοδο και να µειώσουν το κόστος και τον κόπο παραγωγής. Στην προσπάθεια τους αυτή, έχουν εντοπίσει δέντρα, σε πολύ µικρή συχνότητα, µε εξαιρετικά υψηλή απόδοση, των οποίων η παραγωγή ξεπερνά τα 15 Kg ανά έτος και είναι σταθερή επί σειρά ετών. Η ρητίνη ως φυσικό ανανεώσιµο δευτερογενές προϊόν αποτελεί την πρώτη ύλη για την παραγωγή εκατοντάδων χηµικών προϊόντων υψηλής προστιθέµενης αξίας. Όσο η επιστήµη της χηµείας θα εξελίσσεται, τόσο αναµένεται να αυξάνει και η σπουδαιότητα της ρητίνης. Επειδή το γνώρισµα «ποσότητα ρητίνης» είναι γνώρισµα το οποίο ελέγχεται γενετικά, διαθέτει ευρεία παραλλακτικότητα και κληρονοµείται µε υψηλό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας (h²>0,7), αναµένεται η συµβολή της γενετικής βελτίωσης να έχει θεαµατικά αποτελέσµατα, τόσο στη αύξηση της παραγωγής όσο και στη µείωση του κόστος και του κόπου που απαιτεί το επάγγελµα. Η βελτίωση αυτή µπορεί να επιτευχθεί µε την επιλογή υψηλοαποδοτικών σε ρητίνη γενοτύπων και την εγκατάσταση φυτειών µε την τεχνική του βλαστικού πολλαπλασιασµού, τεχνική η οποία έχει εφαρµοστεί µε επιτυχία στο παρελθόν στο 1

Γενικά συγκεκριµένο είδος (Σκαλτσογιάννης, 1988). Η εγκατάσταση των φυτειών αυτών θα γίνει σε επιλεγµένες περιοχές, εκµηδενίζοντας τις όποιες δυσκολίες και κινδύνους εγκυµονεί το δασικό περιβάλλον, καθιστώντας την εργασία της συλλογής της ρητίνης πιο ουσιαστική και πιο αποδοτική. Η παραπάνω προσέγγιση έχει εφαρµοστεί µε επιτυχία και στις Η.Π.Α. (Goddard and Peters, 1965). Παράλληλα, στη σύγχρονη αγορά, αναγκαία κρίνεται και η ταυτοποίηση των γενοτύπων των επιλεγµένων ατόµων, για την εξασφάλιση, τη κατοχύρωση και τη προστασία του πολλαπλασιαστικού υλικού. Σήµερα, έχει αναπτυχθεί µια πληθώρα τεχνικών που βασίζονται στην ανάλυση του DNA. Οι τύποι των µοριακών δεικτών, είναι πλέον πολλοί και ο καθένας από αυτούς παρουσιάζει τα πλεονεκτήµατα και τα µειονεκτήµατα του και έχουν χρησιµοποιηθεί στη ταυτοποίηση ενός µεγάλου αριθµού γενοτύπων διαφόρων ειδών, ποικιλιών, υβριδίων και κλώνων (Zietkiewicz et al. 1994, Heun, et.al., 1997, Gaafar και Saker 2006, Ibanez et al,. 2009) 2

Επιλογή 1. ΕΠΙΛΟΓΗ Ιστορικά, η προσπάθεια για τη βελτίωση των φυτών πέρασε από δυο στάδια. Το πρώτο, που διήρκεσε χιλιάδες χρόνια, είναι αυτό όπου οι απλοί γεωργοί επιτέλεσαν ασυνείδητα το έργο της βελτίωσης, εξηµερώνοντας άγρια φυτά, στην προσπάθεια τους να καλύψουν τις διατροφικές τους ανάγκες. Το δεύτερο στάδιο που ξεκίνησε τους 3 τελευταίους αιώνες, βρίσκεται σε εξέλιξη και διενεργείται από µια πληθώρα επιστηµόνων. Όσον αφορά τα δασικά είδη, ιστορικά οι δασολόγοι δεν τα αντιµετώπιζαν σαν τυπικά φυτά που διαθέτουν συστήµατα κληρονόµησης, όπως όλοι οι άλλοι ζωντανοί οργανισµοί. Δε δινότανε καµία σηµασία στη γενετική ποικιλότητα και επικρατούσε η άποψη ότι η βελτίωση ενός δέντρου εξαρτάται µόνο από το περιβάλλον στο οποίο αυτό µεγαλώνει. Η κατάσταση αυτή επικρατούσε για πολλά χρόνια και µόνο πριν από µερικές δεκαετίες αναγνωρίστηκε για τα δασικά είδη, η συµβολή της γνώσης και της επιλογής των γονέων στη βελτίωση των φυτών, και ότι µόνο µε τον συνδυασµό καλλιεργητικών µέτρων και επιλογής των γονέων, µπορεί να επιτευχθεί πρόοδος στα ποσοτικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά ενός δέντρου. Οι µηχανισµοί που εφαρµόζονται στη γενετική βελτίωση των δασοπονικών ειδών, ουσιαστικά δε διαφέρουν από τους φυσικούς, δηλαδή τη φυσική επιλογή, τον υβριδισµό, τις µεταλλάξεις και τη µετανάστευση. Απαραίτητη όµως προϋπόθεση στην εφαρµογή τους, αποτελεί η µελέτη του τρόπου και της έκτασης ελέγχου του περιβάλλοντος. Έτσι σύµφωνα µε τον Πανέτσο (1986), οι µέθοδοι βελτίωσης των δασοπονικών ειδών µπορούν να ταξινοµηθούν στις ακόλουθες τέσσερις κατηγορίες: Ι. Τεχνητή επιλογή ΙΙ. Παραγωγή και δοκιµή υβριδίων ΙΙΙ. Εισαγωγή και δοκιµή ξενικών ειδών ΙV. Μεταλλάξεις (µε ευρεία έννοια) 1.1 Τεχνητή επιλογή Με το όρο τεχνητή επιλογή εννοούµε τη διαδικασία επιλογής από φυσικά δάση ή τεχνητές φυτείες, πληθυσµών, οικογενειών, δέντρων ή και κλώνων, που παρουσιάζουν ορισµένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, µε σκοπό τη βελτίωση της 3

Επιλογή παραγωγής ή την ικανοποίηση άλλων επιδιώξεων της δασοπονίας πολλαπλών σκοπών. Απαραίτητη προϋπόθεση για την αποτελεσµατικότητα της επιλογής, είναι η εφαρµογή της σε υλικό το οποίο διαθέτει γενετική ποικιλότητα. Έτσι µε την επιλογή των κατάλληλων γονέων, επιδιώκεται αύξηση της συχνότητας των επιθυµητών γονιδίων στην επόµενη γενιά. Η επιλογή όµως, µε βάση µόνο το φαινότυπο δεν είναι αντικειµενική, αφού ως γνωστόν επηρεάζεται άµεσα από το γενότυπο αλλά και από το περιβάλλον όπου ένας πληθυσµός, µια οικογένεια, ένα δέντρο ή ένας κλώνος, αναπτύσσεται. Έτσι ο φαινότυπος µπορεί να περιγραφεί απλά ως εξής: Φαινότυπος = Γενότυπος + Περιβάλλον ή Φ= Γ+ Π Οι παράγοντες του περιβάλλοντος που επηρεάζουν το φαινότυπο µπορεί να είναι το κλίµα, το έδαφος, η πυκνότητα των δέντρων, οι διάφοροι βιοτικοί παράγοντες, οι δασοκοµικοί χειρισµοί, το υψόµετρο και η κλίση του εδάφους. Ο γενότυπος των δέντρων, δηλαδή το σύνολο των γονιδίων που υπάρχουν στο γένωµα τους, έχει να κάνει µε το γένος, το είδος, την προέλευση, τον τύπο της συστάδας, το ίδιο το δέντρο καθώς και την ποικιλότητα που εντοπίζεται µέσα στο δέντρο, δηλαδή την ετεροζυγωτία (White et al. 2007) 1.2 Συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας Αν τη φαινοτυπική διακύµανση ενός χαρακτήρα, την παραστήσουµε µε (σ²φ) και µε (σ²γ) και (σ²π), παραστήσουµε τη γενετική και τη διακύµανση που προέρχεται από την επίδραση του περιβάλλοντος αντίστοιχα, προκύπτει ο τύπος: σ²φ = σ²γ + σ²π Για να υπολογίσουµε τι ποσοστό από την όλη φαινοτυπική διακύµανση οφείλεται στο γενότυπο, υπολογίζουµε τον λόγο της γενετικής διακύµανσης (σ²γ) προς τη συνολική (σ²φ).ο λόγος αυτός που συµβολίζεται µε h², ονοµάζεται συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας και υπολογίζει το ποσοστό της φαινοτυπικής παραλλακτικότητας που οφείλεται στο γενότυπο και εποµένως κληρονοµείται. 4

Επιλογή h² = σ²γ / σ²φ ή h² = σ²γ / (σ²γ + σ²π ) Οι τιµές του κυµαίνονται από 0-1 και εκφράζονται µε δεκαδικούς αριθµούς ή µε ποσοστό στα εκατό. Αν η τιµή του είναι (0) σηµαίνει ότι όλες οι διαφορές που παρουσιάζουν τα δέντρα µεταξύ τους για ένα χαρακτήρα, οφείλονται στην επίδραση του περιβάλλοντος, ενώ όταν αυτή είναι (1), όλη η ποικιλότητα οφείλεται στο γενότυπο. Ως γνωστόν, από το σύνολο της γενετικής παραλλακτικότητας, µεταβιβάζεται αυτούσια µόνο αυτή που οφείλεται στην αθροιστική δράση των γονιδίων και αποτελεί την κυριότερη αιτία για την οµοιότητα που παρουσιάζεται µεταξύ γονέων και απογόνων. Από την παραλλακτικότητα που δηµιουργούν τόσο η κυριαρχία, όσο και η επίσταση, µόνο ένα µέρος κληρονοµείται, και για αυτό κρίνεται απαραίτητη η ανάλυση της γενετικής παραλλακτικότητας, στα επιµέρους συστατικά της, δηλαδή σ²γ = σ²α + σ²κ + σ²ε Τελικά η συνολική φαινοτυπική διακύµανση ενός χαρακτήρα θα είναι: σ²φ = σ²α + σ²κ + σ²ε + σ²π + σ²γπ Ο παράγοντας (σ²γπ), εκφράζει την παραλλακτικότητα που οφείλεται στην αλληλεπίδραση µεταξύ γενοτύπου και περιβάλλοντος. Αφού όµως η διακύµανση της αθροιστικής δράσης των γονιδίων είναι το συστατικό που συµβάλει περισσότερο στο να κληρονοµηθεί ένα γνώρισµα σταθερά, πρέπει να αποτελεί και το καλύτερο µέτρο εκτιµήσεως του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας. Άρα : h² = σ²α / σ²φ Ο παραπάνω τύπος µας δίνει τον συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας µε τη στενή έννοια, ενώ ο αρχικός τύπος µε την ευρεία. h² σ.ε. = σ²α / σ²φ και h² ε.ε. = σ²γ / σ²φ 5

Επιλογή Όταν ο υπολογισµός γίνεται από δεδοµένα που παίρνουµε από πειραµατικές φυτείες µε φυτά που προήλθαν από σπέρµατα, τότε ο συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας που θα προκύψει είναι αυτός µε τη στενή έννοια, ενώ όταν ο υπολογισµός γίνεται µε βάση δεδοµένα από πειράµατα που εγκαταστάθηκαν µε αγενή πολλαπλασιασµό, ο συντελεστής που υπολογίζεται, βασίζεται στο σύνολο της γενετικής διακύµανσης και είναι αυτός µε την ευρεία έννοια. (Πανέτσος 1986). Από όλα τα παραπάνω φαίνεται ότι ο συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας αποτελεί έναν καλό οδηγό εκτίµησης της δυνατότητας βελτίωσης ενός χαρακτήρα. Όσο µεγαλύτερος είναι, τόσο περισσότερη βαρύτητα πρέπει να δοθεί στη γενετική βελτίωση και στην εφαρµογή των µεθόδων της, ενώ όσο µικρότερος είναι, τόσο καλύτερα αποτελέσµατα θα δώσουν οι µέθοδοι της δασοκοµικής. Είναι βέβαιο πάντως πως ο συνδυασµός και των δυο θα δώσει τα καλύτερα αποτελέσµατα. Οι Squillace και Dorman (1961) υπολόγισαν συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας, για την ποσότητα παραγωγής ρητίνης από 0,45-0,90, γεγονός που δείχνει πόσο ο χαρακτήρας αυτός είναι συνδεδεµένος µε τη γενετική σύσταση του δέντρου. Αυτό αποκτά ιδιαίτερη σηµασία για τη χώρα µας, αφού σηµαντικές εκτάσεις της καλύπτονται από δάση Pinus halepensis που είναι είδος ρητινοπαραγωγό και ως τέτοιο το εκµεταλλευόµαστε. 1.3 Γενετικό κέρδος Με τον όρο γενετικό κέρδος, εννοείται η πρόοδος που θα προκύψει για το συγκεκριµένο χαρακτήρα, σε διαδοχικές γενιές επιλογής. Για ποσοτικούς χαρακτήρες, το κέρδος µετριέται µε τη µεταβολή του µέσου όρου του χαρακτήρα, στο νέο πληθυσµό, σε σχέση µε το µέσο όρο του πληθυσµού από τον οποίο έγινε η επιλογή. Άρα, η πρόοδος εξαρτάται άµεσα από το συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας του χαρακτήρα καθώς και από την ποικιλότητα που παρουσιάζει ο χαρακτήρας αυτός στον πληθυσµό. Η σηµασία της ποικιλότητας, στην επιτυχία της επιλογής, είναι εξίσου µεγάλη µε αυτή, του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας, γιατί επηρεάζει την επιλογική απόκλιση (S). Αν συµβολίσουµε µε Χ1 τη µέση φαινοτυπική τιµή του χαρακτήρα στα επιλεγµένα άτοµα και µε Χ τη µέση φαινοτυπική τιµή του στον πληθυσµό από τον οποίο έγινε η επιλογή, η επιλογική απόκλιση δίνεται από τον τύπο: 6

Επιλογή S = X1 - X Όταν πραγµατοποιείται επιλογή δέντρων µε βάση µόνο το φαινότυπο τους, χωρίς καµία γνώση της γενετικής τους αξίας από δοκιµή απογόνων, το γενετικό κέρδος υπολογίζεται ως εξής : Γενετικό κέρδος = Συντ. Κληρ. Ικαν. Χ Συντ. επιλογής Γκ = S.h2 Από τον παραπάνω τύπο διαπιστώνουµε ότι, το γενετικό κέρδος είναι ανάλογο του h2 και του συντελεστή επιλογικής απόκλισης. Σε φυσικούς πληθυσµούς δέντρων, το h2 για ορισµένους χαρακτήρες που επηρεάζονται εύκολα από το περιβάλλον είναι µικρό, αλλά η επιλογική απόκλιση µεγάλη, γιατί τα δέντρα είναι πολύ διαφορετικά µεταξύ τους. Ο συντελεστής (S) επηρεάζεται άµεσα από το ποσοστό των δέντρων που θα επιλεχθούν από τον πληθυσµό [ ένταση επιλογής (i)] και από την τυπική απόκλιση (σφ) του χαρακτήρα στον πληθυσµό. Έτσι ο τύπος που µας δίνει το γενετικό κέρδος µπορεί να διατυπωθεί και ως εξής: Γκ = S.h2 = i. σφ. h2 Η ένταση της επιλογής (i), είναι ένα µέτρο των τυπικών αποκλίσεων, που ο µέσος όρος των επιλεγµένων ατόµων υπερέχει από το µέσο όρο του πληθυσµού. 1.4 Μέθοδοι τεχνητής επιλογής Οι µέθοδοι της τεχνητής επιλογής είναι πολλές και διαφορετικές µεταξύ τους, και η χρήση τους εξαρτάται από τον τύπο των πληροφοριών που είναι κάθε φορά διαθέσιµες. Τα συστήµατα επιλογής που εφαρµόζονται σε φυσικές συστάδες καθώς και σε φυτείες που απαρτίζονται από µη βελτιωµένο υλικό είναι διαφορετικά από αυτά που βρίσκουν εφαρµογή σε φυτείες προηγµένων γενεών. Τη βάση όµως για οποιαδήποτε επιλογική διαδικασία αποτελούν οι παρακάτω µέθοδοι επιλογής. 7

Επιλογή 1.4.1 Μαζική επιλογή. Η µαζική επιλογή περιλαµβάνει την επιλογή ατόµων, µε µοναδικό κριτήριο τον φαινότυπο τους και χωρίς καµία πληροφόρηση σχετικά µε την απόδοση των προγόνων, των αδελφών, των απογόνων ή κάποιου άλλου συγγενικού τους ατόµου. Για τον λόγο αυτό καλείται και φαινοτυπική επιλογή. Η µαζική επιλογή αποδίδει καλύτερα για χαρακτηριστικά µε υψηλό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας και είναι η καταλληλότερη µέθοδος για επιλογή σε φυσικές συστάδες και φυτείες όπου δεν υπάρχει καµία γνώση σχετικά µε την καταγωγή των ατόµων του πληθυσµού. Χαρακτηριστικά µε υψηλό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας είναι το ειδικό βάρος του ξύλου, η παραγωγή ρητίνης καθώς και τα περισσότερα από τα χαρακτηριστικά εκείνα που σχετίζονται µε την προσαρµοστικότητα. Η ευθυτένεια του κορµού, όπως και η αντοχή απέναντι σε ασθένειες παρουσιάζουν µια ενδιάµεση τιµή, ενώ σε χαρακτηριστικά που σχετίζονται µε την ανάπτυξη η µαζική επιλογή είναι λιγότερο αποτελεσµατική, εξαιτίας της χαµηλής τιµής του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας. Για να είναι πιο αποτελεσµατική η µαζική επιλογή, θα πρέπει να εφαρµόζεται σε συστάδες που διαθέτουν ένα µεγάλο ποσοστό καλών δέντρων και δεν έχουν υποστεί υλοτοµίες µε τις οποίες αποµακρύνθηκαν τα καλύτερα δέντρα. Πολλές φορές όµως, η υπεροχή που παρουσιάζει ένα άτοµο, δεν οφείλεται στις γενετικές του καταβολές, αλλά στο µικροπεριβάλλον στο οποίο αυτό αναπτύχθηκε. Έτσι για να αµβλυνθεί η υποκειµενικότητα του κριτηρίου επιλογής, το υποψήφιο δέντρο συγκρίνεται µε τα πλησιέστερα γειτονικά του ή µε το µέσο ή το καλύτερο δέντρο της συστάδας, λαµβάνοντας υπόψη και την ηλικία. Παράλληλα θα πρέπει η ένταση της επιλογής να είναι µεγάλη, δηλαδή τα επίλεκτα άτοµα να προέρχονται από επιλογή µεταξύ χιλιάδων ατόµων του είδους, Η µαζική επιλογή είναι πιο αποτελεσµατική όταν εφαρµόζεται σε οµήλικες συστάδες, που έχουν την κατάλληλη ηλικία και αποτελούνται από ένα κυρίαρχο είδος, καθώς και σε τεχνητές, φυτείες από τυχαίους σπόρους. Αυτό γιατί απλοποιούνται πολύ οι συγκρίσεις, µεταξύ των επιλεγµένων δέντρων και των δέντρων ελέγχου. Τα πλεονεκτήµατα της εφαρµογής της µαζικής επιλογής σε οµήλικες συστάδες σε σχέση µε τις ανοµήλικες ή τις µεικτές συστάδες είναι πάρα πολλά. Καταρχήν, µπορούµε να είµαστε σίγουροι ότι τα δέντρα της συστάδας δε διαφέρουν σηµαντικά στην ηλικία και ότι η έκφραση των χαρακτηριστικών που σχετίζονται µε την αύξηση, την µορφή, την ανθεκτικότητα απέναντι στις προσβολές και την προσαρµοστικότητα δεν οφείλονται στην επίδραση της ηλικίας. Παράλληλα, 8

Επιλογή τα δέντρα αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες ανταγωνισµού, παρόµοιες µε αυτές που θα αντιµετωπίσουν τα βελτιωµένα δέντρα στις εµπορικές φυτείες που θα εγκατασταθούν. Ακόµη οι συστάδες αυτού του τύπου, είναι οι πλέον κατάλληλες για την εφαρµογή του συστήµατος επιλογής που περιλαµβάνει τα δέντρα σύγκρισης, και αυτό γιατί τα υποψήφια προς επιλογή άτοµα, βαθµολογούνται σε σχέση µε τα καλύτερα δέντρα της συστάδας. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες συντελούν στην αύξηση του συντελεστή επιλογικής απόκλισης και εποµένως στην αύξηση του γενετικού κέρδους. Γενικά, η αποτελεσµατικότητα της µαζικής επιλογής είναι µεγαλύτερη στις τεχνητές φυτείες από ότι στις φυσικές συστάδες, επειδή η ηλικία των δέντρων είναι ακριβώς η ίδια. Στις φυσικές συστάδες, ακόµη και µικρές διαφορές στην ηλικία, προκαλούν διαφορετικές συνθήκες ανταγωνισµού, οι οποίες µπορούν να οδηγήσουν σε µεγάλες διαφορές όσον αφορά στην αύξηση και στη µορφή των ατόµων της συστάδας. Ένα επιπλέον πλεονέκτηµα των φυτειών, είναι ότι ο αυξητικός χώρος µεταξύ των δέντρων είναι πιο οµοιόµορφος. Επειδή στην πραγµατικότητα ο ανταγωνισµός είναι ένας παράγοντας του περιβάλλοντος που επηρεάζει το φαινότυπο του δέντρου, όταν αυτός εξισώνεται, προάγεται η επίδραση της κληρονοµικότητας. Οι Zobel και Talbert (1984) προτείνουν ορισµένες γενικές οδηγίες για την επιλογή ατόµων σε οµήλικες συστάδες και φυτείες, οι οποίες έχουν αποδειχθεί πολύ αποτελεσµατικές στην επιλογή άριστων ατόµων, σε προγράµµατα βελτίωσης πρώτης γενιάς. 1. Η αναζήτηση θα πρέπει να επικεντρώνεται σε συστάδες και φυτείες που παρουσιάζουν ανωτερότητα όσον αφορά την αύξηση, την ευθυτένεια, τη γωνία των κλαδιών, την ανθεκτικότητα καθώς και άλλα χαρακτηριστικά ενδιαφέροντος. 2. Οι συστάδες και οι φυτείες όπου θα αναζητηθούν τα υποψήφια προς επιλογή δέντρα, θα πρέπει να εντοπίζονται σε περιβάλλοντα, αντίστοιχα µε αυτά όπου θα εγκατασταθούν τελικά οι φυτείες από τον βελτιωµένο σπόρο. 3. Σε συστάδες µεγάλης ηλικίας, η προσπάθεια θα πρέπει να περιοριστεί σε δέντρα τα οποία έχουνε ηλικία 10-15 χρόνια µεγαλύτερη ή µικρότερη, από τον προβλεπόµενο περίτροπο χρόνο της φυτείας που θα εγκατασταθεί. 4. Η επιλογή θα πρέπει να επικεντρώνεται σε συστάδες όσο πιο φτωχές γίνεται από άποψη ποικιλίας ειδών, από τα οποία αποτελούνται. 5. Το ελάχιστο µέγεθος µιας συστάδας ή µιας φυτείας όπου θα αναζητηθεί ένα υποψήφιο για επιλογή δέντρο δεν είναι καθορισµένο. Έτσι, αν µια συστάδα είναι 9

Επιλογή αρκετά µεγάλη ώστε να εντοπιστεί ένα υποψήφιο άτοµο και να επιτρέπει την επιλογή δέντρων σύγκρισης, τότε αυτή έχει το κατάλληλο µέγεθος για να διενεργηθεί επιλογή. 6. Τελικά θα πρέπει να επιλέγεται µόνο ένα επίλεκτο άτοµο από κάθε µικρή φυσική συστάδα και αυτό γιατί έτσι µειώνεται η πιθανότητα τα υποψήφια προς επιλογή δέντρα να είναι συγγενείς. Ο περιορισµός αυτός δεν ισχύει όταν εφαρµόζεται επιλογή σε φυτείες. 7. Παρόλο που είναι πολύ επιθυµητό τα υποψήφια δέντρα να παρουσιάζουν αυξηµένη ανθοφορία και παραγωγή σπόρων, δε θα πρέπει να δίνεται µεγάλη έµφαση σε αυτά τα χαρακτηριστικά. Αυτό ισχύει κυρίως για νεαρές συστάδες µε µεγάλη πυκνότητα, όπου πολλά δέντρα δε παρουσιάζουν σηµάδια ανθοφορίας εξαιτίας της περιορισµένης ακτινοβολίας που δέχεται η κόµη τους. Συνήθως, τα δέντρα αυτά ανθοφορούν έντονα σε περιβάλλον σποροπαραγωγού κήπου. 8. Όταν η απόφαση για αναζήτηση υποψηφίων ατόµων έχει παρθεί, η επιλογή θα πρέπει να είναι εκτενής και συστηµατική. Η εµπειρία έχει αποδείξει ότι συνήθως, τα καλύτερα δέντρα δεν εντοπίζονται τελικά, όταν η αναζήτηση γίνεται τυχαία χωρίς κανένα σχεδιασµό. 9. Όπου είναι εφικτό, θα πρέπει να εφαρµόζεται ένα σύστηµα επιλογής, που θα περιλαµβάνει και σύγκριση των υποψηφίων ατόµων, µε δέντρα ελέγχου. 1.4.2 Επιλογή οικογενειών. Η µέθοδος αυτή περιλαµβάνει την επιλογή ολόκληρων οικογενειών, µε κριτήριο τη µέση φαινοτυπική τους αξία. Εδώ δεν υπάρχει επιλογή ατόµων µέσα στις οικογένειες, και η αξία των ατόµων χρησιµοποιείται µόνο για τον υπολογισµό της µέσης αξίας της οικογένειας. Η µέθοδος αυτή είναι πιο αποτελεσµατική, όταν εφαρµόζεται σε περιπτώσεις που θέλουµε να βελτιώσουµε χαρακτήρες, µε µικρό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας, όπου ο φαινότυπος δεν αποτελεί καλή αντανάκλαση του γενοτύπου. Όταν η µέση φαινοτυπική αξία της οικογένειας, βασίζεται σε µεγάλο αριθµό ατόµων, τότε η διακύµανση που προέρχεται από την επίδραση του περιβάλλοντος τείνει να µειωθεί, µε αποτέλεσµα ο µέσος όρος της οικογένειας να αποτελεί καλό δείκτη εκτίµησης της γενετικής της αξίας. Η επιλογή οικογενειών από µόνη της, σπάνια χρησιµοποιείται στη δασοπονία, ακόµη και για χαρακτήρες µε µικρό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας. Αυτό γιατί, άλλες µέθοδοι, οι οποίες περιλαµβάνουν την επιλογή οικογενειών σαν ένα τµήµα τους, µπορούν να επιτύχουν µεγαλύτερο κέρδος. Τέλος η µέθοδος αυτή µπορεί να οδηγήσει 10

Επιλογή σε αύξηση των επιπέδων οµοµοιξίας επειδή ολόκληρες οικογένειες αποµακρύνονται, γεγονός που οδηγεί στη µείωση της γενετικής βάσης του πληθυσµού. 1.4.3 Επιλογή από δοκιµή απογόνων. Η µέθοδος αυτή περιλαµβάνει επιλογή µητρικών δέντρων, βασισµένη στην απόδοση των απογόνων τους. Γενικά η µέθοδος αυτή δεν αποτελεί την πρωταρχική µορφή επιλογής για τα περισσότερα προγράµµατα βελτίωσης και αυτό γιατί η όλη διαδικασία είναι εξαιρετικά χρονοβόρα. 1.4.4 Επιλογή µέσα στις οικογένειες. Σε αυτή τη µέθοδο επιλέγονται άτοµα, µε κριτήριο την απόκλιση κάθε ατόµου από τον µέσο όρο της οικογένειας στην οποία ανήκει. Στη µέθοδο αυτή δίνεται µηδενική επιλογική αξία στο φαινοτυπικό µέσο όρο της οικογένειας. Η επιλογή έχει καλύτερα αποτελέσµατα, όταν η παραλλακτικότητα µεταξύ των ατόµων της οικογένειας που οφείλεται στο περιβάλλον είναι µικρότερη, σε σύγκριση µε αυτή που οφείλεται στο γενότυπο. Από όλες τις µεθόδους επιλογής, αυτή δίνει τους πιο αργούς ρυθµούς βελτίωσης, γεγονός που αποτελεί πρόβληµα για τα περισσότερα προγράµµατα. Στην πράξη, η επιλογή οικογενειών και η επιλογή µέσα στις οικογένειες, συνδυάζονται σχεδόν πάντα. 1.4.5 Συνδυασµένη επιλογή. Η µέθοδος αυτή περιλαµβάνει δυο στάδια. Το πρώτο περιλαµβάνει επιλογή των καλύτερων οικογενειών µε βάση το φαινοτυπικό µέσο όρο τους. Κατά το δεύτερο στάδιο, επιλέγουµε τα καλύτερα άτοµα κάθε οικογένειας µε κριτήριο το µέγεθος της απόκλισης τους από το µέσο όρο της οικογένειας στην οποία ανήκουν. Η µέθοδος αυτή, είναι πιο αποτελεσµατική για χαρακτήρες µε µικρό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας και είναι η κυρίαρχη µορφή επιλογής που εφαρµόζεται στα περισσότερα προγράµµατα βελτίωσης προχωρηµένων γενεών, και αυτό γιατί µε την εφαρµογή της εξασφαλίζεται ένα γενετικό κέρδος από την επιλογή µεταξύ των οικογενειών και ένα δεύτερο από την επιλογή µέσα σε αυτές. 1.4.6 Επιλογή για πολλούς χαρακτήρες. Τα περισσότερα προγράµµατα βελτίωσης σχεδιάζονται µε τέτοιο τρόπο ώστε να επιτυγχάνεται βελτίωση σε περισσότερους από έναν χαρακτήρα ταυτόχρονα. Αυτό απαιτεί τη χρήση στην επιλογική διαδικασία, όλων των πληροφοριών που αποκτήθηκαν για τους διάφορους χαρακτήρες. Όλες οι µέθοδοι που αναπτύχθηκαν παραπάνω, µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την εξαγωγή πληροφοριών για κάθε χαρακτήρα, µόνο που πρέπει οι πληροφορίες αυτές να διαχειριστούν µε τέτοιο τρόπο, 11

Επιλογή ώστε να αναπτυχθεί ένα σχέδιο επιλογής για πολλούς χαρακτήρες. Βασικά έχουν αναπτυχθεί τρία συστήµατα που αναφέρονται στον παραπάνω σκοπό. i) Διαδοχική επιλογή. Το σύστηµα αυτό περιλαµβάνει την επιλογή ενός χαρακτήρα κάθε φορά, µέχρι η βελτίωση του να φτάσει σε ορισµένα επιθυµητά όρια. Μόλις η επιθυµητή βελτίωση έχει επιτευχθεί για τον πρώτο χαρακτήρα, που συνήθως είναι ο πιο σηµαντικός για τη βελτίωση ενός δασοπονικού είδους, αρχίζει η προσπάθεια για τη βελτίωση ενός δεύτερου, µετά ενός τρίτου κ.λ.π. Η µέθοδος αυτή σπάνια χρησιµοποιείται στη πράξη, λόγω της µεγάλης πίεσης χρόνου και της ανάγκης για βελτίωση πολλών χαρακτήρων ταυτόχρονα. Η χρήση της διαδοχικής επιλογής γίνεται σε περιπτώσεις όπου ο χαρακτήρας που θέλουµε να βελτιώσουµε είναι κρίσιµης σηµασίας, όπως είναι η ανθεκτικότητα σε προσβολές ή η ανθεκτικότητα στο ψύχος, όταν τροπικά και υποτροπικά είδη εισάγονται σε κρύα περιβάλλοντα. ii) Σύγχρονη επιλογή χαρακτήρων. Σύµφωνα µε αυτή τη µέθοδο επιλογής, ορίζεται για κάθε χαρακτήρα που µας ενδιαφέρει, µια ελάχιστη τιµή αποδοχής τους. Έτσι τα δέντρα αξιολογούνται µε βάση το κριτήριο αυτό. Αν τα δέντρα συνδυάζουν χαρακτήρες, που όλοι βαθµολογούνται πάνω από την ελάχιστη τιµή, αυτά επιλέγονται, διαφορετικά απορρίπτονται έστω και αν ένας µόνο χαρακτήρας υστερεί. Η διαδικασία αυτή αποτελεί την κυριότερη µέθοδο επιλογής για πολλούς χαρακτήρες, που χρησιµοποιείται στην πράξη στα προγράµµατα βελτίωσης. iii) Δείκτης επιλογής. Ο δείκτης επιλογής, είναι µια µορφή επιλογής για πολλούς χαρακτήρες, που συνδυάζει τις πληροφορίες για όλους τα χαρακτήρες που µας ενδιαφέρουν, σε µια ενιαία βαθµολογία. Αυτό επιτρέπει στον βελτιωτή, να αξιολογήσει και να βαθµολογήσει κάθε δέντρο ξεχωριστά, µε βάση τις γενετικές του πληροφορίες και την οικονοµική σηµασία των χαρακτήρων που θέλει να βελτιώσει. Στην πιο ολοκληρωµένη και σύνθετη µορφή του, ο δείκτης επιλογής συνδυάζει πληροφορίες για τους χαρακτήρες ενδιαφέροντος, σχετικές τόσο µε την οικογένεια όσο και µε τα άτοµα που τη συγκροτούν, σε έναν και µόνο δείκτη. Οι τιµές για κάθε δέντρο προέρχονται από εξισώσεις πολύ-συµµεταβολής, στις οποίες οι µεταβλητές εξαρτώνται από τους συντελεστές κληρονοµικής ικανότητας, τη συσχέτιση µεταξύ χαρακτήρων και την οικονοµική βαρύτητα του καθενός από αυτούς. Θεωρητικά η µέθοδος αυτή δίνει το µεγαλύτερο γενετικό κέρδος για σύγχρονη επιλογή 12

Επιλογή χαρακτήρων. Προκύπτει όµως ένα µεγάλο πρόβληµα στον καθορισµό της οικονοµικής βαρύτητας του κάθε χαρακτήρα και σε περιπτώσεις όπου οι αποκλίσεις από τις πραγµατικές τιµές ήτανε µεγάλες, το αποτέλεσµα ήταν αυτά τα προγράµµατα βελτίωσης να είναι ανεπαρκή. 1.4.7 Επανεπιλογή. Τα περισσότερα προγράµµατα βελτίωσης δασοπονικών ειδών, σχεδιάζονται µε τέτοιο τρόπο ώστε να εξασφαλίζουν συνεχόµενη πρόοδο µέσα από διαδοχικούς κύκλους επιλογής. Οι µέθοδοι επιλογής που αναφέρθηκαν προηγουµένως, επικεντρώνονται κυρίως στη βελτίωση που µπορεί να επιτευχθεί σε µια γενιά, αλλά βρίσκουν εφαρµογή και σε προγράµµατα που περιλαµβάνουν πολλές γενιές. Η διαδικασία που περιλαµβάνει πολλούς κύκλους επιλογής και βελτίωσης είναι γνωστή ως επανεπιλογή. Μια πληθώρα σχηµάτων επιλογής έχει επινοηθεί από βελτιωτές φυτών και ζώων, µε σκοπό την εκµετάλλευση της παραλλακτικότητας για γενική συνδυαστική ικανότητα και σε µερικές περιπτώσεις για ειδική συνδυαστική ικανότητα. Το σύστηµα που χρησιµοποιείται κυρίως στα προγράµµατα βελτίωσης δασοπονικών φυτών είναι γνωστό ως απλή επανεπιλογή. Με το σύστηµα αυτό, τα προγράµµατα βελτίωσης ξεκινούν µε την επιλογή ατόµων σε φυσικές συστάδες ή µη βελτιωµένες φυτείες, βάση της φαινοτυπικής τους αξίας. Στη συνέχεια, τα επιλεγµένα δέντρα διασταυρώνονται µεταξύ τους, και οι απόγονοι τους αποτελούνε πηγή για επιλογή, για τη δεύτερη γενιά βελτίωσης. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η επιλογή δεύτερης γενιάς γίνεται βάση της αξίας τόσο των οικογενειών όσο και των ατόµων που τις συγκροτούν. Έπειτα τα άτοµα που επιλέγονται διασταυρώνονται µεταξύ τους, δηµιουργώντας µια νέα γενιά απογόνων που µπορεί να χρησιµοποιηθεί σαν πηγή για επιλογή για την επόµενη γενιά. 1.5 Επιλογή µε γενετικούς δείκτες Η επιλογή µε γενετικούς δείκτες είναι µια µορφή επιλογής που εφαρµόζεται στους γενετικούς δείκτες που σχετίζονται µε ένα γνώρισµα στόχο. Η µορφή αυτή επιλογής, µπορεί να εφαρµοστεί από µόνη της ή σε συνδυασµό µε τις κλασσικές µεθόδους επιλογής και διαχωρίζεται σε δυο βασικούς τύπους: 13

Επιλογή α) Έµµεση επιλογή που βασίζεται σε δείκτες συνδεδεµένους µε QTLs. Κατά τη µέθοδο αυτή, χρησιµοποιούνται γενεαλογικοί πληθυσµοί χαρτογράφησης για την ταυτοποίηση συνδέσεων µεταξύ των µοριακών δεικτών και των γονιδιακών θέσεων ποσοτικών γνωρισµάτων (QTLs), έτσι ώστε η επιλογή ειδικών αλληλόµορφων στη γονιδιακή θέση δείκτη να οδηγεί στην αύξηση της συχνότητας των επιθυµητών αλληλόµορφων στην QTL. Η έµµεση επιλογή µε γενετικούς δείκτες είναι µια επέκταση της κλασσικής έµµεσης επιλογής, επειδή η επιλογή βασίζεται σε γενετικούς δείκτες, που είναι τα έµµεσα γνωρίσµατα, τα οποία σχετίζονται µε τα φαινοτυπικά γνωρίσµατα στόχους. Η συσχέτιση µεταξύ του δείκτη και του γνωρίσµατος στόχου προκύπτει από τη σύνδεση του δείκτη µε µια περιοχή του χρωµοσώµατος που περιέχει ένα γονίδιο που επηρεάζει το γνώρισµα στόχο, δηλαδή µια QTL. β) Άµεση επιλογή που βασίζεται σε γονίδια που κωδικοποιούν για γνωρίσµατα στόχους. Η µέθοδος αυτή επιλογής µε γενετικούς δείκτες, αφορά στην άµεση επιλογή των αλληλόµορφων των ατόµων για µια ή περισσότερες γονιδιακές θέσεις που επηρεάζουν τα πολυγονιδιακά γνωρίσµατα. Απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρµογή της είναι η γνώση σε µοριακό επίπεδο, µερικών ή όλων των γονιδίων που ελέγχουν το γνώρισµα στόχο και για να είναι επιτυχής θα πρέπει πιθανώς να εφαρµοστεί σε πολλές, αν όχι σε όλες, τις γονιδιακές θέσεις που κωδικοποιούν για πολυγονιδιακά γνωρίσµατα στόχους. Θεωρείται ως άµεση επιλογή επειδή η επιλογή γίνεται για ειδικά, επιθυµητά αλληλόµορφα σε εκείνες τις θέσεις. Τα πλεονεκτήµατα που προκύπτουν από την εφαρµογή της επιλογής µε γενετικούς δείκτες είναι σηµαντικά και περιλαµβάνουν: 1) Πρώιµη επιλογή που δυναµικά µπορεί να µειώσει τη διάρκεια του βελτιωτικού κύκλου. 2) Μείωση των δαπανών µε τη µείωση των εξόδων για την ίδρυση, συντήρηση και µέτρηση των δοκιµών απογόνων. 3) Αύξηση της έντασης επιλογής, επειδή είναι δυνατόν να εκτιµηθούν περισσότερα άτοµα στο εργαστήριο χρησιµοποιώντας γενετικούς δείκτες έναντι της φαινοτυπικής επιλογής στις υπαίθριες δοκιµές. 4) Αύξηση της σχετικής αποτελεσµατικότητας της επιλογής σε γνωρίσµατα µε χαµηλό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας. 14

Επιλογή Υπάρχει µια πληθώρα ερευνητών που παρουσιάζουν τα πλεονεκτήµατα της επιλογής µε γενετικούς δείκτες για αρκετά γνωρίσµατα όπως η αντοχή σε ασθένειες (Nance et al., 1992) και οι ιδιότητες του ξύλου (Williams and Neale, 1992). Παρόλα τα σηµαντικά πλεονεκτήµατα που προκύπτουν από την επιλογή µε γενετικούς δείκτες, υπάρχει ένας αριθµός εµποδίων για την αποτελεσµατική εφαρµογή της τα οποία περιλαµβάνουν (White et al. 2007): 1) Το µεγάλο έργο της ανίχνευσης QTLs. Αν το γνώρισµα στόχος είναι πολυγονιδιακό και υπό τον έλεγχο εκατοντάδων γονιδιακών θέσεων, µε την καθεµιά να έχει πολύ µικρή επίδραση στον φαινότυπο, υπάρχει µεγάλη δυσκολία στην ανίχνευση όλων αυτών των γονιδίων και στην ταυτοποίηση των συσχετιζόµενων γενετικών δεικτών. 2) Τη δυσκολία στον εντοπισµό διαφορετικών QTLs σε διαφορετικά περιβάλλοντα ή γενετικά υπόβαθρα που οδηγούν σε αλληλεπιδράσεις QTL x περιβάλλον (π.χ. εντοπισµός µιας QTL σε ένα συγκεκριµένο έδαφος ή κλίµα η οποία δεν εντοπίζεται σε άλλες εδαφικές και κλιµατικές συνθήκες) και αλληλεπιδράσεις QTL x γενετικό υπόβαθρο (π.χ. εντοπισµός µιας QTL σε µια οικογένεια αλλά όχι σε άλλη). 3) Το αναµενόµενο χαµηλό επίπεδο σύνδεσης µεταξύ των γενετικών δεικτών και των QTLs στα δασικά δέντρα. Συνέπεια των χαµηλών επιπέδων σύνδεσης στους πληθυσµούς των δασικών δέντρων είναι ότι οι συνδέσεις των γενετικών δεικτών µε τις QTLs θα µπορούσε να είναι σε οµόπλευρη φάση στον ένα γενότυπο και σε ετερόπλευρη σε έναν άλλο. Εποµένως η φάση σύνδεσης που εντοπίστηκε σε ένα γενότυπο δε µπορεί να υποτεθεί και για άλλους γενοτύπους, επειδή ένα ειδικό αλληλόµορφο δείκτης µπορεί να είναι συνδεδεµένο µε το επιθυµητό αλληλόµορφο QTL σε µια οικογένεια αλλά µε το ανεπιθύµητο αλληλόµορφο QTL στις άλλες οικογένειες. 1.6 Μαζική επιλογή σε γνωρίσµατα που επιδεικνύουν σταθερότητα στο χρόνο Η κλασσική µέθοδος της µαζικής επιλογής ως µέθοδος επιλογής που αναφέρθηκε προηγουµένως, δεν είναι άµεσα αξιοποιήσιµη (άµεση παραγωγή πολλαπλασιαστικού-αναδασωτικού υλικού), διότι πρέπει να εκτιµηθεί η επίδραση του περιβάλλοντος. Αυτό επιτυγχάνεται µε δυο προσεγγίσεις, είτε µε δοκιµή απογόνων σε πειράµατα κοινού περιβάλλοντος, είτε µε τη µεταφορά των επιλεγµένων ατόµων µε 15

