Homocysteine. For use on IMMULITE 2000 systems

Homocysteine For use on IMMULITE 2000 systems

IMMULITE 2000 Homocysteine English Intended Use: For in vitro diagnostic use with the IMMULITE 2000 Systems Analyzers for the quantitative determination L-homocysteine in human plasma or serum. This device can assist in the diagnosis and treatment of patients suspected of having hyperhomocysteinemia or homocystinuria. Catalog Number: L2KHO2 (200 tests) L2KHO6 (600 tests) Test Code: HCY Color: Dark Gray Warning: Specimens from patients who are on drug therapy involving S-adenosyl-methionine may show falsely elevated levels of homocysteine. Results on specimens obtained from patients taking methotrexate, carbamazepine, phenytoin, nitrous oxide, anti-convulsants, or 6-azauridine triacetate should be interpreted with caution as these substances interfere with homocysteine determination. Summary and Explanation Total homocysteine (thcy) has emerged as an important risk factor in the assessment of cardiovascular disease. 3 7,12 Hcy, a thiol-containing amino acid, is produced by the intracellular demethylation of methionine. Hcy thereby serves as a pool that can be later scavenged for use in the remanufacture of either methionine through the action of the folate-dependent enzyme methionine synthase or cysteine using the B6 dependent transsulphuration pathway. 1,2 Hcy in plasma is found primarily in a protein bound form but free, oxidized and disulfide forms are also present. Highly elevated levels of thcy are found in patients with homocystinuria, a rare genetic disorder of the enzymes involved in Hcy metabolism. 1,2,3 Homocystinuria patients exhibit arterial thromboembolism, mental retardation and early arteriosclerosis. 1 Less severe genetic defects are also associated with moderate levels of Hcy. 3,4,5 Homocysteine has been identified as a indicator of cardiovascular disease. A meta-analysis of 27 epidemiological studies has suggested that a 5 µmol/l increase in thcy could be associated with an odds ratio for coronary artery disease (CAD) of 1.6 for men and 1.8 for women, the same increase in risk as a 0.5 mmol/l increase in cholesterol. 7 In addition, patients with chronic renal disease complicated by arteriosclerotic cardiovascular disease show elevated thcy due to the inability of the kidney to remove Hcy from the blood. 1,2,3 Principle of the Procedure Competitive Immunoassay. The IMMULITE 2000 performs an on-line one-cycle sample pretreatment of patient plasma or serum with S-adenosyl-Lhomocysteine (SAH) hydrolase and dithiothreitol (DTT) solution in a reaction tube containing no bead. After a 30-minute incubation, the treated sample is transferred to a second reaction tube containing a SAH-coated polystyrene bead and an alkaline phosphatase-labeled antibody specific for SAH. During a 30-minute incubation, the converted SAH from the sample pretreatment competes with immobilized SAH for binding alkaline phosphatase-labeled anti-sah antibody. Unbound enzyme conjugate is removed by centrifugal wash. Substrate is added and the procedure continues as described for typical immunoassays in the Operator's Manual. Incubation Cycles: 2 30 minutes. 2 test positions per assay: 1 sample treatment cup; 1 immunoreaction cup. Cycle 1: Release of bound homocysteine and conversion to SAH Cycle 2: Immunoreaction Time to first result: 65 minutes 2 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

Specimen Collection Heparinized and EDTA plasma are the samples of choice, but serum is also suitable for use. It is important to separate the plasma or serum from the cells as soon as possible after collection, as synthesis of HCY will take place in red blood cells after sampling. Samples should be stored on ice between the time of sampling and centrifugation. Note that storage on ice makes the use of serum samples particularly difficult. The use of an ultracentrifuge is recommended to clear lipemic samples. Hemolyzed samples may indicate mistreatment of a specimen before receipt by the laboratory; hence the results should be interpreted with caution. Centrifuging serum samples before a complete clot forms may result in the presence of fibrin. To prevent erroneous results due to the presence of fibrin, ensure that complete clot formation has taken place prior to centrifugation of samples. Some samples, particularly those from patients receiving anticoagulant therapy, may require increased clotting time. Blood collection tubes from different manufacturers may yield differing values, depending on materials and additives, including gel or physical barriers, clot activators and/or anticoagulants. IMMULITE 2000 Homocysteine has not been tested with all possible variations of tube types. Consult the section on Alternate Sample Types for details on tubes that have been tested. Volume Required: 15 µl plasma or serum Storage: 14 days at 2 8 C, or 6 months at 20 C. Warnings and Precautions For in vitro diagnostic use. Reagents: Store at 2 8 C. Dispose of in accordance with applicable laws. Follow universal precautions, and handle all components as if capable of transmitting infectious agents. Source materials derived from human blood were tested and found nonreactive for syphilis; for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis B surface antigen; and for antibodies to hepatitis C. Sodium azide, at concentrations less than 0.1 g/dl, has been added as a preservative. On disposal, flush with large volumes of water to prevent the buildup of potentially explosive metal azides in lead and copper plumbing. Chemiluminescent Substrate: Avoid contamination and exposure to direct sunlight. (See insert.) Water: Use distilled or deionized water. Materials Supplied Components are a matched set. Labels on the inside box are needed for the assay. Homocysteine Bead Pack (L2HO12) With barcode. 