Επιλογή βλαστικό τρόπο σε κοινό περιβάλλον. Τα παραπάνω απαιτούν χρόνο και µεγάλες οικονοµικές δαπάνες για να καταλήξουµε σε αξιόπιστα συµπεράσµατα. Μια άλλη µέθοδος µαζικής επιλογής που αίρει τα παραπάνω µειονεκτήµατα, είναι αυτή η οποία βασίζεται στην επιλογή µε βάση γνωρίσµατα που επιδεικνύουν σταθερότητα στο χρόνο. Ένα τέτοιο γνώρισµα είναι η ρητίνη για την οποία εφαρµόστηκε η µέθοδος αυτή της επιλογής στις Η.Π.Α. από τους Roberts και Strom to 2006. Οι δυο ερευνητές, εκτίµησαν την επαναληψιµότητα στην παραγωγή ρητίνης σε 10 συστάδες τριών διαφορετικών ειδών πεύκης στις Η.Π.Α. Όταν για ένα γνώρισµα ενός ατόµου, είναι εφικτές πάνω από µια µετρήσεις, η συνολική φαινοτυπική παραλλακτικότητα µέσα σε ένα πληθυσµό, µπορεί να διαχωριστεί στην παραλλακτικότητα που υπάρχει µεταξύ των ατόµων και σε αυτή µέσα στο ίδιο το άτοµο. Ο διαχωρισµός αυτός καθιστά δυνατή τη µελέτη της σχετικής συµµετοχής της κάθε µιας, στη φαινοτυπική παραλλακτικότητα του χαρακτηριστικού αυτού. Τα παραπάνω ισχύουν και για τη περίπτωση της ρητίνης. Εξαιτίας του γεγονότος, ότι η εκτίµηση της επαναληψιµότητας στους πληθυσµούς µπορεί να προέλθει από µετρήσεις σε τυχαία άτοµα, δεν απαιτούνται πειράµατα ελεγχόµενων διασταυρώσεως, µε απογόνους διαχωρισµένους µε βάση τη γνωστή δοµή των οικογενειών. Ως εκ τούτου, είναι εφικτός ο υπολογισµός της επαναληψιµότητας σε γνωρίσµατα και πληθυσµούς, όπου είναι δύσκολο να επιτευχθούν αξιόπιστες εκτιµήσεις της κληρονοµικότητας. Η επαναληψιµότητα είναι µια παράµετρος ενός πληθυσµού που παρέχει χρήσιµες πληροφορίες για έρευνες αυτού του τύπου και εκφράζεται µε το λόγο της παραλλακτικότητας µεταξύ των ατόµων, προς τη συνολική φαινοτυπική παραλλακτικότητα. Οι τιµές της κυµαίνονται από 0-1, όπου το 0 υποδεικνύει ότι η φαινοτυπική παραλλακτικότητα αποτελείται εξ ολοκλήρου από αυτή που εντοπίζεται µεταξύ των ατόµων, ενώ όταν η τιµή της είναι ίση µε 1, υποδηλώνει τέλεια επαναληψιµότητα. Οι εκτιµήσεις της επαναληψιµότητας, µπορούν να χρησιµοποιηθούν στον καθορισµό των µετρήσεων που απαιτούνται σε κάθε άτοµο, ώστε να καταστεί δυνατή η εκτίµηση του µέσου όρου του συγκεκριµένου γνωρίσµατος του ατόµου καθώς και η βελτιωτική του αξία. Παράλληλα, παρέχουν πληροφορίες για τον καθορισµό ενός ανώτατου ορίου της κληρονοµικότητας µε την ευρεία έννοια. Αυτό γιατί η επαναληψιµότητα, συµπεριλαµβάνει την µεταξύ των ατόµων παραλλακτικότητα του περιβάλλοντος σαν συστατικό του αριθµητή, ενώ οι παράµετροι της κληρονοµικότητας όχι. 16

Επιλογή Σε θέµατα δασικής γενετικής, η έννοια της επαναληψιµότητας έχει χρησιµοποιηθεί κυρίως στον καθορισµό της επαναληψιµότητας στους κλώνους, η οποία επίσης ερµηνεύεται γενικά, ως ένα ανώτατο όριο της κληρονοµικότητας µε την ευρεία έννοια. Ο τύπος αυτός της επαναληψιµότητας, εκτιµάται από µελέτες σε κλώνους, όπου παίρνονται µετρήσεις σε πολλά µέλη του κλώνου, ενώ διαφέρει από τους άλλους τύπους στον τρόπο µε τον οποίο συµµετέχει η παραλλακτικότητα που οφείλεται στο περιβάλλον. Η παράµετρος αυτή, έχει µελετηθεί για αρκετά γνωρίσµατα στα δασικά δέντρα, ανάµεσα τους βέβαια και η παραγωγή της ρητίνης. Τα αποτελέσµατα της συγκεκριµένης έρευνας υποδεικνύουν ότι η παραλλακτικότητα µεταξύ των ατόµων συµβάλει ουσιαστικά στη φαινοτυπική παραλλακτικότητας της παραγωγής της ρητίνης. Ο συντελεστής κληρονοµικότητας (CV), τόσο µεταξύ των ατόµων όσο και µέσα στο ίδιο το άτοµο, επιβεβαιώνουν τα ευρήµατα της επαναληψιµότητας. Όσον αφορά στην παραγωγή της ρητίνης όµως, το ενδιαφέρον επικεντρώνεται στην εκτίµηση της απόδοσης του κάθε ατόµου χωριστά. Στην περίπτωση που είναι εφικτές αρκετές µετρήσεις ενός γνωρίσµατος σε ένα άτοµο, ο µέσος όρος αποτελεί ιδανικό µέτρο της αξίας του δέντρου αυτού. Ο αριθµός των µετρήσεων που απαιτούνται σε κάθε άτοµο, για την αξιόπιστη εκτίµηση αυτής της παραµέτρου δίνεται από τη σχέση: n m 1-r/ E m Η ανισότητα στη σχέση αυτή καταδεικνύει ότι ο απαραίτητος αριθµός µετρήσεων για ένα γνώρισµα, εξαρτάται από το µέγιστο αποδεκτό σφάλµα της διακύµανσης, σχετικό στη φαινοτυπική παραλλακτικότητα (E m ) και από την επαναληψιµότητα (r) που παρουσιάζει το γνώρισµα αυτό. Ο λόγος της παραλλακτικότητας που υπάρχει µεταξύ των ατόµων, προς τη φαινοτυπική παραλλακτικότητα, µας δείχνει ότι όταν η επαναληψιµότητα είναι υψηλή, το κέρδος από το να πάρουµε περισσότερες από λίγες µετρήσεις, είναι χαµηλό. Αντίστοιχα, όταν η επαναληψιµότητα είναι χαµηλή, απαιτούνται περισσότερες µετρήσεις για την επίτευξη µεγαλύτερης ακρίβειας. Έτσι, µε βάση τα αποτελέσµατα τους, οι δυο ερευνητές προτείνουν ότι δυο µετρήσεις σε κάθε δέντρο, είναι ικανές για να εκτιµηθεί η παραγωγή του σε ρητίνη. Για εφαρµογές που απαιτούνται εκτιµήσεις µε αρκετά υψηλή ακρίβεια ή όταν η επαναληψιµότητα είναι πολύ χαµηλή, µπορεί να χρειαστούν 4 µετρήσεις σε κάθε άτοµο. Πάντως η εφαρµογή άνω των 4 µετρήσεων δεν έχει σηµασία, αφού το κέρδος που επιτυγχάνεται είναι πολύ µικρό. 17

Επιλογή Ένας συνδυασµός των παραπάνω µεθόδων τεχνητής επιλογής είναι το πείραµα που πραγµατοποιήθηκε στην Ισπανία, που συνδυάζει τη φαινοτυπική επιλογή µε το βλαστικό πολλαπλασιασµό και τη σταθερότητα της απόδοσης τους στα µέλη του κλώνου στο είδος Pinus pinaster Ait.(Tadesse et al., 2001). Οι ερευνητές θέλησαν να αξιολογήσουν την απόδοση σε ρητίνη των µελών ενός κήπου κλώνων, σε σχέση µε τα µητρικά άτοµα (δότες), που είχαν επιλεγεί µε βάση το φαινότυπο τους ως προς το συγκεκριµένο χαρακτηριστικό στο πεδίο. Για το σκοπό αυτό εφάρµοσαν τη τεχνική της µικρο-ρητίνευσης (mιcro-chipping) σε 17 κλώνους, µε 4 µέλη κατά µέσο όρο ο καθένας. Στα αποτελέσµατα τους καταγράφηκε µια µετρίως ισχυρή συσχέτιση στη παραγωγή των µητρικών ατόµων (δότες) και στα µέλη των κλώνων τους (Clonal Repeatability Value r=0,63 µε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%). Ακόµη παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των κλώνων και µια υψηλή τιµή του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας στα µέλη των κλώνων, ως προς την απόδοση σε ρητίνη (h 2 =0,5). Τα αποτελέσµατα αυτά συµφωνούν µε αυτά που αναφέρονται από τον Kraus (1965) (r=0,661), καθώς και των Squillace και Gansel το 1976 (r=0.61). Η ισχυρή συσχέτιση µεταξύ των µητρικών φυτών και των µελών των κλώνων τους, επιβεβαιώνουν την αποτελεσµατικότητα της αξιολόγησης στο πεδίο, των υποψηφίων για επιλογή ατόµων και τη πιθανή χρήση αυτής στην επιλογή υψηλοαποδοτικών ατόµων για προγράµµατα βελτίωσης. Η υψηλή τιµή του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας που υπολογίστηκε (h 2 =0,5) είναι αντίστοιχη µε τις τιµές άλλων ερευνητών που εργάστηκαν σε άλλα είδη πεύκης, όπως οι Squillace και Bengston (1961), Alvarez et al. (1987) και Psawrayl et al. (1996) που ανεφέρουν τιµές h 2 =0,45-0,9, 0,67 και 0,37 αντίστοιχα. Ακόµη µια προσπάθεια, έγινε και στις Η.Π.Α. από τους Goddart και Peters (1965), στο είδος Pinus elliottii, µε σκοπό τη µελέτη της απόδοσης σε ρητίνη των µελών των κλώνων ενός κήπου, σε σχέση µε αυτή των µητρικών φυτών που είχαν επιλεγεί µε βάση την αύξηση και την ποιότητα τους. Αφού επέλεξαν τελικά 531 εµβολιασµένα δέντρα, που αντιστοιχούσαν σε 373 διαφορετικούς κλώνους µε 2 µέλη ο καθένας και σε 215 κλώνους µε 1 µέλος, εφάρµοσαν την τεχνική της µικρορητίνευσης. Με τη ανάλυση των δεδοµένων από τους 373 κλώνους, των µητρικών ατόµων αλλά και του πληθυσµού σύγκρισης, παρατήρησαν µια αυξηµένη παραγωγή στα επιλεγµένα άτοµα και στα µέλη των κλώνων τους, σε σχέση µε τον πληθυσµό σύγκρισης. Παράλληλα παρατήρησαν σηµαντικές διαφορές στην απόδοση σε ρητίνη µεταξύ των κλώνων, ενώ οι υπολογισµοί υποδεικνύουν ότι το 67% της διακύµανσης 18

Επιλογή στη παραγωγή οφείλεται στην κληρονοµικότητα. Από τους 373 το 4,3% είχε απόδοση 1,82 φορές πάνω από το µέσο όρο του πληθυσµού. Η ικανότητα παραγωγής που παρουσίασαν τα µητρικά φυτά δότες, που επιλέχθηκαν για την αύξηση και την ποιότητα τους, µεταφέρθηκε και στα µέλη των κλώνων τους. 1.7 Εφαρµογή των µεθόδων επιλογής στη δασοπονία Η εφαρµογή των µεθόδων της τεχνητής επιλογής στη δασοπονία άρχισε πολύ αργότερα σε σχέση µε τη γεωργία και την κτηνοτροφία. Έτσι η πείρα που είχε αποκτηθεί έως τότε από άλλους οργανισµούς, αξιολογήθηκε και προσαρµόστηκε στις ιδιαιτερότητες των δασοπονικών ειδών. Παρακάτω παρουσιάζονται οι µέθοδοι της τεχνητής επιλογής, όπως εφαρµόζονται στη δασοπονία. 1.7.1 Φυσική αναγέννηση Όταν σε µια συστάδα που πρόκειται να αναγεννηθεί, επιλέγουµε τα δέντρασπορείς, εφαρµόζουµε επί της ουσίας µια µορφή µαζικής επιλογής. Έχοντας ως κριτήριο τους χαρακτήρες που θέλουµε να βελτιώσουµε καθώς και τον τρόπο κληρονόµησης τους, επιλεγούµε τα άτοµα-σπορείς εξασφαλίζοντας βέβαια οµοιόµορφη κατανοµή τους στο χώρο. Τα περιθώρια όµως για επίτευξη γενετικού κέρδους από µια τέτοια επιλογή είναι περιορισµένα, ιδιαίτερα για χαρακτήρες µε µικρό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας. Ορισµένοι όµως χαρακτήρες όπως η µορφή, η διχάλωση, η ευθυτένεια και η ανθεκτικότητα στις προσβολές, που έχουνε υψηλό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας, είναι δυνατόν να παρουσιάσουν κάποια βελτίωση στην επόµενη γενιά, αν επιλεχθούν σωστά τα δέντρα σπορείς. 1.7.2 Συλλογή αναγεννητικού υλικού από φυσικά δάση και τεχνητές φυτείες Οι δυνατότητες που υπάρχουν για την ικανοποίηση των αναγκών µας σε προµήθεια σπόρων, όταν αυτές δεν µπορούν να ικανοποιηθούν από δέντρα που έχουνε προκύψει από ένα πρόγραµµα γενετικής βελτίωσης είναι δυο. Συλλογή από επιλεγµένα δέντρα ή επιλογή και διαχείριση συστάδων σποροπαραγωγής. 1.7.2.1 Συλλογή σπόρων από επιλεγµένα δέντρα Στη περίπτωση αυτή επιλέγονται για τη συλλογή σπόρων, τα δέντρα της συστάδας τα οποία ανταποκρίνονται σε όλες τις προδιαγραφές που αναφέρονται στην 19

Επιλογή αύξηση, της µορφή του κορµού, το πάχος και τη διάταξη των κλαδιών και την ανθεκτικότητα απέναντι στις προσβολές. Η βελτίωση όµως που αναµένεται είναι περιορισµένη, γιατί η γύρη που έχει επικονιάσει τα άνθη των δέντρων που επιλέξαµε είναι άγνωστης προέλευσης. Με τη µέθοδο όµως αυτή εξασφαλίζουµε την ικανότητα προσαρµογής στο περιβάλλον, αφού τα δέντρα που έχουνε επιλεγεί είναι τα καλύτερα στις περιοχές που αναπτύσσονται. Στη περίπτωση των ειδών που πολλαπλασιάζονται βλαστικά, η επιλογή αυτή µπορεί να έχει πολύ θετικά αποτελέσµατα.. Έτσι από τα άτοµα που έχουνε επιλεγεί µε βάση τα κριτήρια που αναφέρθηκαν παραπάνω, συλλέγονται µοσχεύµατα τα οποία αναπαράγουν στο φυτώριο τους αρίστους φαινοτύπους, δηµιουργώντας κλώνους για άµεση χρήση. 1.7.2.2 Συστάδες σποροπαραγωγής Για τη δηµιουργία συστάδων σποροπαραγωγής, απαιτούνται δυο φάσεις επιλογής. Κατά την πρώτη φάση επιλέγεται η καλύτερη συστάδα από φυσικά δάση ή φυτείες, η οποία έχει φθάσει σε ηλικία παραγωγής σπόρων και κατά τη δεύτερη φάση αποµακρύνονται όλα τα ανεπιθύµητα άτοµα αυτής. Με τον τρόπο αυτό ο σπόρος που θα πάρουµε θα προέρχεται από τη σταυρογονιµοποίηση των καλύτερων δέντρων της συστάδας. Οι συστάδες που επιλέγονται θα πρέπει να είναι νεαρές και όσο το δυνατόν οµήλικες, ώστε η επιλογή των αρίστων φαινοτύπων να είναι εύκολη και η αντίδραση στις αραιώσεις που θα ακολουθήσουν, αποτελεσµατική. Η γενετική βελτίωση που επιτυγχάνεται µε την ίδρυση συστάδων σποροπαραγωγής δεν είναι αξιόλογη γιατί η ένταση της επιλογής είναι µικρή και γιατί δεν υπάρχει καµία πληροφορία για το γενότυπο των δέντρων σπορέων. Εξασφαλίζεται όµως η γνώση της προέλευσης των σπόρων που θα χρησιµοποιηθούν για την αναδάσωση µιας περιοχής 1.7.3 Κήποι σποροπαραγωγής Ως κήπος σποροπαραγωγής, ορίζεται µια φυτεία από επιλεγµένους κλώνους ή απογόνους επιλεγµένων δέντρων, που προορίζεται για µαζική παραγωγή σπόρων και αποτελεί την πιο συνηθισµένη διαδικασία που εφαρµόζεται στην πράξη για την παραγωγή µεγάλων ποσοτήτων, γενετικά βελτιωµένων σπόρων. 1.7.3.1 Κήπος σποροπαραγωγής µε κλώνους Για τη δηµιουργία ενός κήπου σποροπαραγωγής µε κλώνους επιλέγουµε, µε κριτήριο το µέσο όρο της συστάδας ή τα άτοµα σύγκρισης, τα δέντρα που 20

Επιλογή παρουσιάζουν µια σαφή και σηµαντική υπεροχή, στους χαρακτήρες που θέλουµε να βελτιώσουµε. Η αναζήτηση των αρίστων φαινοτύπων, καλύπτει µια εκτεταµένη περιοχή και γίνεται µε πολύ αυστηρά κριτήρια. Με τη διαδικασία αυτή, η ένταση της επιλογής αυξάνεται στο µεγαλύτερο δυνατό βαθµό, όπως επίσης και η φαινοτυπική απόκλιση εξαιτίας του γεγονότος ότι η επιλογή εφαρµόζεται σε µια ποικιλία περιβαλλόντων. Για τους ίδιους λόγους, ο συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας µειώνεται, εξακολουθεί όµως να είναι αρκετά υψηλός για χαρακτήρες που βρίσκονται κάτω από ισχυρό γενετικό έλεγχο. Μετά από την επιλογή των αρίστων φαινοτύπων, ακολουθεί η συγκέντρωση τους σε µια θέση, µε τη χρήση της µεθόδου του βλαστικού πολλαπλασιασµού, και η δηµιουργία του κήπου. Η φύτευση των κλώνων αυτών, σε µια ορισµένη περιοχή θα δηµιουργήσει ένα σποροπαραγωγό κήπο κλώνων. Το σχέδιο εγκατάστασης θα πρέπει να είναι τέτοιο, ώστε να εξασφαλίζεται η επικονίαση µεταξύ των αρίστων φαινοτύπων. Το γενετικό κέρδος που θα προκύψει σε έναν τέτοιο κήπο, υπολογίζεται ότι θα είναι διπλάσιο από εκείνο που θα προέκυπτε, αν η συλλογή των σπόρων γινόταν από τα επιλεγµένα άτοµα στο δάσος. Αυτό γιατί στη περίπτωση αυτή, οι αρσενικοί γονείς θα ήταν άγνωστοι ενώ στον κήπο είναι και αυτοί άριστοι φαινότυποι. 1.7.3.2 Σποροπαραγωγός κήπος σποροφύτων Για τη δηµιουργία ενός σποροπαραγωγού κήπου σποροφύτων, το αρχικό στάδιο επιλογής των άριστων φαινοτύπων είναι ακριβώς όµοιο µε αυτό που εφαρµόζεται στον σποροπαραγωγό κήπο κλώνων, µόνο που εδώ δεν συλλέγονται εµβόλια αλλά σπόροι. Οι σπόροι αυτοί µπορεί να προέρχονται από ελεύθερη επικονίαση ή και από ελεγχόµενες διασταυρώσεις µεταξύ των αρίστων φαινοτύπων. Αρχικά δηµιουργούνται στο φυτώριο οικογένειες σποροφύτων από κάθε άριστο φαινότυπο χωριστά. Η σπορά και η ανάπτυξη των σπόρων γίνεται σε χάρτινα δοχεία που περιέχουν κατάλληλο µίγµα, µε σκοπό την εξασφάλιση οµοιόµορφων συνθηκών ανάπτυξης. Έπειτα ακολουθεί εγκατάσταση του κήπου σε θέση που βρίσκεται σε περιβάλλον όµοιο µε αυτό που θα χρησιµοποιηθούν οι σπόροι που θα παραχθούν. Όταν τα φυτά αναπτυχθούν και οι διαστάσεις τους γίνουν τέτοιες που να επιτρέπουν την αξιολόγηση των χαρακτήρων για τους οποίους έγινε η επιλογή, ακολουθεί αραίωση της φυτείας µε κριτήριο το µέσο όρο όλων των οικογενειών. Αυτές που υπερέχουν σε ποσοστό το οποίο έχει καθοριστεί πριν την εγκατάσταση της 21

Επιλογή φυτείας, είναι και αυτές που τελικά επιλέγονται ενώ οι υπόλοιπες αποµακρύνονται µε αποψιλωτική υλοτοµία. Σε αυτές που παρέµειναν, επιλέγεται σε κάθε πειραµατικό τεµάχιο ένα δέντρο που υπερέχει από τα άλλα και τα υπόλοιπα αποµακρύνονται. Τα δέντρα που τελικά θα παραµείνουν συγκροτούν τον κήπο σποροφύτων. Με τη διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται αρχικά δοκιµή απογόνων και µετά από την αραίωση δηµιουργείται ο κήπος σποροπαραγωγής. Η γενετική πρόοδος που θα προκύψει τελικά εξαρτάται από το αν οι οικογένειες προήλθαν από ελεύθερη επικονίαση ή σταυρεπικονίαση. Στην πρώτη περίπτωση εξασφαλίζεται ένα γενετικό κέρδος από τη µαζική επιλογή (µισό από αυτό των κήπων κλώνων), ένα δεύτερο από την επιλογή µεταξύ των οικογενειών και ένα τρίτο από την επιλογή µέσα στις οικογένειες. Στη περίπτωση που οι οικογένειες προήλθαν από σταυρεπικονίαση, προκύπτει ένα γενετικό κέρδος από τη µαζική επιλογή (ίσο µε αυτό των κήπων κλώνων), ένα δεύτερο από την επιλογή των οικογενειών και ένα τρίτο από αυτή µέσα στις οικογένειες. 1.7.4 Είδη που πολλαπλασιάζονται βλαστικά Για τα δασοπονικά είδη που ο βλαστικός πολλαπλασιασµός αποτελεί την κύρια µέθοδο αναπαραγωγής τους, όπως είναι οι λεύκες, τα πλατάνια και άλλα, η αρχική µαζική επιλογή γίνεται µε τον ίδιο τρόπο που περιγράφηκε για είδη στα οποία ο βασικός τρόπος αναπαραγωγής είναι οι σπόροι. Μετά τη φαινοτυπική επιλογή των ατόµων που παρουσιάζουν τους επιθυµητούς χαρακτήρες ακολουθεί συλλογή µοσχευµάτων που φυτεύονται στο φυτώριο για παραγωγή δενδρυλλίων. Τα δενδρύλλια αυτά χρησιµοποιούνται στη συνέχεια για την εγκατάσταση πειραµατικών φυτειών στις περιοχές που το επιλεγµένο υλικό πρόκειται να χρησιµοποιηθεί για φυτείες παραγωγής. Οι πειραµατικές φυτείες, που αποτελούν στην ουσία φυτείες κλώνων, γίνονται µε στατιστικό σχεδιασµό, ο οποίος πρέπει να επιτρέπει την αξιολόγηση τους και τη δυνατότητα αύξησης τους σε µονοκλωνικές ή πολυκλωνικές φυτείες. Μετά την αξιολόγηση τους, οι κλώνοι που υπερέχουν σε σχέση µε τους µάρτυρες, επιλέγονται και χρησιµοποιούνται για την συλλογή αναπαραγωγικού υλικού (µοσχεύµατα). Χαρακτηριστικό της µεθόδου αυτής, αποτελεί το γεγονός ότι δεν ακολουθεί δεύτερος κύκλος επιλογής και ότι η βελτίωση που αναµένεται είναι θεαµατική αφού χρησιµοποιείται όλη η γενετική παραλλακτικότητα των γονιδίων. 22

Επιλογή 1.7.5 Τράπεζα κλώνων Από την φυσική εξάπλωση ενός είδους σε µια χώρα, επιλέγονται άριστοι φαινότυποι µε κριτήρια πιο πλατιά από αυτά που λαµβάνονται υπόψη για την εγκατάσταση ενός κήπου σποροπαραγωγής. Από τα δέντρα που επιλέγονται, τα οποία είναι πολύ περισσότερα σε αριθµό από αυτά που συγκροτούν ένα κήπο κλώνων, συλλέγονται µοσχεύµατα τα οποία φυτεύονται κατά κανόνα σε δυο περιοχές για λόγους ασφάλειας. Μια τέτοια φυτεία που περιλαµβάνει όλο το άριστο γενετικό υλικό ενός δασοπονικού είδους µιας χώρας, λέγεται τράπεζα κλώνων ή τράπεζα γονιδίων του είδους και προσφέρει τις εξής δυνατότητες: α) Τη δοκιµή των απογόνων των ατόµων της τράπεζας είτε από ελεύθερη επικονίαση είτε από σταυρεπικονίαση, για τον υπολογισµό της γενικής και της ειδικής συνδυαστικής ικανότητας τους αντίστοιχα. β) Τη σύγκριση της γενετικής ποιότητας των κλώνων στους κήπους µε αυτούς που υπάρχουν στη τράπεζα. γ) Τη δηµιουργία κήπου για τη βελτίωση ενός συγκεκριµένου χαρακτήρα, µε βάση το γενετικό υλικό που υπάρχει στην τράπεζα, χωρίς να απαιτηθεί επιλογή στα φυσικά δάση. δ) Την πιο αποτελεσµατική διατήρηση και προστασία των γενετικών πόρων ενός είδους. 1.8 Η παραγωγικότητα σε ρητίνη και η χηµική σύσταση της, σε σχέση µε την ανθεκτικότητα απέναντι σε προσβολές από βιοτικούς παράγοντες. Ως γνωστών, η ρητίνη αποτελεί τον βασικότερο αµυντικό µηχανισµό των κωνοφόρων, θέτοντας στο σηµείο τραυµατισµού ένα εµπόδιο, απέναντι στην αποξήρανση του ιστού και στην επίθεση των εντόµων και των παθογόνων (Smith 1966, Shain 1967, Reid et al. 1987). Ειδικά στις νοτιο-ανατολικές Η.Π.Α., το έντοµο Dendroctonus frontalis- Zimmer-mam, ευθύνεται για τεράστιες ζηµιές, µιας και αποτελεί το πιο καταστροφικό έντοµο για τα δάση πεύκης της περιοχής (Hodges et al. 1979, Cook and Hain 1987, Strom et al. 2002). Άλλα έντοµα που προσβάλλουν τη πεύκη στις περιοχές αυτές, είναι το Dendroctonus brevicomis στο είδος Pinus ponderosa (Smith, 1969) και το Dioryctria splendidella στο είδος Pinus pinaster (Bercovici, 1974) ενώ σηµαντικές είναι και οι προσβολές από τον µύκητα Cronartium fusiform Hedge στα είδη Pinus elliottii και Pinus taeda (Rockwood 1973,1974). 23

Επιλογή Έχει παρατηρηθεί ότι δέντρα τα οποία παράγουν µεγάλες ποσότητες ρητίνης, φαίνονται να είναι πιο ικανά στο να αποτρέψουν τις προσβολές των εντόµων (Strom et al. 2002, Roberds et al. 2003, Roberds and Strom 2006). Η αυξηµένη παραγωγή σε ρητίνη θεωρείται ότι αποτρέπει τις προσβολές των εντόµων µε δυο τρόπους : 1) µε το να λειτουργεί σαν καθαριστικό στο σηµείο τραυµατισµού, το οποίο εκδιώκει ή παγιδεύει τα επιτιθέµενα έντοµα (Popp et al. 1991) και 2) µε το να ενισχύει και να επιταχύνει τη µεταφορά, των τοξικών για το έντοµο συστατικών της ρητίνης, στο σηµείο προσβολής (Coyne and Lott, 1976). Παράλληλα, η αυξηµένη παραγωγή ρητίνης δρα ακόµη και ως ανασταλτικός παράγοντας, στην αναπαραγωγική διαδικασία του εντόµου (Reeve et al., 1995). Ο Mirov (1928), µετρώντας τη παραγωγή ρητίνης, στο είδος Pinus ponderosa σε 4 περιοχές της Ν.Α, Καλιφόρνιας, αναφέρει ότι οι συστάδες που είχαν κατά µέσο όρο µεγαλύτερη παραγωγή ρητίνης, παρουσίασαν µεγαλύτερη ανθεκτικότητα στις προσβολές εντόµων, σε σχέση µε συστάδες που παρουσίασαν χαµηλή παραγωγή. Ακόµη ο Callaham (1955), αναφέρει ότι άτοµα του ίδιου µε το παραπάνω είδος, τα οποία παρουσίαζαν µικρή χρονική περίοδο εκροής της ρητίνης, ήταν και πιο ευπαθή στις προσβολές. Ο ίδιος, πιθανολογεί ότι η γρήγορη µείωση στο ρυθµό εκροής, δηµιουργεί συνθήκες που επιτρέπουν στο έντοµο να τραφεί και να αναπαραχθεί. Από την άλλη µεριά, η παρατεταµένη εκροή ρητίνης από τα ανθεκτικά άτοµα, εξαντλεί, απωθεί και παγιδεύει τα έντοµα, εµποδίζοντας την ωοτοκία. Ο Smith (1969), σηµειώνει ότι στο είδος Pinus ponderosa, η εκκρινόµενη ποσότητα ρητίνης αλλάζει κατά τη διάρκεια του 24ώρου, στα διάφορα τµήµατα του δέντρου και ότι παρουσιάστηκε σηµαντικός αριθµός προσβολών στα τµήµατα εκείνα, που η εκκρινόµενη ποσότητα ήταν µικρή. Στο ίδιο συµπέρασµα κατέληξε και ο Mason (1969), ο οποίος αναφέρει ότι στο είδος Pinus taeda L., τα άτοµα που παρουσιάζουν χαµηλές τιµές του λόγου της παραγωγής της ρητίνης, στη µονάδα του χρόνου, είναι και τα πιο ευπαθή στις προσβολές του Ips grandicollis Einghh. Γενικά, η ευπάθεια απέναντι στις προσβολές από το D.frontalis, αλλά και από τα υπόλοιπα έντοµα, επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες. Είναι ευρέως διαδεδοµένο, ότι όλα τα δέντρα που ανήκουν στα ευπαθή στις προσβολές είδη και οποιουδήποτε µεγέθους, είναι πιθανό να προσβληθούν από κάποιο έντοµο. Παρόλα αυτά, κάποια µεµονωµένα άτοµα, θεωρούνται πιο ανθεκτικά από κάποια άλλα. Η ιδιότητα τους αυτή, είναι αποτέλεσµα ενός συνδυασµού παραγόντων, µε τον σηµαντικότερο από όλους να είναι 24

Επιλογή η αυξηµένη παραγωγή ρητίνης (Hodges et al. 1977, Lorio et al. 1995, Reeve et al. 1995). Εκτός από την παραγωγή, ένας άλλος παράγοντας που έχει προταθεί ότι συµβάλει στην ανθεκτικότητα των πεύκων απέναντι στις προσβολές, είναι και τα χηµικά συστατικά της ρητίνης (Coyne and Lott 1976, Raffa et al. 1993). Το βασικότερο πτητικό συστατικό της ρητίνης είναι το α-πινένιο (α-pinene), το οποίο αποτελεί έναν ισχυρό συνεργάτη των φεροµονών του D. frontalis (Renwick and Vite, 1969). Το λιµονένιο (limonene) είναι το πιο τοξικό από τα µονοτερπένια και εµπλέκεται στην ανθεκτικότητα απέναντι στις προσβολές των εντόµων και σε ασθένειες. Σε µια άλλη έρευνα των Hayes et al. (1994b), αναφέρεται ότι το συστατικό 4-allylanisole της ρητίνης, φαίνεται να είναι ένα ενεργό, χηµικό αποτρεπτικό για το έντοµο D. frontalis. Συσχετίσεις έχουν αναφερθεί ακόµη και µεταξύ κάποιων συστατικών της ρητίνης, µε τους τραυµατισµούς που προέρχονται από τα ζώα. Οι Santamour et al. (1963), σηµειώνουν πως το 3-δ-καρένιο, συνδέεται µε την ανθεκτικότητα των πεύκων απέναντι στους ποντικούς, ενώ το α-πινένιο µε την ευπάθεια τους. Παράλληλα, από πολλούς ερευνητές υποστηρίζεται η ισχυρή συσχέτιση που παρουσιάζει η παραγωγή της ρητίνης, µε την αύξηση και τη ζωτικότητα των δέντρων (Squillace 1965, Kossuth et al. 1982). Είναι εύλογο λοιπόν, µε δεδοµένο ότι όλα τα παραπάνω γνωρίσµατα ελέγχονται γενετικά και παρουσιάζουν υψηλή κληρονοµικότητα, ότι η εφαρµογή των µεθόδων της επιλογής µπορεί να επιφέρει σηµαντική αύξηση του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας και για τα 3 γνωρίσµατα. Έτσι επιλέγοντας δέντρα µε βάση την απόδοση σε ρητίνη, τη µεταφορά και εγκατάσταση τους µε βλαστικό τρόπο σε τεχνητές φυτείες, είναι δυνατή η παραγωγή βελτιωµένου πολλαπλασιαστικού υλικού και σπόρου, που θα συνδυάζουν και τα 3 παραπάνω γνωρίσµατα 1.9 Βιβλιογραφική ανασκόπηση Η εφαρµογή των µεθόδων της τεχνητής επιλογής που προαναφέρθηκαν, από µια πληθώρα επιστηµόνων σε όλο τον κόσµο, έχει οδηγήσει στην επίτευξη θεαµατικών αποτελεσµάτων πάνω σε ένα αρκετά µεγάλο αριθµό χαρακτήρων οικονοµικού ενδιαφέροντος. 25

Επιλογή Ο Matziris (2000) αναφέρει ότι η εφαρµογή της φαινοτυπικής επιλογής σε φυσικές συστάδες χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis) ακολουθούµενη από εγκατάσταση κήπου κλώνων και δοκιµή απογόνων από ελεύθερη επικονίαση, είναι µια πολύ επικερδής διαδικασία αφού µε τη µέθοδο αυτή επιτεύχθηκε γενετικό κέρδος 7,9% για το ύψος, 10,38% για τη στηθιαία διάµετρο και 21,25% για την αύξηση σε όγκο. Παράλληλα ο ίδιος συγγραφέας (Matziris 2005), µε την εφαρµογή της ίδιας µεθόδου στο είδος Pinus nigra, αναφέρει επίτευξη γενετικού κέρδους 8% για το ύψος, 11% για τη στηθιαία διάµετρο και 32% για την αύξηση σε όγκο. Ακόµη οι Krushe et al. (1980), αναφέρουν ότι µε την εγκατάσταση κήπου κλώνων της Pinus sylvestris, τη δοκιµή των απογόνων τους από ελεύθερη επικονίαση και την µετέπειτα επιλογή των καλύτερων κλώνων σε ποσοστό 50%, το γενετικό κέρδος που µπορεί να επιτευχθεί είναι 10% για την αύξηση σε ύψος και 13% για την αύξηση της στηθιαίας διαµέτρου. Όσον αφορά στη παραγωγή κώνων οι Mutke et al (2005), αναφέρουν ότι µε την εγκατάσταση κήπου κλώνων από υψηλοαποδοτικά σε παραγωγή κώνων άτοµα της Pinus pinea και µετέπειτα επιλογή των πιο παραγωγικών σε ποσοστό 10% επιτυγχάνεται γενετικό κέρδος 12% για τον χαρακτήρα αυτό. Ένας ακόµη χαρακτήρας στον οποίο πραγµατοποιήθηκε βελτίωση, είναι και η αύξηση στην ανθεκτικότητα απέναντι σε διάφορες ασθένειες και προσβολές. Έτσι οι Toda και Kurinobu (2002), αναφέρουν αύξηση στην ανθεκτικότητα των απογόνων επιλεγµένων κλώνων των ειδών Pinus densiflora και Pinus thunbergii σε ποσοστό 18% και 35% αντίστοιχα, απέναντι στις προσβολές του νηµατώδους Bursaphelenchus xylophilis. Όσον αφορά τη ρητίνη, έχουν γίνει διάφορες προσπάθειες για την γενετική βελτίωση της παραγωγής της, σε πολλές χώρες ανά τον κόσµο και αυτό λόγω κυρίως της µεγάλης κοινωνικο-οικονοµικής της αξίας. Το πρώτο πρόγραµµα βελτίωσης της παραγωγής της ρητίνης ξεκίνησε από την υπηρεσία δασών των Η.Π.Α. (USDA Forest Service), όπως αναφέρεται από τον Dorman (1945), µε την επιλογή παραγωγικών σε ρητίνη ατόµων του είδους Pinus elliottii και την εγκατάσταση κήπου κλώνων µε τη τεχνική των µοσχευµάτων. Έπειτα η προσπάθεια αυτή επεκτάθηκε και σε άλλες χώρες µε διαφορετικά είδη του γένους Pinus. Τα κυριότερα κίνητρα για την έναρξη των προσπαθειών αυτών αποτέλεσαν και συνεχίζουν να αποτελούν ο υψηλός συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας για παραγωγή ρητίνης και το υψηλό γενετικό κέρδος που αναµένεται από την επιλογή και τη βελτίωση υψηλο-αποδοτικών γενοτύπων. Οι Squillace και Bengston (1961), δηλώνουν ότι γενετικό κέρδος για την 26

Επιλογή παραγωγή ρητίνης της τάξης του 55%, είναι δυνατόν να επιτευχθεί µε φαινοτυπική επιλογή σε φυσικές συστάδες, ενώ το ποσοστό αυτό µπορεί να αυξηθεί σε 70%, αν ακολουθήσει φαινοτυπική επιλογή σε φυτείες που εγκαταστάθηκαν µε σπόρους που προήλθαν από διασταυρώσεις ατόµων µε παραγωγή διπλάσια από αυτή του µέσου όρου. Επιπλέον, ο Squillace (1965) αναφέρει ότι η παραγωγή σε ρητίνη και ο ρυθµός ανάπτυξης ενός δέντρου του είδους Pinus elliottii, συσχετίζονται γενετικά τουλάχιστον σε ένα µέτριο βαθµό, γεγονός που σηµαίνει ότι η γενετική βελτίωση του ενός χαρακτήρα θα συνεπάγεται και βελτίωση του άλλου. Τα αποτελέσµατα αυτά συµφωνούν και µε τις παρατηρήσεις του Peters (1971) καθώς και των Goddard και Peters (1965), οι οποίοι διέκριναν άµεση συσχέτιση µεταξύ παραγωγής ρητίνης, ζωτικότητας και ανάπτυξης στο ίδιο είδος και προτείνουν ότι η παραγωγή δενδρυλλίων που συνδυάζουν και τους τρεις αυτούς χαρακτήρες, µπορεί να προέλθει από επιλογή ατόµων για υψηλή σε ρητίνη παραγωγή, από άτοµα τα οποία είχαν αρχικά επιλεγεί για την καλή τους ανάπτυξη και την µεγάλη τους ζωτικότητα. Το παραπάνω γεγονός επιβεβαιώνεται και από τους Roberds et al. (2003) οι οποίοι αναφέρουν ότι η εφαρµογή επιλογής για βελτίωση της αύξησης στο είδος Pinus taeda L., θα έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της παραγωγής σε ρητίνη. Παράλληλα οι McReynolds και Gansel (1985) αναφέρουν για το ίδιο είδος, αύξηση της παραγωγής σε ρητίνη µεγαλύτερη από 60% σε µια γενιά επιλογής. Μια ακόµη προσπάθεια γενετικής βελτίωσης όσον αφορά στην αύξηση σε παραγωγή ρητίνης, και η οποία βρίσκεται ακόµη σε εξέλιξη και λαµβάνει χώρα στην Ισπανία, αναφέρεται από τους Tadesse et al. (2001). Η προσπάθεια αυτή βασίστηκε στην επιλογή υψηλοαποδοτικών σε παραγωγή ρητίνης ατόµων του είδους Pinus pinaster και στη συνέχεια ακολούθησε εγκατάσταση φυτειών για δοκιµή απογόνων από σταυρεπικονίαση καθώς και τράπεζας κλώνων. Οι παραπάνω µελέτες επιβεβαίωσαν το γεγονός ότι ελεγχόµενες διασταυρώσεις µεταξύ ατόµων υψηλο-αποδοτικών σε παραγωγή ρητίνης, οδηγούν σε απογόνους µε µεγαλύτερη παραγωγή από αυτούς που προέρχονται από ελεύθερη επικονίαση. Μια αντίστοιχη προσπάθεια που εξελίσσεται στην Ινδία πάνω στο είδος Pinus roxburghii Sargent αναφέρεται και από τους Sharma et al. (1998) και έχει ως στόχο την αποτίµηση των απογόνων από ελεύθερη επικονίαση, ατόµων µε υψηλή παραγωγή ρητίνης, σε ότι έχει να κάνει µε την συγκέντρωση των τερπενίων του τερεβινθελαίου, τη γενετική διακύµανση, τη κληρονοµικότητα και το γενετικό κέρδος, για την ανάπτυξη περαιτέρω στρατηγικών βελτίωσης που αναφέρονται στο χαρακτήρα αυτό. Σε ότι έχει να κάνει µε την 27

Επιλογή ποιότητα της ρητίνης, οι Squillace και Fisher (1966) παρέχουν αποδείξεις για την κληρονοµικότητα της σύνθεσης του τερεβινθελαίου του είδους Pinus elliottii, ενώ οι McReynolds et al. (1989) περιγράφουν αύξηση της ποιότητας στο περιεχόµενο της ρητίνης δέντρων του ίδιου είδους, που προήλθαν από ελεγχόµενες διασταυρώσεις υψηλο-αποδοτικών ατόµων, κατά 50-100%. 28

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών 2 ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΑΣΙΚΩΝ ΔΕΝΤΡΩΝ 29

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών 2.1 Γενετικοί δείκτες, χρήσεις και χαρακτηριστικά Ως γενετικός δείκτης, ορίζεται κάθε ορατό γνώρισµα ή κάθε µετρήσιµος φαινότυπος, για τον οποίο τα αλληλόµορφα µιας γονιδιακής θέσης διαχωρίζονται κατά τους µενδελικούς νόµους. Οι γενετικοί δείκτες περιλαµβάνουν: i) τους µορφολογικούς δείκτες, ii) τους βιοχηµικούς δείκτες και iii) τους µοριακούς δείκτες (White et al. 2007) Οι γενετικοί δείκτες, χρησιµοποιούνται στη µελέτη της γενετικής των φυσικών αλλά και των καλλιεργούµενων πληθυσµών και στη µελέτη των παραγόντων που προκαλούν µεταβολές σε αυτούς. Μερικές από τις σηµαντικότερες εφαρµογές των γενετικών δεικτών είναι: 1) Στην περιγραφή των συστηµάτων διασταύρωσης, των επίπεδων οµοµιξίας και των χωρο-χρονικών προτύπων της γενετικής ποικιλότητας µέσα στις συστάδες. 2) Στη περιγραφή των µοντέλων της γεωγραφικής ποικιλότητας. 3) Στη µελέτη ταξινοµικών και φυλογενετικών σχέσεων µεταξύ των ειδών. 4) Στην εκτίµηση των επιπτώσεων των πρακτικών της βελτίωσης και της διαχείρισης στη γενετική ποικιλότητα. 5) Στη ταυτοποίηση γενοτύπων και γενετικού υλικού στους βελτιωτικούς και πολλαπλασιαστικούς πληθυσµούς. 6) Στη κατασκευή γενετικών χαρτών σύνδεσης. 7) Στη βελτίωση µε βάση τους γενετικούς δείκτες. Μερικά από τα επιθυµητά χαρακτηριστικά ενός γενετικού δείκτη µπορεί να είναι: 1) Το χαµηλό κόστος παραγωγής, 2) Να µην επηρεάζεται από το περιβάλλον, 3) Να εντοπίζεται σε πολλούς τύπους ιστών και σε ικανή ποσότητα, 4) Να παρουσιάζει πολυµορφισµό και 5) Να εκφράζεται ως συγκυρίαρχο γνώρισµα 2.2 Μορφολογικοί δείκτες Όσον αφορά τα δασικά είδη, ελάχιστοι µορφολογικοί χαρακτήρες, θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν ως γενετικοί δείκτες. Πολλοί από αυτούς είναι µεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν σε αρτίφυτρα, αλµπινισµός των βελονών, νανισµός και άλλες ανωµαλίες και χρησιµοποιήθηκαν στην εκτίµηση του βαθµού 30

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών αυτογονιµοποίησης στα κωνοφόρα. Παρόλα αυτά όµως έχουν περιορισµένη εφαρµογή αφού µορφολογικές µεταλλάξεις συµβαίνουν σπάνια και συνήθως είναι επιβλαβείς ή και θανατηφόρες για το δέντρο (White et al. 2007). 2.3 Βιοχηµικοί δείκτες 2.3.1 Μονοτερπένια Τα µονοτερπένια είναι υποοµάδα των τερπενοϊδών, εντοπίζονται στη ρητίνη και τα αρωµατικά έλαια των φυτών και παίζουν πιθανώς σηµαντικό ρόλο στην αντίσταση των δέντρων σε ασθένειες και σε επιθέσεις εντόµων. Οι συγκεντρώσεις τους προσδιορίζονται µε τη µέθοδο της αεριοχρωµατογραφίας και αποτελούν χρήσιµους γενετικούς δείκτες (White et al. 2007). Οι µονοτερπενικοί δείκτες βρήκαν εφαρµογή σε µεγάλη κλίµακα, κατά τις δεκαετίες του `60 και του `70 σε ταξινοµικές και εξελικτικές µελέτες (Mirov 1961,1963, Hanover 1975, Zavarin και Snajberk 1986). Στο γένος Pinus οι µεγάλες ποιοτικές και ποσοτικές διαφορές της ρητίνης µεταξύ των ατόµων οδήγησαν πολλούς ερευνητές να χρησιµοποιήσουν τα τερπένια στην ταυτοποίηση (διαχωρισµό) κλώνων (Squillace 1976, Esteban et al. 1976, Kossuth et al. 1988) Το γεγονός ότι οι δείκτες αυτοί είναι λίγοι σε αριθµό και οι περισσότεροι εκφράζουν κάποια µορφή κυριαρχίας στο φαινότυπο, σε συνάρτηση µε τις υψηλές απαιτήσεις σε εξειδικευµένο εξοπλισµό, οδήγησαν στον περιορισµό της χρήσης τους και την σταδιακή αντικατάσταση τους από τα αλλοένζυµα. 2.3.2 Αλλοένζυµα Τα αλλοένζυµα είναι αλληλοµορφικοί τύποι ενζύµων που µπορούν να αναγνωριστούν µε µια διαδικασία που λέγεται ηλεκτροφόρηση. Ο γενικότερος όρος για τα αλλοένζυµα είναι ισοένζυµα. Τα ισοένζυµα είναι διαφορετικοί τύποι ενός ενζύµου που καταλύουν την ίδια αντίδραση µε διαφορετικό όµως τρόπο (Markert και Moller, 1959). Η αλλοενζυµική ανάλυση περιλαµβάνει την αποµόνωση πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων από κάθε ιστό και τον διαχωρισµό τους σε πηκτώµατα αµύλου µε την εφαρµογή ηλεκτρικού ρεύµατος. Τα ισοένζυµα στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα µετακινούνται σε διαφορετικές θέσεις στο πήκτωµα, ανάλογα µε την ισχύ του ηλεκτρικού πεδίου, το καθαρό τους ηλεκτρικό φορτίο, το PH του πηκτώµατος και του ρυθµιστικού διαλύµατος των ηλεκτροδίων. Η φορά (προς την άνοδο ή τη κάθοδο), 31

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών στην οποία θα κινηθούν τα ένζυµα, εξαρτάται από το αν έχουν θετικό ή αρνητικό φορτίο. Τα σηµεία στα οποία µεταναστεύουν τα φορτισµένα µόρια ανιχνεύονται µε την εφαρµογή ειδικών χρώσεων, κατά τις οποίες εµφανίζονται οι ζώνες των ισοενζύµων. Το αποτέλεσµα που προκύπτει ονοµάζεται ζυµόγραµµα (Hunter και Markert 1957). Για να γίνει η ταυτοποίηση τους πρέπει τα ισοένζυµα να διαθέτουν δυο βασικά χαρακτηριστικά: η εξειδίκευση του υποστρώµατος τους να είναι µεγάλη και η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα να είναι διαφορετική (White et al. 2007). Η ηλεκτροφόρηση των ισοενζύµων µας παρέχει µοναδικές πληροφορίες επειδή στηρίζεται στο φαινότυπο ποιοτικών χαρακτηριστικών (τα ένζυµα θεωρούνται η άµεση έκφραση του γονιδίου) και γι αυτό το λόγο πλεονεκτεί έναντι των µορφολογικών χαρακτηριστικών και της χηµείας των δευτερογενών προϊόντων στις γενετικές αναλύσεις (Crawford, 1983). Εξαιτίας της συγκυρίαρχης συµπεριφοράς τους και του υψηλού επιπέδου πολυµορφισµού, τα ισοένζυµα χρησιµοποιήθηκαν για την εκτίµηση της γενετικής παραλλακτικότητας σε πληθυσµούς χαλεπίου πεύκης της Ελλάδας αλλά και άλλων Μεσογειακών χωρών, όπως το Ισραήλ και η Ιορδανία (Korol και Schiller 1996, Καρανίκας 2008), καθώς και σε άλλα δασικά είδη (Schiller et al. 1986, Teisseire et al. 1995, Agúndez et al. 1997). Επίσης βρήκαν εφαρµογή και στη προστασία και διατήρηση των γενετικών πόρων και σε προγράµµατα βελτίωσης δέντρων. 2.4 Μοριακοί δείκτες Οι µοριακοί δείκτες έκαναν την εµφάνιση τους τη δεκαετία του `80 και έκτοτε έχουν µονοπωλήσει τις γενετικές αναλύσεις αφού ο αριθµός τους αυξάνεται κάθε χρόνο. Βασικά εργαλεία στη δηµιουργία και την ανάπτυξη των µοριακών δεικτών αποτελούν τα περιοριστικά ένζυµα και η Αλυσιδωτή Aντίδραση της Πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction). Μια από τις πιο σηµαντικές ανακαλύψεις στη µοριακή γενετική αποτέλεσαν τα περιοριστικά ένζυµα (restriction enzymes) ή περιοριστικές ενδονουκλεάσες, τα οποία έχουν την ικανότητα να κόβουν το DNA και στα δυο του νήµατα. Το κάθε περιοριστικό ένζυµο αναγνωρίζει µια µοναδική και συγκεκριµένη αλληλουχία, µήκους 4-6 ζευγαριών βάσεων, όπου και κόβει το DNA. Η συχνότητα των θέσεων κοπής, ποικίλει και εξαρτάται τόσο από το περιοριστικό ένζυµο όσο και από το γονιδίωµα. Ένζυµα τα οποία ενεργούν σε αλληλουχίες που βρίσκονται σε µεγάλη συχνότητα στο γονιδίωµα, θα έχουν ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία ενός µεγάλου 32

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών αριθµού µικρών θραυσµάτων, ενώ όταν η συχνότητα τους είναι µικρή το αποτέλεσµα είναι η δηµιουργία λίγων και µεγάλων θραυσµάτων. Όλα τα θραύσµατα του DNA που προέκυψαν από τη δράση ενός συγκεκριµένου ενζύµου, θα µοιράζονται την ίδια ακολουθία στα άκρα, αλλά οι αλληλουχίες µεταξύ αυτών θα είναι διαφορετικές. Τα διάφορα θραύσµατα µπορούν να διαχωριστούν µεταξύ τους, βάση του µοριακού τους βάρος, µε ηλεκτοφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης. Η ανακάλυψη της Αλυσιδωτής Aντίδρασης της Πολυµεράσης (PCR) αποτέλεσε µια τεχνολογική καινοτοµία στην ανάλυση του γονιδιώµατος, αφού καθιστά δυνατή την ενίσχυση (πολλαπλασιασµό) συγκεκριµένων τµηµάτων του συνολικού γονιδιώµατος. H PCR ανακοινώθηκε στην επιστηµονική κοινότητα για πρώτη φορά το 1985 και ο εφευρέτης της µεθόδου (Karry Mullis) τιµήθηκε µε το βραβείο Νόµπελ το 1993 (Mullis 1990). Για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος DNA χρησιµοποιώντας την τεχνική PCR, το δείγµα του DNA αρχικά θερµαίνεται έτσι ώστε να αποδιαταχθεί το δίκλωνο DNA και να διαχωριστεί σε δυο µονόκλωνα τµήµατα (στάδιο denaturation). Ακολουθεί ο υβριδισµός του εκκινητή (primer) στις συµπληρωµατικές αλληλουχίες (στάδιο annealing) και η προσθήκη τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων, µέσω του ενζύµου Taq Polymerase στο 3 άκρο των εκκινητών χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο της ανοιγµένες αλυσίδες του DNA (στάδιο extension). Αφού τα προϊόντα της επέκτασης είναι επίσης συµπληρωµατικά των εκκινητών και µπορούν να τους δεσµεύουν, κάθε επιτυχηµένος κύκλος ουσιαστικά διπλασιάζει το ποσό του DNA που συντέθηκε στον προηγούµενο κύκλο. Το γεγονός αυτό καταλήγει στην εκθετική συσσώρευση του συγκεκριµένου τµήµατος-στόχου, περίπου 2 n, όπου n ο αριθµός των κύκλων (Εικ.1). Το υπόλοιπο γονιδίωµα δεν πολλαπλασιάζεται και έτσι δεν ανιχνεύεται µε τις µοριακές τεχνικές. Γενικά, οι περισσότερες τεχνικές για τη µελέτη της ποικιλότητας βασίζονται είτε στη χρήση των περιοριστικών ενζύµων είτε στη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης. Στην πραγµατικότητα µπορούν να διακριθούν 2 βασικές κατηγορίες µοριακών δεικτών ανάλογα µε το αν βασίζονται στην χρήση της τεχνικής PCR ή όχι. 33

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών Κύ κλος 1 ΑΛΥΣ ΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Εκκινητής 1 Εκκινητής 2 Θερµική µετουσίωση Σύνδεση εκκινητών Πολυµερισµός νέας αλυσίδας DNA Προϊόν αρχικών κύκλων PCR Κύριο προϊόν PCR Κύ κλος 1 Κύ κλος 2 Κύ κλος 3 Εικόνα 1. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης Οι πρώτοι µοριακοί δείκτες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν οι RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) (Botstein et al. 1980). Μετά την εισαγωγή της PCR σαν πολύτιµο εργαλείο στην έρευνα, αναπτύχθηκαν και άλλοι µοριακοί δείκτες όπως οι RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al. 1990). Τη δεκαετία του 1990 αναπτύχθηκαν οι δεύτερης γενιάς µοριακοί δείκτες που συµπεριλαµβάνουν τους SSRs (Simple Sequence Repeats) (Hearne et al. 1992), AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms) (Vos et al. 1995) και µια ποικιλία τροποποιηµένων τύπων τους. Στα τέλη της δεκαετίας του 1990 αναπτύχθηκαν και οι τρίτης γενιάς µοριακοί δείκτες όπως οι IFLPs (Intron Fragment Length Polymorphisms) και οι SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Τις δυο τελευταίες δεκαετίες, έχει γίνει διαθέσιµη µια πολύ µεγάλη οµάδα µοριακών δεικτών (Πιν.1), που οι κυριότερες διαφορές µεταξύ τους εντοπίζονται στο αν βασίζονται στην χρήση της PCR ή όχι και στο αν οι εκκινητές που χρησιµοποιούνται είναι τυχαίοι ή όχι καθώς και στο µέγεθος αυτών. 2.4.1 Πολυµορφισµός Μήκους Περιοριστικού Τµήµατος Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Η RFLP ανάλυση (Restriction Fragment Length Polymorphism) αποτελεί την πρώτη τεχνολογία που αναπτύχθηκε για την ανίχνευση των πολυµορφισµών σε επίπεδο αλληλουχίας DNA (Botstein et. al. 1980). Η προσέγγιση αυτή περιλαµβάνει 34

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών τεµαχισµό του DNA µε περιοριστικά ένζυµα, διαχωρισµό των τµηµάτων DNA που προκύπτουν µε πηκτή ηλεκτροφόρησης, διαχωρισµό των τµηµάτων σε µεµβράνη και υβριδισµό ραδιενεργών ή φθοριζόντων ανιχνευτών στα ξεχωρισµένα τµήµατα. Οι δείκτες αυτού του τύπου είναι συγκυρίαρχοι και παρουσιάζουν µεγάλη επαναληψιµότητα. Η ανάλυση RFLP έχει εφαρµοστεί τόσο σε χλωροπλαστικό όσο και σε µιτοχονδριακό DNA σε διάφορα είδη δέντρων, για τη µελέτη της γενετικής ποικιλότητας, την κατασκευή γενετικών χαρτών κτλ. (Byrne et al. 1995, Devey et al. 1991,1996, Bradshaw et al. 1994, Newton et al. 2002). 2.4.2 Δείκτες Πολυµορφισµού Μήκους Ενισχυµένου Θραύσµατος Amplified fragment length polymorphism (AFLP) Οι δείκτες πολυµορφισµού µήκους ενισχυµένου θραύσµατος (AFLPs) είναι µια πρόσφατα ανεπτυγµένη τεχνική (Vos et. al., 1995), η οποία έχει ως αποτέλεσµα την παραγωγή ενός µεγάλου αριθµού επαναλήψιµων και κυρίως κυρίαρχων δεικτών. Κατά την τεχνική αυτή, το DNA τεµαχίζεται µε τη βοήθεια περιοριστικών ενζύµων και ακολουθεί ενίσχυση τυχαίων αλληλουχιών µε τη χρήση της PCR. Tον τεµαχισµό, ακολουθεί προσθήκη προσαρµογέων µε γνωστές ακολουθίες στα άκρα του θραύσµατος. Έπειτα οι PCR εκκινητές υβριδίζουν µε τους προσαρµογείς και µε µερικά επιλεκτικά νουκλεοτίδια, µε αποτέλεσµα τη µείωση του αριθµού των προϊόντων ενίσχυσης. Σε περιπτώσεις µεγάλων γενωµάτων, η αντίδραση της PCR µπορεί να επαναληφθεί, πραγµατοποιώντας ακόµη ένα κύκλο επιλεκτικής ενίσχυσης. Είτε οι εκκινητές είτε τα προϊόντα της PCR πρέπει να είναι προσηµασµένα, έτσι ώστε να είναι δυνατός ο εντοπισµός των πολυµορφισµών στο πήκτωµα. Οι AFLP δείκτες είναι τυχαίες ακολουθίες, είναι κυρίαρχοι δείκτες και για αυτό προσοµοιάζουν µε τους RAPD δείκτες. Απαιτούν όµως µεγαλύτερη ποσότητα DNA (0,3-1,0 µg για κάθε αντίδραση), είναι πιο απαιτητικοί ως προς την τεχνική και παρουσιάζουν µεγαλύτερη επαναληψιµότητα (Jones et. al. 1997). Οι δείκτες AFLP βρήκαν µεγάλη εφαρµογή στα φυτά ευρείας καλλιέργειας, σε έρευνες γενετικής ποικιλότητας (Zhu et. al. 1998, Travis et. al. 1996, Travis et. al. 1996), δηµιουργίας γενετικών χαρτών σύνδεσης (Keim et. al. 1997), ταυτοποίησης γενοτύπων (Heun, et.al., 1997) κ.α. Οι δείκτες AFLP χρησιµοποιήθηκαν για πρώτη φορά στα δέντρα από τους Cervera et. al. (1996) για τη χαρτογράφηση ενός γονιδίου αντοχής σε ασθένεια στις λεύκες. Γενετικοί χάρτες µε τη χρήση των δεικτών αυτών κατασκευάστηκαν για µια πληθώρα ειδών όπως Pinus taeda (Remington et. al. 1999), 35

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών Pinus densiflora (Kim et. al. 2005), Pinus pinaster ( Costa et. al. 2000,), Pinus edulis (Travis et. al. 1998), ενώ έχουν χρησιµοποιηθεί και για την εκτίµηση της γενετικής ποικιλότητας διαφόρων ειδών όπως Pinus brutia (Choumane et. al. 2004), Pinus pinaster (Mariette et. al. 2001), Pinus oocarpa (Diaz et. al. 2001). 2.4.3 Μικροδορυφόροι ή δείκτες επανάληψης απλής αλληλουχίας Microsatellites or simple sequence repeats (SSR) Οι µικροδορυφόροι ή δείκτες επανάληψης απλής αλληλουχίας, αποτελούνται από επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες, στις οποίες το επαναλαµβανόµενο µοτίβο έχει µήκος 1-6 νουκλεoτίδια (Jarne and Lagoda 1996, Powell et al. 1996). Οι αλληλουχίες αυτές βρίσκονται σε αφθονία στο γένωµα πολλών ζώων, αλλά στο γένωµα των φυτών η συχνότητα τους είναι µικρότερη (Morgante and Olivieri 1993). Οι αλληλουχίες CA και GA εντοπίζονται στο γένωµα των πεύκων µε συχνότητα, µια κάθε 500-700 kb (Smith and Devey 1994, Echt and May-Marquardt 1997). Οι µικροδορυφόροι εντοπίζονται σε κωδικοποιηµένες και µη περιοχές τους γενώµατος, είναι δείκτες συγκυρίαρχοι και παρουσιάζουν υψηλό επίπεδο πολυµορφισµού. Οι δείκτες µικροδορυφορικού DNA που έχουν αναπτυχθεί για ένα συγκεκριµένο είδος µπορούν να χρησιµοποιηθούν και σε συγγενικά µε αυτό είδη π.χ. µικροδορυφόροι που αναπτύχθηκαν για την Pinus radiata (Smith and Devey 1994) και την Pinus strobus (Echt et al. 1996), χρησιµοποιήθηκαν και σε αναλύσεις στην Pinus sylvestris (Karhu et al. 1996). Οι δείκτες του τύπου αυτού χρησιµοποιήθηκαν µε επιτυχία στη κατασκευή γενετικών χαρτών πολλών ειδών (Echt and Nelson 1997, Ritter et al. 2002, Scalfi et al. 2004) αλλά και στη µελέτη της γενετικής ποικιλότητας (Gómez et al. 2005, Vendramin et al. 2002, Naydenov et al. 2005) και την ταυτοποίηση γενοτύπων, υβριδίων κ.λ.π. (Zietkiewicz et al. 1994, Rajora and Rahman 2003). 2.4.4 Δείκτες Τυχαία Ενισχυµένου Πολυµορφικού DNA Rapid Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Οι Δείκτες Τυχαία Ενισχυµένου Πολυµορφικού DNA (RAPD) ήταν οι πρώτοι, βασισµένοι στη PCR δείκτες, που αναπτύχθηκαν και αποτελούν τµήµατα DNA, που δηµιουργήθηκαν µέσω της PCR αντίδρασης, µε τη χρήση τυχαίων 10- µερών εκκινητών (Williams et al. 1990, Welsh and McClelland 1990). Το βασικό πλεονέκτηµα της µεθόδου RAPD είναι ότι δεν απαιτείται καµία γνώση της αλληλουχίας του DNA στόχου, οπότε και οι αλληλουχίες των εκκινητών που 36

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών χρησιµοποιούνται είναι τυχαίες. Παράλληλα απαιτεί και µικρή ποσότητα DNA (10ng) και ένα µόνο εκκινητή. Βέβαια εξαιτίας της στοχαστικής φύσης της ενίσχυσης του DNA µε τυχαίους εκκινητές αλληλουχιών, είναι σηµαντικό να διατηρηθούν σταθερές οι συνθήκες αντίδρασης που έχουν βελτιστοποιηθεί για την ενίσχυση του αναπαραγωγικού DNA. Αρκετοί παράγοντες, συµπεριλαµβανοµένης της συγκέντρωσης του πρότυπου DNA, της συγκέντρωσης µαγνησίου, της θερµοκρασίας αναδόµησης (annealing) του εκκινητή, του µήκους και της σύνθεσης των βάσεων του εκκινητή επηρεάζουν την αντίδραση και θα πρέπει να ελέγχονται προσεκτικά (Baker 2000). Η τεχνική περιλαµβάνει τη χρήση ενός µόνο τυχαίου εκκινητή ο οποίος µπορεί να υβριδίσει σε έναν αριθµό θέσεων στο γένωµα. Για να είναι επιτυχηµένη όµως η ενίσχυση, θα πρέπει δυο παρακείµενες θέσεις υβριδισµού να απέχουν µεταξύ τους απόσταση περίπου 2 kb και να έχουν αντίθετο προσανατολισµό. Τα τµήµατα του DNA, που προκύπτουν από την ενίσχυση, τα οποία αντιπροσωπεύουν τις ζώνες RAPD, διαχωρίζονται µεταξύ τους µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, είτε αγαρόζης, είτε πολυακρυλαµιδίου που παρέχει και µεγαλύτερη ευκρίνεια (Ronning and Schnell 1995), το οποίο βάφεται µε βρωµιούχο αιθίδιο (EtBr) και τοποθετείται για παρατήρηση κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία UV. Οι πολυµορφισµοί ανιχνεύονται από την παρουσία ή την απουσία της ζώνης και προκύπτουν κυρίως από διαφορές στην αλληλουχία των περιοχών σύνδεσης των εκκινητών (Εικ.2). Οι Williams et al. (1993), πρότειναν ότι το αποτέλεσµα µιας RAPD αντίδρασης, καθορίζεται κατά ένα µέρος από τον ανταγωνισµό για θέσεις υβριδισµού στο γένωµα. Ζώνες RAPD µπορούν να προκύψουν από κάθε θέση µέσα στο κυτταρικό DNA, συµπεριλαµβανοµένου του πυρηνικού DNA, του χλωροπλαστικού (cpdna) και του µιτοχονδριακού (mtdna) (Glaubitz and Moran 2000). Στο είδος Pseudotsuga menziesii, ένα υψηλό ποσοστό (45%) των πολυµορφικών RAPD ζωνών επέδειξε µητρική κληρονόµηση και ήταν για αυτό το λόγο µιτοχονδριακής προέλευσης (Aagaard et al. 1995). Στην περίπτωση που και τα δυο οµόλογα χρωµοσώµατα του ζευγαριού διαθέτουν τόσο την κανονική όσο και την αντίστροφη θέση εκκίνησης (οµοζύγωτα +/+), τα προϊόντα της ενίσχυσης που συντίθενται µέσω της αντίδρασης PCR είναι του ίδιου µήκους και για τα δυο οµόλογα χρωµοσώµατα. 37

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών AFLP AMP-PCR AP-PCR ASA ASSR CAPS DAF DALP DAMD-PCR DFLP dramp IFLP IM-PCR IRAP ISA ISSR MAAP MP-PCR OLA RAHM RAMPO RAMS RAPD RBIP REMAP RFLP SAMPL SCAR SNP SPAR S-SAP SSCP SSLP SSR STAR STMS STR STS VNTR Amplified Fragment Length Polymprphisms Anchored Microsatellite Primed PCR Arbitrarily Primed PCR Allele-Specific Amplification Anchored Simple Sequence Repeat Cleaved Amplified Polymorphic Sequence DNA Amplification Fingerprint Direct Amplification of Length Polymorphism Direct Amplification of Microsatellite DNA by PCR DNA Fragment Length Polymorphism Digested RAMP Intron Fragment Length Polymorphisms Inter- Microsatellite PCR Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism Inter-SSR Amplification Inter-Simple Sequence Repeats Multiple Arbitrary Amplicon Profiling Microsatellite Primed PCR Oligonucleotide Ligation Assay Randomly Amplified Hybridizing Microsatellites Randomly Amplified Microsatellites Polymorphisms Randomly Amplifies Microsatelittes Random Amplified Polymorphic DNA Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms Retrotransposon-MicrosatelliteAmplified Polymorphisms Restriction Fragment Length Polymorphisms Selective Amplification of Microsatelitte Polymorphic Loci Sequence Characterized Amplified Regions Single Nucleotide Polymorphism Single Primer Amplification Reactions Sequence-Specific Amplification Polymorphism Single Strand Conformation Polymorphism Simple Sequence Length Polymorphism Simple Sequence Repeat Sequence-Tagged Amplified Region Sequence-Tagged Microsatellite Site Short Tandem Repeat Sequence-Tagged-Site Variable Number of Tandem Repeats Πίνακας 1. Μοριακοί δείκτες κατά Pushpendra et al. (2002) Έτσι στο πήκτωµα εµφανίζεται, µετά την ηλεκτροφόρηση, µόνο µια ζώνη RAPD. Αντίστοιχα, αν και τα δυο οµόλογα χάσουν µία ή και τις δυο θέσεις εκκίνησης (οµόλογα -/-), η ενίσχυση δεν είναι επιτυχής, µε αποτέλεσµα να µη 38

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών προκύπτουν προϊόντα ενίσχυσης και έτσι να µην εµφανίζονται καθόλου ζώνες στο πήκτωµα. Τέλος, στην περίπτωση που το ένα οµόλογο έχει και τις δυο θέσεις εκκίνησης, αλλά το άλλο τουλάχιστον µια (ετερώζυγο +/-), τότε προκύπτει µόνο ένα προϊόν ενίσχυσης από το πρώτο οµόλογο, δηλαδή ο ετερόζυγος (+/-) φαινότυπος δε µπορεί να διακριθεί από τον οµόζυγο (+/+). Από τα παραπάνω συνάγεται το συµπέρασµα ότι οι δείκτες RAPD είναι κυρίαρχοι και διαλληλικοί (δηλαδή εκφράζονται µόνο δυο αλληλόµορφα σε κάθε θέση). Εικ.2. Σχηµατική αναπαράσταση πολυµορφισµού τύπου RAPD. Στην περίπτωση όµως που εργαζόµαστε µε το µεγαγαµετόφυτο των κωνοφόρων, εντοπίζεται µια ιδιαιτερότητα. Το µεγαγαµετόφυτο, είναι ο θρεπτικός ιστός που περιβάλει το αναπτυσσόµενο έµβρυο και προέρχεται από το ίδιο µεγασπόριο που προέρχεται και ο µητρικός γαµέτης, δηλαδή είναι ιστός απλοειδής και γενετικά πανοµοιότυπος µε το ωάριο (Lev-Yadum and Sederoff 2000). Έτσι, άτοµα ετεροζύγωτα για ένα δείκτη RAPD θα δώσουν ξεχωριστούς (+) και (-) φαινοτύπους, ενώ µόνο (+) φαινότυποι θα παρατηρηθούν στα µεγαγαµετόφυτα των οµόζυγων (+/+). Με τον τρόπο αυτό, είναι δυνατή η διάκριση των ετερόζυγων (+/-) από τα οµόζυγα (+/+), ξεπερνώντας έτσι το πρόβληµα της κυριαρχίας. Η 39

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών ιδιαιτερότητα αυτή παρέχει τη δυνατότητα της ανάλυσης του γενοτύπου ενός κωνοφόρου δέντρου, βασισµένη σε 6 απλοειδή µεγαγαµετόφυτα (Baker 2000). 2.4.4.1 Πλεονεκτήματα- Μειονεκτήματα των Δεικτών RAPD Το κύριο πλεονέκτηµα των RAPD είναι ότι δεν απαιτούνται ανιχνευτές DNA (DNA probes), ούτε γνώση των αλληλουχιών προκειµένου να σχεδιαστούν συγκεκριµένοι εκκινητές. Η διαδικασία δεν περιλαµβάνει µεταφορά σε µεµβράνη ή στάδια υβριδισµού. Γι αυτό, η τεχνική είναι γρήγορη, απλή και αποτελεσµατική ενώ απαιτεί µόνο την αγορά του µηχανήµατος των θερµικών κύκλων (PCR) και συσκευές πηκτής αγαρόζης. Χρειάζεται µικρές µόνο ποσότητες DNA (10 ng ανά αντίδραση) κάτι που σε µερικές περιπτώσεις κρίνεται απαραίτητο. Στην περίπτωση, για παράδειγµα, που χαρτογραφούµε τα γονίδια των κωνοφόρων µέσω ιστού µεγαγαµετόφυτου, το µειονέκτηµα των ελάχιστων ποσοτήτων DNA υπερνικάται ενώ ταυτόχρονα δίνεται χρήση των πλεονεκτηµάτων της 1:1 αναλογίας διάσπασης και των πλήρων πληροφοριών, παρόλο που οι RAPDs είναι κυριαρχικοί δείκτες (Grattapaglia et al. 1992). Εξάλλου, τα δείγµατα µπορούν να αναλύονται γρήγορα και η διαδικασία µπορεί να αυτοµατοποιηθεί (Karp et al. 1997). Οι δείκτες RAPD, έχει αποδειχθεί ότι ανιχνεύουν υψηλότερα επίπεδα πολυµορφισµών σε σχέση µε τους δείκτες RFLP (Glaubitz and Moran 2000) και µπορούν να χρησιµοποιηθούν στη χαρτογράφηση περιοχών του γενώµατος που δεν µπορούν να προσεγγιστούν µε την RFLP ανάλυση, λόγω της παρουσίας επαναλαµβανόµενων DNA αλληλουχιών. Σχετικά µε τα µειονεκτήµατα αναφέρονται τα ακόλουθα: Επειδή οι RAPD πολυµορφισµοί είναι το αποτέλεσµα είτε αλλαγής βάσης νουκλεοτιδίου που αλλάζει το σηµείο σύνδεσης του εκκινητή, είτε µια εισαγωγή ή µια διαγραφή µέσα στην ενισχυµένη περιοχή (Parks et al. 1991, Williams et al. 1990), οι πολυµορφισµοί συνήθως σηµειώνονται από την παρουσία ή απουσία ενός ενισχυµένου προϊόντος µιας περιοχής. Αυτό σηµαίνει ότι η RAPD τεχνική τείνει να παρέχει µόνο δείκτες κυριαρχίας. Άτοµα που περιέχουν δύο αντίγραφα ενός αλληλοµόρφου δεν ξεχωρίζουν ποσοτικά από εκείνα που περιέχουν ένα µόνο αντίγραφο του αλληλοµόρφου. Έτσι η χαρτογράφηση µε κυρίαρχους δείκτες µειονεκτεί σε σχέση µε αυτή που βασίζεται σε συγκυρίαρχους δείκτες, εκτός από τις περιπτώσεις που αυτή βασίζεται σε απλοειδή ή γαµετοφυτικό ιστό (Tingey and Tufo 1993). 40

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών Ένα ακόµη βασικό µειονέκτηµα των δεικτών RAPD, είναι η έλλειψη επαναληψιµότητας των αποτελεσµάτων που παρουσιάζεται ανάµεσα σε διαφορετικά εργαστήρια, ακόµη κάποιες φορές και στο ίδιο εργαστήριο (Levi et al. 1993, Jones et al. 1997, Perez et al.,1998). Οι Penner et al. (1993) αναφέρουν ότι οι δυσκολίες που αντιµετώπισαν στη λήψη ταυτόσηµων αποτελεσµάτων µεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων, χρησιµοποιώντας το ίδιο υλικό και ίδιους εκκινητές, οφείλονταν κατά κύριο λόγο στη συσκευή των θερµικών κύκλων. Οποιαδήποτε αλλαγή των παραµέτρων της PCR αντίδρασης, όπως είναι η θερµοκρασία αναδόµησης η συγκέντρωση του DNA στα δείγµατα µας, µπορεί να αυξήσει ή να µειώσει των αριθµό των ζωνών που θα εµφανιστούν στο πήκτωµα. Ακόµη ένα πρόβληµα που µπορεί να εντοπιστεί είναι οι µολύνσεις µε ξένο γενετικό υλικό, αφού η συγκεκριµένη τεχνική απαιτεί πολύ µικρές ποσότητες DNA. Τα προβλήµατα αυτής της φύσεως µπορούν να ελαχιστοποιηθούν µε τον προσεκτικό έλεγχο της συγκέντρωσης του DNA καθώς και της ποιότητας του. Παρόλα αυτά όµως, ο Skov (1998), εργαζόµενος µε την Picea abies (L.), πέτυχε µε προσεκτικό έλεγχο όλων το παραµέτρων της PCR αντίδρασης, επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων του σε διαφορετικά εργαστήρια, σε ποσοστό 93%, σε ένα αριθµό 43 δεικτών κατανεµηµένους σε 18 RAPD εκκινητές. Τέλος, ένας άλλος τύπος προβλήµατος που αναφέρεται, είναι η παρουσία RAPD ζωνών στο DNA των απογόνων, οι οποίες όµως απουσιάζουν από το DNA των γονέων (Riedy et al. 1992, Ayliffe et al. 1994). Το φαινόµενο αυτό αποδίδεται συχνά στα κωνοφόρα, σε ένα µεγάλο αριθµό από υπολειπόµενα εµβρυικά θανατηφόρα γονίδια, τα οποία διατηρούν συνήθως υψηλά γενετικά φορτία (Mukai, et.al, 1995). Άλλοι λόγοι του φαινοµένου αυτού, µπορεί να είναι η απώλεια χρωµοσωµάτων (Bradshow et.al. 1994), κάποιο σφάλµα κατά το σκοράρισµα (Plomion et.al.1995) καθώς σε λάθος στη δειγµατοληψία ή στην ύπαρξη κάποιας σύνδεσης µε άλλες γονιδιακές θέσεις που µπορούν να παραµορφώσουν εµφανώς τον 1:1 διαχωρισµό εξαιτίας κάποιας µορφής προ-ζυγωτικής ή µετα-ζυγωτικής επιλογής (Aravanopoulos et al. 1994). Επιπλέον η παρουσία µιας ζώνης που φαίνεται να έχει ακριβώς το ίδιο µοριακό βάρος στην πηκτή RAPD διαφορετικών ατόµων, δεν µπορεί να ληφθεί ως απόδειξη ότι τα δύο άτοµα έχουν την ίδια ζώνη, αν και συνήθως γίνεται αυτή η παραδοχή (Baker 2000). Στο ίδιο συµπέρασµα κατέληξαν και οι Manescu et.al (2011) εφαρµόζοντας µοριακούς και µορφολογικούς δείκτες για την κατασκευή γενετικού χάρτη σύνδεσης για το Cupressus sempervirens. 41

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών 2.4.4.2 Εφαρµογές των µοριακών δεικτών τύπου RAPD Υπάρχουν αρκετές εφαρµογές των RAPD δεικτών, κάθε µια από τις οποίες αξιοποιεί την αποτελεσµατικότητα ανίχνευσης των πολυµορφισµών που βασίζονται σε αλληλουχίες του DNA, και αναφέρονται στην εκτίµηση της γενετικής ποικιλότητας, σε ταξονοµικές και συστηµατικές µελέτες και σε ταυτοποιήσεις γενοτύπων. Οι Gómez et al. (2001), εκτιµώντας τη γενετική ποικιλότητα 9 πληθυσµών του είδους Pinus halepensis µε τη χρήση των δεικτών RAPD, µελετώντας την απόκλιση µεταξύ των πληθυσµών και λαµβάνοντας υπόψη την γενετική απόσταση, κατέληξαν στη υπόθεση ότι οι πληθυσµοί της ανατολικής Μεσογείου, ακολούθησαν µια διαφορετική ιστορία σε σχέση µε αυτούς της δυτικής. Έρευνες πάνω στη χαλέπιο πεύκη µε τη χρήση των δεικτών RAPD έγιναν και από τους Μπάκα και Αραβανόπουλο (2000, 2002). Στις έρευνες αυτές αναφέρεται τιµή της γενετικής ποικιλότητας σε πληθυσµό της Κασσάνδρας Χαλκιδικής (He=0,359), µεγαλύτερη από αυτή του πληθυσµού των Θερµοπυλών στο Νοµό Φθιώτιδας (He=0,340), καθώς και ότι στη Χαλκιδική για την πλειοψηφία των γονιδιακών θέσεων (90%) ισχύει ο νόµος Hardy-Weinberg. Παράλληλα, µια πληθώρα άλλων ερευνητών έκαναν χρήση των δεικτών RAPD για την εκτίµηση της γενετικής ποικιλότητας σε πληθυσµούς διαφόρων ειδών (Bucci & Menozzi 1995, Szmidt et al. 1996. Peng et al. 2003, Ghosn et al. 2000, Nkongolo & Gratton, 2001, Fazekas & Francis, 2001, Collignon et al. 2002, Peng et al. 2003). Οι Mosseler et al. (1992), οι Bucci et al. (1997) και Zhang et al. (2005), εντόπισαν µε τη βοήθεια των δεικτών RAPD, χαµηλά επίπεδα γενετικής ποικιλότητας σε πληθυσµούς των Pinus resinosa Ait., Pinus leucodermis και Pinus squamatα αντίστοιχα, γεγονός που καταδεικνύει την ανάγκη για την προστασία και διατήρηση των πληθυσµών αυτών. Παράλληλα, οι δείκτες RAPD χρησιµοποιήθηκαν εκτενώς σε φυλογενετικές και ταξινοµικές µελέτες. Οι Nkongolo et al. (2002), κατάφεραν µε τη χρήση 8 εκκινητών να διαχωρίσουν 8 διαφορετικά είδη του γένους Pinus, εντοπίζοντας ένα δείκτη χαρακτηριστικό του γένους καθώς και άλλους χαρακτηριστικούς των διαφόρων ειδών που µελετήθηκαν. Ακόµη, οι Scheepers et al. (2000), χρησιµοποιώντας 4 RAPD εκκινητές διαχώρισαν τα είδη Larix decidua και Larix kaempferi καθώς και το υβρίδιο τους Larix X eurolepis. Οι Vicario et al. (1995), µε τη βοήθεια των δεικτών RAPD, διαχώρισαν σαφώς τα είδη Abies alba και Abies 42