200 beads, coated with S-adenosyl-L-homocysteine (SAH). Stable at 2 8 C until the expiration date. L2KHO2: 1 pack L2KHO6: 3 packs Homocysteine Reagent Wedge (L2HOA2) With barcode. One wedge, containing 3 reagents: 15.5 ml bovine S-adenosyl-Lhomocysteine hydrolase in buffer, with preservative. 18.5 ml dithiothreitol (DTT) in buffer. 11.5 ml alkaline phosphatase (bovine calf intestine) conjugated to murine monoclonal anti-sah in buffer. Stable at 2 8 C until expiration date. L2KHO2: 1 wedge L2KHO6: 3 wedges Before use, tear off the top of the label at the perforations, without damaging the barcode. Remove the foil seal from the top of wedge; snap the sliding cover down into the ramps on the reagent lid. Homocysteine Adjustors (LHOL, LHOH) Two amber vials (Low and High), 2.0 ml each, of synthetically-derived S-adenosyl- L-homocysteine (SAH) in a protein/buffer matrix. Stable at 2 8 C for 30 days after opening, or for 6 months (aliquotted) at 20 C. L2KHO2: 1 set L2KHO6: 2 sets Before making an adjustment, place the appropriate Aliquot Labels (supplied with the kit) on test tubes so that the barcodes can be read by the on-board reader. IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 3

Kit Components Supplied Separately Homocysteine Sample Diluent (L2HOZ) For the on-board dilution of high samples. 25 ml of concentrated (ready-to-use) homocysteine-free protein/buffer matrix. Storage: 30 days (after opening) at 2 8 C or 6 months (aliquotted) at 20 C. Barcode labels are provided for use with the diluent. Before use, place an appropriate label on a 16 100 mm test tube, so that the barcodes can be read by the on-board reader. L2HOZ: 3 labels L2SUBM: Chemiluminescent Substrate L2PWSM: Probe Wash L2KPM: Probe Cleaning Kit LRXT: Reaction Tubes (disposable) L2ZT: 250 Sample Diluent Test Tubes (16 100 mm) L2ZC: 250 Sample Diluent Tube Caps Also required Distilled or deionized water; test tubes; controls Assay Procedure Note that for optimal performance, it is important to perform all routine maintenance procedures as defined in the IMMULITE 2000 Systems Operator's Manual. See the IMMULITE 2000 Systems Operator's Manual for preparation, setup, dilutions, adjustment, assay and quality control procedures. Recommended Adjustment Interval: 4 weeks Quality Control Samples: Follow government regulations or accreditation requirements for quality control frequency. Use controls or plasma or serum pools with at least two levels (low and high) of homocysteine. Siemens Healthcare Diagnostics recommends the use of commercially available quality control materials with at least 2 levels (low and high). A satisfactory level of performance is achieved when the analyte values obtained are within the Acceptable Control Range for the system, or within an established range determined by an appropriate internal laboratory quality control scheme. Expected Values Homocysteine levels can vary with age, gender, geographical area and genetic factors, therefore it is important for laboratories to establish their own reference ranges based on their local populations. Literature suggests a reference range of 5 15 µmol/l for adult males and females, 11 but also notes that men tend to have higher levels than women, and that postmenopausal women tend to have higher levels than premenopausal. 12 One hundred and twenty samples from apparently healthy adult male and female volunteers age 22 66 were analyzed using the IMMULITE 2000 Homocysteine procedure. The samples were drawn in heparinized plasma tubes and kept on ice prior to separation of the plasma from the cells. The median value was 7.7 µmol/l, with a central 95% range of 5.0 12 µmol/l. Consider these limits as guidelines only. Each laboratory should establish its own reference ranges. Limitations Specimens from patients who are on drug therapy involving S-adenosyl-methionine may show falsely elevated levels of homocysteine. Although analysis of the parent compounds of carbamazepine, phenytoin, 6-azauridine, and anthopterin indicate no cross-reactivity, specimens obtained from patients treated with these drugs, as well as with methotrexate, nitrous oxide, and other anticonvulsants, should be interpreted with caution as these substances have been shown to interfere in some homocysteine assays. Heterophilic antibodies in human serum can react with the immunoglobulins included in the assay components causing interference with in vitro immunoassays. [See Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem 1988:34: 27-33.] Samples from patients routinely exposed to animals or animal serum products can demonstrate this type of interference potentially causing an anomalous result. These reagents have been formulated to minimize the risk of 4 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

interference; however, potential interactions between rare sera and test components can occur. For diagnostic purposes, the results obtained from this assay should always be used in combination with the clinical examination, patient medical history, and other findings. Performance Data See Tables and Graphs for data representative of the assay's performance. Results are expressed in µmol/l. (Unless otherwise noted, all were generated on heparinized plasma samples.) Reportable Range: 2 to 50 µmol/l The assay is traceable to an internal standard manufactured using qualified materials and measurement procedures. Analytical Sensitivity: 1.2 µmol/l Precision: Samples were repeatedly assayed in quadruplicate over the course of several days, for a total of 20 runs and 80 replicates. (See "Precision" table.) Linearity: Samples were assayed under various dilutions. (See "Linearity" table for representative data.) Recovery: Samples spiked 1 to 19 with three homocysteine solutions (125, 250, and 500 µmol/l), were assayed. (See "Recovery" table for representative data.) Specificity: The antibody is highly specific for homocysteine. (See "Specificity" table.) Bilirubin: Presence of conjugated and unconjugated bilirubin in concentrations up to 200 mg/l has no effect on results, within the precision of the assay. Hemolysis: Presence of hemoglobin in concentrations up to 512 mg/dl has no effect on results, within the precision of the assay. Lipemia: Presence of triglycerides in concentrations up to 3000 mg/dl has no effect on results, within the precision of the assay. Alternate Sample Type: To determine whether serum can be used in the IMMULITE 2000 Homocysteine procedure, blood was collected on ice from 34 laboratory volunteers into heparinized, EDTA and plain vacutainer tubes. Samples were separated from the cells, and matched samples were spiked with homocysteine and then assayed by the IMMULITE 2000 Homocysteine procedure, with the following results. (EDTA) = 0.98 (Heparin) + 0.85 µmol/l r = 0.954 (Serum) = 1.02 (Heparin) 0.53 µmol/l r = 0.975 Means: 20.2 µmol/l (Heparin) 20.7 µmol/l (EDTA) 20.1 µmol/l (Serum) To assess the effect of storage temperature, heparinized, EDTA and plain vacutainer tubes were collected from five volunteers for each tube type. Some tubes were stored at room temperature, while other tubes were kept on ice for various time periods prior to separation. The graphs below show the effect of storage time and temperature for heparin, EDTA and serum. (See graphs 1 3.) Method Comparison 1: The assay was compared to a commercially available manual enzyme immunoassay (Kit A) on 168 plasma samples. (Concentration range: approximately 4 to 43 µmol/l. See Method Comparison 1 graph.) By linear regression: (IML 2000) = 1.0 (Kit A) + 0.24 µmol/l r = 0.966 Means: 12.9 µmol/l (IMMULITE 2000) 12.7 µmol/l (Kit A) Method Comparison 2: The assay was also compared to an in-house HPLC method in use at a reference laboratory in the United States on 95 heparinized plasma samples. (Concentration range: approximately 4 to 44 µmol/l. See Method Comparison 2 graph.) By linear regression: (IML 2000) = 0.97 (HPLC) + 0.71 µmol/l r = 0.974 Means: 13.4 µmol/l (IMMULITE 2000) 13.2 µmol/l (HPLC) Method Comparison 3: The assay was compared to another commercially available immunoassay (Kit B) on 113 plasma samples. (Concentration range: approximately 4 to 23 µmol/l. See Method Comparison 3 graph.) By linear regression: (IML 2000) = 0.90 (Kit B) 0.02 µmol/l r = 0.925 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 5

Means: 8.7 µmol/l (IMMULITE 2000) 9.6 µmol/l (Kit B) References 1) Selhub J, Miller JW. The pathogenesis of homocysteinemia: interruption of the coordinate regulation by s-adenosylmethionine of the remethylation and transsulfuration of homocysteine. Am J Clin Nutr 1992;55:131-8. 2) Jacques PF, Bostom AG, Williams RR, et al. Relation between folate status, a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase and plasma homocysteine concentrations. Circulation 1996;93:7-9. 3) Malinow MR. Plasma homocysteine and arterial occlusive diseases: A mini review. Clin Chem. 1995;40:173-76. 4) Clarke R, Daly L, Robinson K, Naughten E, et al. Hyperhomocysteinemia: An independent risk factor for vascular disease. New Eng J Med 1991;324:1149-55. 5) Deloughery TG, Evans A, Sadeghi A,et al. Common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase: Correlation with homocysteine metabolism and late-onset vascular disease. Circulation 1996;94:3074-78. 6) Bostom AG, Selhub J. Homocysteine and arteriosclerosis: Subclinical and clinical disease associations. Circulation 1999;99:2361-63. 7) Boushey CJ, Beresford SAA, et al. A quantitative assessment of plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease. JAMA 1995;274(13):1049-57. 8) Guttormsen AB, Svarstad E, et al. Elimination of homocysteine in subjects with end-stage renal failure. Irish J Med Sci 1995;164:8. 9) Bostom AG, Lathrop, L. Hyper-homocysteinemia in endstage renal disease (ESDR): Prevalence, etiology and potential relationship to arteriosclerotic outcomes. Kidney Int 1997;52:10-20. 10) Refsum H, Ueland PM. Clinical significance of pharmacological modulation of homocysteine metabolism. TIPS 1990;11:411-16. 