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών nebrodensis όπως επίσης και οι Sanchez et al. (1998), διαχώρισαν 5 διαφορετικά είδη του γένους Populus (P. deltoides, P. nigra, P. alba, P. tremoula και P. trichocarpa) µε τη χρήση ενός µόνο εκκινητή. Μια από τις πρώτες εφαρµογές των RAPD δεικτών, ήταν η δηµιουργία γενετικών χαρτών σύνδεσης. Η ανάλυση της γενετικής σύνδεσης στα κωνοφόρα ήταν αρχικά αργή λόγω του µεγάλου µεγέθους του γενώµατος και λόγω της έµφυτης δυσκολίας παραγωγής ενός διασπώµενου F2 πληθυσµού (Carlson et al. 1991). Οι Carlson et al. (1991) και Chaparro et al. (1992), πρόσφατα έδειξαν ότι η ταχύτητα και η αποτελεσµατικότητα της RAPD ανάλυσης έχουν συνεισφέρει ιδιαίτερα στην χαρτογράφηση των κωνοφόρων. Το 1992 οι Tulsieram et al. ανέφεραν µια µοναδική εφαρµογή της RAPD ανάλυσης, στην κατασκευή ενός γενετικού χάρτη σύνδεσης, χρησιµοποιώντας απλοειδές DNA από τον µεγαγαµετοφυτικό ιστό σπόρων ενός µόνο ατόµου του είδους Picea glauca. 47 από τους 61 συνολικά δείκτες κατανεµήθηκαν σε 12 οµάδες σύνδεσης καλύπτοντας µια απόσταση 873,8 Cm. Στο είδος Pinus halepensis Mill., η πρώτη µελέτη για την κατασκευή γενετικού χάρτη σύνδεσης έγινε από τους Gómez et. al. (2002), όπου εντοπίστηκαν 6 οµάδες σύνδεσης ενώ το µήκος του χάρτη κυµαίνεται από 175 cm έως 225cM. Η µέθοδος αυτή βρήκε εφαρµογή σε πολλές έρευνες συµβάλλοντας στη κατασκευή γενετικών χαρτών διαφόρων ειδών, όπως Pinus brutia Ten. (Kya και Neale 1995), Pinus contorta (Li and Yea 2001), Pinus pinaster (Plomion et al. 1995), Pinus palustris Mill.(Nelson et al. 1994), Pinus elliottii ( Nelson et al. 1993), Picea abies (Skov και Wellendorf 1998), Pinus taeda L. (Sewell et al. 1999). Αξιοσηµείωτες είναι και οι προσπάθειες που έγιναν για τη χαρτογράφηση γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την αντοχή των διαφόρων δασικών ειδών απέναντι σε προσβολές από παθογόνα, όπως αυτή των Devey et al. (1995), στην περίπτωση του γονιδίου R, που ευθύνεται για την αντοχή των ατόµων του είδους Pinus lambertiana Dougl. απέναντι στις προσβολές του παθογόνου Cronartium ribicola Fisch. Από τους 10 συνδεδεµένους µε το γονίδιο R δείκτες, 6 από αυτούς εντοπίζονται σε µια απόσταση 5 cm από το γονίδιο R και ένας σε απόσταση 0.9 cm. Για το ίδιο παθογόνο αλλά στο είδος Pinus monticola, οι Liu et al. (2006), κατάφεραν να αναγνωρίσουν 8 RAPD δείκτες που ήταν συνδεδεµένοι µε το γονίδιο Cr2. Άλλες αντίστοιχες προσπάθειες είναι αυτές των Wilcox et al. (1996), στο είδος Pinus taeda L., των Kondo et al. (2000), στο είδος Pinus thunbergii, των Benet et al. (1995), στο είδος Ulmus parvifolia, των Junghans et al. (2003), στο είδος 43

Γενετικοί Δείκτες- Γεν. Ανάλυση Δασικών ειδών Eucalyptus grandis, των Tabor et al. (2000) στο είδος Populus deltoides και των Mehlenbacher et al. (2004) στο είδος Corylus avellana. Οι δείκτες RAPD βρήκαν εφαρµογή και στη ταυτοποίηση κλώνων, ποικιλιών και γενοτύπων διαφόρων ειδών. Με τη χρήση ενός συνδυασµού από 4-6 εκκινητές, οι Van De Ven και McNicol (1995), ταυτοποίησαν 57 διαφορετικούς κλώνους του είδους Picea sitchensis ενώ οι Scheepers et al. (1997), ταυτοποίησαν 96 κλώνους του είδους Picea abies µε τη δηµιουργία RAPD αποτυπωµάτων για καθέναν από αυτούς. Ακόµη οι Ibanez et al. (2009), χρησιµοποιώντας 5 RAPD εκκινητές, ταυτοποίησαν µε επιτυχία 10 κλώνους του είδους Sequoia sempervirens (D.Don) Endl., παρόλο που αυτοί προέρχονταν από την ίδια γεωγραφική περιοχή. Ένα πλήθος ερευνητών εφήρµοσαν την RAPD ανάλυση σε κλώνους, αλλά και µέλη αυτών, των ειδών Populus, Salix, Ulmus και Eucalyptus επιτυγχάνοντας την ταυτοποίηση τους (Lin et al. 1994, Rani et al. 1995, Castiglione et al. 1993, Sigurdsson et al. 1995, Laia et al. 2000, Keil and Griffin 1994, Kamalay and Carey 1995,). Τέλος, οι RAPD δείκτες χρησιµοποιήθηκαν επιτυχώς και στην ταυτοποίηση και τον διαχωρισµό των ποικιλιών διαφόρων καλλιεργούµενων ειδών (Moreno et al. 1995, Besnard et al. 2001, Rajora και Rahman 2003, Gaafar και Saker 2006). Η ιχνηλάτηση (fingerprinting) των φυτών έχει πολλές εφαρµογές στο εµπόριο και σε νοµικές υποθέσεις. Μια εξ αυτών περιλαµβάνει τη χρήση της σε βελτιωτικά προγράµµατα προκειµένου να καθοριστεί η συγγένεια των γενοτύπων και η πιστοποίηση των απογόνων. Επίσης οι τεχνικές αποτύπωσης DNA µπορεί να χρησιµεύσουν στη δηµιουργία, απόκτηση και ενίσχυση των ιδιοκτησιακών δικαιωµάτων στα φυτά (Jondle, 1993). 44

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία 3.ΒΛΑΣΤΙΚΟΣ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ ΚΛΩΝΙΚΗ ΔΑΣΟΠΟΝΙΑ 45

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία 3.1 Βλαστικός πολλαπλασιασµός Με τον όρο βλαστικός (αγενής, σωµατικός, κλωνικός), πολλαπλασιασµός εννοούµε την αναπαραγωγή ενός οργανισµού µε κάθε άλλο τρόπο εκτός από την ένωση δυο γαµετών. Ειδικά όταν αναφερόµαστε στα φυτά εννοούµε την ανάπτυξη νέων φυτών από βλαστικά τµήµατα ενός µητρικού. Η αναπαραγωγή µπορεί να προκύψει από τµήµατα κλαδιών, φύλλων, ριζών ακόµη και µε εµβολιασµό ή ενοφθαλµισµό ή από ένα απλό σωµατικό κύτταρο (Πανέτσος 1986). Τα φυτά που προέρχονται από βλαστικό πολλαπλασιασµό, έχουνε όλα τον ίδιο γενότυπο µεταξύ τους και µε το µητρικό φυτό «δότη» (ortet), βλαστικά µέρη του οποίου αποτέλεσαν το αναπαραγωγικό υλικό. Το σύνολο των φυτών που προήλθαν από τον ίδιο αρχικό «δότη», συγκροτούν έναν κλώνο (clone) και λέγονται µέλη (ramets) του κλώνου. Έτσι ως κλώνος µπορεί να οριστεί µια οµάδα γενετικά όµοιων φυτών που προήλθαν µε βλαστικό πολλαπλασιασµό από ένα αρχικό φυτό «δότη» (Πανέτσος 1986, Quijada 1985, Wright 1976, Zolbert and Talbert, 1984). Η πρακτική χρήση των µεθόδων του βλαστικού πολλαπλασιασµού βασίζεται σε δυο βιολογικές θεωρήσεις (Σκαλτσογιάννης, 1988, Burdon 1989, White et al. 2007): Α) Διατήρηση της φυσιολογικής κατάστασης του µητρικού φυτού, στο πολλαπλασιαζόµενο τµήµα. Β) Διατήρηση της γενετικής πιστότητας γιατί το βλαστικό τµήµα που θα χρησιµοποιηθεί στον πολλαπλασιασµό, είναι όµοιο γενετικά µε το µητρικό φυτό «δότη» (Quijada 1985). Ο βλαστικός πολλαπλασιασµός προσφέρει τεράστιες δυνατότητες τόσο στη γενετική βελτίωση των δασοπονικών δέντρων όσο και στην κλωνική Δασοπονία γιατί: 1) Εξασφαλίζει το µεγαλύτερο δυνατό γενετικό κέρδος, διατηρώντας αναλλοίωτη τόσο τη δράση των αθροιστικών γονιδίων όσο και την αλληλεπίδραση των µη αθροιστικών γονιδίων. 2) Παρέχει τη δυνατότητα συγκέντρωσης γενετικού υλικού σε ένα ορισµένο τόπο, για την εφαρµογή προγραµµάτων βελτίωσης ή για τη δηµιουργία τράπεζας γονιδίων ή κέντρων προστασίας των γενετικών πόρων ενός είδους. 46

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία 3) Παρέχει τη δυνατότητα για άµεση και οικονοµική ίδρυση φυτειών µε βελτιωµένο υλικό σε φυτικά είδη που µπορούν να αναπαραχθούν κλωνικά σε µαζική κλίµακα (Populus spp, Salix spp, Cryptomeria japonica) ή σε περιορισµένη κλίµακα (Picea mariana, Picea abies και διάφορα είδη του Platanus spp). 4) Εξασφαλίζει την οµοιοµορφία του υλικού (χωρίς γενετική παραλλακτικότητα) που είναι σηµαντικό σε πολλά πειράµατα: i) βασικής έρευνας φυσιολογίας και παθολογίας των φυτών, µε τον προσδιορισµό των σχέσεων: ανθεκτικότητα και περιβάλλον, ανθεκτικότητα και ταχύτητα αύξησης και ii) δασοκοµικής έρευνας π.χ. επίδραση διαφόρων λιπασµάτων, γονιµότητας του εδάφους, φυτευτικού συνδέσµου στην ανάπτυξη των δασικών δέντρων. 5) Βελτιώνει και απλοποιεί τις κλασικές µεθόδους βελτίωσης των δασοπονικών δέντρων. 6) Παρέχει τη δυνατότητα οικονοµικής αναπαραγωγής δαπανηρών γενοτυπικών συνδυασµών. 7) Εξασφαλίζει τη δυνατότητα αναπαραγωγής φαινοτύπων προσαρµοσµένων σε ιδιαίτερα περιβάλλοντα (ecotypes). 8) Εξασφαλίζει την (ανα)παραγωγή : i) αρκετά εξειδικευµένων κλώνων, δηλαδή κλώνων που διακρίνονται για τη µεγάλη αλληλεπίδραση µε ένα συγκεκριµένο περιβάλλον - ( genotype x site interaction) και ii) κλώνων µε ευρεία προσαρµοστικότητα (broadly adapted clones). 9) Απλοποιεί τον υπολογισµό βασικών γενετικών παραµέτρων (συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας (h 2 ), αλληλεπίδραση γενοτύπων περιβάλλοντος), που είναι απαραίτητοι τόσο στην ανάλυση της φαινοτυπικής και γενοτυπικής παραλλακτικότητας όσο και στην αξιολόγηση του γενοτύπου. 10) Επιτρέπει τον πολλαπλασιασµό στείρων δέντρων, ελέγχει τη µορφή του κορµού και της κόµης αυτών και τέλος εξασφαλίζει οµοιοµορφία παραγωγής στον τοµέα της βελτίωσης των καλλωπιστικών δέντρων και θάµνων. Η χρήση του βλαστικού πολλαπλασιασµού στη δασοπονία θα αυξάνεται συνεχώς καθώς έχει γίνει ένα από τα πιο σηµαντικά εργαλεία στα χέρια των βελτιωτών των δασικών ειδών (Zobel and Talbert, 1984). Η χρησιµότητα του εξαρτάται, µεταξύ άλλων παραγόντων, από: Α) Την ευκολία µε την οποία τα είδη µπορούν να υποστούν διάφορους χειρισµούς. Πολλά είδη παρουσιάζουν δυσκολίες στο να αναπαραχθούν βλαστικά, ενώ για κάποια άλλα είναι εξαιρετικά εύκολο. Το γεγονός αυτό επηρεάζει το κόστος 47

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία παραγωγής, τόσο στην εγκατάσταση δενδροκήπων όσο και στην, σε µαζική κλίµακα, παραγωγή φυτευτικού υλικού. Β) Το βαθµό στον οποίο µπορεί να ελεγχθεί η ανάπτυξη των πολλαπλασιαζόµενων βλαστικών τµηµάτων. Σε µερικές περιπτώσεις παρουσιάζεται το φαινόµενο της τοπόφυσης καθώς και αυτό της ασυµβατότητας µεταξύ υποκειµένου-εµβολίου (Quijada, 1985). Μέχρι τις τελευταίες δεκαετίες ο βλαστικός πολλαπλασιασµός για πολλά δασοπονικά είδη, ήταν αδύνατος. Την περίοδο αυτή ο εγγενής πολλαπλασιασµός παρέµεινε ο µόνος τρόπος αναπαραγωγής δασοπονικών ειδών µε εξαίρεση τα περισσότερα είδη των γενών Populus, Salix και του κωνοφόρου Cryptomeria japonica, που µπορούσαν να αναπαραχθούν αγενώς σε µαζική κλίµακα (Toda, 1974). Τα τελευταία χρόνια ο βλαστικός πολλαπλασιασµός αποκτά όλο και µεγαλύτερο ενδιαφέρον, ιδιαίτερα σε προγράµµατα γενετικής βελτίωσης δασοπονικών ειδών, µε αποτέλεσµα την επίτευξη εκπληκτικής προόδου (Rauter, 1982, Libby and Rauter, 1984, Πανέτσος, 1986). Την τελευταία 30ετία, µε την ανάπτυξη του µικροπολλαπλασιασµού στη δασοπονία, η συµβολή του βλαστικού πολλαπλασιασµού στη µαζική αναπαραγωγή γενετικά βελτιωµένου υλικού θεωρείται αναντικατάστατη, καθώς θα παρέχει τη δυνατότητα αναπαραγωγής σωµατικών υβριδίων απλοειδών ή πλήρως οµοζυγωτών φυτών, φυτών απαλλαγµένων από ιούς ή φυτών µε ανασυνδιασµένο DNA (Σκαλτσογιάννης, 1988). 3.2 Τεχνικές βλαστικού πολλαπλασιασµού Οι τεχνικές του βλαστικού πολλαπλασιασµού είναι πολλές και αρκετές από αυτές, έχουνε αναπτυχθεί και εξελιχθεί, ειδικά για την χρήση τους στη δασοπονία. (Hartman and Kestler, 1983, Zobel and Talbert, 1984). Οι κυριότερες µέθοδοι βλαστικού πολλαπλασιασµού που χρησιµοποιούνται σήµερα είναι οι ακόλουθες: - Μοσχεύµατα - Εµβολιασµός - Καταβολάδες - Ιστοκαλλιέργεια- Μικροπολλαπλασιασµός Σήµερα, η µεγαλύτερη έµφαση στη δηµιουργία φυτειών έχει δοθεί στη χρήση των µοσχευµάτων. Ο εµβολιασµός εµπλέκεται συνήθως στη δηµιουργία κήπων 48

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία κλώνων και σποροπαραγωγών κήπων, στους οποίους ο στόχος είναι η σε µεγάλη κλίµακα παραγωγή σπόρων (Zobel and Talbert, 1984). Η πιο σύγχρονη τεχνική βλαστικού πολλαπλασιασµού που τυγχάνει µεγάλης προσοχής και δηµοσιότητας, είναι ο πολλαπλασιασµός µε ιστοκαλλιέργεια, αφού παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον και µεγάλη δυναµική και προοπτικές για επιχειρηµατική αξιοποίηση (Durzan and Cambell, 1974, Zobel, 1977). Σηµαντική είναι η ύπαρξη γενικότερης κατανόησης της χρήσης, της αξίας καθώς και των προβληµάτων που παρουσιάζουνε οι διάφορες µέθοδοι του βλαστικού πολλαπλασιασµού. Διαφωνίες θα προκύπτουν συνεχώς για το ποια είναι η καλύτερη από αυτές, για τα προγράµµατα αναγέννησης. Η απάντηση µπορεί να δοθεί µόνο µε τη διεξαγωγή συγκριτικών ερευνών, κάτω από όµοιες και ελεγχόµενες συνθήκες. Συγκριτικές έρευνες µεταξύ σποροφύτων και φυτών που προέρχονται από αγενή πολλαπλασιασµό, σε σχέση µε την ανάπτυξη και τα µορφολογικά χαρακτηριστικά τους, έχουνε γίνει από τους, Copes (1977), Roulund (1978a, 1978b) και τους Birot και Nepveu (1979). Κάποιες φορές τα εµβόλια παρουσιάζουν µεγαλύτερη ανάπτυξη σε σχέση µε τα ριζοβοληµένα µοσχεύµατα ή τα σπορόφυτα. Ακόµη και όταν ριζοβοληµένα µοσχεύµατα και σπορόφυτα αναπτύσσονται µε τον ίδιο ρυθµό, εντοπίζονται διαφορές στη µορφή τους, µε τα µοσχεύµατα να παρουσιάζουν µικρότερη σταδιακή µείωση της διαµέτρου τους, µικρότερα κλαδιά και πιο λεπτό φλοιό (Libby and Hood, 1976). Γενικά, τα µοσχεύµατα αναπτύσσονται µε πιο αργό ρυθµό, σε σχέση µε τα σπορόφυτα. Παρόλα αυτά, πολλά εξαρτώνται από την ηλικία του µητρικού φυτού «δότη», από το κατά πόσο είναι αναπτυγµένο το ριζικό σύστηµα των µοσχευµάτων, καθώς και από τους χειρισµούς που προηγηθήκαν της φύτευσης στο εξωτερικό περιβάλλον (Zobel and Talbert, 1984). 3.2.1 Μοσχεύµατα Μόσχευµα είναι ένα τµήµα κλαδιού, φύλλου ή ρίζας, το οποίο αφού τοποθετηθεί σε κατάλληλο υπόστρωµα και ριζοβολήσει, δηµιουργεί ένα νέο φυτό (Πανέτσος, 1986, Quijada, 1985, Wright, 1976). Τα µοσχεύµατα είναι µια από τις πλέον διαδεδοµένες τεχνικές βλαστικού πολλαπλασιασµού, γιατί προσφέρει τη δυνατότητα παραγωγής πολλαπλασιαστικού υλικού σε µαζική κλίµακα. Η χρήση της σε ορισµένα είδη των γενών Salix, Populus, Cryptomeria (Chemlar 1974, Toda 1974), είναι γνωστή από πολύ παλιά. Τα περισσότερα όµως είδη οικονοµικού ενδιαφέροντος, όπως είναι τα 49

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία γυµνόσπερµα, παρουσιάζουν δυσκολίες στη ριζοβόληση των µοσχευµάτων τους (Zsuffa, 1974, Niensteadt et.al., 1958). Λόγω των πλεονεκτηµάτων του βλαστικού πολλαπλασιασµού, έχει αρχίσει σε πολλά ερευνητικά ιδρύµατα σε όλο τον κόσµο, έντονη ερευνητική δραστηριότητα, για την επίλυση των προβληµάτων ριζοβολίας των µοσχευµάτων (Kleinschmit and Schmit 1977, Werner 1977, Hartney 1980). Στις αναφορές των McAlpine και Kormanik (1972), Nienstaedt et al. (1958) και Lepisto (1977) συνοψίζεται η εµπειρία πάνω σε µια πληθώρα δασικών ειδών, όσον αφορά τον πολλαπλασιασµό τους µε τη µέθοδο των µοσχευµάτων (Εικ.3). Εικόνα.3 Ριζοβοληµένα µοσχεύµατα Τα δασικά είδη, ανάλογα µε την ικανότητα ριζοβόλησης των µοσχευµάτων τους, µπορούνε να διακριθούν σε τρεις κατηγορίες: Α) Είδη που ριζοβολούνε πολύ εύκολα, χωρίς τη βοήθεια ορµονών ή ειδικών προµεταχειρήσεων. Στη κατηγορία αυτή περιλαµβάνονται είδη των γενών Populus, Salix, Platanus, Tamarix, Hibiscus κ.λ.π. Β) Είδη που παρουσιάζουν διάφορο βαθµό δυσκολίας στη ριζοβόληση και απαιτείται ειδική προµεταχείρηση ή χρήση ορµονών. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα είδη Pinus radiata, Cryptomeria japonica, Sequoia sempervirens καθώς και είδη των γενών Taxus και Juniperus. Γ) Είδη που δε ριζοβολούν ή ριζοβολούν µε µεγάλη δυσκολία ακόµα και µε χρήση ορµονών. Στην κατηγορία αυτή ανήκουνε είδη των γενών Pinus, Picea, Larix, Abies, Betula, Acer κ.λ.π. (Πανέτσος, 1986) 50

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία 3.2.1.1 Παράγοντες που επηρεάζουν τη ριζοβόληση των µοσχευµάτων Η ριζοβόληση των µοσχευµάτων εξαρτάται από µια πληθώρα παραγόντων, οι οποίοι διαχωρίζονται σε δυο µεγάλες κατηγορίες α) Ενδογενείς παράγοντες i) Γενότυπος ii) Κατάσταση ωριµότητας του φυτού δότη iii) Τύπος του µοσχεύµατος iv) Φυσιολογική κατάσταση του µοσχεύµατος v) Προµεταχείρηση του φυτού δότη και των µοσχευµάτων vi) Εποχή συλλογής των µοσχευµάτων β) Εξωγενείς παράγοντες i) Υπόστρωµα ριζοβολίας ii) Ένταση φωτισµού και φωτοπερίοδος iii) Θερµοκρασία και υγρασία του περιβάλλοντος χώρου iv) Ρυθµιστές αύξησης και άλλα χηµικά παράγωγα Ο παράγοντας ηλικία είναι πολύ σηµαντικός στη ριζοβόληση των µοσχευµάτων. Οι Steele κ.α. (1990), µελέτησαν τη ριζοβολία µοσχευµάτων του είδους Picea sitchensis (Bong.) Carr., που προήλθαν από δέντρα διαφόρων ηλικιών (1-39 ετών) και κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η ικανότητα ριζοβολίας µειώνεται δραµατικά µε την αύξηση της ηλικίας του φυτού δότη. Νεαρά δέντρα των οποίων τα µοσχεύµατα ριζοβολούν εύκολα, µπορεί να παρουσιάσουν δυσκολίες σε µεγαλύτερη ηλικία, σε βαθµό που µπορεί η ριζοβόληση να είναι αδύνατη (Zobel and Talbert, 1984). Γενικά µοσχεύµατα που προέρχονται από δέντρα µεγάλης ηλικίας, αυξάνονται µε πιο αργό ρυθµό σε σχέση µε αυτά που προέρχονται από νεαρότερα άτοµα (Talbert et al., 1982). Οι Klomp και Hong (1985) συγκρίνοντας για 15 έτη την ανάπτυξη µοσχευµάτων που προήλθαν από δέντρα του είδους Pinus radiata D.Don και σποροφύτων του ίδιου είδους, διαπίστωσαν σηµαντικές διαφορές στην αύξηση της διαµέτρου ενώ τα ύψη τους βρέθηκαν στατιστικά όµοια. Όσον αφορά στη φυσιολογική κατάσταση, τα πολύ αποξυλωµένα µοσχεύµατα δεν βλαστάνουν και δε ριζοβολούν εύκολα, ενώ τα πολύ νεαρά είναι ευαίσθητα στην ξηρασία. Μια ενδιάµεση κατάσταση αποτελεί το ιδανικό, ειδικά όταν τα µοσχεύµατα φυτεύονται κατευθείαν στο εξωτερικό περιβάλλον. Παράλληλα, η καλύτερη περίοδος για την συλλογή τους είναι αυτή όπου οι οφθαλµοί του δέντρου αρχίζουν να ενεργοποιούνται 51

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία και να αυξάνονται. Οι Hartmann και Kester (1983) αναφέρουν ότι µοσχεύµατα κωνοφόρων στις εύκρατες περιοχές τείνουν να ριζοβολούνε καλύτερα, όταν η συλλογή τους γίνεται από τα τέλη του φθινοπώρου έως τα τέλη του χειµώνα. Το υπόστρωµα ριζοβολίας θα πρέπει να εξασφαλίζει ικανοποιητική αλλά όχι εκτεταµένη υγρασία. Τέλος, ό,τι έχει να κάνει µε τις προµεταχειρήσεις, ρυθµιστές αύξησης ριζοβολίας όπως είναι ινδολυλοξικό οξύ (IAA, indole-3-acetic acid), το ινδολυλοβουτυρικό οξύ (IBΑ, indole-3-butyric acid), το ναφθαλινικό οξύ (NAA, a- naphthaleneacetic acid) είναι κατάλληλες για εργασίες µικρής κλίµακας ακόµα και για δενδρόκηπους (Quijada, 1985). 3.2.2 Καταβολάδες Ο πολλαπλασιασµός µε καταβολάδες, είναι µια τεχνική βλαστικού πολλαπλασιασµού, όπου ένα κλαδί ενός δέντρου ή ενός θάµνου έρχεται σε επαφή µε έδαφος και εκπτύσσει ρίζες. Η µέθοδος αυτή αποτελεί τον κύριο τρόπο πολλαπλασιασµού των θάµνων, αλλά µπορεί να εφαρµοστεί και τεχνητά στα δέντρα, όταν πλάγια κλαδιά ακουµπήσουν στο έδαφος και καλυφθούν µε χούµο, άµµο, τύρφη, βρύα, φυτόχωµα και διατηρηθεί υψηλή υγρασία. (Πανέτσος, 1986) Η όλη διαδικασία µπορεί να υποβοηθηθεί και µε τη χρήση ορµονών, όµοιες µε αυτές που χρησιµοποιούνται και στα µοσχεύµατα (Εικ.4). Εικόνα 4. Μέθοδος πολλαπλασιασµού µε καταβολάδες 52

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία Ο πιο κοινός τύπος καταβολάδων που χρησιµοποιούνται στη πράξη είναι οι αεροκαταβολάδες. Ουσιαστικά αναφερόµαστε στο ίδιο φαινόµενο µε τη µόνη διαφορά, ότι αντί το κλαδί να έρθει σε επαφή µε το έδαφος και να καλυφθεί µε υλικό που διευκολύνει τη ριζοβολία το υλικό αυτό µεταφέρεται στο κλαδί (Εικ.5). Η µέθοδος αυτή είναι κατάλληλη για είδη που παρουσιάζουν δυσκολίες στη ριζοβόληση των µοσχευµάτων καθώς και σε περιπτώσεις όπου υπάρχει ασυµβίβαστο µεταξύ υποκειµένου και εµβολίου. (Zobel and Talbert 1984, Quijada, 1985) Εικόνα.5. Πολλαπλασιασµός µε αεροκαταβολάδες 3.2.3 Ιστοκαλλιέργεια- Μικροπολλαπλασιασµός Η ιστοκαλλιέργεια (tissue culture) είναι η τεχνική µε την οποία κύτταρα ή µικρά τεµάχια ιστών ή όργανα, που έχουν αποσπαστεί από το φυτό δότη, καλλιεργούνται ασηπτικά σε θρεπτικό υπόστρωµα. Επειδή η καλλιέργεια γίνεται σε δοκιµαστικούς σωλήνες, γυάλινα βάζα ή κωνικές φιάλες, η τεχνική αυτή είναι γνωστή και ως υαλοκαλλιέργεια (in vitro culture) (Εικ.6). Το καλλιεργούµενο in vitro φυτικό τµήµα, ανεξάρτητα από την προέλευση του, ονοµάζεται έκφυτο (explant). Ως έκφυτα µπορούν να χρησιµοποιηθούν οποιαδήποτε φυτικά τµήµατα που έχουν τη δυνατότητα να αναπαράγουν το αρχικό φυτό. Τέτοια είναι τα επάκρια µεριστώµατα, τα πλευρικά µεριστώµατα (βλαστών και ριζών), οι µασχαλιαίοι οφθαλµοί, οι κορυφές των βλαστών, τα γόνατα των βλαστών, τα έµβρυα των σπερµάτων, καθώς και τµήµατα νεαρών φύλλων, κοτυληδόνων, υποκοτυλίου και ριζών. Ελέγχοντας κάθε φορά τη χηµική σύσταση του θρεπτικού υποστρώµατος και τις παραµέτρους του περιβάλλοντος, η αύξηση και η ανάπτυξη των καλλιεργειών 53

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία µπορούν να προσανατολισθούν ανάλογα µε το σκοπό, σε διαφορετικά κανάλια διαφοροποίησης. Για τη διαφοροποίηση των βλαστών απαιτούνται ρυθµιστές αύξησης που περιλαµβάνουν τις κυτοκινίνες όπως η BAP (6-benzylaminopurine), η ζεατίνη (zeatin) και η κινιτίνη (kinetin), ενώ οι ρίζες γενικά επάγονται από τις αυξίνες όπως το NAA (naphthaleneacetic acid), το IAA (indole-3-acetic acid), τo ΙΒΑ ( indole-3-butyric acid) και το 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid). Tόσο οι κυτοκινίνες όσο και οι αυξίνες είναι απαραίτητες για την αύξηση των ιστών και η διαφοροποίηση των βλαστών ή των ριζών προσδιορίζεται από την αναλογία αυξινών/ κυτοκινίνες στο θρεπτικό υπόστρωµα. Γενικά, έχουν χρησιµοποιηθεί δυο προσεγγίσεις για τoν in vitro βλαστικό πολλαπλασιασµό των κωνοφόρων: η οργανογένεση και η σωµατική εµβρυογένεση. Η οργανογένεση είναι η παραγωγή φυτών µέσω της επαγωγής οργάνων (βλαστοί ή ρίζες) από µεριστώµατα οφθαλµών, από έκφυτα µεσογονατίων στελεχών ή από καλλιέργειες κάλλων. Η οργανογένεση µπορεί να συµβεί µε τουλάχιστον δυο οδούς: από τυχαίους (adventitious) οφθαλµούς/βλαστούς σε κάλλους (Sommer et al. 1975, John 1983, Thorpe and Biondi 1984, Bonga 1987, Hackett 1987) και από µασχαλιαίους (axillary) οφθαλµούς/βλαστούς από µεριστώµατα οφθαλµών ή από έκφυτα µεσογονατίων στελεχών (Abdullah et al. 1984, Burns et al. 1991, Jelaska et al. 1982, Kaul 1987, Toribio and Pardos 1989). Η σωµατική εµβρυογένεση περιλαµβάνει τη διαφοροποίηση εµβρύων από σωµατικούς ιστούς που κατόπιν αναπτύσσονται σε φυτά. Τα σωµατικά έµβρυα προέρχονται από εµβρυογενετικά κύτταρα νεαρών ή ώριµων εµβρύων. Τα σωµατικά έµβρυα είναι διπολικά, έχοντας ένα πόλο βλαστού και ένα πόλο ρίζας. Αντίθετα µε την οργανογένεση, όπου οι βλαστοί και οι ρίζες αναπτύσσονται διαδοχικά σε διαφορετικά υποστρώµατα, η σωµατική εµβρυογένεση είναι µια διαδικασία ενός βήµατος, βλαστοί και ρίζες αναπτύσσονται δηλαδή ταυτόχρονα. Σωµατικά έµβρυα έχουν παραχθεί σε έναν ικανοποιητικό αριθµό κωνοφόρων ειδών (Atrre et al. 1990b,1992, Barbas et al. 2000, Roberts et al. 1990b, Mo and von Arlold 1991, Becwar 1993). Τις τελευταίες δεκαετίες, η καλλιέργεια φυτικών ιστών έχει υιοθετηθεί από τα περισσότερα επιστηµονικά εργαστήρια του κόσµου και αποτελεί πλέον σήµερα βασικό ερευνητικό εργαλείο των γενετιστών, βοτανολόγων και φυτοπαθολόγων. Γενικά, η ιστοκαλλιέργεια αποτελεί ένα σύστηµα «µοντέλο» που επιτρέπει τη µελέτη θεµάτων φυσιολογίας, ανατοµίας, βιοχηµείας και γενετικής βελτίωσης των φυτών (Σκαλτσογιάννης, 1988). 54

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία Εικ.6 Η τεχνική της ιστοκαλλιέργειας 3.2.4 Εµβολιασµός Ο εµβολιασµός είναι η εφαρµογή τεχνικής µε επιδίωξη την ένωση ενός εµβολίου (graft) (βλαστικό τµήµα ενός φυτού), που προέρχεται από ένα δέντρο «δότη», µε ένα υποκείµενο (rootstock), (συνήθως σπορόφυτο). Το νέο φυτό που θα αναπτυχθεί, θα έχει το ριζικό σύστηµα που προέρχεται από το υποκείµενο και το υπόλοιπο, από το σηµείο του εµβολιασµού και άνω, θα είναι ακριβές αντίγραφο του φυτού από το οποίο πάρθηκε το εµβόλιο (Πανέτσος, 1986). Ανάλογα µε την ταξονοµική σχέση που υπάρχει µεταξύ υποκειµένου και εµβολίου, ο εµβολιασµός διακρίνεται σε: - Ετεροπλαστικός εµβολιασµός (υποκείµενο και εµβόλιο ανήκουν σε διαφορετικά είδη) - Οµοπλαστικός εµβολιασµός (υποκείµενο και εµβόλιο ανήκουν στο ίδιο είδος). Ο οµοπλαστικός εµβολιασµός καλείται και αυτοπλαστικός όταν εµβόλιο και υποκείµενο έχουν τον ίδιο γενότυπο (Quijada, 1985). Ο εµβολιασµός αποτελεί µια από τις παλαιότερες τεχνικές βλαστικού πολλαπλασιασµού µε ευρεία εφαρµογή στη δασοπονική πράξη όπως είναι η δηµιουργία σποροπαραγωγών κήπων και τραπεζών κλώνων καθώς και η διατήρηση και ο πολλαπλασιασµός επιθυµητών γενοτύπων. Ο εµβολιασµός µπορεί να γίνει σε βολόφυτα ή και σε φυτά που αναπτύσσονται στην οριστική θέση που πρόκειται να εγκατασταθεί ο κήπος. Εµβολιασµός που γίνεται σε δεντρύλλια στο φυτώριο, µπορεί 55

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία να παρουσιάσει αποτυχία κατά τη µεταφύτευση των γυµνόριζων εµβολιασθέντων φυτών από το φυτώριο, στην οριστική τους θέση. Στην περίπτωση όµως της µαύρης πεύκης του κήπου Χολοµώντα Χαλκιδικής, φυτά που εµβολιασθήκαν στο φυτώριο Αρναίας, µεταφυτεύτηκαν γυµνόριζα µε µεγάλη επιτυχία (Πανέτσος, 1986). Για τη δηµιουργία των διαφόρων τοµών του υποκειµένου και του εµβολίου, χρησιµοποιούνται ειδικά µαχαίρια εµβολιασµού, τα οποία πρέπει να διατηρούνται καθαρά και κοφτερά για την αποφυγή µολύνσεων και την καταστροφή των καµβιακών κυττάρων. Τα εµβόλια δένονται στο υποκείµενο µε ηµι-ελαστικό κάλυµµα που ονοµάζεται ταινία εµβολιασµού και περιέχει και µυκητοκτόνο µείγµα, για να αποφευχθούν προσβολές από µύκητες. Πολλές φορές για την στερέωση του εµβολίου γίνεται και χρήση ειδικού κεριού εµβολιασµών (Quijada, 1985). Τα είδη του εµβολιασµού είναι πολλά και περιγράφονται από µια πληθώρα ερευνητών, µεταξύ των οποίων είναι Πανέτσος (1986), Hartmann και Kester (1983), Dorman (1976), Garner (1979), Rauter (1982) κ.α. Μερικές φορές δεν είναι σηµαντικό το ποιά µέθοδος θα χρησιµοποιηθεί. Παρόλα αυτά έχουνε αναπτυχθεί εξειδικευµένες µέθοδοι για τα δασικά είδη που εµβολιάζονται στο τοπίο, όπου επικρατούνε δύσκολες συνθήκες και το περιβάλλον δε µπορεί να ελεγχθεί. Κάποια είδη, ειδικά κάποια πλατύφυλλα, δεν εµβολιάζονται τόσο εύκολα όσο κάποια άλλα, όπως είναι τα κωνοφόρα, και για αυτό είναι απαραίτητες κάποιες τροποποιήσεις στις συνηθισµένες µεθόδους, έτσι ώστε να επιτευχθεί ένας ικανοποιητικός βαθµός επιτυχίας (Zobel and Talbert, 1984). Σύµφωνα µε τους Wright (1976) και Πανέτσο (1986) τα κυριότερα είδη εµβολιασµού είναι τα ακόλουθα: 3.2.4.1 Πλάγιος εµβολιασµός Σύµφωνα µε την τεχνική αυτή, η βάση του εµβολίου κόβεται λοξά έτσι ώστε να εµφανιστεί µια µακρόστενη επιφάνεια του καµβίου. Στο υποκείµενο γίνεται επίσης µια πλευρική τοµή στο ίδιο µήκος και πλάτος µε αυτή του εµβολίου, έτσι ώστε τα δυο κάµβια να έρθουν σε τέλεια επαφή. Παράλληλα µπορεί να γίνει και µια εγκοπή στο κάτω άκρο της τοµής του υποκειµένου και ανάλογη σε πλάτος στο εµβόλιο, ενέργεια η οποία εξασφαλίζει καλύτερη στερέωση και µεγαλύτερη επιφάνεια επαφής (Εικ.7,8). Όταν γίνει η σύνδεση των σηµείων επαφής και αρχίσει η αυξητική δραστηριότητα του εµβολίου, τότε κόβεται το τµήµα του υποκειµένου πάνω από τη θέση εµβολιασµού (Εικ.7,8). 56

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία Εικόνα 7. Πλάγιος εµβολιασµός Εικόνα 8. Πλάγιος εµβολιασµός µε δηµιουργία εγκοπής Μια παραλλαγή της µεθόδου, είναι και αυτή όπου το υποκείµενο κόβεται πρώτα στη θέση εµβολιασµού και µετά γίνεται ο εµβολιασµός (Εικ.9). Ο πλάγιος εµβολιασµός βρήκε εφαρµογή στον βλαστικό πολλαπλασιασµό αρκετών κωνοφόρων ειδών αφού πολλοί ήταν οι ερευνητές που τον χρησιµοποίησαν για το σκοπό αυτό όπως οι Mowat και Silen (1957), Matziris (1982), Melchior (1984), Kidar και Ertekin (2007). 57

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία Εικόνα 9. Πλάγιος εµβολιασµός µε αποκοπή του υποκειµένου 3.2.4.2 Εµβολιασµός µε σχισµή Στο είδος αυτό του εµβολιασµού, το υποκείµενο κόβεται αρχικά στο ύψος που θα γίνει ο εµβολιασµός και στη συνέχεια γίνεται µια τοµή σε σχήµα σφήνας. Το άκρο του εµβολίου, µε κατάλληλες τοµές, διαµορφώνεται επίσης σε σχήµα σφήνας, συµπληρωµατικής του υποκειµένου. Όταν και τα δυο έχουνε την ίδια διάµετρο, είναι δυνατή µια πλήρης και επιτυχής ένωση των καµβίων τους (Εικ.10). Η µέθοδος του εµβολιασµού σε Σχισµή εφαρµόστηκε από πολλούς ερευνητές όπως οι Slee και Spidy(1970), Copes (1972), Mantziris (1982), Lot et al. (2003), Chauhan et al. (2007), Frey et al. (2010), οι οποίοι εργάστηκαν σε µια πληθώρα κωνοφόρων ειδών. Εικόνα 10. Εµβολιασµός σε σχισµή 58

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία 3.2.4.3 Εµβολιασµός Αγγλικού τύπου Στον τύπο αυτό του εµβολιασµού, το υποκείµενο κόβεται διαγώνια σε όλο το πάχος του βλαστού. Η ίδια ενέργεια επαναλαµβάνεται και στο κάτω άκρο του εµβολίου. Απαραίτητη προϋπόθεση στη περίπτωση αυτή, είναι ότι το υποκείµενο και το εµβόλιο θα πρέπει να έχουν την ίδια διάµετρο, καθώς και ότι οι τοµές θα πρέπει να γίνονται µε την ίδια γωνία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η τέλεια επαφή των δυο καµβίων. Έπειτα ακολουθεί στερέωση του υποκείµενου στο εµβόλιο µε τον τρόπο που αναφέρθηκε παραπάνω (Εικ.11). Η µέθοδος του εµβολιασµού Αγγλικού τύπου χρησιµοποιήθηκε από τους Mowat και Silen (1957), στον βλαστικό πολλαπλασιασµό του είδος Pinus ponderosa και τον Hajek (2009) στα είδη Pinus sylvestris και Picea abies. Εικόνα 11. Εµβολιασµός Αγγλικού τύπου 3.2.4.4 Ενοφθαλµισµός Ο ενοφθαλµισµός είναι µια παραλλαγή του εµβολιασµού. Στην περίπτωση αυτή το εµβόλιο είναι ένας κοιµώµενος οφθαλµός µε ένα µικρό κοµµάτι φλοιού. Με ένα ειδικό µαχαίρι εµβολιασµού, γίνεται µια τοµή, συνήθως σε σχήµα Τ, στο πλευρό του υποκειµένου. Έπειτα ανοίγεται ο φλοιός, προσαρµόζεται ο οφθαλµός στο άνοιγµα που δηµιουργείται και τελικά ακολουθεί δέσιµο αυτό στο υποκείµενο. Η τεχνική αυτή γίνεται σε εποχή όπου οι οφθαλµοί είναι κοιµώµενοι, αλλά υπάρχουν παράλληλα αρκετοί χυµοί στο υποκείµενο έτσι ώστε αυτό να ξεφλουδίζεται εύκολα. 59

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία Τέτοια εποχή είναι αργά το καλοκαίρι ή νωρίς την άνοιξη, όπου και αρχίζει η κίνηση των χυµών (Εικ. 12). Εικόνα 12. Η τεχνική του ενοφθαλµισµού 3.2.4.5 Απαραίτητες προϋποθέσεις και παράγοντες που επηρεάζουν την επιτυχία των εµβολιασµών Για την επιτυχία του εµβολιασµού είναι απαραίτητη η τήρηση µιας σειράς προϋποθέσεων. Η τέλεια και σταθερή επαφή των καµβίων του εµβολίου και του υποκειµένου, τουλάχιστον στη µια πλευρά του εµβολίου είναι µια από αυτές. Αυτό είναι πιο εύκολο να επιτευχθεί, όταν τα υποκείµενα είναι νεαρά σπορόφυτα µε διάµετρο ίδια ή ελαφρώς µεγαλύτερη από αυτή των εµβολίων, και χρησιµοποιείται η µέθοδος του πλάγιου εµβολιασµού ή ο εµβολιασµός σε σχισµή. Το µαχαίρι εµβολιασµού πρέπει να κόβει καλά και οι τοµές να γίνονται µε ταχύτητα µε την ελάχιστη ζηµιά του καµβίου. Είναι επίσης απαραίτητη η διατήρηση της υγρασίας των τοµών τόσο του υποκειµένου όσο και του εµβολίου, για αυτό ο εµβολιασµός θα πρέπει να γίνεται αµέσως µετά τη δηµιουργία αυτών. Στην καλύτερη περίπτωση µια γρήγορη και ιδανική τοµή θα καταστρέψει τα καµβιακά κύτταρα που βρίσκονται στην επιφάνεια τοµής. Στην περίπτωση που το µαχαίρι δεν είναι κοφτερό και ο εµβολιαστής εργάζεται µε αργούς ρυθµούς, θα υπάρξει µια νέκρωση επιπλέον 60

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία καµβιακών κυττάρων, γεγονός που µπορεί να οδηγήσει στην αποτυχία των εµβολιασµών. Το σηµείο επαφής θα πρέπει να προστατεύεται και να διατηρεί την υγρασία του για πολλές εβδοµάδες µετά τον εµβολιασµό. Αυτό επιτυγχάνεται µε την περιτύλιξη της τοµής µε ταινία εµβολιασµού, η οποία προτιµάται να έχει την ιδιότητα να αποσυντίθεται µετά από µερικές εβδοµάδες. Σε διαφορετική περίπτωση, θα πρέπει να αφαιρείται όταν η ένωση του εµβολίου έχει πραγµατοποιηθεί. Παράλληλα η χρήση της ταινίας ή του κεριού εµβολιασµών, π.χ. παραφίνη, εξασφαλίζει και τη στερέωση της τοµής έτσι ώστε να αποφεύγεται οποιαδήποτε µετακίνηση του εµβολίου από το υποκείµενο. Μετά το πέρας των παραπάνω ενεργειών θα πρέπει να ακολουθεί ράντισµα µε υγρό ή επίπαση µε σκόνη εντοµοκτόνο, π.χ. µαλαθείο, για τον έλεγχο των αφίδων ή άλλων εντόµων. Απαραίτητη για τη διατήρηση της υγρασίας, κρίνεται και η κάλυψη του εµβολίου και του υποκειµένου µε µια πλαστική σακούλα εσωτερικά, και εξωτερικά µε µία χάρτινη, µη διαπερατή από το φως, η οποία βοηθά στην προστασία από την ηλιακή ακτινοβολία. Μια άλλη παράµετρος η οποία επηρεάζει την επιτυχία είναι οι συνθήκες κάτω από τις οποίες γίνονται οι εµβολιασµοί. Ο υγρός και δροσερός καιρός αποτελούνε τις άριστες συνθήκες. Διενέργεια εµβολιασµών κάτω από ψυχρές συνθήκες και δυνατούς ανέµους θα πρέπει να αποφεύγεται. Στα ψυχρά κλίµατα, η όλη διαδικασία λαµβάνει χώρα µέσα σε θερµοκήπια. Τα εµβόλια παραµένουν εκεί για µερικές εβδοµάδες σε θερµοκρασία 20-25 C, χωρίς σκίαση και µε επιπρόσθετο φωτισµό, (µε µια φωτοπερίοδο 18-20 ώρες φως) και πότισµα 1-2 φορές καθηµερινά. Σε υγρά και θερµά κλίµατα ο εµβολιασµός µπορεί να λάβει χώρα στην ύπαιθρο. Σχεδόν πάντα σε αυτές τις περιπτώσεις όµως, θα πρέπει να διατηρείται η υγρασία των εµβολίων µε τις µεθόδους που αναφέρθηκαν παραπάνω. Στα περισσότερα οπωροφόρα δέντρα ο εµβολιασµός γίνεται σε θερµοκήπια, πάνω σε γυµνόριζα υποκείµενα. Η ίδια πρακτική εφαρµόζεται και σε ορισµένα πλατύφυλλα δασικά είδη. Η χρήση γυµνόριζων υποκειµένων αποδείχθηκε αναποτελεσµατική στα περισσότερα κωνοφόρα. Έτσι, στις περιπτώσεις αυτές προτείνεται, τα υποκείµενα να είναι βολόφυτα ή ο εµβολιασµός να γίνεται σε φυτά που έχουνε φυτευτεί στην οριστική τους θέση, ένα χρόνο πριν. Στα οπωροφόρα δέντρα, συνηθίζεται να γίνονται εµβολιασµοί µε εµβόλια που ανήκουν σε διαφορετικό είδος από αυτό του υποκειµένου. Με την πρακτική αυτή, ανακαλύφθηκαν υποκείµενα που προάγουν την παραγωγή φρούτων, ενώ τα 61

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία δέντρα βρίσκονται ακόµη σε νεαρή ηλικία. Τέτοιου είδους όµως υποκείµενα δεν έχουν ανακαλυφθεί για τα δασικά είδη, για αυτό και η επιτυχία είναι µεγαλύτερη όσο µεγαλύτερη είναι και η γενετική συγγένεια µεταξύ υποκειµένου και εµβολίου. Γενικά η επιτυχία του εµβολιασµού ποικίλλει µεταξύ ειδών, δέντρων του ίδιου είδους και εξαρτάται και από την εποχή που έγινε. Επίσης η µέθοδος που θα εφαρµοστεί µπορεί να αποδειχθεί κατάλληλη για ένα είδος, ενώ για ένα άλλο, µια άλλη να δίνει καλύτερα αποτελέσµατα. Ένας άλλος παράγοντας που πρέπει να λαµβάνεται υπόψη, είναι η ηλικία του δέντρου «δότη» (όσο µεγαλύτερη ηλικία τόσο πιο δύσκολη η επιτυχία), καθώς και η ηλικία και η κατάσταση του υποκειµένου (θα πρέπει να προτιµώνται νεαρά δεντρύλλια µε καλή ανάπτυξη). Οι οφθαλµοί του εµβολίου θα πρέπει να βρίσκονται σε πλήρη ανάπτυξη, γεγονός που µπορεί να ελεγχθεί από το µέγεθος τους και από την περίοδο συλλογής (µικρή διαφοροποίηση και συλλογή στο ξεκίνηµα της βλαστικής τους δραστηριότητας) (Wright, 1976, Quijada, 1985, Πανέτσος, 1986). Πολλές φορές η αποτυχία των εµβολιασµών, δεν οφείλεται στην τεχνική του εµβολιασµού που χρησιµοποιείται ούτε στη µικρή εµπειρία του ατόµου που διενεργεί τους εµβολιασµούς. Ο βασικότερος λόγος αποτυχίας είναι η µικρή φροντίδα που δίνεται στα εµβόλια ή στα υποκείµενα πριν ή κατά τη διάρκεια της διαδικασίας των εµβολιασµών καθώς και αυτή που παρέχεται µετά το πέρας αυτών. Πολύ µεγαλύτερος αριθµός εµβολίων νεκρώνονται εξαιτίας της κακής τους διαχείρισης, παρά εξαιτίας του εµβολιασµού αυτού καθαυτού (Zobel and Talbert, 1984). Όσον αφορά στα πεύκα και γενικά σε όλα τα κωνοφόρα, επειδή παρουσιάζουν δυσκολίες στον εµβολιασµό, αλλά είναι και συγχρόνως και τα πιο σηµαντικά δασοπονικά είδη, ο Πανέτσος (1986) προτείνει ορισµένες επιπλέον προϋποθέσεις που πρέπει να τηρούνται για να είναι επιτυχής η όλη προσπάθεια. α) Συλλογή εµβολίων 1) Τα εµβόλια πρέπει να συλλέγονται από τα άνω δυο τρίτα της κόµης, από καλά αποξυλωµένα κλαδιά. 2) Τα εµβόλια πρέπει να προέρχονται από την αύξηση του τελευταίου χρόνου. 3) Τα εµβόλια και τα δέντρα «δότες», να είναι υγιή, µε καλά σχηµατισµένους οφθαλµούς, 4) Τα εµβόλια να µη φέρουν ανθοφόρους οφθαλµούς. 5) Ο εµβολιασµός να γίνεται νωρίς την άνοιξη. 62

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία β) Εµβολιασµός 1) Οι βελόνες πρέπει να αποµακρύνονται από το εµβόλιο και το υποκείµενο, σε όλο το µήκος που θα γίνουν οι τοµές, χωρίς να πληγωθεί ο φλοιός. 2) Οι βελόνες του εµβολίου κόβονται µε ψαλίδι σε µήκος 2 εκατοστών, γύρω από τον επάκριο οφθαλµό και αποµακρύνονται τυχόν ανθοφόροι οφθαλµοί. 3) Ο εµβολιασµός λαµβάνει χώρα όσο το δυνατόν πιο κοντά στον επάκριο οφθαλµό του υποκειµένου. 4) Οι τοµές του εµβολίου αρχίζουν 2-3 εκατοστά κάτω από τον επάκριο οφθαλµό. 5) Τα χέρια δε πρέπει να έρχονται σε επαφή µε τις τοµές. 6) Μέσα στην περιτύλιξη µε την ταινία εµβολιασµού, δε πρέπει να περιλαµβάνονται βελόνες ή άλλα ξένα υλικά. 7) Μετά το πέρας του εµβολιασµού, τοποθετείται στο εµβόλιο ετικέτα µε τα αρχικά του εµβολιαστή, τον αριθµό του δέντρου «δότη» και την ηµεροµηνία εµβολιασµού. γ) Μετά τον εµβολιασµό 1) Όταν οι νέες βελόνες αναπτυχθούνε κατά 0,5 εκατοστά περίπου, ελέγχονται οι ταινίες και αν έχουνε γίνει πολύ σφιχτές, λύνονται και γίνεται νέα περιτύλιξη. 2) Όταν οι βελόνες του εµβολίου αυξηθούνε κατά 1 εκατοστό, ανοίγονται πλάγιες τοµές στο πάνω µέρος της πλαστικής σακούλας, (εφόσον ο εµβολιασµός έχει γίνει στην ύπαιθρο) και αντικαθίσταται η χάρτινη σακούλα. 3) 2-3 εβδοµάδες µετά το παραπάνω στάδιο, το εµβόλιο ελευθερώνεται τελείως από κάθε µέσο προστασίας του. Αυτό πρέπει να γίνει σε µέρα όπου επικρατεί συννεφιά, έτσι ώστε το τρυφερό εµβόλιο να µην υποστεί καταπόνηση. Τέλος τα πλάγια κλαδιά του υποκειµένου αποµακρύνονται για να κυριαρχήσει το εµβόλιο. 3.2.4.6 Αλληλεπίδραση υποκειµένου-εµβολίου Μετά από ένα επιτυχηµένο εµβολιασµό και την πλήρη ένωση του εµβολίου µε το υποκείµενο, δεν υπάρχει καµία ανταλλαγή γενετικού υλικού µεταξύ τους και το καθένα διατηρεί τον δικό του γενότυπο. Το γεγονός αυτό καταδεικνύεται εύκολα, αν παρατηρήσουµε τον φλοιό, ειδικά σε περιπτώσεις εµβολιασµού µεταξύ διαφορετικών ειδών. Το σηµείο εµβολιασµού είναι αµέσως ορατό, αφού οι δυο τύποι φλοιού 63

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία διαφέρουν έντονα µεταξύ τους. Όµως υπάρχει η πιθανότητα, τα θρεπτικά στοιχεία που εµπλέκονται µε το ένα τµήµα του δέντρου, να µεταφέρονται µέσω της ένωσης που υπάρχει και να επηρεάζουν το άλλο τµήµα αυτού. Παράλληλα υπάρχει και η πιθανότητα, η εξαιρετικά αργή ή γρήγορη ανάπτυξη του υποκειµένου, να επηρεάζει την ανάπτυξη του εµβολίου µε το να του περιορίζει ή να του παρέχει σε αφθονία θρεπτικά στοιχεία. Η αλληλεπίδραση αυτή µεταξύ υποκειµένου και εµβολίου ήτανε γνωστή από πολύ παλιά, για τα οπωροφόρα δέντρα. Το γεγονός αυτό αποτέλεσε έναυσµα για την έναρξη µιας έντονης ερευνητικής δραστηριότητας πάνω στο θέµα αυτό (Avery 1970, Olien and Lakso 1986, Williams and Smith 1991, Düring 1994, Castle 1995, Webster 1995, Georgiou 2000, Efron et. al. 2003). Γενικά έχει διαπιστωθεί επίδραση του υποκειµένου στο εµβόλιο όσον αφορά την αύξηση, την πρωιµότητα, την καρποφορία, την αντοχή σε ασθένειες και δυσµενείς συνθήκες ακόµη και την ένταση της φωτοσύνθεσης. Εκτός όµως από την επίδραση του υποκειµένου στο εµβόλιο, στα οπωροφόρα δέντρα έχει αναφερθεί και το αντίθετο φαινόµενο. Εµβόλιο από ταχυαυξές δέντρο σε βραδυαυξές υποκείµενο, συµβάλει ώστε αυτό να αποκτήσει διαστάσεις µεγαλύτερες από τις δυνατότητες του. Το αντίθετο συµβαίνει όταν ταχυαυξές υποκείµενο εµβολιάζεται µε εµβόλιο από βραδυαυξές φυτό (Πανέτσος, 1986). Όσον αφορά τα δασικά φυτά και ιδιαίτερα τα κωνοφόρα, η έρευνα δεν έχει πάρει τέτοιες διαστάσεις, όπως στην περίπτωση των οπωροφόρων δέντρων. H επιλογή κατάλληλου υποκειµένου µπορεί να επηρεάσει την επιτυχία των εµβολιασµών και την αύξηση του εµβολίου (Melchior 1984, Dyson 1975). Επιπλέον έχει παρατηρηθεί επίδραση στην ανθοφορία (Melchior 1987, Burczyk και Chalupka 1997, Climent et.al. 1997, Medina Perez et al. 2007), καθώς και επαναφορά νεανικότητας σε εµβόλια που προέρχονται από ώριµο τµήµα της κόµης (Franclet 1981). Αρκετές έρευνες έγιναν και για τη µελέτη της αλληλεπίδρασης µεταξύ υποκειµένου και εµβολίου στη σύνθεση της ρητίνης των εµβολίων και αποδείχθηκε πως τα υποκείµενα δεν την επηρεάζουν (Squillace and Fisher 1966, Chudnyi 1971). Οι Kossuth et al. (1981) αναφέρουν πως εµβόλια του είδους Pinus clausa var. immuginata D.B. Ward τροποποιούν την ποσοστιαία σύνθεση των µονοτερπενίων της ρητίνης των υποκειµένων (Pinus elliottii), ενώ αντίθετα η επίδραση των υποκειµένων φαίνεται να είναι ασήµαντη. Ακόµη ο Smith (2000), αναφέρει πως 15 µε 17 χρόνια 64

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία µετά την διενέργεια εµβολιασµών, όπου εµβόλια και υποκείµενα ανήκαν στο ίδιο είδος (Pinus ponderosa), η σύσταση της ρητίνης των εµβολίων ήταν παρόµοια µε αυτή των µητρικών φυτών παρόλο που τα προηγούµενα χρόνια υπήρχε διαφοροποίηση. Παράλληλα η επίδραση των εµβολίων στα υποκείµενα ήτανε σαφής και αυξανόταν µε την πάροδο των ετών. Στο ίδιο συµπέρασµα καταλήγουν και οι ZhanQian et al. (1995), οι οποίοι χρησιµοποίησαν εµβόλια των ειδών Pinus glabra, Pinus echinata και Pinus patula σε υποκείµενα Pinus elliottii και δεν εντόπισαν καµία διαφοροποίηση στη χηµική σύσταση της ρητίνης των εµβολίων. Γενικά, παρόλο που υπάρχει µια δεδοµένη επίδραση του υποκειµένου στο εµβόλιο, αυτή δε φαίνεται να ακολουθεί κάποιο πρότυπο. Πάντως, κάποια χαρακτηριστικά της κόµης καθώς και κάποιες ιδιότητες και µειονεκτήµατα των εµβολίων, µπορεί να χειραγωγηθούν µε τη χρήση συγκεκριµένων υποκειµένων και να οδηγήσουν στην επίτευξη των επιθυµητών στόχων ( Jayawickrama et.al., 1991). 3.2.4.7 Ασυµβίβαστο Ως ασυµβίβαστο ορίζεται η αδυναµία δυο τµηµάτων διαφορετικών δέντρων (φυτών) να δηµιουργήσουν πετυχηµένη ένωση όταν εµβολιάζονται, ώστε να προκύψει φυτό µε κανονική ανάπτυξη (Πανέτσος, 1986). Σε ένα επιτυχηµένο εµβολιασµό, η πραγµατική ένωση τείνει να περιορίζεται σε µια ή δυο στρώσεις κυττάρων, τόσο του εµβολίου όσο και του υποκειµένου. Οι στρώσεις αυτές των κυττάρων επικαλύπτουν κατά µήκος η µια την άλλη. Στην περίπτωση που εµβόλιο και υποκείµενο είναι απολύτως συµβατά, η ένωση είναι δυνατή και θρεπτικά συστατικά µπορούν να µεταφέρονται επιτυχώς από τη ρίζα στον κορµό και αντίστροφα. Όταν υπάρχει ένας µικρός βαθµός ασυµβατότητας, τα κύτταρα του εµβολίου και του υποκειµένου παραµένουν σε αρµονία µεταξύ τους, αλλά δε συµπλέκονται στο βαθµό που απαιτείται ώστε να δηµιουργηθεί µια µηχανικά δυνατή ένωση. Το εµβόλιο µπορεί να αναπτύσσεται φυσιολογικά µέχρι που κάποια ξαφνική καταπόνηση προκαλεί το σπάσιµο του κορµού στο σηµείο εµβολιασµού. Τέλος στην περίπτωση που ο βαθµός ασυµβατότητας είναι µεγάλος, τα κύτταρα του εµβολίου και του υποκειµένου, δρουν ανταγωνιστικά µεταξύ τους µε αποτέλεσµα την ύπαρξη δυσκολιών στη µεταφορά των θρεπτικών συστατικών που οδηγούν στην ολοκληρωτική αποτυχία του εµβολιασµού. Αυτό το πρόβληµα είναι το ίδιο µε αυτό που εµφανίζεται στις µεταµοσχεύσεις ανθρωπίνων οργάνων (Wright 1976). 65

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία Το φαινόµενο αυτό, εντοπίζεται όχι µόνο στους ετεροπλαστικούς εµβολιασµούς, όπου µπορεί και να αναµένεται εξαιτίας των ταξονοµικών διαφορών, αλλά και στους οµοπλαστικούς. Στη δεύτερη περίπτωση, έχει να κάνει περισσότερο µε διαφορές που οφείλονται στην προέλευση του υλικού (Quijada, 1985). Το ασυµβίβαστο εκδηλώνεται µε διάφορους τρόπους και µορφές και αποτελεί σοβαρή αιτία αποτυχίας µε πολλές συνέπειες. Διακρίνεται κυρίως σε δυο κατηγορίες σύµφωνα µε τον Πανέτσο (1986): α) Εντοπισµένο. Εκδηλώνεται ως αντίδραση των δυο τµηµάτων που έρχονται σε επαφή και µπορεί να ξεπεραστεί µε παρεµβολή ενός τµήµατος άλλου φυτού που συµβιβάζεται τόσο µε το εµβόλιο όσο και µε το υποκείµενο. β) Μεταφερόµενο. Εκδηλώνεται µε εκφυλισµό του αγωγού ιστού και αναγνωρίζεται από την ανάπτυξη γραµµής χρώµατος καφέ, στη θέση εµβολιασµού, αποτέλεσµα νέκρωσης περιοχής του φλοιού. Το φαινόµενο του ασυµβίβαστου µπορεί να εκδηλωθεί γρήγορα, γεγονός που καθιστά αναγκαία τη πραγµατοποίηση περισσοτέρων εµβολίων, έτσι ώστε να εκπληρωθεί ο επιδιωκόµενος στόχος. Το µεγαλύτερο πρόβληµα εντοπίζεται στην περίπτωση του επιβραδυνόµενου ασυµβίβαστου, το οποίο µπορεί να εκδηλωθεί µετά από ένα ή και περισσότερα χρόνια από την εγκατάσταση των φυτών στην ύπαιθρο, γεγονός που οδηγεί σε µεγάλες απώλειες, όπως π.χ. στην περίπτωση των σποροπαραγωγών κήπων. Πληθώρα ερευνητών που ασχοληθήκαν µε εµβολιασµούς σε κωνοφόρα (Wynens 1965, Lantz 1973, Duffield and Weat 1964, Matziris 1996), αλλά και σε πλατύφυλλα (Burgess 1973), ήρθαν αντιµέτωποι µε το πρόβληµα του ασυµβίβαστου. Το γεγονός αυτό αποτέλεσε έναυσµα για έρευνα σχετικά µε τις αιτίες και τον πιθανό έλεγχο του ασυµβίβαστου (Copes 1969, 1970, 1980, 1981, 1982, McKinley 1975, Haines and Dieters 1990, Emmanuel and Bagchi 1984, Slee and Spidy 1970, Cameron and Thomson 1971, Sharma and Uniyal 2003). Έτσι ανακαλύφθηκαν κάποια εξωτερικά συµπτώµατα τα οποία καταδεικνύουν την ύπαρξη ασυµβίβαστου. Το πιο σύνηθες σύµπτωµα είναι η διόγκωση που παρατηρείται πάνω από το σηµείο εµβολιασµού και προέρχεται από την υπεραύξηση του εµβολίου λόγω ασυνέχειας του αγωγού ιστού. Ακόµη ανωµαλίες στις βελόνες και τα φύλλα, ακόµη και αυτών της τρέχουσας χρονιάς, αποτελούν σοβαρές ενδείξεις. Συνήθως, είναι µικρές µε χρώµα καφετί στις άκρες τους. Ένα ακόµη σύµπτωµα αποτελεί και η εκροή ρητίνης από τις βελόνες των κωνοφόρων καθώς και η παρουσία έντονης ανθοφορίας. 66

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία Γενικά η εµφάνιση του ασυµβίβαστου θα πρέπει να αναµένεται σε κάθε περίπτωση όπου διενεργούνται εµβολιασµοί. Έχει αποδειχθεί ότι είναι θέµα αλληλεπίδρασης κλώνου και υποκειµένου και η αιτία εµφάνισης του έχει άµεση σχέση µε τις γενετικές διαφορές που παρουσιάζουν. Οι µηχανισµοί όµως, που δραστηριοποιούνται για την εκδήλωση των διαφόρων µορφών ασυµβίβαστου δεν είναι ακόµη σαφείς. Ένας πιθανός µηχανισµός είναι οι βιοχηµικές και φυσιολογικές διαφορές µεταξύ εµβολίου και υποκειµένου. Τέλος πολλές φορές αποδείχθηκε ότι η αποτυχία των εµβολιασµών δεν είχαν ως αιτία το ασυµβίβαστο, αλλά προσβολές από ιούς ή παθογόνα στο σηµείο του εµβολιασµού, οι οποίες παρουσίαζαν όµοια µε αυτό συµπτώµατα. 3.3 Κλωνική Δασοπονία Η κλωνική δασοπονία (Clonal Forestry), αναφέρεται στην αξιοποίηση σε µαζική κλίµακα σχετικά λίγων (15-50) γνωστών κλώνων που έχει αποδειχτεί η υπεροχή τους σε κλωνικές δοκιµές. (Burdon 1989, Talbert et al., 1993). Η κλωνική δασοπονία µας παρέχει τη δυνατότητα: 1) Της ανάπτυξης των ίδιων γνωστών, αξιόπιστων κλώνων για πολλά έτη, ακόµη και για αρκετούς περίτροπους χρόνους 2) Της υιοθέτησης διαχειριστικών πρακτικών εξειδικευµένων στον κάθε κλώνο, περιλαµβάνοντας τον συνδυασµό του κλώνου µε το κατάλληλο περιβάλλον και την αριστοποίηση των δασοκοµικών χειρισµών των διαφορετικών κλώνων Η εφαρµογή της κλωνικής δασοπονίας περιλαµβάνει µια σειρά από απαραίτητα στάδια. Το πρώτο στάδιο, αφορά στην ίδρυση κλωνικών δοκιµών µε µεγάλους αριθµούς κλώνων, οι οποίες ιδρύονται σε αρκετές θέσεις δοκιµής που περιέχουν η καθεµία τους πολλαπλά µέλη του ίδιου κλώνου. Κατά το δεύτερο στάδιο, όταν οι κλωνικές δοκιµές έχουν φτάσει σε µια κατάλληλη ηλικία επιλογής, παίρνονται µετρήσεις που χρησιµοποιούνται στη πρόβλεψη των κλωνικών γενετικών αξιών για όλους τους κλώνους. Τέλος, κατά το τρίτο στάδιο, οι καλύτεροι από αυτούς (10-50), επιλέγονται και πολλαπλασιάζονται σε µεγάλη κλίµακα είτε µε µοσχεύµατα είτε µε ιστοκαλλιέργεια, για να δώσουν φυτάρια για τις επιχειρησιακές αναδασώσεις. Η κλωνική δασοπονία παρουσιάζει µια σειρά πλεονεκτηµάτων που σχετίζονται µε την αύξηση του γενετικού κέρδους και περιλαµβάνουν: 1) Την καλύτερη αξιοποίηση της αθροιστικής γενετικής διακύµανσης, γιατί οι διαφορές µεταξύ των δοκιµασµένων κλώνων την περιλαµβάνουν ολόκληρη. 67

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία 2) Την πλήρη δέσµευση τη µη-αθροιστικής γενετικής διακύµανσης αφού οι κλώνοι που δηµιουργούνται διατηρούν ολόκληρη τη γενετική τους αξία. 3) Την αξιοποίηση της αλληλεπίδρασης γενοτύπου x περιβάλλον, µε την ανάπτυξη δοκιµασµένων κλώνων εξειδικευµένων για συγκεκριµένες εδαφοκλιµατικές συνθήκες. 4) Την ταυτοποίηση των εξαιρετικών κλώνων που συνδυάζουν δυο επιθυµητά χαρακτηριστικά, που στη περίπτωση των σποροφύτων εκδηλώνουν αρνητική συσχέτιση µεταξύ τους. Παρόλα αυτά, παρουσιάζονται κάποιες δυσκολίες στην εφαρµογή των προγραµµάτων κλωνικής δασοπονίας, οι οποίες σχετίζονται µε: 1) Τη δυσκολία στην αποτελεσµατική παραγωγή πολλαπλασιαστικού υλικού, από υλικό στην ηλικία επιλογής. 2) Την ωριµότητα που µπορεί να περιορίσει την χρήσιµη επιχειρησιακή ζωή των δοκιµασµένων κλώνων. 3) Την επίδραση των C-effects (τοπόφυση, κυκλόφυση, περίφυση, µητρικές επιδράσεις, µη-πυρηνικές γενετικές επιδράσεις). 4) Τις σωµατικές µεταλλάξεις που µπορούν να προκαλέσουν γενετική ποικιλότητα µέσα στους κλώνους. 5) Τον µεγάλο αριθµό των αρχικών κλώνων που πρέπει να ελεγχθούν για την τελική επιλογή αυτών (10-50) που θα αξιοποιηθούν επιχειρησιακά. Η επιτυχία των προγραµµάτων της κλωνικής δασοπονίας εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από την βιολογία του είδους, γι αυτό και τα περισσότερα από αυτά αναφέρονται σε είδη που µπορούν να πολλαπλασιαστούν βλαστικά σε µαζική κλίµακα κατά την ηλικία επιλογής, όπως είναι αρκετά είδη του γένους Eucalyptus (Duncan et al. 2000), Populus, Salix όπως και το είδος Picea abies (Bentzer 1993). Άλλες εφαρµογές της αφορούν στην αγροδασοπονία, στα χριστουγεννιάτικα δέντρα και στην τοπογραφία στο αστικό τοπίο (White et al. 2007). 3.4 Διέγερση και ανάπτυξη των µασχαλιαιών οφθαλµών βραχυκλαδίων στο γένος Pinus ως βασική προµεταχείρηση στο βλαστικό πολλαπλασιασµό επιλεγµένων ατόµων χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis Mill.) Ο βλαστικός πολλαπλασιασµός στο γένος Pinus δεν έχει βρει ευρεία εφαρµογή εξαιτίας της δυσκολίας που παρουσιάζεται στην ριζοβόληση των 68

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία µοσχευµάτων, κυρίως εκείνων που προέρχονται από ώριµα δέντρα, καθώς και της αδυναµίας οργανογένεσης in vitro. Για τους παραπάνω λόγους µια πληθώρα ερευνητών έχει προτείνει τα βραχυκλάδια (brachyblast ή needle fascicle) ως το άριστο όργανο για τον βλαστικό πολλαπλασιασµό των κωνοφόρων ειδών. Τα βραχυκλάδια των κωνοφόρων και κυρίως αυτά του γένους Pinus συνίστανται από ένα ορισµένο αριθµό βελονών, ενωµένες στη βάση τους µε κολεό και φέρουν στη µασχάλη τους ένα µικροσκοπικό οφθαλµό που ονοµάζεται µασχαλιαίος οφθαλµός τους βραχυκλαδίου (interfascicular bud) (Εικ.13). Η πρώτες επιτυχηµένες προσπάθειες ριζοβολίας βραχυκλαδίων αναφέρονται στο είδος Pinus strobus από τους Thimann και Delisle (1939) και Delisle (1942). Οι Reines και McAlpine (1959), εργαζόµενοι στο είδος Pinus elliοttii, πέτυχαν τη διέγερση των µασχαλιαίων οφθαλµών των βραχυκλαδίων και την ανάπτυξη τους σε βλαστούς, αποµακρύνοντας όλους τους ακραίους οφθαλµούς των µακροκλαδίων. Έκτοτε µια πληθώρα ερευνητών όπως οι Kummerow και Hoffmann(1963), Cohen και Shanks(1975), Kossuth (1980), Inglis (1984), κατέληξαν στα ίδια αποτελέσµατα, εργαζόµενοι σε διάφορα είδη πεύκης, χρησιµοποιώντας ως µέσο διέγερσης (εκτός από την αποµάκρυνση των ακραίων οφθαλµών) διαλύµατα βενζιλαδενίνης (BAP) αµιγώς ή σε συνδυασµό µε άλλους φυτικούς ρυθµιστές αύξησης. Οι διεγερµένοι αυτοί βλαστοί που προκύπτουν µε τις παραπάνω µεθόδους µπορούν να χρησιµοποιηθούν µε επιτυχία ως µοσχεύµατα για τον βλαστικό πολλαπλασιασµό νεανικών και ώριµων ατόµων πεύκης (Hong 1974, Inglis 1984), καθώς και ως έκφυτα στον µικροπολλαπλασιασµό των ειδών Pinus elliottii, Pinus radiata και Pinus pinaster (Abo El-Nil 1982, Aitken-Christie 1986, David 1982). 69

Βλαστικός Πολλαπλασιασµός- Κλωνική Δασοπονία Εικ. 13. Διέγερση µασχαλιαίων βλαστών βραχυκλαδίων και βρακτίων α) Αµέσως µετά την αποκοπή των ακραίων οφθαλµών β) Μετά 10-12 εβδοµάδες (Σκαλτσογιάννης, 1988) 70

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης 4 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ - ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ΡΗΤΙΝΗΣ 71

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης 4.1 Χαλέπιος Πεύκη (Pinus halepensis Mill.) Η χαλέπιος πεύκη (Pinus halepensis) είναι ένα αειθαλές κωνοφόρο δέντρο, που ανήκει στην οικογένεια Pinaceae και στο γένος Pinus. Το γένος Pinus περιλαµβάνει περίπου 90 είδη, που φύονται στο Βόρειο Ηµισφαίριο. Στη χώρα µας φύονται τα είδη Pinus halepensis, Pinus brutia, Pinus pinea, Pinus nigra, Pinus silvestris, Pinus leucodermis (P. Heldreichii) και Pinus peuce. Η χαλέπιος πεύκη (Pinus halepensis) είναι ένα µεγάλο δέντρο µε ύψος 5-20 µέτρα. Ο κορµός του είναι συνήθως στρεβλός και η διακλάδωση του δε γίνεται σε σπονδύλους. Η κόµη του είναι σε νεαρή ηλικία κωνική και σε µεγαλύτερη πλατιά και ακανόνιστη. Ο φλοιός του στην αρχή λείος, γυαλιστερός και σταχτόλευκος ενώ αργότερα σχηµατίζει ξηρόφλοιο κοκκινοκάστανο, µε επιµήκεις σχισµές (Εικ. 14). Εικόνα 14. Ώριµο άτοµο Pinus halepensis Οι βελόνες της βρίσκονται ανά δυο σε βραχυκλάδια, µε σπειροειδή διάταξη, έχουνε χρώµα ανοιχτοπράσινο και είναι λεπτές, στιλπνές, ευθείες µε µήκος 8-13 εκατοστά και πλάτος 1 χιλιοστό. Οι παρυφές τους είναι ελαφρά οδοντωτές, µε οδόντωση που δεν είναι αισθητή στην αφή. Ρητινοφόροι αγωγοί εντοπίζονται στην πάνω επίπεδη επιφάνεια (1-2), ενώ στην κάτω είναι περισσότεροι. Η διάρκεια ζωής των βελονών είναι 2 χρόνια. Είναι φυτό µόνοικο και τα άνθη του είναι µονογενή. Τα αρσενικά είναι κίτρινοι ίουλοι, ενώ τα θηλυκά έχουν µορφή µικρών κωνίσκων, πορφυροκόκκινου 72

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης χρώµατος, µε ποδίσκο 1 εκατοστού. Στην αρχή είναι όρθια και µετά την επικονίαση στρέφονται προς τα κάτω. Η άνθηση τους γίνεται από τον Μάρτιο έως τον Απρίλιο. Οι κώνοι της είναι ωοειδείς, οξυκόρυφοι µε µήκος 5-10 εκατοστά και πλάτος 6 εκατοστά, ευθείς ή λίγο κυρτοί. Είναι µονοί ή ανά δύο σε σπονδύλους και κρέµονται από τα κλαδιά µε κυρτό ποδίσκο που έχει µήκος 1,5-3 εκατοστά. Το χρώµα των ώριµων κώνων είναι κοκκινοκάστανο, όταν όµως µένουν πολλά χρόνια πάνω στα δέντρα παίρνουν χρώµα σκούρο σταχτί. Η ωρίµανση τους γίνεται τον Απρίλιο- Μάιο του τρίτου χρόνου από την άνθηση, δηλαδή µετά από µια διετία. Οι περισσότεροι από τους κώνους ανοίγουν ως το φθινόπωρο, άλλοι τον επόµενο ή τον µεθεπόµενο χρόνο και µερικοί µένουν κλειστοί πολλά χρόνια. Ανοιχτοί κώνοι επίσης µένουν πάνω στα δέντρα για πολύ καιρό. Τα σπέρµατα είναι αχλαδόµορφα, αµβλέα στο πάνω άκρο και οξέα στο κάτω, µε µήκος 5-7 χιλιοστά και χρώµα καστανοσταχτί µε µαύρα στίγµατα. Το πτερύγιο τους είναι ανοιχτοκαστανό, κρατά το σπέρµα σαν τσιµπίδα και συνήθως είναι πλατύτερο στο πάνω µισό (Εικ. 15). Εικόνα 15. Ώριµοι κώνοι Pinus halepensis Είναι ένα είδος µε µεγάλη προσαρµοστική ικανότητα και λιτοδίαιτο. Αναπτύσσεται σε πολύ διαφορετικά εδάφη, ακόµα και σε άγονα, ξηρά και αβαθή. Είναι πολύ φωτόφιλο και έχει απαιτήσεις σε φως µεγαλύτερες από όλα τα πεύκα εκτός από την κουκουναριά (Pinus pinea). Είναι είδος ανθεκτικό στην ξηρασία, αντέχοντας σε ξηρές περιόδους µέχρι και 6 µήνες, ενώ παρουσιάζει δυσκολία προσαρµογής σε ψυχρά κλίµατα και χαµηλές θερµοκρασίες. Σύµφωνα µε τον Quezel (1985), εµφανίζεται σε κλίµατα στα οποία η µέση ελάχιστη θερµοκρασία δεν πέφτει 73

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης κάτω από τους -3 C. Παράλληλα, είναι ένα αρκετά πυρόφιλο είδος προσαρµοσµένο στις δασικές πυρκαγιές, γεγονός που οφείλεται στη µικρή ανταγωνιστική ικανότητα των νεαρών ατόµων του είδους απέναντι στα υπόλοιπα είδη του υπορόφου, καθώς και στο ότι µέρος των κώνων που παράγονται κάθε χρόνο παραµένει κλειστό για µεγάλο χρονικό διάστηµα. Έτσι µετά από µια πυρκαγιά και διάστηµα µιας έως δυο ηµερών, ώστε να έχει κρυώσει το έδαφος και να έχει ξεπεραστεί ο κίνδυνος καταστροφής των σπερµάτων, οι κώνοι ανοίγουν και απελευθερώνουν τα σπέρµατα αφού πλέον έχει εξαλειφτεί ο υπόροφος και το πυκνό στρώµα βελονών. Η γεωγραφική της εξάπλωση περιλαµβάνει τη Β. Αφρική, Ισπανία, Ν. Γαλλία, Ιταλία, Αλβανία, Κροατία, Τουρκία (Άδανα), Συρία, Λίβανο και Παλαιστίνη. Στην Ελλάδα απαντάται στην Ήπειρο, Στερεά Ελλάδα, Πελοπόννησο, Χαλκιδική, Πήλιο, Εύβοια, Σκύρο και µερικά άλλα νησιά του Αιγαίου και του Ιονίου πελάγους (Αθανασιάδης, 1986) (Εικ.16). Στον ελλαδικό χώρο φύεται από παραθαλάσσιες περιοχές µέχρι και υψόµετρο 1000µ. (Παπαιωάννου, 1935). Τα δάση της χαλεπίου πεύκης ανήκουν στα ευµεσογειακά δασικά οικοσυστήµατα µε ευρύ υψοµετρικό φάσµα και οι φυτοκοινωνιολογικές ζώνες όπου αυτά συναντώνται είναι η Oleo ceratonion, η Oleo lentiscetum, η Quercion ilicis και ιδιαίτερα η Adrachno quercetum όπου βρίσκεται και το άριστο της ανάπτυξης του είδους. Η συνολική έκταση των δασών της χαλεπίου πεύκης ανέρχεται σε 3,5 εκ. εκτάρια (Ντάφης, 1987). Εικόνα 16. Γεωγραφική εξάπλωση της Pinus halepensis 74

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης Η γενετική ποικιλότητα του είδους είναι µεγάλη, γεγονός που διακρίνεται αµέσως από συγκεκριµένα µορφολογικά χαρακτηριστικά, όπως είναι η ευθύτητα του κορµού, το πάχος των κλαδιών και το σχήµα των κώνων καθώς και η ανατοµία των βελονών. Ακόµη, ποικιλότητα έχει εντοπιστεί και ως προς τον χρόνο ανοίγµατος των κώνων και της διασποράς των σπόρων (Vidakovic 1991). Η χαλέπιος πεύκη (Pinus halepensis) είναι ένα πολύ σηµαντικό δασοπονικό είδος, τόσο από οικολογική όσο και από οικονοµική και αισθητική σκοπιά. Αποτελεί το κυριότερο ρητινοπαραγωγό είδος στη χώρα µας αφού παράγει ρητίνη σε σηµαντικές ποσότητες (Φιλίππου 1986). Το ξύλο της είναι κατάλληλο για διάφορα προϊόντα όπως πριστή ξυλεία, στύλοι, αντικολλητά, χαρτοπολτός, µοριοπλάκες κ.α. Τέλος, µια πλουτοπαραγωγική πηγή που είναι συνυφασµένη µε τα δάση χαλεπίου πεύκης είναι η άσκηση της µελισσοτροφίας και το προϊόν αυτής το µέλι (Οικονόµου 1987). 4.2 Ρητίνη 4.2.1 Γενικά Η ρητίνη είναι ένα παχύρρευστο, άχρωµο υγρό που εκκρίνεται από ορισµένα είδη κωνοφόρων δέντρων (κυρίως πεύκων) όταν πληγωθούν, θέτοντας στο σηµείο τραυµατισµού ένα εµπόδιο, απέναντι στην αποξήρανση του ιστού και στην επίθεση των εντόµων και των παθογόνων (Smith 1966, Shain 1967, Shrimpton 1973, Reid et al. 1987). Από χηµική άποψη, η ρητίνη είναι µίγµα ρητινικών οξέων (κολοφωνίου) και πτητικού ελαίου (τερεβινθελαίου). Η ροή της ρητίνης γίνεται από ρητινοφόρους αγωγούς. Σε µια τοµή ξύλου, οι αγωγοί αυτοί φαίνονται µε γυµνό µάτι ή µε φακό, αλλά η δοµή τους διακρίνεται µόνο µε µικροσκόπιο. Έτσι διαπιστώνεται, ότι είναι σωληνόµορφες κατασκευές, που είναι τοποθετηµένες αξονικά και ακτινικά, και ενώνονται µεταξύ τους σχηµατίζοντας ένα «δίκτυο συγκοινωνούντων αγγείων». Οι ρητινοφόροι αγωγοί δεν είναι κύτταρα, αλλά κενοί χώροι ανάµεσα στα κύτταρα του ξύλου και έχουν εσωτερική επένδυση από ειδικευµένα κύτταρα (παρεγχυµατικά, επιθηλιακά). Τα κύτταρα αυτά είναι πηγή της ρητίνης. Είναι αξιοσηµείωτο, ότι ρητίνη εκκρίνεται µόνο από ρητινοφόρους αγωγούς που βρίσκονται στο σοµφό ξύλο. Στο εγκάρδιο ξύλο, οι αγωγοί είναι κλειστοί (αποφραγµένοι). Γενικά τα κωνοφόρα κατατάσσονται σε δυο οµάδες σε σχέση µε την παραγωγή ρητίνης ως αµυντικό µηχανισµό κατά των τραυµατισµών. Η πρώτη οµάδα περιλαµβάνει είδη όπως τα Pinus, τα οποία παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα 75