11) Ueland PM, Refsum H, Stabler SP, et al. Total homocysteine in plasma or serum: Methods and clinical applications. Clin Chem 1993;39:1764-79. 12) Nehler MR, Taylor LM, Porter JM. Homocysteine as a risk factor for atherosclerosis: A Review. Cardiovasc Pathol 1997;6:1-9. Technical Assistance For technical assistance, contact your National Distributor. www.siemens.com/diagnostics The Quality System of Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. is certified to ISO 13485:2003. Tables and Graphs Precision (µmol/l) Within-Run 1 Total 2 Mean 3 SD 4 CV 5 SD CV 1 4.2 0.54 12.8% 0.63 15.1% 2 11.0 0.89 8.1% 0.94 8.5% 3 16.5 0.96 5.9% 1.29 7.8% 4 24.5 1.37 5.6% 1.98 8.1% Česky. 1 V rámci stanovení, 2 Celkem, 3 Střední hodnota, 4 Směrodatná odchylka, 5 Variační koeficient. Ελληνικά. 1 Κατά την ίδια περίοδο, 2 Συνολικά, 3 Μέσος όρος, 4 SD, 5 CV. Polski. 1 W serii, 2 Całość, 3 Średnie, 4 SD, 5 CV. Specificity (µmol/l) Compound 1 Amount Added 2 µmol/l % Cross reactivity 3 Adenosine 5000 ND S-adenosyl-L-methionine 500 0.6% Cystathionine 500 6.1% L-Cysteine 100,000 ND Glutathione 100,000 ND ND: Not detectable. 4 Česky. 1 Sloučenina, 2 Přidané množství, 3 % Zkřížená reaktivita, 4 ND: nezjistitelné. Ελληνικά. 1 Μείγμα, 2 Προστέθηκαν, 3 % Διασταυρ.Αντίδραση, 4 ND: Μη ανιχνεύσιμη ποσότητα. Polski. 1 Składnik, 2 Ilość dodana, 3 % reaktywności Krzyżowej, 4 ND: Nieoznaczlne. Linearity (µmol/l) Dilution 1 Observed 2 Expected 3 %O/E 4 1 8 in 8 5 19.2 4 in 8 9.47 9.60 99% 2 in 8 4.94 4.80 103% 1 in 8 2.11 2.40 88% 2 8 in 8 25.2 4 in 8 13.8 12.6 110% 2 in 8 6.15 6.30 98% 1 in 8 3.34 3.15 106% 3 8 in 8 31.6 4 in 8 15.7 15.8 99% 2 in 8 7.44 7.90 94% 1 in 8 3.37 3.95 85% 6 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

Dilution 1 Observed 2 Expected 3 %O/E 4 4 8 in 8 47.5 4 in 8 24.2 23.7 102% 2 in 8 11.5 11.9 97% 1 in 8 4.91 5.94 83% Česky. 1 Ředění, 2 Naměřená, 3 Očekávaná, 4 % Naměřená / Očekávaná, 5 8 v 8. Ελληνικά. 1 Αραίωση, 2 Παρατηρούμενη (O), 3 Αναμενόμενη (E), 4 % O/E, 5 8 στα 8. Polski. 1 Rozcieńczenie, 2 Zmierzone (Z), 3 Oczekiwane (O), 4 % Z/O, 5 8 w 8. Recovery (µmol/l) Solution 1 Observed 2 Expected 3 %O/E 4 1 7.41 A 13.3 13.3 100% B 20.2 19.5 104% C 34.4 32.0 108% 2 9.96 A 14.7 15.7 94% B 22.6 22.0 103% C 36.2 34.5 105% 3 13.3 A 16.9 18.9 89% B 26.0 25.1 104% C 32.0 37.6 85% 4 20.2 A 27.7 25.4 109% B 33.0 31.7 104% C 44.5 44.2 101% Česky. 1 Roztok, 2 Naměřená, 3 Očekávaná, 4 Naměřená / Očekávaná. Ελληνικά. 1 Διάλυμα, 2 Παρατηρούμενη (O), 3 Αναμενόμενη (E), 4 % O/E. Polski. 1 Roztwór, 2 Zmierzone (Z), 3 Oczekiwane (O), 4 % Z/O. Method Comparison 1 (IML 2000) = 1.0 (Kit A) + 0.024 µmol/l r = 0.966 Method Comparison 2 IMMULITE 2000 Homocysteine 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 HPLC, µmol/l (IML 2000) = 0.97 (HPLC) + 0.71 µmol/l r = 0.974 Method Comparison 3 IMMULITE 2000 Homocysteine 20 15 10 5 5 10 15 20 25 Kit B, µmol/l (IML 2000) = 0.90 (Kit B) 0.02 µmol/l r = 0.925 Effect of Storage Temperature on Different Sample Types Graph 1: Heparin IMMULITE 2000 Homocysteine 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 Kit A, µmol/l IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 7

Graph 2: EDTA Kód metody : HCY Barva : Tmavě šedá Upozornění : Vzorky od pacientů léčených pomocí S-adenosylmethioninu můžou poskytovat falešně zvýšenou koncentraci homocysteinu. Graph 3: Serum Česky. Srovnání metody: Homocystein: Vliv teploty skladování na různé typy vzorků: 1 Vliv teploty skladování na různé typy vzorků, 2 Graf 1: Heparin, 3 Graf 2: EDTA, 4 Graf 3: Sérum. Συγκριτική μελέτη: Ομοκυστείνη: Επίδραση της θερμοκρασίας αποθήκευσης σε διαφορετικούς τύπους δείγματος: 1 Επίδραση της θερμοκρασίας αποθήκευσης σε διαφορετικούς τύπους δείγματος, 2 Γράφημα 1: Ηπαρίνη, 3 Γράφημα 2: EDTA, 4 Γράφημα 3: Ορός. Polski. Porównanie metod: Homocysteina: Wpływ temperatury na różne rodzaje materiału: 1 Wpływ temperatury na różne rodzaje materiału, 2 Wykres 1: Heparyna, 3 Wykres 2: EDTA, 4 Wykres 3: Surowica. Česky IMMULITE 2000 Homocystein Použití : Pro in vitro diagnostické použití na analyzátorech IMMULITE 2000 ke stanovení koncentrace L-homocysteinu v lidské plazmě nebo séru. Toto stanovení může pomoci při diagnostice a léčbě pacientů, u kterých je podezření na hyperhomocysteinémii nebo homocystinurii. Katalogové číslo : L2KHO2 (200 stanovení) L2KHO6 (600 stanovení) Výsledky vzorků získaných od pacientů, kteří užívají metotrexát, karbamazepin, fenytoin, oxid dusný, antikonvulziva nebo 6-azauridin triacetát, je třeba interpretovat s opatrností, protože tyto látky interferují se stanovením homocysteinu. Shrnutí a vysvětlení Celkový homocystein (thcy) se stal důležitým rizikovým faktorem v hodnocení kardiovaskulárních onemocnění. 3-7,12 Hcy je aminokyselina s thiolovým zbytkem a vzniká vnitrobuněčnou demetylací methioninu. Hcy tak slouží jako zásoba pro případnou tvorbu methioninu díky methionin synthase závislé na folátu nebo tvorbu cysteinu prostřednictvím transsulfurace závislé na B6. 1,2 V plazmě se Hcy vyskytuje především vázaný na proteiny, ale existuje též volný, oxidovaný nebo ve formě bisulfidu. Značně zvýšené množství celkového Hcy se vyskytuje u pacientů s homocystinurií, ojedinělou genetickou poruchou enzymů, které se účastní metabolizmu Hcy. 1,2,3 U pacientů s homocystinurií se projevuje arteriální tromboembolie, mentální retardace a předčasná arterioskleróza. 1 Méně závažné genetické poruchy rovněž souvisí s průměrným množstvím Hcy. 3,4,5 Homocystein je považován za indikátor kardiovaskulárního onemocnění. Meta-analýzou 27 epidemiologických studií se ukázalo, že zvýšení koncentrace celkového homocysteinu o 5 µmol/l odpovídá pravděpodobnosti výskytu choroby srdeční tepny (coronary artery disease CAD) 1,6 u mužů a 1,8 u žen. To představuje stejné zvýšení rizika jako zvýšení hladiny cholesterolu o 0,5 mmol/l. 7 Pacienti s chronickým selháním ledvin komplikovaným arteriosklerotickou kardiovaskulární chorobou mají koncentraci celkového Hcy zvýšenou kvůli neschopnosti ledvin odstranit Hcy z krve. 1,2,3 8 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

Princip stanoveni Konkurenční imunochemická reakce. Analyzátor IMMULITE 2000 provede v jednom cyklu automatickou úpravu vzorku plazmy nebo séra s S-adenosyl-Lhomocystein (SAH) hydrolázou a roztokem dithiotreitolu (DTT) v reakční zkumavce bez kuličky. Po 30-ti minutové inkubaci se upravený vzorek přepipetuje do druhé reakční zkumavky s polystyrénovou kuličkou potaženou SAH a alkalickou fosfatázou značenou protilátkou specifickou vůči SAH. Během 30-ti minutové inkubace soutěží upravený SAH z předúpravy vzorku s imobilizovaným SAH (navázaným na kuličce) o vazbu na protilátku proti SAH značenou alkalickou fosfatázou. Nenavázaný enzymový konjugát se odstraní odstředivým promýváním. Přidá se substrát a dále se postupuje podle popisu typické imunochemické reakce v manuálu k analyzátoru. Inkubační cykly : 2 30 minut. 2 testovací pozice na jeden test : 1 zkumavka na úpravu vzorků, 1 zkumavka na imunochemickou reakci. Cyklus 1 : Uvolnění navázaného homocysteinu a konverze na SAH Cyklus 2 : Imunochemická reakce Čas do prvního výsledku : 65 minut Odebírání vzorků Je možné použít heparinizovanou nebo EDTA plazmu, a taky sérum. Je důležité oddělit plazmu nebo sérum od buněk co nejdřív po odběru vzorku, protože v červených krvinkách začne probíhat syntéza Hcy. V čase mezi odběrem a odstředěním je vzorky třeba dát na led. Všimněte si, že uložení na led činí použití vzorků séra obzvláště nesnadným. K úpravě lipemických vzorků se doporučuje použití ultracentrifugy. Hemolyzované vzorky můžou být známkou nesprávného zacházení s preparátem ještě před přijetím do laboratoře ; proto by výsledky měly být interpretovány s obezřetností. Centrifugace vzorků séra ještě před úplným vysrážením může mít za následek přítomnost fibrinu. Chybným výsledkům způsobeným přítomností fibrinu lze zamezit úplným vysrážením vzorků před jejich centrifugací. U některých vzorků, zejména od pacientů podstupujících antikoagulační léčbu, může srážlivost vyžadovat více času. Použití zkumavek pro odběr krve od různých výrobců může přinášet rozličné hodnoty v závislosti na materiálech a přísadách včetně gelových nebo fyzických bariér, aktivátorů sraženin a/nebo antikoagulačních činidel. Stanovení Homocystein na přístroji IMMULITE 2000 nebylo testováno se všemi možnými varianty jednotlivých typů zkumavek. Informace o testovaných zkumavkách najdete v části o alternativních typech vzorků. Potřebný objem vzorku : 15 μl plazmy nebo séra. Skladování : 14 dní při teplotě 2 8 C nebo 6 měsíců při teplotě 20 C. Upozornění a bezpečnostní opatření Pro in vitro diagnostické použití. Reagencie : Skladujte při teplotě 2 8 C. Likvidujte v souladu s platnými předpisy. Řiďte se obecnými pravidly bezpečnosti práce a se všemi komponenty nakládejte, jako by byly potenciálně infekční. Zdrojové materiály získané z lidské krve byly testovány a shledány nereaktivní na syfilis, na protilátky proti HIV 1 a 2, na povrchový antigen hepatitidy typu B (HBsAg), a na protilátky proti hepatitidě typu C. Jako konzervační látka byl přidán azid sodný v koncentracích menších než 0,1 g/dl. Při likvidaci vypláchněte velkým množstvím vody, aby se zamezilo nahromadění potenciálně výbušných azidů kovů v olověném a měděném potrubí. Chemiluminiscenční substrát : Vyvarujte se kontaminace a nevystavujte přímému slunečnímu světlu. (Viz připojený letáček.) Voda : Použijte destilovanou nebo deionizovanou vodu. Dodaný materiál Komponenty představují ucelenou sadu. Pro stanovení jsou zapotřebí štítky s čárovými kódy na krabici. IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 9

Homocystein zásobník s kuličkami (L2HO12) Opatřeno čárovým kódem. 200 kuliček potažených S-adenosyl-L-homocysteinem (SAH). Stabilní při teplotě 2 8 C do expirace. L2KHO2 : 1 balení L2KHO6 : 3 balení Homocystein reagencie (L2HOA2) Opatřeno čárovým kódem. Jedna nádobka obsahující 3 reagencie: 15,5 ml hovězí S-adenosyl-L-homocystein hydrolázy v pufru, s konzervačním prostředkem. 18,5 ml dithiotreitolu (DTT) v pufru. 11,5 ml alkalické fosfatázy (z telecího střeva) konjugované s myší monoklonální protilátkou proti SAH v pufru. Stabilní při teplotě 2 8 C do expirace. L2KHO2 : 1 nádobka L2KHO6 : 3 nádobky Před použitím utrhněte vršek štítku v perforovaném místě, ale nepoškoďte čárový kód. Z vrchu nádobky odstraňte uzavírací fólii ; posuvný uzávěr zaklapněte do ramp na víčku reagencie. Homocystein kalibrátory (LHOL, LHOH) Dvě ampulky z tmavého skla po 2,0 ml s vysokou a nízkou koncentrací syntetického S-adenosyl-L-homocysteinu (SAH) v bílkovino/pufrové matrici. Stabilní 30 dní po otevření při teplotě 2 8 C nebo rozdělené na alikvotní části 6 měsíců při 20 C. L2KHO2 : 1 sada L2KHO6 : 2 sady Před adjustací nalepte na testovací zkumavky příslušné alikvotní štítky (dodané se soupravou) tak, aby zabudovaný snímač mohl přečíst čárové kódy. Materiál dodávaný zvlášť Homocystein diluent vzorků (L2HOZ) Pro automatické ředění koncentrovaných vzorků analyzátorem. 