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης πρωτογενούς (συστατικής) ρητίνης και ένα πολύ καλά ανεπτυγµένο εκκριτικό σύστηµα. Τα είδη αυτά αντιδρούν στους τραυµατισµούς, µε τη µεταφορά προσχηµατισµένης ρητίνης στο σηµείο, διαµέσου του πολύ καλά ανεπτυγµένου συστήµατος των ρητινοφόρων αγωγών. Τα είδη της δεύτερης οµάδας, όπως είναι τα Abies, τα οποία παράγουν µικρές ποσότητες συστατικής ρητίνης και εµφανίζουν αποµονωµένα κύτταρα µε ρητίνη ή κύστεις, βασίζονται κυρίως στην άµεση βιοσύνθεση της στην περιοχή τραυµατισµού, ενώ σχηµατίζουν τραυµατικούς ρητινοφόρους αγωγούς, οι οποίοι είναι απόντες στους µη πληγωµένους ιστούς (Bamman 1936, Shimaji and Nagatsuka 1971, Kuroda and Shimaji 1983). Πολλά είδη κωνοφόρων πάντως βασίζονται και στα δυο συστήµατα (Lewinsohn et al. 1991). 4.2.2 Συλλογή της ρητίνης Για τη συλλογή της ρητίνης χρησιµοποιούνται διάφορα είδη πεύκης που παράγουν ρητίνη. Στην Ελλάδα ρητινεύεται κυρίως η χαλέπιος πεύκη (Pinus halepensis) και σε µικρό ποσοστό η τραχεία πεύκη (Pinus brutia). Οι περιοχές της Ελλάδας όπου και εξακολουθεί να ασκείται η εργασία της ρητινοσυλλογής είναι οι νοµοί Χαλκιδικής και Εύβοιας, κατά κύριο λόγο, και έπειτα οι νοµοί Κορινθίας και Ηλείας Σε άλλες Ευρωπαϊκές χώρες ρητινεύονται τα είδη Pinus pinaster, Pinus laricio, Pinus pinea, Pinus silvestris, στις Η.Π.Α. οι Pinus palustris, Pinus elliottii, στην Ινδία η Pinus longifolia, στην Κίνα η Pinus koraiensis κ.α. Η ρητίνευση γίνεται µε δυο βασικές µεθόδους 1. µε πελέκηση και 2. µε αποφλοίωση και επίπαση µε διάλυµα ή πάστα θειικού οξέος. Στην πρώτη µέθοδο γίνεται πελέκηση και τοµή των ρητινοφόρων αγωγών µέσα στο ξύλο. Στη δεύτερη γίνεται µόνο αποφλοίωση και η εκροή της ρητίνης προκαλείται µε χηµικό ερεθισµό µε χρήση πάστας θειικού οξέος. Το θειικό οξύ λειτουργεί ως ερεθιστικό, καίγοντας την επιφάνεια του αποφλοιωµένου ξύλου, µε συνέπεια να ανοίγουν οι ρητινοφόροι αγωγοί και έτσι η εκροή την ρητίνης να διαρκεί µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα (Τσουµής 1969). Η διαδικασία αυτή επαναλαµβάνεται συνήθως κάθε 21 ηµέρες. Η ρητίνη συλλέγεται σε ειδικά µεταλλικά ή πλαστικά δοχεία και σακούλες και µεταφέρεται στις βιοµηχανίες επεξεργασίας (Εικ. 17). Η περίοδος ρητινεύσεως διαρκεί από τον Μάρτιο ως τον Οκτώβριο Νοέµβριο, αρχίζει και τελειώνει δηλαδή σύµφωνα µε την αυξητική περίοδο του δέντρου όποτε και παρατηρείται η µεγαλύτερη παραγωγή. Η παραγωγή της στον ελλαδικό χώρο κυµαίνεται κατά µέσο όρο στα 1,7-3,3 Kg/έτος/άτοµο µε βάση τον Τσουµή (1978) ενώ ο Παπαϊωάννου (1971), αναφέρει 76

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης µέσο όρο 3-5 Kg/έτος/άτοµο, αν και έχουν εντοπιστεί άτοµα στην περιοχή της Χαλκιδικής µε παραγωγή άνω των 10 Kg/έτος ( Μουλαλής 1981). Εικόνα 17. Συλλογή ρητίνης 4.2.3 Παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή της ρητίνης Η ετήσια παραγωγή ρητίνης ανά δένδρο ποικίλει σε ευρύτατα όρια (1-15 kg) και εξαρτάται κατά κύριο λόγο από το είδος της πεύκης, την ηλικία, τη µέθοδο ρητίνευσης κ.ά. Ο Schopmeyer (1953) αναφέρει ότι οι παράγοντες που ελέγχουν ή επηρεάζουν την παραγωγή της ρητίνης είναι: (1) Το µέγεθος των αξονικών ρητινοφόρων αγωγών. (2) Ο αριθµός των ρητινοφόρων αγωγών ανά τετραγωνική ίντσα. (3) Από το πόσο παχύρρευστη είναι η ρητίνη και (4) πιθανώς, από την πίεση εκκρίσεως µέσα σε ένα δέντρο, η οποία ωθεί την ρητίνη προς τα έξω. Ο Μουλαλής (1981) κατέληξε στο συµπέρασµα ότι η διάµετρος του κορµού είναι θετικά συσχετισµένη µε την ρητινοπαραγωγή, ενώ το ύψος του δέντρου, η επιφάνεια της κόµης, ο αριθµός των ρητινοφόρων αγωγών στις βελόνες και ο αριθµός 77

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης των σειρών των στοµάτων στις βελόνες, δεν την επηρεάζουν. Σε ότι αφορά τους ρητινοφόρους αγωγούς σε παρόµοια συµπεράσµατα κατέληξαν και οι Schopmeyer (1957) και Hodges et al. (1981). Ακόµη η ρητινοπαραγωγή δεν επηρεάζεται από τη διαµόρφωση του εδάφους (επίπεδο-κλίση) και από το ύψος της ρητίνευσης (βάση του κορµού-ύψος στηθιαίας διαµέτρου), σύµφωνα µε τους Τσουµή και Βουλγαρίδη (1980). Παράλληλα η παραγωγή της ρητίνης επηρεάζεται θετικά από τη θερµοκρασία του περιβάλλοντος και την αποµάκρυνση της βλάστησης (Papaioannou και Megalophonos 1966) ενώ δεν συσχετίζεται σηµαντικά µε τα µορφολογικά χαρακτηριστικά όπως επίσης και µε την πυκνότητα του δάσους (Tadesse et al. 2001). Οι έρευνες µιας πληθώρας επιστηµόνων κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η παραγωγή της ρητίνης διαφόρων πεύκων είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισµα, κληρονοµήσιµο σε µεγάλο βαθµό (Dorman 1947, Mergen et al. 1955, Chundnoff 1962, Squillace and Fisher 1966, Wright 1976). Ο Ντίτορας (1987), υπολόγισε το συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας σε 14 ελληνικές προελεύσεις χαλεπίου πεύκης και βρήκε πως κυµαίνεται από 0,75 έως 0,80. Παράλληλα, οι Squillace και Bengston (1961), υπολόγισαν πως ο συντελεστής κληρονοµικής ικανότητας για την παραγωγή της ρητίνης κυµαίνεται από 0,45 έως 0,90 σε άτοµα του είδους Pinus elliotii, ενώ λίγο αργότερα για το ίδιο είδος ο Peters (1971) τον υπολόγισε σε 0,89. Από τις υψηλές τιµές του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας για την παραγωγή της ρητίνης, εύκολα συνάγεται το συµπέρασµα πως αποτελεί ένα γνώρισµα µε µεγάλα περιθώρια γενετικής βελτίωσης. 4.2.4 Επεξεργασία και χρήσεις της ρητίνης Η ρητίνη ως χηµική πρώτη ύλη, συνίσταται από µείγµα τερπενοειδών και λιπαρών οξέων, εκ των οποίων άλλα είναι πτητικά (τερεβινθέλαιο) και άλλα µη πτητικά (κολοφώνιο). Η πρώτη βιοµηχανική επεξεργασία της ρητίνης συνίσταται στην παραγωγή του κολοφωνίου και του τερεβινθελαίου. Η τεχνική παραγωγής των προϊόντων αυτών διακρίνεται σε δυο βασικά στάδια (Φιλίππου 1986) : 1. Στον καθαρισµό της ρητίνης και 2. Στην απόσταξη στους 100-160 C Το τερεβινθέλαιο αποτελείται από δύο κλάσεις-τάξεις τερπενίων, το µονοτερπένια και τα σεσκιτερπένια που συνιστούν το 15% του βάρους της ρητίνης και αποτελούν την τουρπεντίνη. Το κολοφώνιο αποτελείται από τα διτερπένια και τα 78

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης οξυγονωµένα προϊόντα αυτών, τα ρητινικά οξέα, συστατικά που αποτελούν το 70% του βάρους της ρητίνης. Η χρήση της ρητίνης από τον άνθρωπο είναι γνωστή περίπου από το 500 π.χ. (περιγράφει την παραγωγή της στην Ελλάδα ο κλασσικός Έλληνας βοτανολόγος Θεόφραστος στην Περί Φυτών ιστορία του). Παραδοσιακά, είναι γνωστή η χρησιµοποίηση της για φωτισµό, σε θρησκευτικές τελετές, ως φάρµακο, συντηρητικό σε ξύλινες κατασκευές (κολοφώνια πίσσα), για την ταρίχευση των νεκρών και στη στεγανοποίηση των ξύλινων ενώσεων των πλοίων (από όπου προέρχεται και ο διεθνής όρος naval stores για τη ρητίνη και τα προϊόντα της) (Δαµιανός 1933, Παπαδηµητρακόπουλος 1991, Τσουµής 1978, Zinkel 1975). Κατά τους Βυζαντινούς χρόνους και την επανάσταση του 1821 αποτέλεσε πολύτιµο υλικό για την παρασκευή του υγρού πυρός και την πυρπόληση των εχθρικών πλοίων. Ακόµη χρησιµοποιείται και στην παρασκευή του κρασιού ρετσίνα στην Ελλάδα από αµνηµονεύτων ετών. Σήµερα, η εικόνα των χρήσεων έχει αλλάξει τελείως. Η ρητίνη χρησιµοποιείται ως πρώτη ύλη παραγωγής µεγάλης ποικιλίας µοντέρνων βιοµηχανικών προϊόντων. Το νέφτι, δηλαδή το υγρό κλάσµα απόσταξης της ρητίνης, αποτελεί χρήσιµη ύλη στις βιοµηχανίες υφασµάτων, χρωµάτων, αρωµάτων, καλλυντικών, φαρµάκων, λιπαντικών ουσιών, συνθετικών ρητινών, κ.ά. Το κολοφώνιο, δηλαδή το στερεό κλάσµα απόσταξης της ρητίνης, αποτελεί χρήσιµη ύλη στην τυπογραφία, υφαντουργία, µεταλλουργία, και στην παρασκευή ποικιλίας προϊόντων, όπως λιπαντικά, πλαστικά, αντιδιαβρωτικά, αρωµατικά κεριά, αδιάβροχα υλικά, σφραγίσµατα δοντιών, τεχνητά δόντια, έµπλαστρα, συντηρητικά, προσθετικά γεύσης σε τρόφιµα, ποτά και είδη ζαχαροπλαστικής, καταλύτες, επιβραδυντικά της φωτιάς, µουσαµάδες για δάπεδα, ταπετσαρίες, τεχνητά δέρµατα, καλλυντικά, συνθετικό καουτσούκ, εντοµοκτόνα, παρκετίνη, µονωτικά, τυπογραφική µελάνη, χρώµατα, φάρµακα, κόλλες, προσθετικές ύλες στο χαρτί, τσίχλες για µάσηση, κ.ά. (Τσουµής 1978, Καραολάνογλου και Κούκιος 2002, Zinkel 1980). 4.2.5 Η ρητίνη και η ρητινοσυλλογή σήµερα Η ρητινοσυλλογή στην Ελλάδα αποτελούσε αξιόλογη παραγωγική δραστηριότητα και από την άσκηση της ζούσε ένα σηµαντικό ποσοστό του δασόβιου και παραδασόβιου πληθυσµού της χώρας. Η συµπίεση του εισοδήµατος των ρητινοσυλλεκτών, λόγω των χαµηλών τιµών, σε συνδυασµό µε τη µετακίνηση του αγροτικού πληθυσµού προς τα αστικά κέντρα και την παλιά νοµοθεσία σχετικά µε 79

Περιγραφή του είδους- Γενικά περί ρητίνης την εµπορία των ρητινικών προϊόντων (οι ρητινοσυλλέκτες θεωρούνται εργαζόµενοι και οι ρητινοβιοµήχανοι εργοδότες), συνετέλεσαν στη σταδιακή αποδυνάµωση του κλάδου και µείωση της παραγωγής σε πολύ χαµηλά επίπεδα. Μεταξύ των παραγόντων που συνετέλεσαν στην εξέλιξη αυτή περιλαµβάνονται η συνεχής µείωση της έκτασης των ρητινευόµενων δασών από µεγάλες καταστροφικές πυρκαγιές, η µείωση και γήρανση του προσωπικού συλλογής ρητίνης αλλά και οι χαµηλές τιµές της ρητίνης οι οποίες έχουνε παραµείνει για δεκαετίες καθηλωµένες σε ιδιαίτερα χαµηλά επίπεδα. Γενικά, η εξέλιξη των τιµών της, χαρακτηρίζεται από τη µεγάλη υστέρηση τους, έναντι βασικών οικονοµικών δεικτών της χώρας µας. Αυτό µπορεί να θεωρηθεί ως αποτέλεσµα της στασιµότητας των τιµών στο διεθνή χώρο. Ένας άλλος σηµαντικός παράγοντας, είναι και η ικανότητα πλέον παραγωγής πετροχηµικών υποκατάστατων των συστατικών της ρητίνης, όπως ο πετρελαϊκός αιθέρας που αντικατέστησε το νέφτι (τερεβινθέλαιο). Παράλληλα ξένοι ανταγωνιστές παράγουν φυσικό ρετσίνι σε µεγαλύτερες ποσότητες και µε χαµηλότερες τιµές, µε αποτέλεσµα το ελληνικό ρετσίνι να µην αποτελεί πλέον ένα ανταγωνιστικό προϊόν. Η σταδιακή πτώση της δραστηριότητας της ρητινοσυλλογής στη χώρα µας, δεν είναι µοναδικό φαινόµενο καθώς έχει παρατηρηθεί σε όλες σχεδόν τις δυτικές χώρες (Γαλλία, Ισπανία, Η.Π.Α. κ.λ.π.), και συνδέεται µε την τραχύτητα του επαγγέλµατος, τη συνεχή άνοδο του κόστους εργασίας αλλά και το γεγονός ότι κολοφώνιο και τερεβινθέλαιο είναι δυνατό να παραχθούν και από άλλες παραγωγικές διαδικασίες, όπως εκχύλιση ξύλου πρέµνων και ως υποπροϊόντα κατά τη παραγωγή ξυλοπολτού. Σήµερα µόνο η Πορτογαλία εµφανίζεται να έχει διατηρήσει αξιόλογη παραγωγή ρητίνης, γεγονός που αποδίδεται στον πεδινό χαρακτήρα των δασών της. Είναι γεγονός ότι η παραγωγή ρητίνης από ρητίνευση ζώντων δέντρων συνοδεύεται από πολλά κοινωνικά και οικονοµικά οφέλη, όπως παροχή απασχόλησης και βελτίωση του εισοδήµατος κατοίκων αγροτικών και ορεινών περιοχών, βελτίωση της αποδοτικότητας των δασικών εργασιών, ιδιαίτερα όταν συνδυάζεται µε συµπαραγωγή ξύλου, και µπορεί να συµβάλλει στη βελτίωση της ανταγωνιστικότητας της εγχώριας βιοµηχανίας µέσω της παραγωγής προϊόντων υψηλής προστιθέµενης αξίας και ενίσχυση της εξαγωγικής δραστηριότητας. (Πετειναράκης, Κάββουρας 2002) 80

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 81

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής Από τα παραπάνω συµπεραίνεται ότι το είδος διακρίνεται για την ιδιαίτερη οικονοµική του αξία ως το κατεξοχήν ρητινοπαραγωγό είδος της Μεσογείου και ίσως ένα από τα καλύτερα παγκοσµίως. Εντούτοις αν και το γνώρισµα ρητινοπαραγωγή φαίνεται να ελέγχεται γενετικά από µικρό αριθµό γονιδίων (γεγονός που τεκµηριώνεται και από τον υψηλό συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας που διαθέτει), η επιλογή των υψηλοαποδοτικών ατόµων χαλεπίου πεύκης παραµένει αδιευκρίνιστη. Παράλληλα, το είδος λόγω της ιδιαιτερότητας του και των πλεονεκτηµάτων που διαθέτει εµπεριέχεται, δυνητικά, στον κατάλογο των φυτών που οι περιβαλλοντικές του διαστάσεις-επιπτώσεις, µπορούν να το εντάξουν στις δασοαγροαναπτυξιακές πολιτικές τουλάχιστον των Μεσογειακών χωρών (βιοµηχανικό φυτό). Εποµένως, πρέπει να διερευνηθεί και υπό το πρίσµα της ταυτοποίησης του µε τα διεθνή πρότυπα (µοριακοί δείκτες) και της αναπαραγωγής των επιλεγµένων ατόµων µε αποτελεσµατικό τρόπο (κλωνική αναπαραγωγή). Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η µελέτη των κάτωθι: 1) Η επιλογή των υψηλοαποδοτικών σε ρητίνη ατόµων χαλεπίου πέυκης. 2) Η ταυτοποίηση των ατόµων αυτών µε µοριακούς δείκτες. 3) Η αναπαραγωγή τους µε βλαστικό πολλαπλασιασµό. 82

Μέθοδοι και Υλικά ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ 83

Μέθοδοι και Υλικά 5.1 Επιλογή 5.1.1 Επιλογή άριστων σε παραγωγή ρητίνης φαινοτύπων-γενοτύπων χαλεπίου πέυκης µε τη µέθοδο της µαζικής επιλογής Στην παρούσα εργασία, η επιλογή των υψηλοαποδοτικών σε ρητίνη ατόµων, βασίστηκε στα δεδοµένα που µας παρείχαν οι ρητινοσυλλέκτες και µε κριτήριο την υψηλή και σταθερή από έτος σε έτος απόδοση σε ρητίνη, µετρήσεις της οποίας πάρθηκαν 2 διαδοχικές χρονιές (2006, 2007). Η µέθοδος δηλαδή που εφαρµόστηκε είναι αυτή της επιλογής αρίστων φαινοτύπων, µε βάση τη µέγιστη ετήσια παραγωγή και τη σταθερότητα της απόδοσης του συγκεκριµένου γνωρίσµατος στο χρόνο. Η προσέγγιση αυτή έχει εφαρµοστεί µε επιτυχία στις Η.Π.Α., στην περίπτωση της ρητίνης 3 ειδών πεύκης, (Roberds and Strom 2006), όπως και στην περίπτωση του καουτσούκ (Hevea brasiliensis) σε χώρες της Ν. Αµερικής (Gonçalves et al. 2003). Η επιλογή έγινε κατόπιν υποδείξεων των ντόπιων ρητινοσυλλεκτών, σε δυο περιοχές, όπου η ρητινοσυλλογή εξασκείται εντατικά, στην Κασσάνδρα Χαλκιδικής και στην Κίρυνθο στη Β. Εύβοια. Στην περίπτωση της Χαλκιδικής η επιλογή έγινε από ένα σύνολο περίπου 5000 δέντρων και στην Εύβοια από ένα σύνολο 10000 δέντρων. Η παραγωγή της ρητίνης των επιλεγµένων δέντρων, συλλέχθηκε και ζυγίστηκε για δύο συνεχόµενες χρονιές, το 2006 και το 2007. Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι παρατηρούνται κάποιες διακυµάνσεις στην ετήσια παραγωγή ρητίνης ενός δέντρου, καθώς εξαρτάται σε κάποιο βαθµό από διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες (π.χ. ξηρασία ή άλλες καταστάσεις στρες). Παρόλα αυτά όµως η σχέση της παραγόµενης ποσότητας µεταξύ των ατόµων παραµένει σταθερή. Για παράδειγµα ένα δέντρο που παράγει τη µια χρονιά 15 Kg, µπορεί την επόµενη να δώσει 13 Kg, ταυτόχρονα όµως θα έχει µειωθεί αναλογικά και η απόδοση των υπολοίπων δέντρων. Γενικά τα πολύ παραγωγικά δέντρα, παραµένουν παραγωγικά, ανεξάρτητα από τις συνθήκες του περιβάλλοντος κάθε έτος. 5.1.2 Υπολογισµός του γενετικού κέρδους όσον αφορά στο γνώρισµα παραγωγή ρητίνης Η γενική εξίσωση πρόβλεψης του γενετικού κέρδους είναι (White et.al. 2007): ΔG= b (ȳ s - µ ρ )= b S (1) όπου ΔG είναι το προβλεπόµενο γενετικό κέρδος, b ο συντελεστής παλινδρόµησης, ȳ s ο φαινοτυπικός µέσος όρος των επιλεγµένων ατόµων, µ ρ ο φαινοτυπικός µέσος όρος 84

Μέθοδοι και Υλικά του πληθυσµού βάσης και S το διαφορικό επιλογής. Η παραπάνω εξίσωση παίρνει δυο διαφορετικές µορφές, ανάλογα µε το αν προβλέπονται οι κλωνικές (ΔG C ) ή οι βελτιωτικές αξίες (ΔG A ). ΔG C = Ḡ S -Ḡ P = H 2 S (2) ΔG C = Ā S -Ā P = h 2 S (3) Για κάθε µετρούµενο γνώρισµα η εξίσωση (2) εκφράζει το γενετικό κέρδος ως τη διαφορά στις µέσες κλωνικές αξίες (Ḡ) µεταξύ του επιλεγµένου πληθυσµού (δείκτης s) και του πληθυσµού βάσης (δείκτης ρ), ως συνάρτηση του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας υπό την ευρεία έννοια (Η 2 ) και του διαφορικού επιλογής (S). Αντίστοιχα η εξίσωση (3) εκφράζει το γενετικό κέρδος ως τη διαφορά των µέσων βελτιωτικών αξιών (Ā) µεταξύ των δυο πληθυσµών, χρησιµοποιώντας το συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας υπό τη στενή έννοια. Το διαφορικό επιλογής (S) είναι εννοιολογικά το ίδιο και για τις δυο εξισώσεις και αποτελεί τη διαφορά µεταξύ του φαινοτυπικού µέσου όρου των επιλεγµένων ατόµων και του φαινοτυπικού µέσου όρου του πληθυσµού βάσης. Αφού οι κληρονοµικές ικανότητες είναι αδιάστατες, το κέρδος που προβλέπεται από τις παραπάνω εξισώσεις έχει τις µονάδες µέτρησης του µετρούµενου γνωρίσµατος και µετατρέπεται σε ποσοστό αν το διαιρέσουµε µε το µέσο όρο του πληθυσµού βάσης. Όσον αφορά στο µέσο όρο παραγωγής της ρητίνης στη χώρα µας, αυτός ποικίλει από 1,7-3,3 Κg/έτος/άτοµο µε βάση τον Τσουµή (1978) και 3-5 Κg/έτος/άτοµο µε βάση τον Παπαϊωάννου (1971). Για τους υπολογισµούς του γενετικού κέρδους χρησιµοποιήθηκε µια «αισιόδοξη» τιµή του µέσου όρου παραγωγής του πληθυσµού βάσης, ίση µε 4Κg/έτος/άτοµο. Αντίστοιχα οι τιµές του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας για την παραγωγή ρητίνης κυµαίνονται από 0,75-0,8 (Ντίτορας, 1987), 0,45-0,9 (Squillace and Bengston, 1961) και αναφέρονται σε αυτόν υπό τη στενή έννοια. Με δεδοµένο ότι ο λόγος h 2 /H 2 κυµαίνεται από 0,18-0,84 µε ένα µέσο όρο 0,49 (White et.al. 2007), στους υπολογισµούς δόθηκε µια συγκρατηµένη τιµή τόσο του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας υπό τη στενή έννοια (h 2 =0,5), όσο και του συντελεστή υπό την ευρεία έννοια (Η 2 =0,7). Ο λόγος που δόθηκαν αυτές οι τιµές στον µέσο όρο του πληθυσµού βάσης και στους συντελεστές κληρονοµικής ικανότητας για τη παραγωγή ρητίνης, υπό τη στενή και υπό την ευρεία έννοια, ήταν για να προκύψει µια συγκρατηµένη εκτίµηση της τιµής του γενετικού κέρδους. Παράλληλα, γίνεται εκτίµηση τόσο της κλωνικής όσο και της 85

Μέθοδοι και Υλικά βελτιωτικής αξίας έτσι ώστε να καταστεί δυνατή µια σύγκριση της κλωνικής δασοπονίας έναντι της δασοπονίας σποροφύτων. 5.2 Ταυτοποίηση µε µοριακούς δείκτες τύπου RAPD 5.2.1 Προετοιµασία φυτικού ιστού 5.2.1.1 Φύτρωση των σπόρων Το φυτικό υλικό που χρησιµοποιήθηκε για την εκχύλιση και αποµόνωση του DNA αποτελούνταν από ενδοσπέρµια και έµβρυα φυτρωµένων σπόρων, τεσσάρων επιλεγµένων ως προς τη παραγωγή ρητίνης, ατόµων χαλεπίου πεύκης. Τα δυο άτοµα προέρχονται από την περιοχή της Φούρκας στη Χαλκιδική και τα άλλα δυο από την περιοχή των Βασιλικών στη Β. Εύβοια. Αρχικά στους επιλεγµένους σπόρους εφαρµόστηκε διαδικασία απολύµανσης όπως αυτή περιγράφεται από τους Normand & Fortin (1982). Οι σπόροι τοποθετήθηκαν αρχικά σε νερό για διάστηµα µιας ώρας και στη συνέχεια σε διάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) και της ουσίας Tween-20, η οποία εξασφαλίζει την αποµάκρυνση των λιπαρών ουσιών, για χρονικό διάστηµα 15 λεπτών. Η φύτρωση επιτεύχθηκε σε διάστηµα 5-7 ηµερών, σε θερµοκρασία 24ºC, σε petri που περιείχαν διηθητικό χαρτί εµποτισµένο µε απεσταγµένο νερό. Μετά τη διάρρηξη του περιβλήµατος του κάθε σπόρου, ακολουθούσε προσεκτική αποµόνωση του εµβρύου και του ενδοσπερµίου µε τη χρήση λαβίδας και νυστεριού, και στη συνέχεια αποθήκευση τους σε πλαστικά σωληνάρια τύπου Eppendorf 1,5 ml σε θερµοκρασία -80 ºC. 5.2.1.2 Eκχύλιση και αποµόνωση του DNA Η εκχύλιση του DNA έγινε σύµφωνα µε τη µέθοδο CTAB (Doyle and Doyle, 1987), µε κάποιες τροποποιήσεις. Αρχικά, τοποθετείται σε πλαστικά σωληνάρια τύπου Eppendorf 1,5 ml, περίπου 0,60 mg φυτικού ιστού (µισό ενδοσπέρµιο) και προστίθενται 0,50mg PVP-40 και 400 µl διαλύµατος οµογενοποίησης (Tris 100 mm/ EDTA 10 mm). Ακολουθεί οµογενοποιήση µε τη χρήση πλαστικών οµογενοποιητών, καλή ανατάραξη σε µηχανή Vortex και προσθήκη 53 µl διαλύµατος εκχύλισης (CTAB 10%), 66µl διαλύµατος NaCl 5M, 4 µl Proteinase K και 3 µl Rnase A. Στη συνέχεια τα δείγµατα τοποθετούνται για επώαση σε υδατόλουτρο, αρχικά για 45 λεπτά στους 50 ºC και στη συνέχεια για 15 λεπτά στους 37 ºC. Στη συνέχεια ακολουθεί προσθήκη 400 µl 86

Μέθοδοι και Υλικά διαλύµατος χλωροφόρµιου/ισοαµυλικής αλκοόλης 24/1, καλή ανακίνηση και φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 10.000 rpm σε θερµοκρασία δωµατίου. Η υπερκείµενη φάση µεταφέρεται µε προσοχή σε νέο σωληνάριο Eppendorf όπου προσθέτονται 200µl χλωροφόρµιου και 200 µl φαινόλης. Ακολουθεί ανακίνηση και φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 10.000 rpm σε θερµοκρασία δωµατίου και έπειτα µεταφορά της ανώτερης φάσης σε νέο σωληνάριο Eppendorf και προσθήκη ενός όγκου παγωµένης ισοπροπανόλης. Μετά από ανακίνηση για την κατακρήµνιση του DNA, τα δείγµατα τοποθετούνται για φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 10.000 rpm σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια αφαιρείται η ισοπροπανόλη αφήνοντας στον πυθµένα του σωληνάριου το DNA. Στη συνέχεια ακολουθεί προσθήκη 400µl παγωµένης αιθανόλης 70% για τον καθαρισµό του DNA και φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 10.000 rpm σε θερµοκρασία δωµατίου. Τελικά, η αιθανόλη αποµακρύνεται και αφού τα δείγµατα στεγνώσουν, διαλύονται σε 50µl απεσταγµένου και αποστειρωµένου νερού. Στην περίπτωση της εκχύλισης του DNA από έµβρυο, έγινε χρήση ολόκληρου του εµβρύου. Η ποιότητα και η ποσότητα του DNA εκτιµήθηκαν: α) µε τη µέθοδο της φασµατοφωτοµέτρησης (Φασµατοφωτόµετρο Biomate 3). Μετράται η απορρόφηση από το δείγµα, σε διαφορετικά µήκη κύµατος. Στα 260nm απορροφούν τα νουκλεικά οξέα, στα 280 nm οι πρωτεΐνες, στα 230 nm φαινολικά πολυσακχαρίτες άλλες οργανικές ουσίες. Η καθαρότητα του δείγµατος υπολογίζεται βάσει των λόγων των απορροφήσεων Α 260 /Α 280 : για επιµόλυνση από πρωτεΐνες ( τιµή καθαρού DNA = 1.8 ) Α 260 /Α 230 : για επιµόλυνση απο φαινολικά και πολυσακχαρίτες (τιµή καθαρού DNA = 1.8 ) (Sambrook et al.,1989). Η διαδικασία περιλαµβάνει το αρχικό καλιµπράρισµα του µηχανήµατος µε ανάγνωση 1 ml αποσταγµένου νερού και στη συνέχεια πρόσθεση 1 µl DNA στο νερό και µέτρηση απορρόφησης στα διάφορα µήκη κύµατος (η αραίωση του αρχικού δείγµατος είναι 1 : 1000). β) µε τη µέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης 0.8% µετά από βαφή βρωµιούχου αιθιδίου. Χρησιµοποιήθηκε DNA γνωστών συγκεντρώσεων για τη σύγκριση. Μετά τον έλεγχο των δειγµάτων βρέθηκε ότι το πρωτόκολλο ήταν αποτελεσµατικό. Η τελική συγκέντρωση του DNA βρέθηκε κατά µέσο όρο 50 ng/µl -1. Οι τιµές Α 260 /Α 280, Α 260 /Α 230 βρέθηκαν µέσα στα αποδεκτά όρια. Η εξέταση σε πηκτή αγαρόζης του συνολικού DNA έδειξε ότι η εκτίµηση των συγκεντρώσεων µε 87

Μέθοδοι και Υλικά την φασµατοφωτοµετρική µέθοδος ήταν ακριβείς. Τέλος ακολούθησε αραίωση των δειγµάτων µε απεσταγµένο και αποστειρωµένο νερό, προκειµένου να προκύψει η επιθυµητή για την διαδικασία συγκέντρωση, δηλαδή τα 10 ng/µl. 5.2.2 Προετοιµασία του µίγµατος της αντίδρασης PCR Για την εφαρµογή της τεχνικής της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (PCR) χρησιµοποιήθηκαν τα ακόλουθα συστατικά: - Taq DNA Polymerase Kappa Biosystems (5 U ml -1 ) - PCR Buffer Kappa Biosystems (10X) - Mg 2+ Kappa Biosystems (25 mm) - dntps Invitrogen (20mM) - Δεκαµερείς εκκινητές της εταιρίας Operon (10 µm) - 10 ng γενωµικού DNA - H 2 O (αποσταγµένο-αποστειρωµένο) Αρχικά έγινε διάλυση των εκκινητών, οι οποίοι ήτανε σε µορφή σκόνης, σε διάλυµα TE (10mM Tris, 1mM EDTA ph8) σύµφωνα µε τις οδηγίες που τους συνόδευαν. Τα διαλύµατα εργασίας των εκκινητών είχαν συγκέντρωση 10 µμ µετά από αραίωση των διαλυµάτων φύλαξης 1:10. Τα υπόλοιπα αντιδραστήρια της αντίδρασης φυλάσσονταν στους -20ºC σε διαλύµατα εργασίας µε τις συγκεντρώσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω. Συνολικά προετοιµάστηκαν και εξετάστηκαν 30 εκκινητές της εταιρίας Operon Technologies (set OPA01-10, OPE01-10 και OPH01-10). Τέλος, ακολουθούσε η προετοιµασία των δειγµάτων DNA, η οποία γινόταν σε απαγωγό νηµατικής ροής που απολυµαίνονταν πριν και µετά τη χρήση µε διάλυµα χλωρίνης καθώς και µε τη χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας UV, µαζί µε τα πλαστικά αναλώσιµα και τις πιπέτες. Τα δείγµατα DNA τοποθετούνταν σε σωληνάρια PCR (0,2ml) και φυλάσσονταν στο ψυγείο µέχρις ότου ετοιµαστεί το µίγµα της αντίδρασης. Η παρασκευή του µίγµατος της PCR είχε ως εξής: -Ξεπάγωµα των αντιδραστηρίων, εκτός της Taq πολυµεράσης, σε θερµοκρασία δωµατίου και µε καλή ανάδευση. Η Taq πολυµεράση προστίθετο στην αντίδραση, απευθείας από την κατάψυξη. Το ρυθµιστικό διάλυµα, το Mg 2+ και τα dntps ξεπαγώνονταν και διατηρούνταν σε πάγο καθ όλη την προετοιµασία της αντίδρασης. Ειδικά τα dntps είναι ευαίσθητα στους πολλαπλούς κύκλους ψύξης-απόψυξης. Προτείνεται για να µην επαναλαµβάνεται ο κύκλος παραπάνω από δύο φορές, η 88

Μέθοδοι και Υλικά φύλαξη τους να γίνεται σε µικρές ποσότητες ανάλογα µε τη χρήση (Sambrook et al. 1989). -Προετοιµασία του µίγµατος της αντίδρασης σε πλαστικό σωληνάριο τύπου eppendorf (η προσθήκη της πολυµεράσης γινότανε στο τέλος). -Οµογενοποίηση του µίγµατος µε ανάδευση. -Διανοµή του κατάλληλου όγκου του µίγµατος (24µl) µε µικροπιπέτα στα µικροσωληνάρια που περιείχαν το DNA. -Ελαφριά ανακίνηση για την ανάµειξη όλων των συστατικών. -Τοποθέτηση των σωληναρίων στη συσκευή PCR και εφαρµογή του επιλεγµένου προγράµµατος. 5.2.3 Ενίσχυση DNA Η ενίσχυση του DNA µέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης πραγµατοποιήθηκε σε συσκευή θερµικών κύκλων τύπου Mastercycler Eppendorf ep Gradient S µε το εξής πρόγραµµα (Gomez et al. 2001), µετά από δοκιµές για την βελτιστοποίηση της αντίδρασης: 1κύκλος που περιλαµβάνει 2 λεπτά στους 94ºC για τη θερµική µετουσίωση του DNA, 1 λεπτό στους 42 ºC για τον υβριδισµό του εκκινητή και 2 λεπτά στους 72 ºC για τον πολυµερισµό του DNA. Ακολουθούν 4 κύκλοι που περιλαµβάνουν 45 δευτερόλεπτα στους 94 ºC για τη θερµική µετουσίωση, 1 λεπτό στους 42 ºC για τον υβριδισµό και 2 λεπτά στους 72 ºC για τον πολυµερισµό του DNA. Έπειτα, ακολουθούν 40 κύκλοι που περιλαµβάνουν 30 δευτερόλεπτα στους 94 ºC για τη θερµική µετουσίωση, 45 δευτερόλεπτα στους 36 ºC για τον υβριδισµό του εκκινητή και 1,5 λεπτό στους 72 ºC για τον πολυµερισµό του DNA και τέλος ένα τελικό στάδιο πολυµερισµού διάρκειας 8 λεπτών στους 72 ºC. Ο όγκος του µίγµατος αντίδρασης ήταν 25µl και περιείχε: 2,5 µl 10X Buffer, 2 mm Mg 2+, 200 µm dntps, 200 nm εκκινητή, 0.75 U Taq πολυµεράση, 10 ng DNA. Σε κάθε ένα σετ δειγµάτων υπήρχε και ένα δείγµα ελέγχου στο οποίο τη θέση του δείγµατος DNA καταλάµβανε µικρή ποσότητα αποσταγµένου-αποστειρωµένου νερού. Σκοπός της παρουσίας του ήταν ο έλεγχος για τυχόν επιµολύνσεις. 5.2.4 Ηλεκτροφόρηση Η οριζόντια υποβρύχια ηλεκτροφόρηση του πολλαπλασιασµένου DNA, πραγµατοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1,5% η οποία περιείχε και διάλυµα βρωµιούχου εθίδιου (EtBr), συγκέντρωσης 0,5 mg/ml, το οποίο έχει την ιδιότητα να 89

Μέθοδοι και Υλικά σχηµατίζει σύµπλοκο µε τη διπλή έλικα του DNA και να φθορίζει κάτω από υπεριώδες φώς. Το ρυθµιστικό διάλυµα 0,5 X TBE, χρησιµοποιήθηκε τόσο για την πλήρωση της συσκευής όσο και για την παρασκευή της πηκτής. Ποσότητα ίση µε 10µl από το προϊόν της αντίδρασης και 5µl από το ρυθµιστικό διάλυµα πλήρωσης φρεατίων πηκτής (loading buffer) 6X, ηλεκτροφορήθηκαν περίπου για 1ώρα σε συνεχές ρεύµα τάσης 80 volt. Κατόπιν η πηκτή εκτίθονταν σε υπεριώδη ακτινοβολία και η φωτογράφηση των προϊόντων της ηλεκτροφόρησης έγινε µε ψηφιακή φωτογραφική µηχανή. Το µέγεθος των προϊόντων της ενίσχυσης του DNA εκτιµήθηκε µε βάση σκάλα DNA γνωστών µοριακών µεγεθών, Ladder 123 bp της εταιρίας Sigma (D5042). Ο προσδιορισµός του µεγέθους των τµηµάτων έγινε µε το πρόγραµµα DNAsize (Raghava, 1994). Οι συνταγές όλων των διαλυµάτων που χρησιµοποιήθηκαν στα διάφορα στάδια αναφέρονται στο Παράρτηµα. 5.2.5 Διερεύνηση της συµπεριφορας των µοριακών δεικτών τύπου RAPDs ως γενετικοί δείκτες- Ταυτοποίηση επιλεγµένων ατόµων-στατιστική ανάλυση. Οι δείκτες RAPD παρουσιάζουν κυριαρχία στην έκφραση τους, για αυτό και η εκτίµηση γενετικών παραµέτρων µπορεί να γίνει έµµεσα (Lynch & Milligan, 1994). Στα κωνοφόρα είναι δυνατόν οι δείκτες RAPD να χρησιµοποιηθούν για την ανάλυση ενδοσπερµίου, ο οποίος είναι απλοειδής ιστός που προκύπτει ως µειωτικό προϊόν του µητρικού γενοτύπου. Αν υποτεθεί ότι ισχύει µεντελικός διαχωρισµός για µια γονιδιακή θέση κατά τη µείωση (1:1), είναι δυνατόν αναλύοντας ικανό αριθµών απλοειδών ενδοσπερµίων να καταλήξουµε στον µητρικό γενότυπο. Για τη µελέτη του διαχωρισµού των RAPD τµηµάτων, για το αν αυτός ακολουθεί την 1:1 αναλογία που αναµένεται από ένα Μενδελικό γνώρισµα, αποµονώθηκε το DNA 60 ενδοσπερµίων του ατόµου Ε5. Η συµφωνία του διαχωρισµού που παρατηρήθηκε µε αυτή που αναµένεται σε ένα κυρίαρχο Mενδελικό χαρακτήρα υπολογίστηκε µε τη εφαρµογή του κριτηρίου x 2 χρησιµοποιώντας λογιστικό φύλλο Excel (Microsoft ). Παράλληλα για τη διενέργεια της ταυτοποίησης, αποµονώθηκε από κάθε ένα από τα επιλεγµένα άτοµα, το DNA επτά ενδοσπερµίων και ενός εµβρύου. Με την παραδοχή ότι ισχύει ο Μενδελικός 1:1 διαχωρισµός των RAPD τµηµάτων, το µέγεθος του δείγµατος είναι ικανό στο να εντοπιστούν οι ετερογυγώτες, σε ποσοστό περίπου 100% (Morris and Spieth 1978). Με αυτό το τρόπο στάθηκε δυνατό να βρεθεί ο γενότυπος του κάθε ατόµου για κάθε γονιδιακή θέση µε στατιστική ασφάλεια (p=0.0078) και να αναχθούν οι δείκτες RAPD από κυρίαρχοι σε συγκυρίαρχοι. 90

Μέθοδοι και Υλικά Καταρτίστηκε πίνακας των γενοτύπων για κάθε άτοµο σε λογιστικό φύλλο Excel, οι γενότυποι εισήχθησαν στο λογισµικό GenAlex v.6 (Peakall και Smouse 2006) και ακολούθησε στατιστική ανάλυση για την ταυτοποίηση τους.. 5.3 Εµβολιασµός 5.3.1 Συλλογή και διατήρηση εµβολίων Η συλλογή των εµβολίων, από τα επιλεγµένα, ως προς τη ρητινοπαραγωγή, άτοµα χαλεπίου πεύκης, πραγµατοποιήθηκε τον Ιανουάριο του 2007. Συγκεκριµένα, στις 21/01/2007 ελήφθησαν εµβόλια από 10 επιλεγµένα άτοµα (Χ1 έως Χ10) στην περιοχή της Κασσάνδρας στη Χαλκιδική και στις 24/01/2007 από 10 επιλεγµένα άτοµα (Ε1 έως Ε10) στη Β. Εύβοια. Τα εµβόλια ηλικίας ενός έτους, πάρθηκαν από τα άνω 2/3 της κόµης, είχαν µήκος 10-15cm και διάµετρο 0,5-0,8 cm. Μετά τη συλλογή τους, τα εµβόλια διατηρήθηκαν σε υγρασία και τοποθετήθηκαν στο ψυγείο στους 4 C, µέχρι τη διενέργεια των εµβολιασµών. 5.3.2 Διενέργεια εµβολιασµών και µελέτη της επίδρασης της µεθόδου του εµβολιασµού, στο τελικό ποσοστό επιτυχίας Οι εµβολιασµοί πραγµατοποιήθηκαν τον ΜΑΡΤΙΟ του 2007 στις εγκαταστάσεις ιδιωτικών φυτωρίων, σε συνθήκες σκίασης. Ως υποκείµενα χρησιµοποιήθηκαν σπορόφυτα χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis) ηλικίας (2) ετών, η προµήθεια των οποίων έγινε από ιδιωτικά και δηµόσια φυτώρια. Για τη µελέτη της επίδρασης της µεθόδου εµβολιασµού, χρησιµοποιήθηκαν οι ακόλουθες τρεις τεχνικές: 1. Η µέθοδος του εµβολιασµού σε Σχισµή 2. Η µέθοδος του εµβολιασµού Αγγλικού τύπου 3. Η µέθοδος του Πλάγιου εµβολιασµού Βασική προϋπόθεση για την επιτυχία των µεθόδων αυτών είναι να ταυτίζονται οι διάµετροι του εµβολίου και του υποκειµένου, έτσι ώστε να επιτευχθεί η καλύτερη δυνατή ένωση των καµβίων. Σε όλες τις περιπτώσεις αρχικά, αποµακρύνθηκαν οι βελόνες από τη βάση κάθε εµβολίου καθώς και στο σηµείο του υποκειµένου όπου θα γινότανε ο εµβολιασµός. Το µαχαίρι που χρησιµοποιήθηκε ήταν ειδικό µαχαίρι εµβολιασµών, το οποίο ξεπλενότανε µε καθαρό οινόπνευµα µετά το πέρας κάθε εµβολιασµού. 91

Μέθοδοι και Υλικά Στην περίπτωση της µεθόδου του εµβολιασµού µε σχισµή, αποµακρυνόταν αρχικά η κορυφή του υποκειµένου και ακολουθούσε κάθετη τοµή στο µέσο του κορµού και σε βάθος 3-4 cm. Οι τοµές του εµβολίου, για τη δηµιουργία σφήνας, γινότανε εκατέρωθεν της βάσης τους εµβολίου υπό γωνία περίπου 10 και σε µήκος 3-4 cm. Στους εµβολιασµούς που πραγµατοποιηθήκαν µε τη µέθοδο εµβολιασµού Αγγλικού τύπου, οι τοµές του υποκειµένου και του εµβολίου έγιναν υπό γωνία περίπου 15 και είχανε µήκος 3-4 cm. Τέλος, στους εµβολιασµούς που πραγµατοποιήθηκαν µε τη µέθοδο του πλάγιου εµβολιασµού, οι τοµές στη βάση των εµβολίων έγιναν υπό γωνία περίπου 35-40 και είχανε µήκος 3-4 cm. Οι πλευρικές τοµές που πραγµατοποιήθηκαν στα υποκείµενα ήτανε ανάλογες µε αυτές των εµβολίων έτσι ώστε να εξασφαλισθεί η καλύτερη δυνατή επαφή των δυο καµβίων. Μετά τη δηµιουργία των τοµών και την ένωση εµβολίου και υποκειµένου, ακολούθησε δέσιµο µε ειδική ταινία εµβολιασµών, στο σηµείο της ένωσης, επίπαση µε µυκητοκτόνο σκόνη, ελαφρά περιτύλιξη µε βαµβάκι και αλουµινόχαρτο, και τέλος κάλυψη µε διάφανη πλαστική σακούλα για την πρώτη εβδοµάδα για τη διατήρηση της απαραίτητης υγρασίας. Τα εµβολιασµένα δέντρα διατηρήθηκαν στη σκιά και ποτίζονταν κανονικά. Συνολικά, για κάθε µια από τις τρεις µεθόδους εµβολιασµού, χρησιµοποιήθηκαν 10 εµβόλια, από κάθε ένα από τα 20 επιλεγµένα άτοµα. Το πείραµα διενεργήθηκε σε 3 επαναλήψεις. 5.4 Διέγερση και ανάπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών βραχυκλαδίων των εµβολίων που προήλθαν από τα επιλεγµένα υψηλοαποδοτικά σε ρητίνη άτοµα χαλεπίου πεύκης Όπως είναι εύλογο, τα µητρικά άτοµα που επιλέχθηκαν δε µπορούν να αποτελέσουν πηγή µεγάλου αριθµού εµβολίων κυρίως λόγω της µεγάλης ηλικίας τους αλλά και του πεπερασµένου αριθµού νέων βλαστών. Για να ξεπεραστεί το πρόβληµα αυτό, τα αρχικά εµβολιασµένα άτοµα υπέστησαν χειρισµούς που οδήγησαν στη διέγερση και ανάπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών των βραχυκλαδίων τους σε βλαστούς, µε σκοπό τη δηµιουργία φυτών «µάνες» που θα αποτελέσουν πηγή εµβολίων (Σκαλτσογιάννης 1988). 92

Μέθοδοι και Υλικά Για το σκοπό αυτό, τον Μάρτιο του 2009, δυο χρόνια µετά τη διενέργεια των εµβολιασµών, 5 εµβολιασµένα άτοµα από κάθε επιλεγµένο γενότυπο που έλαβε µέρος στο προηγούµενο πείραµα, ψεκάστηκαν µε διάλυµα βενζυλαδενίνης (BAP) συγκέντρωσης 400 mg/l αφού είχε προηγηθεί αποκοπή των ακραίων οφθαλµών τους. Τα φυτά τοποθετήθηκαν σε θερµοκήπιο µε ηµερήσια θερµοκρασία 24±4 ºC, νυχτερινή 17±4 ºC και φωτοπερίοδο 18 ωρών και ψεκάστηκαν συνολικά 5 φορές ανά 5 ηµέρες. Εννέα εβδοµάδες µετά τον τελευταίο ψεκασµό, εξετάστηκε η διέγερση των µασχαλιαίων βλαστών στα βραχυκλάδια και µόνο όσοι είχαν µήκος µεγαλύτερο από 10mm θεωρήθηκαν ως διεγερµένοι. 93

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 94

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα 6.1 ΕΠΙΛΟΓΗ Η µέθοδος της επιλογής, που βασίζεται στη σταθερότητα της απόδοσης ενός γνωρίσµατος στο χρόνο, κρίνεται απόλυτα επιτυχής. Η επιλογή των υψηλοαποδοτικών σε ρητίνη ατόµων µε βάση την επί χρόνια εµπειρία των ρητινοσυλλεκτών πάνω σε αυτά, καθώς και µε βάση τις µετρήσεις της παραγωγής που πάρθηκαν κατά τα έτη 2006 και 2007, έρχεται σε απόλυτη συµφωνία µε την πρόταση των Roberds και Strom (2006). Οι παραπάνω ερευνητές µελετώντας την παραγωγή της ρητίνης σε τρία είδη πεύκης Pinus taeda L., Pinus palustris Mill. και Pinus elliottii, κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι δυο µετρήσεις ανά δέντρο στο στηθιαίο ύψος είναι επαρκείς για την εκτίµηση αυτής. Έτσι τα 22 άτοµα που επιλέχθηκαν από τη Χαλκιδική και τα 11 από τη Εύβοια µπορούν µε ασφάλεια να θεωρηθούν ως άριστοι γενότυποι όσον αφορά την παραγωγή της ρητίνης. Στον Πίνακα 2 παρουσιάζονται οι κωδικές ονοµασίες και οι µέσοι όροι της παραγωγής των επιλεγµένων ατόµων στις δυο αυτές χρονιές. Συνολικά επιλέχθηκαν 33 δέντρα, 22 από τη Χαλκιδική και 11 από την Εύβοια (Γράφηµα 1,2,3,4). Η ίδια προσέγγιση εφαρµόστηκε και από άλλους ερευνητές ανά τον κόσµο σε µια πληθώρα προγραµµάτων βελτίωσης. Το πρώτο στάδιο όλων αυτών των προγραµµάτων ήταν η φαινοτυπική επιλογή υψηλοαποδοτικών σε ρητίνη ατόµων, διαφόρων ειδών πεύκης. Η πρώτη προσπάθεια επιλογής και βελτίωσης του συγκεκριµένου χαρακτήρα έγινε στις Η.Π.Α από τον Dorman (1945) στο είδος Pinus elliottii και περιελάµβανε την επιλογή παραγωγικών σε ρητίνη ατόµων και την εγκατάσταση κήπου κλώνων µε τη τεχνική των µοσχευµάτων. Οι Squillace και Bengston (1961) µε την φαινοτυπική επιλογή, ως προς τον συγκεκριµένο χαρακτήρα, σε φυσικές συστάδες του είδους πέτυχαν αύξηση του γενετικού κέρδους κατά 55%. Παρόµοιες προσπάθειες αναφέρονται και από τους McReynolds και Gansel (1985) οι οποίοι πέτυχαν µε τη µέθοδο αυτή αύξηση της παραγωγής της ρητίνης κατά 60% στο είδος Pinus taeda L, καθώς και από τους Tadesse et al. (2001) στην Ισπανία, στο είδος Pinus pinaster και τους Sharma et al. (1998) στην Ινδία, στο είδος Pinus roxburghii Sargent. Παράλληλα, στην περίπτωση του καουτσούκ και στο είδος Hevea brasiliensis, η µέθοδος της φαινοτυπικής επιλογής υψηλοαποδοτικών ατόµων και της δηµιουργίας κλώνων αυτών, εφαρµόστηκε µε απόλυτη επιτυχία, µε αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση της παραγωγής. Η τακτική αυτή ακολουθήθηκε, ως ένα αρχικό στάδιο, σε 95

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Ν ΧΑΛΚΙΔΙΚΗ Kg Kg Μ.Ο. Ν ΕΥΒΟΙΑ Kg Kg Μ.Ο. 1έτος 2έτος + 1έτος 2έτος + Τ.Σ. 1 Χ1 20 20 20±0 23 Ε1 32 34 33±1 2 Χ2 20 18 19±1 24 Ε2 24 22 23±1 3 Χ3 26 24 25±1 25 Ε3 25 29 27±2 4 Χ4 21 17 19±2 26 Ε4 23 21 22±1 5 Χ5 17 17 17±0 27 Ε5 22 18 20±2 6 Χ6 11 13 12±1 28 Ε6 21 23 21±1 7 Χ7 21 19 20±1 29 Ε7 25 25 25±0 8 Χ8 14 16 15±1 30 Ε8 26 22 24±2 9 Χ9 18 18 18±0 31 Ε9 19 21 20±1 10 Χ10 19 17 18±1 32 Ε10 29 23 26±3 11 Χ11 13 11 12±1 33 Ε11 24 20 22±2 12 Χ12 29 25 27±2 13 Χ13 11 13 12±1 14 Χ14 16 14 15±1 15 Χ15 17 19 18±1 16 Χ16 13 15 14±1 17 Χ17 12 12 12±0 18 Χ18 16 14 15±1 19 Χ19 33 31 32±1 20 Χ20 17 19 18±1 21 Χ21 22 22 22±0 22 Χ22 15 17 16±1 Μ.Ο.±Τ.Σ. 18,2 ± 1,20 17,7 ± 0,99 18 ± 0.77 42 24,54 ± 1,09 23,35 ± 1,35 24 ± 0,857 9 Πίνακας 2. Παραγωγή ρητίνης (µε στρογγυλοποίηση στα Kg) των επιλεγµένων υψηλοαποδοτικών ατόµων χαλεπίου πεύκης. Με «Χ» συµβολίζονται τα επιλεγµένα δέντρα από τη Χαλκιδική ενώ µε «Ε» τα επιλεγµένα δέντρα από την Εύβοια. Παρουσιάζονται οι µετρήσεις δύο ετών (2006 και 2007) ανά δέντρο καθώς και οι Μέσοι Όροι µε τα Τυπικά Σφάλµατα τους. Τ.Σ. 96

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα 35 παραγωγή ρητίνης σε Kg 30 25 20 15 10 5 παραγωγή 1έτους παραγωγή 2έτους 0 x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10 x11 x12 x13 x14 x15 x16 x17 x18 x19 x20 x21 x22 επιλεγμένα άτομα Χαλκιδικής Γράφηµα(1): Παραγωγή ρητίνης των επιλεγµένων ατόµων στη Χαλκιδική, για τα έτη 2006 και 2007. παραγωγή ρητίνης σε Kg 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Ε9 Ε10 Ε11 επιλεγμένα άτομα Εύβοιας παραγωγή 1έτους παραγωγή 2έτους Γράφηµα(2): Παραγωγή ρητίνης των επιλεγµένων ατόµων στη Εύβοια, για τα έτη 2006 και 2007. 97

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα 35 Μ.Ο. παραγωγής 2 ετών 30 25 20 15 10 5 0 χ1 χ2 χ3 χ4 χ5 χ6 χ7 χ8 χ9 χ10 χ11 χ12 χ13 χ14 χ15 χ16 χ17 χ18 χ19 χ20 χ21 χ22 επιλεγμένα άτομα Χαλκιδικής Γράφηµα(3): Μέσος όρος της παραγωγής των επιλεγµένων ατόµων από τη Χαλκιδική, για τα έτη 2006 και 2007. Μ.Ο. παραγωγής 2 ετών 40 35 30 25 20 15 10 5 0 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 επιλεγμένα άτομα Εύβοιας Γράφηµα(4): Μέσος όρος της παραγωγής των επιλεγµένων ατόµων από την Εύβοια, για τα έτη 2006 και 2007. 98

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα διάφορα προγράµµατα βελτίωσης ανά τον κόσµο (Onokpise 1981, Alika 1985, Gonçalves et al. 1999, 2003, 2005, Brito da Costa et al. 2000a, 2000b, Cardinal et al. 2007). Η επιτυχία αυτών των προγραµµάτων βελτίωσης µπορεί να εντοπιστεί στη θεαµατική αύξηση της παραγωγής του καουτσούκ, από περίπου 500 Kg/ha/year στα µη επιλεγµένα άτοµα σε περίπου 3000Kg/ha/year στους κλώνους που δηµιουργήθηκαν, παραγωγή η οποία βρίσκεται µακριά από το θεωρητικό δυναµικό παραγωγής το οποίο είναι περίπου 10.000Kg/ha/year. 6.2 Αποτελέσµατα των υπολογισµών του γενετικού κέρδους Στους πίνακες 3 και 4 παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα των υπολογισµών της κλωνικής και της βελτιωτικής αξίας των επιλεγµένων ατόµων της Χαλκιδικής και της Εύβοιας. Πίνακας 3. Προβλεπόµενη κλωνική και βελτιωτική αξία των επιλεγµένων ατόµων της Ευβοίας.. Δέντρο Φαινoτυπική µέτρηση P i Φαινότυπος µείον το µέσο όρο (P i -µ ρ ) Προβλεπόµενη κλωνική αξία (G i ) Προβλεπόµενη βελτιωτική αξία (Α i ) E1 33 29 20,3 14,5 E2 23 19 13,3 9,5 E3 27 23 16,1 11,5 E4 22 18 12,6 9 E5 20 16 11,2 8 E6 21 17 11,9 8,5 E7 25 21 14,7 10,5 E8 24 20 14 10 E9 20 16 11,2 8 E10 26 22 15,4 11 E11 22 18 12,6 9 M.O 24 19,9 13,9 9,9 99

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 4. Προβλεπόµενη κλωνική και βελτιωτική αξία των επιλεγµένων ατόµων της Χαλκιδικής. Δέντρο Φαινoτυπική µέτρηση P i Φαινότυπος µείον το µέσο όρο (P i -µ ρ ) Προβλεπόµενη κλωνική αξία (G i ) Προβλεπόµενη βελτιωτική αξία (Α i ) Χ1 20 16 11,2 8 Χ2 19 15 10,5 7,5 Χ3 25 21 14,7 10,5 Χ4 19 15 10,5 7,5 Χ5 17 13 9,1 6,5 Χ6 12 8 5,6 4 Χ7 20 16 11,2 8 Χ8 15 11 7,7 5,5 Χ9 18 14 9,8 7 Χ10 18 14 9,8 7 Χ11 12 8 5,6 4 Χ12 27 23 16,1 11,5 Χ13 12 8 5,6 4 Χ14 15 11 7,7 5,5 Χ15 18 14 9,8 7 Χ16 14 10 7 5 Χ17 12 8 5,6 4 Χ18 15 11 7,7 5,5 Χ19 32 28 19,6 14 Χ20 18 14 9,8 7 Χ21 22 18 12,6 9 Χ22 16 12 8,4 6 Μ.Ο. 18 14 9,8 7 100

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Τα προβλεπόµενα γενετικά κέρδη των επιλογών αυτών µπορούν να υπολογιστούν µε δυο ισοδύναµους τρόπους: 1) Με υπολογισµό της προβλεπόµενης κλωνικής και βελτιωτικής αξίας κάθε επιλογής και κατόπιν υπολογισµό των µέσων όρων ή 2) Υπολογισµό αρχικά του διαφορικού επιλογής, ως τη διαφορά του µέσου όρου των φαινοτυπικών µετρήσεων µείον το µέσο όρο του πληθυσµού και κατόπιν εφαρµογή των εξισώσεων (2) και (3) που αναφέρθηκαν στο προηγούµενο κεφάλαιο. Για την περιοχή της Εύβοιας η κλωνική (ΔG C ) και η βελτιωτική αξία (ΔG A ) είναι: ΔG C = H 2 S= 0,7x(24-4)=14 Kg, ένα γενετικό κέρδος δηλαδή της τάξης του 350% ΔG A = h 2 S= 0,5x(24-4)=10Kg, ένα γενετικό κέρδος δηλαδή της τάξης του 250% Οι προβλεπόµενες κλωνικές και βελτιωτικές αξίες εκφράζονται και οι δυο ως αποκλίσεις πάνω από το µέσο όρο του πληθυσµού βάσης. Αν οι επιλογές αυτές χρησιµοποιηθούν στη δηµιουργία επιχειρησιακών φυτειών, οι προβλεπόµενες τιµές είναι οι προβλέψεις του γενετικού κέρδους. Με τη δηµιουργία κλώνων από τα επιλεγµένα δέντρα, οι φυτείες στην περιοχή της Εύβοιας αναµένεται να έχουν παραγωγή κατά µέσο όρο 14Kg µεγαλύτερη από τη παραγωγή των φυτειών που θα σχηµατιστούν από κλώνους που λαµβάνονται τυχαία από δέντρα του πληθυσµού βάσης. Εάν οι φυτείες δηµιουργηθούν από σπόρο που έχει παραχθεί από τυχαίες διασταυρώσεις µεταξύ των επιλεγµένων ατόµων της Εύβοιας, το προβλεπόµενο κέρδος είναι 10Κg πάνω από ότι θα παίρναµε αν οι φυτείες προέρχονταν από σπόρο που θα είχε συλλεχθεί τυχαία από τον πληθυσµό βάσης. Εκφραζόµενες σε ποσοστά οι τιµές αυτές των κερδών είναι 350% και 250% πάνω από το µέσο όρο του πληθυσµού βάσης. Στον πίνακα 5 εµφανίζονται οι τιµές των κλωνικών και των βελτιωτικών αξιών, όταν εγκαθίσταται µια φυτεία στη περιοχή της Εύβοιας, η οποία απαρτίζεται από 1 µέχρι 10 επιλεγµένα άτοµα, τα οποία πήραν µέρος στα επόµενα πειράµατα που αφορούν στο βλαστικό πολλαπλασιασµό. Στη περίπτωση που αυτή απαρτίζεται από µόνο ένα κλώνο το µεγαλύτερο γενετικό κέρδος επιτυγχάνεται µε τη χρήση του κλώνου Ε1 507,5% για προβλεπόµενη κλωνική αξία 20,3Kg και 362,5% για προβλεπόµενη βελτιωτική αξία 14,5Kg. Με τη χρήση και των 10 επιλεγµένων κλώνων το προβλεπόµενο γενετικό κέρδος είναι 351,75% και 251,25% για προβλεπόµενη κλωνική αξία 14,07Kg και προβλεπόµενη βελτιωτική αξία 10,05Kg αντίστοιχα. 101

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 5. Τιµές των κλωνικών και των βελτιωτικών αξιών, όταν ιδρύεται µια φυτεία στη περιοχή της Εύβοιας, η οποία απαρτίζεται από 1 µέχρι 10 επιλεγµένα άτοµα. Δέντρα Προβλεπόµενη κλωνική αξία Προβλεπόµενη βελτιωτική αξία Ε1 20,3 ή 507,5% 14,5 ή 362,5% Ε1+Ε2 16,8 ή 420% 12 ή 300% Ε1+Ε2+Ε3 16,56 ή 414% 11,83 ή 295,75% Ε1+Ε2+Ε3+Ε4 15,575 ή 389,25% 11,125 ή 277,875% Ε1+Ε2+Ε3+Ε4+Ε5 14,7 ή 367, 5% 10,5 ή 262,5% Ε1+Ε2+Ε3+Ε4+Ε5+Ε6 14,23 ή 355,75% 10,16 ή 254% Ε1+Ε2+Ε3+Ε4+Ε5+Ε6+Ε7 14,3 ή 357,5% 10,21 ή 255,25% Ε1+Ε2+Ε3+ +Ε8 14,26 ή 356,5% 10,18 ή 254,5% Ε1+Ε2+Ε3+ +Ε9 13,92 ή 348% 9,94 ή 248,5% Ε1+Ε2+Ε3+ +Ε10 14,07 ή 351,75% 10,05 ή 251,25% Για τη περιοχή της Χαλκιδικής η κλωνική (ΔG C ) και η βελτιωτική αξία (ΔG A ) είναι: ΔG C = H 2 S= 0,7x(18-4)=9,8Κg, ένα γενετικό κέρδος δηλαδή της τάξης του 245% ΔG A = h 2 S =0,5x(18-4)=7Kg, ένα γενετικό κέρδος δηλαδή της τάξης του 175% Αν οι φυτείες ιδρυθούν στη περιοχή της Χαλκιδικής, από κλώνους των επιλεγµένων δέντρων, η παραγωγή αναµένεται να είναι κατά 9,8 Kg πάνω από τη παραγωγή των φυτειών που θα σχηµατιστούν από κλώνους που λαµβάνονται τυχαία από δέντρα του πληθυσµού βάσης. Εάν οι φυτείες δηµιουργηθούν από σπόρο που έχει παραχθεί από τυχαίες διασταυρώσεις µεταξύ των επιλεγµένων ατόµων, το προβλεπόµενο κέρδος είναι 7 Κg πάνω από ότι θα παίρναµε αν οι φυτείες ιδρύονταν από σπόρο που θα είχε συλλεχθεί τυχαία από τον πληθυσµό βάσης. Εκφραζόµενες σε ποσοστά οι τιµές αυτές των κερδών είναι 245% και 175% πάνω από το µέσο όρο του πληθυσµού βάσης. Στον πίνακα 6 εµφανίζονται οι τιµές των κλωνικών και των βελτιωτικών αξιών, όταν ιδρύεται µια φυτεία στη περιοχή της Χαλκιδικής, η οποία απαρτίζεται από 1 µέχρι 10 επιλεγµένα άτοµα, τα οποία πήραν µέρος στα επόµενα πειράµατα που 102

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα αφορούν στο βλαστικό πολλαπλασιασµό. Στη περίπτωση που αυτή απαρτίζεται από µόνο τον κλώνο Χ1 το προβλεπόµενο γενετικό κέρδος που επιτυγχάνεται είναι 280% για προβλεπόµενη κλωνική αξία 11,2Kg και 200% για προβλεπόµενη βελτιωτική αξία 8Kg. Το κέρδος αυτό µπορεί να µεγιστοποιηθεί (367,5%) µε τη χρήση του κλώνου Χ3. Με τη χρήση και των 10 επιλεγµένων κλώνων το προβλεπόµενο γενετικό κέρδος είναι 250,25% και 178,5% για προβλεπόµενη κλωνική αξία 10,01Kg και προβλεπόµενη βελτιωτική αξία 7,15Kg αντίστοιχα. Πίνακας 6. Τιµές των κλωνικών και των βελτιωτικών αξιών, όταν ιδρύεται µια φυτεία στη περιοχή της Εύβοιας, η οποία απαρτίζεται από 1 µέχρι 10 επιλεγµένα άτοµα, Δέντρα Προβλεπόµενη κλωνική αξία Προβλεπόµενη βελτιωτική αξία Χ1 11,2 ή 280% 8 ή 200% Χ1+Χ2 10,85 ή 271,25% 7,75 ή 193,75% Χ1+Χ2+Χ3 12,13 ή 303,25% 8,66 ή 216,5% Χ1+Χ2+Χ3+Χ4 11,725 ή 293,125% 8,375 ή 209,375% Χ1+Χ2+Χ3+Χ4+Χ5 11,2 ή 280% 8 ή 200% Χ1+Χ2+Χ3+Χ4+Χ5+Χ6 10,26 ή 256,5% 7,33 ή 183,25% Χ1+Χ2+Χ3+ +Χ7 10,4 ή 260 % 7,42 ή 185,5% Χ1+Χ2+Χ3+ +Χ8 10,06 ή 251,5 % 7,18 ή 179,5% Χ1+Χ2+Χ3+ +Χ9 10,03 ή 250,75% 7,16 ή 179% Χ1+Χ2+Χ3+ +Χ10 10,01 ή 250,25% 7,15 ή 178,75% Στη περίπτωση που θα ιδρυθεί µια επιχειρησιακή φυτεία, σε περιοχή µε περιβάλλον ενδιάµεσο της Χαλκιδικής και της Εύβοιας, αυτή θα απαρτίζεται από τους 5 καλύτερους από τους 10 κλώνους της Εύβοιας και της Χαλκιδικής. Στον πίνακα 7 παρουσιάζονται τα δέκα άτοµα που θα απαρτίζουν τη φυτεία, µε τις προβλεπόµενες κλωνικές και βελτιωτικές τους αξίες καθώς και οι συνολικές τιµές που αφορούν στη φυτεία. Οι τιµές της κλωνικής (ΔG C ) και της βελτιωτικής αξίας (ΔG A ) της φυτείας είναι 13,86Kg και 9,9Kg οι οποίες αντιστοιχούν σε γενετικά κέρδη 346,5% και 247,5%. 103

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 7. Προβλεπόµενες κλωνικές και βελτιωτικές αξίες των δέκα ατόµων που θα απαρτίζουν τη φυτεία καθώς και οι συνολικές τιµές τους που αφορούν στη φυτεία. Δέντρα Προβλεπόµενη κλωνική αξία (G i ) Προβλεπόµενη βελτιωτική αξία (Α i ) Ε1 20,3 14,5 Ε3 16,1 11,5 Ε10 15,4 11 Ε7 14,7 10,5 Ε8 14 10 Χ3 14,7 10.5 Χ7 11,2 8 Χ1 11,2 8 Χ4 10,05 7,5 Χ2 10,05 7,5 Μ.Ο. 13,86 9,9 Γενικά παρατηρούµε στα αποτελέσµατα µας, µια υπεροχή της κλωνικής δασοπονίας, στο προβλεπόµενο γενετκό κέρδος που επιτυγχάνεται, σε σχέση µε τη δασοπονία σποροφύτων. Για τις ίδιες οµάδες επιλογών, το προβλεπόµενο γενετικό κέρδος είναι πάντα µεγαλύτερο για τη κλωνική δασοπονία σε σχέση µε τη δασοπονία σποροφύτων και είναι ο λόγος του συντελεστή κληρονοµικής ικανότητας µε την ευρεία έννοια προς τον αντίστοιχο µε τη στενή έννοια: ΔG C /ΔG A =H 2 S/h 2 S= H 2 /h 2 αφού τα διαφορικά επιλογής είναι ίσα εφόσον πρόκειται για τις ίδιες επιλογές. Το επιπλέον κέρδος από τη κλωνική δασοπονία προέρχεται από το γεγονός ότι ο βλαστικός πολλαπλασιασµός δεσµεύει ολόκληρη τη κλωνική αξία G, από κάθε επιλεγµένο δέντρο, ενώ η δασοπονία σποροφύτων δεσµεύει µόνο τη βελτιωτική αξία Α (White et.al, 2007). Γενικά, οι τιµές του προβλεπόµενου γενετικού κέρδους που είναι 351,75%, 250,25%, 346,5% (προβλεπόµενη κλωνική αξία), παρά τους συντηρητικούς υπολογισµούς, είναι αρκετά υψηλότερες από αυτές που αναφέρονται στις εργασίες άλλων ερευνητών, που είχαν ως στόχο τη βελτίωση του γνωρίσµατος της παραγωγής της ρητίνης όπως των Squillace και Bengston, (1961) µε τιµή γενετικού κέρδους 55% 104

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα στο είδος Pinus elliottii,, των McReynolds και Gansel (1985) µε τιµή γενετικού κέρδους 60% στο είδος Pinus taeda L κ.α. 6.3 Δοκιµή και επιλογή εκκινητών Για την ανίχνευση εκκινητών που παρουσιάζουν πολυµορφισµούς, δοκιµάστηκαν 30 εκκινητές µε τη χρήση DNA από απλοειδή µεγαγαµετόφυτα των επιλεγµένων ατόµων. Από τους 30 τυχαίους εκκινητές που δοκιµάστηκαν, οι 8 από αυτούς (OPA04, OPA08, OPA09, OPE08, OPE10, OPH02, OPH04, OPH06),απέτυχαν να δώσουν προϊόντα ενίσχυσης. Ο αριθµός των προϊόντων ενίσχυσης κυµάνθηκε από 4 έως 9 ανά εκκινητή, µε το µέγεθος τους να ποικίλει από 200-2000+bp. Με βάση αυτά τα αποτελέσµατα, επιλέχθηκαν τελικά 6 εκκινητές (OPA01, OPA07, OPE02, OPH05, OPH07 και OPH09) οι οποίοι έδωσαν τα καλύτερα προϊόντα ενίσχυσης και για αυτό χρησιµοποιήθηκαν στην RAPD ανάλυση για την ταυτοποίηση των επιλεγµένων ατόµων. Ο εκκινητής OPE09 χρησιµοποιήθηκε στη µελέτη του διαχωρισµού των RAPD θραυσµάτων που προέκυψαν από την ενίσχυση του DNA του ατόµου Ε5, µιας και παρουσίασε πολυµορφισµούς στα 60 µεγαγαµετόφυτα που αναλύθηκαν. Οι ονοµασίες και οι ακολουθίες των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν βρίσκονται στον Πιν.8. Πίνακας 8. Ονοµασίες και αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στην έρευνα. Εκκινητής Ακολουθία OPA-01 OPA-07 OPE-02 OPE-09 OPH-05 OPH-07 OPH-09 CAGGCCCTTC GAAACGGGTG GGTGCGGGAA CTTCACCCGA AGTCGTCCCC CTGCATCGTG TGTAGCTGGG Εξαιτίας της µικρής συνεισφοράς χλωροπλαστικού και µιτοχονδριακού DNA στο συνολικό DNA που αποµονώθηκε και χρησιµοποιήθηκε ως υπόστρωµα, κυτοπλασµικά θραύσµατα απουσιάζουν από τα προϊόντα ενίσχυσης (Williams et al. 105

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα 1990, Heun and Helantjaris, 1993). Οι πιθανότητες που υπάρχουν σε αυτά τα γενώµατα να εντοπίζονται οι ακολουθίες που είναι απαραίτητες για τον υβριδισµό ενός εκκινητή, είναι πολύ µικρότερες σε σχέση µε το πυρηνικό γένωµα (Heun and Helantjaris, 1993). 6.4 Διαχωρισµός και κληρονόµηση των RAPD θραυσµάτων Τα αποτελέσµατα που αφορούν στον διαχωρισµό των RAPD θραυσµάτων στα 60 απλοειδή ενδοσπέρµια του επιλεγµένου ατόµου Ε5 παρουσιάζονται στον Πιν.9. Ο εκκινητής OPE09 που χρησιµοποιήθηκε στο παρόν πείραµα, αποκάλυψε 2 RAPD θραύσµατα που παρουσίασαν πολυµορφισµούς και σε αναλογία που βρίσκεται σε συµφωνία µε την 1:1 αναλογία που αναµένεται από ένα Μενδελικό γνώρισµα, µε βάση την εφαρµογή του κριτηρίου x 2. Όλα τα θραύσµατα αυτά παρουσίασαν µόνο τη µια από τις δυο πιθανές µορφές, είτε δηλαδή παρουσία είτε απουσία, επιβεβαιώνοντας τον χαρακτηρισµό των RAPD δεικτών ως κυρίαρχους (Εικ. 18,19). Πίνακας 9. Διαχωρισµός των RAPD θραυσµάτων στα µεγαγαµετόφυτα του ατόµου Ε5 και ανάλυση του κριτηρίου χ 2 για τον αν ισχύει η 1:1 αναλογία. Παρατηρούµενες Αναµενόµενες τιµές τιµές θραύσµα + - + - n X 2 P OPE09-32 28 30 30 60 0,166 0,9 984 OPE09-33 27 30 30 60 0,6 0,8 1230 Τα παραπάνω αποτελέσµατα έρχονται σε πλήρη συµφωνία µε αυτά άλλων ερευνητών όπως οι Gomez et al. (2002) στο είδος Pinus halepensis, Lu et al. (1995) και Hurme και Savolainen (1999) στο είδος Pinus sylvestris, Carlson et al. (1991), Bucci και Menozzi (1993), Binelli και Bucci (1994), Heinze et al. (1996) και Skov (1998) στο είδος Picea abies, Tulsieram et al. (1992) στο είδος Picea glauca καθώς και Nelson et al. (1993) στο είδος Pinus elliottii και Kaya και Neale (1995) στο είδος Pinus brutia. Όλοι οι παραπάνω εργαζόµενοι µε µεγαγαµετόφυτα κωνοφόρων ειδών, 106

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα παρατήρησαν µια συµφωνία στο διαχωρισµό των πολυµορφισµών που εντόπισαν µε την 1:1 αναλογία καθώς και µια κυρίαρχη συµπεριφορά αυτών. Εικόνες 18,19. Μενδελικός διαχωρισµός (1:1) των RAPD θραυσµάτων Σύµφωνα µε τους Carlson et al. (1991), Lu et al. (1995) και Skov (1998), οι οποίοι πραγµατοποίησαν ελεγχόµενες διασταυρώσεις στα είδη Picea glauca, Pseudotsuga menziessi και Pinus sylvestris αντίστοιχα, οι RAPD ως δείκτες ακολουθούν τη Μενδελική κληρονόµηση. Με βάση τη παρουσία ή όχι συγκεκριµένων RAPD θραυσµάτων στους γονείς που παίρνουν µέρος στη διασταύρωση, µπορούν να µελετηθούν 3 περιπτώσεις: i) Το συγκεκριµένο θραύσµα εντοπίζεται και στους 2 γονείς. ii) Το συγκεκριµένο θραύσµα εντοπίζεται στον έναν από τους 2 γονείς. iii) Το συγκεκριµένο θραύσµα δεν εντοπίζεται σε κανέναν από τους 2 γονείς. Η πρώτη περίπτωση περιλαµβάνει τους 3 ακόλουθους γενοτύπους γονέων: AAxAA, AAxAα και AαxAα. Οι δυο πρώτοι συνδυασµοί περιλαµβάνουν έναν 107

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα κυρίαρχο οµοζύγωτο γονέα (ΑΑ) και για τον λόγο αυτό αναµένεται να προκύψουν µονοµορφικοί απόγονοι που µοιράζονται το ίδιο θραύσµα µε τους γονείς. Στη περίπτωση της διασταύρωσης δυο κυρίαρχων ετεροζύγωτων γονέων (Αα), το θραύσµα αναµένεται να διαχωριστεί σε µια αναλογία 3:1 στους απογόνους. Η δεύτερη περίπτωση µπορεί να υπάρξει όταν στον έναν γονιό εντοπίζεται ένα θραύσµα είτε σε κυρίαρχη οµοζύγωτη (ΑΑ) είτε σε κυρίαρχη ετεροζύγωτη κατάσταση (Αα) και στον άλλον σε οµοζύγωτη υποτελή (αα). Στη πρώτη περίπτωση (ΑΑxαα), όλοι οι απόγονοι αναµένεται να κατέχουν το θραύσµα που εντοπίστηκε στον έναν γονέα. Στη δεύτερη περίπτωση (Ααxαα), το θραύσµα αναµένεται να παρουσιάσει πολυµορφισµό τύπου παρουσία-απουσία και να διαχωριστεί σε µια αναλογία 1:1 µεταξύ των απογόνων. Η τρίτη περίπτωση όπου το θραύσµα απουσιάζει και από τους δυο γονείς, µπορεί να συµβεί και να µελετηθεί µόνο όταν το θραύσµα αυτό εντοπίζεται σε άλλους γονείς που πήραν µέρος στην έρευνα. Όπως αναµένεται από µια διασταύρωση δυο οµοζύγωτων υποτελών γονέων (ααxαα), το θραύσµα θα απουσιάζει από όλους τους απογόνους. Όλες οι παραπάνω καταστάσεις, που καταδεικνύουν τη Μενδελική συµπεριφορά των RAPD θραυσµάτων, επιβεβαιώθηκαν από διάφορους ερευνητές σε µια πληθώρα οργανισµών (Carlson et al. 1991,, Hunt και Page 1992, Roy et al. 1992, Kazan et al. 1993, Rowland και Len 1994, Lu et al. 1995). Παρόλα αυτά όµως, πολυµορφισµοί που παρουσιάζουν ξεκάθαρη παρέκκλιση από την 1:1 αναλογία παρουσιάζονται στους RFLPs, στους RAPDs και τους ισοενζυµικούς δείκτες, τόσο στα καλλιεργούµενα όσο και στα δασικά είδη. Οι αιτίες του φαινοµένου αυτού δεν είναι πλήρως γνωστές. Πιθανόν µπορεί να οφείλεται σε λάθος στη δειγµατοληψία ή στην ύπαρξη κάποιας σύνδεσης µε άλλες γονιδιακές θέσεις που µπορούν να παραµορφώσουν εµφανώς τον 1:1 διαχωρισµό εξαιτίας κάποιας µορφής προζυγωτικής ή µετα-ζυγωτικής επιλογής (Aravanopoulos et al. 1994). Ο κυρίαρχος χαρακτήρας της RAPD ποικιλότητας περιορίζει τη τεκµηρίωση του πατρικού ή του µητρικού γενοτύπου, στη περίπτωση που τα δεδοµένα αναφέρονται σε διπλοειδή ιστό (Roy et al. 1992). Αυτό γιατί όταν ένα RAPD θραύσµα εντοπίζεται τόσο στους γονείς όσο και σε όλους τους απογόνους, δεν είναι δυνατόν να εξακριβωθεί για κανέναν από τους δυο γονείς αν πρόκειται για κυρίαρχους οµοζύγωτους (ΑΑ) ή κυρίαρχους ετεροζύγωτους (Αα) γενοτύπους. 108

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Όπως αποδείχθηκε ο περιορισµός αυτός µπορεί να αρθεί µε την ανάλυση απλοειδούς ιστού των γονέων. Παρόλο αυτά όµως, για να καταστεί δυνατή η πλήρης αξιοποίηση αυτού του πλεονεκτήµατος, είναι απαραίτητο να εξακριβωθεί ότι τα µεµονωµένα RAPD θραύσµατα που εντοπίζονται στο διπλοειδή ιστό, εντοπίζονται και στον απλοειδή, καθότι κάποιες φορές το προφίλ των δυο τύπων ιστών διαφέρει. Το φαινόµενο αυτό αποδίδεται στην ύπαρξη µιας ετεροζυγωτίας στους γονείς, η οποία δε ήτανε δυνατόν να ανιχνευθεί, εξαιτίας του περιορισµένου αριθµού των µεγαγαµετοφύτων που αναλύθηκαν. Γενικά µε την εφαρµογή της RAPD ανάλυσης σε απλοειδή ιστό µεγαγαµετοφύτων οι RAPD δείκτες συµπεριφέρονται σαν συγκυρίαρχοι γεγονός που τους καθιστά αξιόλογους γενετικούς δείκτες. 6.5 Tαυτοποίηση των επιλεγµένων ατόµων Όπως αποδείχθηκε στο προηγούµενο πείραµα, οι RAPD δείκτες όταν προέρχονται από ανάλυση σε ιστό µεγαγαµετοφύτου ανάγονται σε συγκυρίαρχους. Εποµένως η γενετική ταυτότητα των επιλεγµένων ατόµων προκύπτει από τα αλληλόµορφα που εµφάνισε το κάθε άτοµο για τις 68 γονιδιακές θέσεις. Στον Πιν. 10 παρουσιάζεται το γενετικό προφίλ των ατόµων της Χαλκιδικής και της Εύβοιας, που πήραν µέρος σε αυτό το πείραµα. Παράλληλα, έγινε και έλεγχος για την πιθανή ύπαρξη ίδιων γενοτύπων µε βάση τις 68 γονιδιακές θέσεις. Όπως προκύπτει από τα αποτελέσµατα, και τα 4 επιλεγµένα άτοµα εµφανίζουν διαφορετικό γενότυπο. Εικ. 20 Προφίλ του ατόµου Ε3 µε τη χρήση του εκκινητή OPA01 109