25 ml koncentrované (připravené k použití) bílkovino/pufrové matrice bez homocysteinu. Skladování: 30 dní po otevření při teplotě 2 8 C nebo rozdělené na alikvotní části 6 měsíců při 20 C. Štítky s čárovými kódy jsou určeny pro diluent. Před použitím nalepte příslušný štítek na testovací zkumavku 16 100 mm tak, aby zabudovaný snímač mohl přečíst čárové kódy. L2HOZ : 3 štítky L2SUBM : Chemiluminiscenční substrát L2PWSM : Promývací roztok L2KPM : Čistící roztok na jehly LRXT : Reakční zkumavky (na jedno použití) L2ZT : 250 testovacích zkumavek na diluent vzorků (16 100 mm) L2ZC : 250 uzávěrů na testovací zkumavky na diluent vzorků Dále potřebujete Destilovanou nebo deionizovanou vodu ; testovací zkumavky, kontroly Postup stanovení K dosažení optimálního výkonu je důležité provádět veškerou pravidelnou údržbu stanovenou v manuálu k analyzátorům IMMULITE 2000. V manuálu k analyzátorům IMMULITE 2000 najdete postupy : přípravy, nastavení, ředění, adjustace, stanovení vzorků a kontrol. Doporučený interval mezi adjustacemi : 4 týdny Vzorky ke kontrole kvality : Pokud jde o četnost kontroly kvality, je třeba řídit se platnými předpisy a akreditačními požadavky. Použijte kontroly nebo směsné vzorky s alespoň dvěmi koncentracemi (vysokou a nízkou) homocysteinu. Společnost Siemens Healthcare Diagnostics doporučuje používat obchodně dostupné materiály kontroly kvality o přinejmenším dvou koncentracích vysoké a nízké. Vyhovující funkčnosti se dosahuje, pokud zjištěné hodnoty analytu leží uvnitř přijatelného kontrolního rozmezí analyzátoru nebo uvnitř rozmezí stanoveného příslušným interním systémem kontroly kvality dané laboratoře. Očekávané hodnoty Množství homocysteinu se různí podle věku, pohlaví, zeměpisné polohy a genetických faktorů. Pro laboratoře je tudíž důležité stanovit si vlastní referenční rozmezí založená na místní populaci. V literatuře se uvádí rozmezí 5 15 µmol/l pro dospělé muže a ženy, 11 ale zároveň se poukazuje na skutečnost, že muži mají 10 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

obvykle vyšší koncentraci homocysteinu než ženy a také že ženy po menopauze mívají množství homocysteinu vyšší než ženy před menopauzou. 12 Pomocí stanovení Homocystein na analyzátorech IMMULITE 2000 bylo testováno 120 vzorků od zjevně zdravých dospělých mužů a žen ve věku od 22 66 let. Vzorky byly odebrány do heparinizovaných zkumavek a do oddělení plazmy od buněk byly zkumavky uloženy na ledu. Hodnota mediánu byla 7,7 µmol/l a rozmezí středního 95. percentilu 5,0 12 µmol/l. Uvedené hranice považujte pouze za orientační. Každá laboratoř by si měla stanovit svoje vlastní referenční rozmezí. Omezení Vzorky od pacientů, kteří v rámci léčby užívají S-adenosyl-methionin, můžou vykázat falešně zvýšené množství homocysteinu. I když analýzou výchozích sloučenin karbamazepinu, fenytoinu, 6-azauridinu a anthopterinu se neprojevila žádná zkřížená reaktivita, výsledky vzorků od pacientů léčených pomocí těchto preparátů a též metotrexátem, oxidem dusným a dalšími antikonvulzivy by měly být interpretovány s opatrností, protože při některých testech homocysteinu interferovaly. Heterofilní protilátky v lidském séru můžou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. [Viz Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem 1988:34: 27-33.] Vzorky pacientů rutinně vystavené kontaktu se zvířaty nebo produkty zvířecího séra můžou vykázat tento typ interference a potenciálně způsobit anomální výsledky. Tyto reagencie byly vyvinuty tak, aby bylo riziko interference minimalizováno ; nicméně případné interakce mezi ojedinělými séry a komponenty testu se můžou vyskytnout. Pro diagnostické účely by se výsledky tohoto stanovení měly vždy používat v kombinaci s klinickými zkouškami, zdravotní historií pacienta a ostatními nálezy. Znaky metody Reprezentativní výsledky stanovení najdete v části Tabulky a grafy. Výsledky se udávají v µmol/l. (Pokud není uvedeno jinak, všechny výsledky byly získány na vzorcích heparinizované plazmy.) Rozsah měření : 2 až 50 µmol/l Souprava má návaznost na mezinárodní standard vyrobený s použitím schválených materiálů a měřících procesů. Analytická citlivost : 1,2 µmol/l Přesnost : Vzorky byly stanovovány opakovaně po čtyřech v průběhu několika dní, celkem 20 testů a 80 replikátů. (Viz tabulka "Přesnost".) Linearita : Stanovení vzorků bylo provedeno při rozličném ředění. (Reprezentativní hodnoty najdete v tabulce "Linearita".) Zpětná výtěžnost : Bylo provedeno stanovení vzorků séra s přídavkem tří roztoků homocysteinu (125, 250 a 500 µmol/l) v poměru 1 : 19. (Reprezentativní hodnoty najdete v tabulce "Zpětná výtěžnost".) Specificita : Protilátka je silně specifická vůči homocysteinu. (Viz tabulka "Specificita".) Bilirubin : Přítomnost konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu v koncentracích do 200 mg/l nemá v rámci přesnosti stanovení žádný vliv na výsledky. Hemolýza : Přítomnost hemoglobinu v koncentracích do 512 mg/dl nemá v rámci přesnosti stanovení žádný vliv na výsledky. Lipémie : Přítomnost triglyceridů v koncentracích do 3000 mg/dl nemá v rámci přesnosti stanovení žádný vliv na výsledky. Alternativní typ vzorku : Ke zjištění, zda je v testu Homocystein na analyzátorech IMMULITE 2000 možné použít sérum byla odebrána krev od 34 dobrovolníků do heparinizovaných, EDTA a obyčejných vacutainer zkumavek. Byly oddělené buňky a do odpovídajících vzorků byl přidán homocystein. Následně proběhlo stanovení pomocí testu Homocystein na IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 11

analyzátoru IMMULITE 2000 s následujícími výsledky : (EDTA) = 0,98 (Heparin) + 0,85 µmol/l r = 0,954 (Sérum) = 1,02 (Heparin) 0,53 µmol/l r = 0,975 Střední hodnoty : 20,2 µmol/l (Heparin) 20,7 µmol/l (EDTA) 20,1 µmol/l (Sérum) Ke zjištění vlivu teploty skladování byla odebrána krev do heparinizovaných, EDTA a obyčejných vacutainer zkumavek od 5 dobrovolníků do každého typu zkumavky. Některé zkumavky byly před separací uskladněny při pokojové teplotě, další zase různě dlouhou dobu na ledu. Níže uvedený graf ukazuje vliv času skladování a příslušné teploty na heparin, EDTA a sérum. (Viz grafy 1 3.) Srovnání metody 1 : Stanovení bylo porovnáno s komerčně dostupným manuálním enzymovým imunologickým testem (Kit A) na 168 vzorcích plazmy. (Koncentrační rozsah : přibližně 4 až 43 µmol/l. Viz graf Srovnání metody 1.) Podle lineární regrese : (IML 2000) = 1,0 (Kit A) + 0,24 µmol/l r = 0,966 Střední hodnoty : 12,9 µmol/l (IMMULITE 2000) 12,7 µmol/l (Kit A) Srovnání metody 2 : Stanovení bylo rovněž porovnáno s vlastní metodou využívající HPLC, která se používá v referenční laboratoři ve Spojených státech, a to na 95 vzorcích heparinizované plazmy. (Koncentrační rozsah : přibližně 4 až 44 µmol/l. Viz graf Srovnání metody 2.) Podle lineární regrese : (IML 2000) = 0,97 (HPLC) + 0,71 µmol/l r = 0,974 Střední hodnoty : 13,4 µmol/l (IMMULITE 2000) 13,2 µmol/l (HPLC) Srovnání metody 3 : Stanovení bylo rovněž porovnáno s dalším komerčně dostupným imunologickým testem (Kit B) na 113 vzorcích plazmy. (Koncentrační rozsah : přibližně 4 až 23 µmol/l. Viz graf Srovnání metody 3.) Podle lineární regrese : (IML 2000) = 0,90 (Kit B) 0,02 µmol/l r = 0,925 Střední hodnoty : 8,7 µmol/l (IMMULITE 2000) 9,6 µmol/l (Kit B) Technická Podpora Pro technickou podporu kontaktujte vašeho národního distributora. www.siemens.com/diagnostics Systém kontroly jakosti společnosti Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. je certifikovaný podle ISO 13485:2003. Ελληνικά IMMULITE 2000 Ομοκυστεΐνη Ενδεδειγμένη χρήση: Για in vitro διαγνωστική χρήση με τα συστήματα αναλυτών IMMULITE 2000 για την ποσοτική μέτρηση της L-ομοκυστεΐνης σε ανθρώπινο πλάσμα ή ορό. Η συσκευή αυτή μπορεί να συμβάλει στη διάγνωση και θεραπεία ασθενών με ενδεχόμενη υπερομοκυστεΐναιμία ή ομοκυστεϊνουρία. Αριθμός Καταλόγου: L2KHO2: (200 εξετάσεις) L2KHO6: (600 εξετάσεις) Κωδικός εξέτασης: HCY Χρώμα: Σκούρο γκρι Προειδοποίηση: Τα δείγματα ασθενών υπό θεραπεία με S-αδενοσυλο-μεθιονίνη ενδέχεται να εμφανίσουν παραπλανητικά υψηλά επίπεδα ομοκυστεΐνης. Τα αποτελέσματα δειγμάτων ασθενών, οι οποίοι υποβάλλονται σε θεραπεία με μεθοτρεξάτη, καρβαμαζεπίνη, φαινυτοΐνη, υποξείδιο του αζώτου, αντιεπιληπτικά ή 6- αζαουριδο-τριοξική κυτταρίνη θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή, καθώς αυτές οι ουσίες επηρεάζουν τον καθορισμό των τιμών ομοκυστεΐνης. Περίληψη και επεξήγηση Η ολική ομοκυστεΐνη (thcy) έχει αναδειχθεί σε σημαντικό παράγοντα κινδύνου στην αποτίμηση των καρδιαγγειακών παθήσεων. 3-7,12 Η Hcy, ένα αμινοξύ που 12 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

περιέχει θειόλη, παράγεται από την ενδοκυτταρική απομεθυλίωση της μεθιονίνης. Συνεπώς, η Hcy λειτουργεί ως δεξαμενή αναζήτησης υλικών για την παραγωγή είτε μεθιονίνης, μέσω της δράσης του ενζύμου συνθάση μεθιονίνης που εξαρτάται από το φολικό οξύ, είτε κυστεΐνης μέσω διαθείωσης με βάση τη βιταμίνη Β6. 1,2 Η Hcy στο πλάσμα εντοπίζεται κατά κύριο λόγο υπό μορφή δέσμευσης σε πρωτεΐνες, ενώ συναντώνται επίσης ελεύθερες, οξειδωμένες και διαθειωμένες μορφές της ουσίας. Ιδιαίτερα αυξημένα επίπεδα thcy παρατηρούνται σε ασθενείς με ομοκυστεΐνουρία, μια σπάνια γενετική διαταραχή των ενζύμων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της Hcy. 1,2,3 Οι ασθενείς με ομοκυστεΐνουρία παρουσιάζουν αρτηριακό θρομβοεμβολισμό, νοητική υστέρηση και πρώιμη αρτηριοσκλήρυνση. 1 Με μέτρια επίπεδα Hcy συνδέονται επίσης ορισμένες λιγότερο σοβαρές γενετικές βλάβες. 3,4,5 Έχει διαπιστωθεί ότι η ομοκυστεΐνη λειτουργεί ως δείκτης καρδιαγγειακών παθήσεων. Μια μετα-ανάλυση 27 επιδημιολογικών μελετών έδειξε ότι η αύξηση της Ηcy κατά 5 µmol/l μπορεί να συσχετιστεί με πιθανότητα εμφάνισης στεφανιαίας νόσου 1,6 για τους άνδρες και 1,8 για τις γυναίκες, όση δηλαδή προκύπτει και από την αύξηση της χοληστερίνης κατά 0,5 mmol/l. 7 Επιπλέον, οι ασθενείς με χρόνια νεφροπάθεια και αρτηριοσκληρωτική καρδιαγγειακή νόσο παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα thcy, εξαιτίας της ανικανότητας των νεφρών να αποβάλουν την Hcy από το αίμα. 1,2,3 Αρχή της διαδικασίας Ανταγωνιστική Ανοσοεξέταση. Το IMMULITE 2000 εκτελεί μία αυτόματη ενός κύκλου προεπεξεργασία στο δείγμα του ασθανούς με ένα δ/μα S-adenosyl-Lhomocysteine (SAH) υδρολάσης και διθειοθρειτόλης (DTT) σε ένα σωληνάριο αντίδρασης που δεν περιέχει σφαιρίδιο. Μετά από μια επώαση 30 λεπτών, το επεξεργασμένο