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ.21. Προφίλ του ατόµου X5µε τη χρήση του εκκινητή OPA01 Εικ. 22.Προφίλ του ατόµου X6 µε τη χρήση του εκκινητή OPA01 Εικ. 23. Προφίλ του ατόµου Ε3µε τη χρήση του εκκινητή OPA07 110

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ. 24. Προφίλ του ατόµου X5µε τη χρήση του εκκινητή OPA07 Εικ. 25. Προφίλ του ατόµου X6µε τη χρήση του εκκινητή OPA07 Εικ. 26. Προφίλ του ατόµου Ε3µε τη χρήση του εκκινητή OPE02 111

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ. 27. Προφίλ του ατόµου X5µε τη χρήση του εκκινητή OPE02 Εικ. 28. Προφίλ του ατόµου E5µε τη χρήση του εκκινητή OPE02 Εικ. 29. Προφίλ του ατόµου X6µε τη χρήση του εκκινητή OPE02 112

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ. 30. Προφίλ του ατόµου Ε3 µε τη χρήση του εκκινητή OPH05 Εικ. 31. Προφίλ του ατόµου X5µε τη χρήση του εκκινητή OPH05 Εικ. 33. Προφίλ του ατόµου E5 µε τη χρήση του εκκινητή OPH05 113

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ. 34. Προφίλ του ατόµου X6 µε τη χρήση του εκκινητή OPH05 Εικ. 35. Προφίλ του ατόµου Ε3 µε τη χρήση του εκκινητή OPH07 Εικ. 36. Προφίλ του ατόµου X5µε τη χρήση του εκκινητή OPH07 114

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ. 37. Προφίλ του ατόµου E5µε τη χρήση του εκκινητή OPH07 Εικ. 38. Προφίλ του ατόµου X6 µε τη χρήση του εκκινητή OPH07 Εικ. 39. Προφίλ του ατόµου Ε3 µε τη χρήση του εκκινητή OPH09 115

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ. 40. Προφίλ του ατόµου X5µε τη χρήση του εκκινητή OPH09 Εικ. 41. Προφίλ του ατόµου E5µε τη χρήση του εκκινητή OPH09 Στον Πιν. 12 παρουσιάζεται ο αριθµός των ατόµων που εµφάνισαν ίδιο γενότυπο σε σχέση µε τον αριθµό των γονιδιακών θέσεων που συµπεριλαµβάνονται στην ανάλυση. Έτσι, όταν λαµβάνεται υπόψη µόνο η γονιδιακή θέση OPAO1-250, διαπιστώνουµε πως η θέση αυτή και µόνο αυτή δεν έχει καµία διακριτική ικανότητα µεταξύ των ατόµων µιας και κανένας γενότυπος δε διαχωρίζεται από τον άλλον. Με την προσθήκη στην ανάλυση και άλλων δυο γονιδιακών θέσεων, OPA01-400 και OPA01-490, παρατηρούµε ότι δυο γενότυποι διαχωρίζονται από τους άλλους δυο κ.ο.κ. Η σειρά µε την οποία προστίθενται οι γονιδιακές σχέσεις είναι αυτή µε την οποία έγινε η εισαγωγή των δεδοµένων για ανάλυση. 116

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 10. Γενότυποι των υψηλοαποδοτικών σε ρητίνη ατόµων. Οι δυο αριθµοί που παρουσιάζονται σε κάθε κελί αναφέρονται στα 2 αλληλόµορφα της κάθε γονιδιακής θέσης για το αντίστοιχο επιλεγµένο άτοµο ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ ΘΕΣΕΙΣ E3 Χ5 Ε5 X6 0PA01-250 11 00 11 00 OPA01-400 11 11 11 11 OPA01-490 11 11 11 00 OPA01-500 00 11 00 11 OPA01-550 11 00 11 00 OPA01-620 00 11 00 00 OPA01-700 11 11 11 00 OPA01-750 00 11 00 11 OPA01-900 11 00 00 11 OPA01-1050 00 11 11 00 OPA01-1170 00 00 00 11 OPA01-1300 00 00 00 11 OPA01-1400 00 00 11 00 OPA07-400 11 00 00 00 OPA07-490 00 11 00 00 OPA07-750 00 00 11 11 OPA07-850 11 11 00 00 OPA07-980 00 11 11 00 OPA07-1050 00 00 00 11 OPA07-1230 00 11 11 11 OPA07-1350 11 00 00 00 OPA07-1400 00 00 00 11 OPA07-1600 00 00 11 00 OPA07-1720 11 00 00 00 OPA07-2000+ 11 00 00 00 OPE02-600 11 00 11 00 117

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ ΘΕΣΕΙΣ E3 Χ5 Ε5 X6 OPE02-850 00 00 00 10 OPE02-900 00 11 00 00 OPE02-980 00 11 10 11 OPE02-1100 11 11 11 11 OPE02-1230 11 11 11 11 OPE02-1350 00 00 10 10 OPE02-1470 11 11 11 11 OPE02-1850 11 11 11 11 OPH05-300 11 11 11 11 OPH05-550 11 11 00 11 OPH05-650 11 11 11 11 OPH05-700 00 11 11 00 OPH05-750 00 11 00 00 OPH05-860 00 00 11 11 OPH05-980 00 11 00 11 OPH05-1100 00 00 00 11 OPH05-1350 11 11 11 11 OPH05-2000 11 11 11 11 OPH05-2000+ 11 11 11 11 OPH07-550 00 00 00 11 OPH07-620 11 11 11 00 OPH07-700 00 00 11 11 OPH07-750 00 11 11 11 OPH07-850 11 11 11 11 OPH07-880 00 00 11 00 OPH07-980 11 11 11 11 OPH07-1100 00 11 11 11 OPH07-1470 00 11 11 00 118

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ ΘΕΣΕΙΣ E3 Χ5 Ε5 X6 OPH07-1600 00 11 00 11 OPH07-1720 11 11 11 00 OPH07-2000 11 11 11 11 OPH09-500 11 00 11 11 OPH09-580 00 11 00 00 OPH09-620 00 11 00 00 OPH09-650 00 11 00 00 OPH09-700 00 11 00 11 OPH09-850 11 11 11 11 OPH09-980 00 11 00 11 OPH09-1100 11 00 11 00 OPH09-1230 00 11 00 11 OPH09-1600 11 11 11 00 OPH09-2000+ 11 11 11 11 Πίνακας 11. Οι γενότυποι των 4 ατόµων που ταυτοποιήθηκαν για το σύνολο των 9 γονιδιακών θέσεων που απαιτούνται για τον πλήρη διαχωρισµό τους. ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ ΘΕΣΕΙΣ 0PA01-250 OPA01-400 OPA01-490 OPA01-500 OPA01-550 OPA01-620 OPA01-700 OPA01-750 OPA01-900 E3 11 11 11 00 11 00 11 00 11 X5 00 11 11 11 00 11 11 11 00 E5 11 11 11 00 11 00 11 00 00 X6 00 11 00 11 00 00 00 11 11 119

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 12. Ταυτιζόµενοι και µοναδικοί \γενότυποι ανά συνδυασµό γονιδιακών θέσεων για τα 4 άτοµα (#: Αριθµός δέντρων, Γ.Θ. : Γονιδιακή Θέση) Αριθµός γονιδιακών θέσεων #µε ταυτιζόµενο γενότυπο #µε µοναδικό γενότυπο #που ταυτίζονται εκτός 1 Γ.Θ. #που ταυτίζονται εκτός 2 Γ.Θ. #που ταυτίζονται εκτός 3 Γ.Θ. 1 4 0 0 0 0 1+2 4 0 4 0 0 1+2+3 2 2 4 3 0 1+2+3+4 2 2 2 3 3 1+2+3+4+5 2 2 2 0 3 1+2+3+4+5 2 2 0 2 0 1+2+3+4+5 2 2 0 0 2 1+2+3+4+5 2 2 0 0 2 +6+7+8 1+2+3+4+5 +6+7+8+9 1+2+3+4+5 +6+7+8+9+ 1+2+3+4+5 +6+7+8+9+ 10+11 1+2+3+4+5+ 6+7+8+9+10 +11+12 0 4 2 0 0 0 4 0 2 0 0 4 0 2 0 0 4 0 2 0...... 1+2+ +68. 0 4 0 0 0 Στον παραπάνω πίνακα παρατηρούµε ότι ο πλήρης διαχωρισµός των επιλεγµένων ατόµων γίνεται αν ληφθούν υπόψη 9 γονιδιακές θέσεις. Η πιθανότητα να βρεθεί ένα άτοµο που να παρουσιάζει τον ίδιο γενότυπο, µε κάποιο άλλο, σε αυτόν τον αριθµό των γονιδιακών θέσεων είναι ίση µε 7,3x10-4 (Πιν. 13). Η αντίστοιχη πιθανότητα για το σύνολο των 68 γονιδιακών θέσεων είναι ίση µε 2,7x10-20, που θεωρείται εξαιρετικά 120

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 13. Πιθανότητα δυο άτοµα να έχουν ταυτιζόµενο γενότυπο µε βάση τον αριθµό των γονιδιακών θέσεων. Αριθµός γονιδιακών θέσεων 1 2 9 68 Πιθανότητα δυο. άτοµα να έχουν ταυτιζόµενο γενότυπο 3,8x10-1 3,8x10-1 7,3x10-4 2,7x10-20 υψηλή ειδικά αν αναλογιστούµε ότι αναφερόµαστε σε υψηλοαποδοτικά σε παραγωγή ρητίνης άτοµα, επιλεγµένα ως προς το χαρακτηριστικό τους αυτό, και όχι στο σύνολο του πληθυσµού του είδους. Η ιδιαιτερότητα των ατόµων αυτών είναι και ο λόγος της ταυτοποίησης τους έτσι ώστε να είναι δυνατός ο διαχωρισµός τους στο µέλλον και από άλλα διαφορετικά άτοµα, που έχουν όµως επιλεχθεί για το συγκεκριµένο χαρακτηριστικό, και όχι από τυχαία άτοµα του πληθυσµού. Ένα ακόµη στοιχείο που παρουσιάζεται στο Πιν. 12 είναι ο αριθµός των ατόµων που ταυτίζονται σε όλες τις γονιδιακές θέσεις εκτός από µια, δυο ή τρεις. Τα άτοµα που ταυτίζονται σε όλες τις γονιδιακές θέσεις εκτός από µια είναι 2 στην ένατη γονιδιακή και από εκεί και πέρα µηδενίζονται. Τα ίδιο συµβαίνει για τα άτοµα που ταυτίζονται σε όλες τις γονιδιακές θέσεις εκτός από δυο και τρεις στη 12 και στη 13 γονιδιακή θέση αντίστοιχα. Όπως αναφέρθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο, ο αριθµός των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση των επιλεγµένων ατόµων ήταν 6. Ο πρώτος εκκινητής OPA01 έδωσε ένα σύνολο από 13 γονιδιακές θέσεις στα 4 επιλεγµένα άτοµα. Από αυτές τις γονιδιακές θέσεις, η OPA01-620 είναι ικανή να διαχωρίσει το άτοµο Χ5 αφού και το συγκεκριµένο θραύσµα εντοπίζεται µόνο στο άτοµο αυτό. Για τον ίδιο λόγο οι γονιδιακές θέσεις OPA01-1170 και OPA01-1300 διαχωρίζουν το άτοµο Χ6 και η γονιδιακή θέση OPA01-1400 διαχωρίζει το άτοµο Ε5. Ο δεύτερος εκκινητής OPA07 έδωσε ένα σύνολο από 12 γονιδιακές θέσεις. Από αυτές, οι θέσεις OPA07-400, OPA07-1350, OPA07-1720 και OPA07-2000+ εντοπίστηκαν µόνο στο άτοµο Ε3 ενώ η θέση OPA07-470 µόνο στο άτοµο Χ5. 121

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Παράλληλα, οι γονιδιακές θέσεις OPA07-1050 και OPA07-1400 διαχωρίζουν το άτοµο Χ6 από τα υπόλοιπα, ενώ η OPA07-1600 το άτοµο Ε5. Ο τρίτος εκκινητής OPΕ02 έδωσε ένα σύνολο από 9 γονιδιακές θέσεις και ήταν ο µόνος εκκινητής από τους 6 που χρησιµοποιήθηκαν που παρουσίασε ετερωζυγωτία σε 3 από αυτές. Η θέση OPΕ02-850 είναι ετεροζυγωτική και παρουσιάζεται µόνο στο άτοµο Χ6. Το άτοµο Χ5 διαχωρίζεται από τη θέση OPΕ02-900 που είναι µοναδική για αυτό. Ακόµη, το άτοµο Ε5 διαχωρίζεται από τη θέση OPΕ02-980 που παρουσιάζει ετερωζυγωτία, ενώ στα υπόλοιπα άτοµα που εντοπίζεται είναι οµοζυγωτική. Ο επόµενος εκκινητής που χρησιµοποιήθηκε είναι ο OPH05. Έδωσε συνολικά 11 γονιαδιακές θέσεις από τις οποίες η OPH05-750 και η θέση OPH05-1100 είναι µοναδικές στα άτοµα που εντοπίζονται και διαχωρίζουν τα άτοµο Χ5 και Ε6 αντίστοιχα. Ο πέµπτος στη σειρά εκκινητής είναι ο OPH07. Από τις 12 συνολικά γονιδιακές θέσεις µόνο 2 είναι µοναδικές και µπορούν να διαχωρίσουν τα άτοµα στα οποία εµφανίστηκαν από τα υπόλοιπα. Αυτές είναι η θέση OPH07-550 για το άτοµο Χ6 και η θέση OPH07-880 για το άτοµο Ε5. Τέλος ο εκκινητής OPH09, έδωσε συνολικά 11 γονιδιακές θέσεις. Οι θέσεις OPH09-580, OPH09-620 και OPH09-650 εντοπίζονται µόνο στο άτοµο Χ5 και το διαχωρίζουν από τα υπόλοιπα 3. Από όλα τα παραπάνω παρατηρούµε ότι ένας εκκινητής µπορεί να διαχωρίσει από ένα έως και τα 4 από τα επιλεγµένα άτοµα όπως διαπιστώθηκε για τον εκκινητή OPA07. Εποµένως, µε τη χρήση και των 6 εκκινητών η ταυτοποίηση και ο διαχωρισµός των 4 επιλεγµένων ατόµων αποτελεί µια απλή και σίγουρη διαδικασία, γεγονός που αποδεικνύεται και από την σηµαντι πιθανότητα που αναφέρθηκε προηγουµένως. Ένα άλλο γεγονός που αξίζει να σηµειωθεί είναι η έλλειψη ετεροζυγωτίας που παρουσιάστηκε στους περισσότερους εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν συνολικά. Τα επιλεγµένα υψηλοαποδοτικά άτοµα παρουσίασαν µια τάση προς οµοζυγωτία παρόλο που το συγκεκριµένο είδος παρουσιάζει ένα υψηλό ποσοστό πολυµορφικών θέσεων P=70,83 για τη περιοχή της Κασσάνδρας στη Χαλκιδική όπως αναφέρεται από τους Gómez et al. (2001) και P=73,50 Καρανίκας (2008). Η επιβεβαίωση και η ερµηνεία του φαινοµένου αποτελεί µια ξεχωριστή και ενδιαφέρουσα έρευνα που θα 122

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα περιλαµβάνει τις αναλύσεις πολλών ατόµων τόσο υψηλοαποδοτικών όσο και µε χαµηλή παραγωγή. Τέλος πρέπει να αναφερθεί ότι το γεγονός ότι δεν αναλύθηκαν όλα τα επιλεγµένα άτοµα οφείλεται στο ότι το πρόγραµµα της ταυτοποίησης ήταν καθαρά πιλοτικό και ο βασικός λόγος ήταν να καταδειχθεί η αποτελεσµατικότητα των µοριακών δεικτών τύπου RAPD στο θέµα αυτό. Επιπρόσθετα, στη περίπτωση µας πρέπει να τονισθεί ότι ένας άλλος ουσιαστικός λόγος που δεν ταυτοποιήθηκαν όλα τα επιλεγµένα άτοµα ήταν η δυσχερής οικονοµική κατάσταση (κόστος αντιδραστηρίων) που υπήρχε στο Εργαστήριο Δασικής Γενετικής και Βελτίωσης Δασοπονικών Ειδών. Εντούτοις όµως είναι πρόδηλο ότι η συµβολή της τεχνικής ταυτοποίησης µε µοριακούς δείκτες τύπου RAPD στη συγκεκριµένη περίπτωση ήταν και γρήγορη και αποτελεσµατική. Τα πρωτόκολλα της όλης τεχνικής ταυτοποίησης είναι διαθέσιµα. 6.6 Επίδραση της µεθόδου εµβολιασµού στο ποσοστό επιβίωσης των επιλεγµένων εµβολιασµένων ατόµων χαλεπίου πεύκης Δυο χρόνια µετά τη διενέργεια των εµβολιασµών έγιναν µετρήσεις για τον προσδιορισµό του συνολικού ποσοστού επιβίωσης της κάθε µιας από τις τρεις µεθόδους που χρησιµοποιήθηκαν. Στο γράφηµα (5) παρατηρούµε ότι η καλύτερη µέθοδος εµβολιασµού ήταν αυτή του Αγγλικού τύπου µε µέσο ποσοστό επιβίωσης 92,83%±3,330643, ενώ ακολούθησαν κατά σειρά αυτή του εµβολιασµού σε Σχισµή (72,16%±5,786384) και ο Πλάγιος εµβολιασµός (62,66%±6,24463). Οι συνολικές µετρήσεις παρουσιάζονται στους πίνακες 14,15,16 και 17. Γενικά τα αποτελέσµατα είναι αρκετά ικανοποιητικά και φαίνεται πως τα παρεγχυµατικά κύτταρα των εντεριωνών ακτινών, του φλοιώµατος, του φλοιού και του καµβίου λειτούργησαν κανονικά και πέτυχαν µια οµαλή ένωση των ιστών των υποκειµένων και των εµβολίων. Όσον αφορά στην αύξηση των εµβολίων παρατηρήθηκε µια σχετική οµοιοµορφία και στις τρεις µεθόδους, γεγονός που µπορεί να αποδοθεί στην επαρκή παροχή νερού που υπήρχε στα φυτά. Συµπτώµατα ασυµβίβαστου µεταξύ υποκειµένων και εµβολίων δε εντοπίστηκαν και οι απώλειες αποδίδονται : α) σε µη υγιή και εύρωστα υποκείµενα, β) στην καταλληλότητα ή µη της κάθε µεθόδου για το συγκεκριµένο είδος γ) σε τεχνικά λάθη κατά τη διενέργεια των εµβολιασµών. Η εποχή διενέργειας των εµβολιασµών, αρχές της άνοιξης, κρίνεται η κατάλληλη και 123

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Γράφηµα (5). Επίδραση της µεθόδου εµβολιασµού στο ποσοστό επιβίωσης των εµβολίων έρχεται σε συµφωνία µε ένα πλήθος ερευνητών που την προτείνουν ως την πλέον ιδανική επειδή το εµβόλιο είναι ακόµη σε λήθαργο ενώ το υποκείµενο ενεργό και ικανό να σχηµατίσει κάλλο που συµβάλει στην επούλωση των ιστών στο σηµείο εµβολιασµού (Mergen 1955, Mowat and Silen 1957, Copes 1973, Melchior 1987, Almqvist and Ekberg 2001). Η αφαίρεση των πλαστικών σακούλων που κάλυπταν τα εµβόλια, έγινε µια εβδοµάδα µετά τη διενέργεια των εµβολιασµών, δηλαδή σε χρονικό διάστηµα µικρότερο από αυτό που προτείνεται από τους περισσότερους ερευνητές. Η ενέργεια αυτή έχει να κάνει µε τις υψηλότερες θερµοκρασίες που παρατηρούνται στη χώρα µας, σε σχέση µε αυτές των βορειότερων χωρών στις οποίες αναφέρονται και οι περισσότερες έρευνες, και µε βάση τα αποτελέσµατα κρίνεται επιτυχής και απαραίτητη για την αποφυγή απωλειών λόγω των υψηλών θερµοκρασιών. Παράλληλα η προέλευση των εµβολίων, Χαλκιδική και Εύβοια δηλαδή, δεν φαίνεται να έπαιξε κάποιο ρόλο στα ποσοστά επιβίωσης των εµβολίων αφού και στις δυο περιπτώσεις αυτά ήταν αρκετά ικανοποιητικά και χωρίς ουσιαστικά διαφορές µεταξύ τους (Εικ. 42-47). Με βάση τα αποτελέσµατα των πειραµάτων, ως ιδανική µέθοδος εµβολιασµού στη χαλέπιο πεύκη (εµβόλιο και υποκείµενο) προτείνεται αυτή του Αγγλικού τύπου. Με µια ανασκόπηση στην υπάρχουσα βιβλιογραφία παρατηρούµε µια διαφοροποίηση των αποτελεσµάτων µας σε σχέση µε αυτά άλλων ερευνητών που εργάστηκαν µε διάφορα είδη κωνοφόρων. Οι Mowat και Silen (1957), εφαρµόζοντας διαφορετικές µεθόδους εµβολιασµού στο είδος Pinus ponderosa κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η καλύτερη µέθοδος ήταν αυτή του εµβολιασµού σε σχισµή µε ποσοστό επιτυχίας 54% 124

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα ενώ ακολουθούσαν αυτές του Αγγλικού τύπου και του πλάγιου εµβολιασµού µε το ίδιο ποσοστό επιτυχίας 21%. Ο Copes (1982), εφαρµόζοντας τη τεχνική του εµβολιασµού σε σχισµή στο είδος Pseudotsuga menziesii, πέτυχε ποσοστά επιβίωσης 90,9% και 76,4% ανάλογα µε το αν τα υποκείµενα προέρχονταν από σπόρους ελεγχόµενης ή ελεύθερης επικονίασης αντίστοιχα. Αντίστοιχα, οι Slee και Spidy (1970) µελετώντας την επίδραση του υποκειµένου στην εµφάνιση ασυµβίβαστου και χρησιµοποιώντας την ίδια µέθοδο, όπως παραπάνω, έφθασαν σε ποσοστό επιβίωσης 91% εργαζόµενοι στο είδος Pinus caribeae Mor. var. hondurensis, όπως και οι Cameron και Thomson (1971) πέτυχαν ποσοστό επιβίωσης 55% µε την ίδια µέθοδο στη Pinus radiata. Επιπλέον, οι Lott et al. (2003) πραγµατοποίησαν εµβολιασµούς µε εµβόλια του υβριδίου Pinus palustris Mill X Pinus elliottii Englein. var elliottii πάνω σε δυο ώριµα άτοµα του είδους Pinus palustris και δυο ώριµα άτοµα του είδους Pinus elliottii. Η µέθοδος που χρησιµοποίησαν ήτανε και σε αυτή τη περίπτωση η µέθοδος της σχισµής. Τα ποσοστά επιβίωσης έδειξαν σαφή επίδραση του υποκειµένου αφού στην πρώτη περίπτωση έφθασαν στο 72% και στη δεύτερη 18%. Σε µια αντίστοιχη µελέτη των Almqvist και Ekberk (2001) πάνω στο είδος Pinus sylvestris παρατηρήθηκαν ποσοστά επιβίωσης 54-89%, γεγονός που αποδίδεται στα διαφορετικά ώριµα άτοµα του είδους που χρησιµοποιήθηκαν ως υποκείµενα. Αργότερα οι Chauhan et al. (2007), µε την ίδια µέθοδο εµβολιασµού, έφθασαν σε ποσοστό επιβίωσης 46,79% στο είδος Pinus roxburghii Sargent. Πρόσφατα οι Frey et al. (2010), µελέτησαν την επίδραση της περιόδου διενέργειας των εµβολιασµών, της σκίασης και της άρδευσης στην επιβίωση των εµβολίων του είδους Abies fraseri (Pursh) Poir. σε υποκείµενα του είδους Abies bornmmelleriana Mattf. Με τη χρήση της µεθόδου εµβολιασµού σε σχισµή πέτυχαν ποσοστά επιβίωσης 95% όταν οι εµβολιασµοί έγιναν τον µήνα Απρίλιο, 52% τον Ιούλιο και 0% τον Οκτώβριο. Για το ίδιο είδος, οι Blazich και Hinesley (1994) προτείνουν και αυτοί τη µέθοδο του εµβολιασµού σε σχισµή για τον βλαστικό πολλαπλασιασµό του, µιας και τα ποσοστά επιβίωσης που παρατηρήθηκαν ήτανε αρκετά υψηλά. Οι Aparicio et al. (2009), µελετώντας τις µεθόδους του βλαστικού πολλαπλασιασµού στο είδος Austrocedrus chilensis κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι ο εµβολιασµός σε σχισµή είναι ο πλέον αποδοτικός µιας και παρουσιάστηκε µεγάλη δυσκολία στη ριζοβολία των µοσχευµάτων. Το ποσοστό επιβίωσης που υπολόγισαν έφθασε το 80,95% ενώ εντόπισαν και επίδραση του τύπου του εµβολίου πάνω σε αυτό. Τα καλύτερα ποσοστά έδωσαν τα µη αποξυλωµένα εµβόλια (92,85%) ενώ τα χειρότερα τα 125

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα αποξυλωµένα (37,50%). Ο Mantziris (1982), για την εγκατάσταση ενός σποροπαραγωγού κήπου της Pinus nigra, χρησιµοποίησε τις µεθόδους του πλάγιου εµβολιασµού και του εµβολιασµού σε σχισµή. Οι δυο µέθοδοι που εξετάστηκαν δεν παρουσίασαν στατιστικές διαφορές µεταξύ τους στο ποσοστό επιβίωσης (µέσο ποσοστό επιβίωσης 64,5%), αλλά ο συγγραφέας προτείνει σαν ιδανική µέθοδο, τον εµβολιασµό σε σχισµή µιας και είναι απλούστερη, γρηγορότερη και πιο πρακτική. Άλλοι ερευνητές όµως, προτείνουν ως ιδανική µέθοδο εµβολιασµών αυτή του πλάγιου εµβολιασµού. Ο Melchior (1984), εφαρµόζοντας τη µέθοδο αυτή στο είδος Picea abies L. Karst και χρησιµοποιώντας δυο τύπους υποκειµένων, κανονικά και νάνα, πέτυχε ποσοστά επιβίωσης από 37%-90%. Τα µεγαλύτερα ποσοστά παρατηρήθηκαν στη περίπτωση των νάνων υποκειµένων γεγονός που καταδεικνύει σαφή επίδραση του υποκειµένου στην επιτυχία των εµβολιασµών. Ακόµη οι Kirdar και Ertekin (2007), εµβολιάζοντας άτοµα του είδους Cedrus atlantica Manetti µε τη µέθοδο του πλάγιου εµβολιασµού, σε υποκείµενα του είδους Cedrus libani L., κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι µε την διενέργεια των εµβολιασµών µε τη συγκεκριµένη µέθοδο, σε θερµαινόµενη σήραγγα πολυαιθυλενίου και µε τη χρήση ρυθµιστών αύξησης το ποσοστό επιτυχίας µπορεί να φτάσει το 90%. Σε αντίθεση µε όλους τους παραπάνω αλλά σε συµφωνία µε τα αποτελέσµατα της έρευνας µας, έρχεται ο Hajek (2009), ο οποίος εφάρµοσε τις µεθόδους του Αγγλικού τύπου εµβολιασµού και του ενοφθαλµισµού µε διεγερµένους οφθαλµούς βραχυκλαδίων, για τον βλαστικό πολλαπλασιασµό των ειδών Pinus sylvestris και Picea abies. Με τη µέθοδο του Αγγλικού τύπου και υποκείµενα ηλικίας δυο ετών, πέτυχε ποσοστά επιβίωσης ακόµη και 100% και για τα δυο είδη ενώ µε τη µέθοδο του ενοφθαλµισµού τα ποσοστά έφτασαν στο 78% στην Pinus sylvestris και 92% στη Picea abies. Γενικά, ο εµβολιασµός µπορεί να αποτελέσει µια αξιόπιστη και αποδοτική τεχνική για τον βλαστικό πολλαπλασιασµό επιλεγµένων ατόµων κωνοφόρων διαφόρων ειδών. Συµπερασµατικά µπορούµε να αναφέρουµε ότι και οι τρεις µέθοδοι εµβολιασµού που εφαρµόστηκαν στη συγκεκριµένη έρευνα, κρίνονται ικανοποιητικές για τον εµβολιασµό ατόµων χαλεπίου πεύκης µιας και τα ποσοστά επιβίωσης είναι αρκετά υψηλά και στις τρεις περιπτώσεις. Παρόλα αυτά η µέθοδος εµβολιασµού που προτείνεται για τον βλαστικό πολλαπλασιασµό της Pinus halepensis, στην περίπτωση που και τα υποκείµενα ανήκουν στο ίδιο είδος, είναι αυτή του εµβολιασµού Αγγλικού τύπου. 126

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 14. Αριθµός εµβολίων που επιβίωσαν καθώς και αριθµός εµβολίων που δεν εππιβίωσαν µε τη µέθοδο του εµβολιασµού Αγγλικού τύπου. Αγγλικός τύπος εµβολιασµού Άτοµο Εµβόλια που επιβίωσαν Εµβόλια που δεν επιβίωσαν Επαν. 1 Επαν. 2 Επαν. 3 Επαν.1 Επαν.2 Επαν.3 Χ1 9 9 10 1 1 - Χ2 9 10 10 1 - - Χ3 10 9 9-1 1 Χ4 9 9 8 1 1 2 Χ5 10 10 10 - - - Χ6 10 10 10 - - - Χ7 9 8 9 1 2 1 Χ8 8 9 8 2 1 2 Χ9 9 9 9 1 1 1 Χ10 10 9 9-1 1 Ε1 10 10 9 - - 1 Ε2 9 8 9 1 2 1 Ε3 10 10 10 - - - Ε4 8 9 9 2 1 1 Ε5 10 10 9 - - 1 Ε6 9 9 8 1 1 2 Ε7 9 10 10 1 - - Ε8 8 10 9 2-1 Ε9 10 9 10-1 - Ε10 10 9 10-1 - 127

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 15. Αριθµός εµβολίων που επιβίωσαν καθώς και αριθµός εµβολίων που δεν επιβίωσαν µε τη µέθοδο του εµβολιασµού σε Σχισµή. Εµβολιασµός σε σχισµή Άτοµο Εµβόλια που επιβίωσαν Εµβόλια που δεν επιβίωσαν Επαν. 1 Επαν. 2 Επαν. 3 Επαν.1 Επαν.2 Επαν.3 Χ1 7 8 7 3 2 3 Χ2 8 7 8 2 3 2 Χ3 7 7 7 3 3 3 Χ4 7 7 7 3 3 3 Χ5 9 8 8 1 2 2 Χ6 8 8 7 2 2 3 Χ7 7 7 8 3 4 3 Χ8 7 6 7 3 Χ9 7 7 7 3 3 3 Χ10 6 7 7 4 3 3 Ε1 8 7 8 2 3 2 Ε2 7 8 7 3 2 3 Ε3 8 7 7 2 3 3 Ε4 7 7 6 3 3 4 Ε5 7 8 7 3 2 3 Ε6 6 7 7 4 3 3 Ε7 8 7 7 2 3 3 Ε8 7 7 8 3 3 2 Ε9 7 6 7 3 4 3 Ε10 7 8 7 3 2 3 128

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 16. Αριθµός εµβολίων που επιβίωσαν καθώς και αριθµός εµβολίων που δεν επιβίωσαν µε τη µέθοδο του Πλάγιου εµβολιασµού. Πλάγιος εµβολιασµός Άτοµο Εµβόλια που επιβίωσαν Εµβόλια που δεν επιβίωσαν Επαν. 1 Επαν. 2 Επαν. 3 Επαν.1 Επαν.2 Επαν.3 Χ1 6 5 6 4 5 4 Χ2 6 6 7 4 4 3 Χ3 5 7 7 5 3 3 Χ4 6 6 5 4 4 5 Χ5 7 6 6 3 4 4 Χ6 6 5 6 4 5 4 Χ7 7 5 6 3 5 4 Χ8 6 6 6 4 4 4 Χ9 5 7 7 5 3 3 Χ10 6 6 5 4 4 5 Ε1 7 7 6 3 3 4 Ε2 6 6 7 4 4 3 Ε3 7 7 8 3 3 2 Ε4 5 6 6 5 4 4 Ε5 7 6 7 3 4 3 Ε6 6 7 6 4 3 4 Ε7 7 8 7 3 2 3 Ε8 6 5 6 4 5 4 Ε9 7 6 6 3 4 4 Ε10 7 6 8 3 4 2 129

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Πίνακας 17. Ποσοστά επιβίωσης και τα τυπικά τους σφάλµατα που παρουσίασαν οι 3 µέθοδοι εµβολιασµού Μέθοδος Εµβολιασµού Ποσοστό επιτυχίας % Τ.Σ (S.Ε.) Αγγλικός τύπος Εµβολιασµού 92,83 3,330643 Εµβολισµός σε Σχισµή 72,16 5,786384 Πλάγιος Εµβολιασµός 62,66 6,24463 6.7 Διέγερση και ανάπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών βραχυκλαδίων των εµβολίων που προήλθαν από τα επιλεγµένα υψηλοαποδοτικά σε ρητίνη άτοµα χαλεπίου πεύκης Από τα αποτελέσµατα της συγκεκριµένης µεταχείρισης εύκολα συνάγεται το συµπέρασµα ότι τόσο η επίδραση της κυτοκινίνης (BAP) όσο και η αποµάκρυνση των ακραίων οφθαλµών επέδρασε ευεργετικά στη διέγερση και την ανάπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών και τη δηµιουργία µασχαλιαίων βλαστών βραχυκλαδίων. Οι διεγερµένοι βλαστοί έκαναν την εµφάνιση τους τη δεύτερη και την τρίτη εβδοµάδα µετά τον τελευταίο ψεκασµό και χαρακτηρίζονταν για τα νεανικά χαρακτηριστικά τους, παρόλο που τα εµβόλια προέρχονταν από ώριµα άτοµα. Ο συνολικός µέσος όρος του αριθµού των νέων βλαστών που παρατηρήθηκε µε τη συγκεκριµένη µεταχείριση είναι 19,3333±0,589323. Ο µέγιστος µέσος αριθµός µασχαλιαίων βλαστών βραχυκλαδίων, µε µήκος µεγαλύτερο ή ίσο από 10mm, ήτανε 21,26667±0.5893 στον γενότυπο Ε10 και ο µικρότερος 17,8667±0.336178 στον γενότυπο Ε9 (Πιν.18). Οι ακριβείς µετρήσεις βρίσκονται στον Πιν.19. Οι διαφορές µεταξύ των δυο προσελεύσεων Εύβοιας και Χαλκιδικής, δε θεωρούνται σηµαντικές. Κάποιες διαφορές παρατηρήθηκαν µεταξύ των διαφόρων γενοτύπων στο µήκος αλλά και στο συνολικό αριθµό των διεγερµένων βλαστών, αλλά δε πήραν µέρος στα αποτελέσµατα του πειράµατος µιας και ο αριθµός των βλαστών µε το επιθυµητό µήκος ( 10mm) κρίθηκε αρκετά ικανοποιητικός (Εικ. 48,49,50). Ο συνδυασµός της κυτοκινίνης BAP, στη συγκεκριµένη συγκέντρωση (400mg/l), µε τον αποκεφαλισµό, αποδείχθηκε αποτελεσµατικός µιας και συνέβαλε στην απελευθέρωση των µασχαλιαίων οφθαλµών των βραχυκλαδίων από τον έλεγχο της κυριαρχίας της κορυφής. Η κυτοκινίνη φαίνεται ότι ανέστειλε τη δράση της ενδογενούς αυξίνης IAA η οποία βρίσκεται σε υψηλά ποσοστά στον επικόρυφο και 130

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα τους ακραίους οφθαλµούς. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε συµφωνία και µε τις ερευνητικές εργασίες του Inglis (1984) στο είδος Pinus caribea και των Phillion et al. (1983) στο είδος Pinus sylvestris. Όσον αφορά στα νεανικά χαρακτηριστικά που παρουσίασαν οι διεγερµένοι βλαστοί ήταν, µε βάση τις αναφορές µιας πληθώρας ερευνητών (Mazalewsuy και Hackett 1979, Franclet 1981, Cauvin 1982), αποτέλεσµα της συνδυασµένης δράσης των ακόλουθων µεταχειρίσεων: α) αποκοπή του επικόρυφου οφθαλµού, β) εµβολιασµός σε νεανικά υποκείµενα και γ) ψεκασµός των ώριµων ιστών των εµβολίων µε διάλυµα κυτοκινίνης BAP. Οι διεγερµένοι βλαστοί των βραχυκλαδίων µπορούν να αποτελέσουν µια ανεξάντλητη πηγή εµβολίων, που λόγο της νεανικότητας που διαθέτουν, µπορούν να χρησιµοποιηθούν στο βλαστικό πολλαπλασιασµό των επιλεγµένων για την υψηλή παραγωγή τους σε ρητίνη ατόµων χαλεπίου πεύκης. Άτοµο Μ.Ο. αριθµού Βλαστών Τυπική Απόκλιση (S.D.) Τυπικό Σφάλµα (S.E.) Χ1 18,667 1,76743 0,456349 Χ2 19,06667 1,533747 0,396012 Χ3 19,6 2,063284 0,532738 Χ4 18,73333 1,75119 0,452155 Χ5 19,8 2,00713 0,518239 Χ6 18,266667 1,387015 0,358126 Χ7 18,53333 1,84649 0,476762 Χ8 19,26677 1,75119 0,452155 Χ9 18,93333 2,086236 0,538664 Χ10 18,93333 1,75119 0,452155 Ε1 20,73333 1,75119 0,452155 Ε2 18,8 1,656157 0,427618 Ε3 19,26667 2,051712 0,52975 Ε4 20,4 1,882248 0,485994 Ε5 19,06667 1,624221 0,419372 Ε6 17,86667 1,302013 0,336178 Ε7 20,26667 1,944467 0,502059 Ε8 20,06667 1,944467 0,502059 Ε9 18,93333 2,086236 0,538664 Ε10 21,26667 2,282438 0,589323 Συνολικός µέσος όρος 19,33333 1,966838 0,507835 µεταχείρισης+τ.α+τ.σ. Πίνακας 18. Μέσος όρος αριθµού διεγερµένων βλαστών βραχυκλαδίων. 131

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Αριθµός βλαστών Άτοµο Επανάληψη 1 Επανάληψη 2 Επανάληψη 3 Α Β Γ Δ Ε Α Β Γ Δ Ε Α Β Γ Δ Ε Χ1 20 18 17 21 20 18 17 22 19 17 16 18 21 20 19 Χ2 19 17 21 19 18 20 19 21 19 18 20 22 17 17 19 Χ3 17 19 22 23 19 21 19 23 18 20 17 21 18 20 17 Χ4 18 16 21 20 17 19 17 20 18 18 19 17 21 22 18 Χ5 20 19 18 23 21 18 17 22 21 19 17 23 18 21 20 Χ6 18 20 17 18 17 16 19 21 19 18 17 18 20 19 17 Χ7 17 16 21 19 18 20 17 19 17 21 18 16 19 22 18 Χ8 17 19 22 18 20 19 22 18 19 21 18 19 16 21 20 Χ9 16 18 19 22 17 21 18 23 17 19 17 21 20 19 17 Χ10 20 17 19 17 20 21 18 19 17 22 18 16 19 20 21 Ε1 20 23 21 23 22 19 22 20 18 23 18 21 20 19 22 Ε2 19 21 18 18 19 17 16 19 21 18 18 19 22 17 20 Ε3 16 18 19 23 17 22 18 18 21 20 17 19 20 19 22 Ε4 21 24 21 20 18 23 19 21 18 20 17 22 20 21 21 Ε5 17 17 19 19 21 18 17 21 19 20 22 18 19 21 18 Ε6 19 16 18 18 16 20 18 17 19 17 18 20 18 16 18 Ε7 20 22 19 19 24 17 21 23 19 21 22 18 19 21 19 Ε8 17 19 23 22 20 21 18 20 22 17 19 21 23 19 20 Ε9 16 20 18 21 17 19 20 16 23 22 18 20 18 19 17 Ε10 21 23 21 24 23 18 23 18 21 22 17 23 22 24 19 Πίνακας 19. Αριθµός διεγερµένων βλαστών βραχυκλαδίων στα εµβόλια των επιλεγµένων δέντρων 132

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ.42. Δηµιουργία τοµών στη βάση του εµβολίου. Εικ.43. Δηµιουργία τοµών στη βάση του εµβολίου 133

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ.44. Πλάγιος εµβολιασµός Εικ.45. Πλάγιος εµβολιασµός 134

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ.46. Δέσιµο του εµβολίου στο υποκείµενο Εικ.47. Εµβολιασµένα φυτά 2 χρόνια µετά το πέρας των εµβολιασµών 135

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ. 48. Διεγερµένοι βλαστοί των εµβολίων χαλεπίου πεύκης Εικ. 49. Διεγερµένοι βλαστοί των εµβολίων χαλεπίου πεύκης 136

Αποτελέσµατα και Συζήτηση-Συµπεράσµατα Εικ. 50. Διέγερση µασχαλιαίων βλαστών βραχυκλαδίων 137