δείγμα μεταφέρεται σε έναν δεύτερο σωλήνα αντίδρασης που περιέχει ένα σφαιρίδιο πολυστυρενίου επικαλυμένο με SAH και αντίσωμα σημασμένο με αλκαλική φωσφατάση ειδικό για SAH. Κατά την διάρκεια της επώασης των 30 λεπτών, η μετατραπείσα SAH από την προαραίωση του δείγματος του ασθενούς ανταγωνίζεται την ακινητοποιημένη SAH για τη δέσμευση του αντισώματος αντί-sah με σήμανση αλκαλικής φωσφατάσης. Το ενζυμικό σύμπλοκο που περισσεύει αφαιρείται με φυγοκεντρική πλύση. Προστίθεται υπόστρωμα και η διαδικασία συνεχίζεται όπως περιγράφεται χαρακτηριστικά και για άλλες εξετάσεις στο εγχειρίδιο του χειριστή. Κύκλοι Επώασης: 2 30 λεπτά 2 θέσεις τεστ ανά εξέταση: 1 δοχείο επεξεργασίας δείγματος, 1 δοχείο ανοσοαντίδρασης. Κύκλος 1: Αποδέσμευση δεσμευμένης ομοκυστεΐνης και μετατροπή σε SAH Κύκλος 2: Ανοσοαντίδραση Χρόνος για το πρώτο αποτέλεσμα: 65 λεπτά Συλλογή δειγμάτων Το ηπαρινισμένο και EDTA πλάσμα είναι το συνιστώμενο υλικό δείγματος, ωστόσο είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί και ο ορός. Σημαντικός είναι ο διαχωρισμός του πλάσματος ή του ορού από τα κύτταρα το συντομότερο δυνατό μετά τη συλλογή του δείγματος, επειδή η σύνδεση HCY συντελείται μέσα στα ερυθρά κύτταρα μετά τη δειγματοληψία. Τα δείγματα πρέπει να ανάμεσα στους χρόνους δειγματοληψίας και φυγοκέντρισης. Σημειώστε ότι η φύλαξη στον πάγο καθιστά ιδιαίτερα δύσκολη τη χρήση δειγμάτων ορού. Συνιστάται η χρήση της υπερφυγοκέντρου για να καθαριστούν τα λιπιδαιμικά δείγματα. Τα αιμολυμένα δείγματα μπορεί να υποδηλώνουν κακή μεταχείριση του δείγματος πριν την παραλαβή του από το εργαστήριο και τα αποτελέσματα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Η φυγοκέντρηση των δειγμάτων πριν την πλήρη πήξη μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την παρουσία θρόμβων. Για να αποφευχθούν λανθασμένα αποτελέσματα εξαιτίας της παρουσίας θρόμβων, βεβαιωθείτε ότι πριν την φυγοκέντρηση το αίμα έχει πήξει πλήρως. Κάποια δείγματα, ιδιαιτέρως αυτά των ασθενών που λαμβάνουν αντιπηκτική IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 13

θεραπεία, ίσως χρειάζονται εκτεταμένο χρόνο πήξης. Οι σωλήνες συγκέντρωσης αίματος από διαφορετικές εταιρείες μπορεί να φέρουν διάφορες τιμές, ανάλογα με τα υλικά και τα συμπληρώματα, συμπεριλαμβανομένων των με τζελ ή φυσικών σωληναρίων, των ενεργοποιητών πήξεως και/ή των αντιπηκτικών. Η εξέταση IMMULITE 2000 Ομοκυστεΐνη δεν έχει δοκιμαστεί με όλους τους τύπους σωληναρίων. Συμβουλευτείτε την παράγραφο για τους εναλλακτικούς τύπους δειγμάτων για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα σωληνάρια που έχουν δοκιμαστεί. Απαιτούμενος Όγκος: 15 µl ορού ή πλάσματος. Φύλαξη: 14 ημέρες στους 2 8 C ή 6 μήνες στους 20 C. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για διαγνωστική εργαστηριακή χρήση Αντιδραστήρια : Διατήρηση στους 2 8 C. Απόρριψη σύμφωνα με την ισχύουσα νομοθεσία. Ακολουθείστε τις γενικές προφυλάξεις και χειριστείτε όλα τα συστατικά σαν να ήταν φορείς μολυσματικών παραγόντων. Όλα τα υλικά της μεθόδου που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα έχουν ελεγχθεί και βρέθηκαν αρνητικά για σύφιλη, για αντισώματα στον HIV 1 και 2, για επιφανειακά αντιγόνα της ηπατίτιδας Β και για αντισώματα της ηπατίτιδας C. Αζίδιο του νατρίου σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 0,1 g/dl έχει προστεθεί ως συντηρητικό. Κατά την απόρριψη, ξεπλύνετε με άφθονο νερό για την αποφυγή σχηματισμού πιθανών εκρηξιογόνων μεταλλικών αζιδίων στις αποχετεύσεις από μόλυβδο και χαλκό. Χημειοφωταυγές υπόστρωμα: ποφύγετε την μόλυνση και την έκθεση στο άμεσο ηλιακό φως. (Βλέπε ένθετο.) Νερό: Χρησιμοποιείτε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Υλικά που διατίθενται Τα συστατικά αποτελούν ένα ολοκληρωμένο σετ. Οι ετικέτες στο εσωτερικό κουτί είναι απαραίτητες για την ανάλυση. Συσκευασία σφαιριδίων ομοκυστεΐνης (L2HO12) Με ραβδοκώδικα. 200 σφαιρίδια επικαλυμμένα με S-αδενοσυλ-Lομοκυστεΐνη (SAH). Σταθερά στους 2 8 C μέχρι την ημερομηνία λήξης. L2KHO2: 1 συσκευασία L2KHO6: 3 συσκευασίες Δοχείο αντιδραστηρίου ομοκυστεΐνης (L2HOA2) Με ραβδοκώδικα. Ένα δοχείο, που περιέχει 3 αντιδραστήρια: 15,5 ml βοείας υδρολάσης S-αδενοσυλο-L-ομοκυστεΐνης σε ρυθμιστικό διάλυμα με συντηρητικό. 18,5 ml διθειοθρειτόλης (DTT) σε ρυθμιστικό διάλυμα. 11,5 ml αλκαλικής φωσφατάσης (από βόειο έντερο) συνδεδεμένης με μονοκλωνικό αντί-sah ποντικού σε ρυθμιστικό διάλυμα. Σταθερά στους 2 8 C έως την ημερομηνία λήξης. L2KHO2: 1 δοχείο L2KHO6: 3 δοχεία Πριν τη χρήση, σχίστε την πάνω ετικέτα στο σημείο διάτρησης, χωρίς να καταστρέψετε τον ραβδοκώδικα. Αφαιρέστε (ξεκολλήστε) προσεκτικά το κάλυμμα από την επάνω επιφάνεια του δοχείου, και πιέστε το κάλυμμα κάτω προς τους κεκλιμένους οδηγούς-ράγες. Ρυθμιστές Ομοκυστεΐνης (LHOL, LHOH) Δύο πορτοκαλί φιαλίδια (χαμηλό και υψηλό), 2,0 ml το καθένα με συνθετική S-αδενοσυλο-L-ομοκυστεΐνη (SAH) σε μήτρα πρωτεΐνης/ρυθμιστικού. Σταθεροί στους 2 8 C για 30 ημέρες ή για 6 μήνες (διαχωρισμένοι) στους 20 C. L2KHO2: 1 σετ L2KHO6: 2 σετ Πριν κάνετε κάποια ρύθμιση, τοποθετήστε τις κατάλληλες ετικέτες των διαλυμάτων (παρέχονται με το kit) σε δοκιμαστικούς σωλήνες, έτσι ώστε οι ραβδοκώδικες να μπορούν να διαβαστούν από το σύστημα του αναλυτή. Συστατικά του Kit που παρέχονται ξεχωριστά Αραιωτικό δείγματος ομοκυστεΐνης (L2HOZ) Για την επί-του-αναλυτή αραίωση των υψηλών δειγμάτων. 25 ml συμπηκνωμένα (έτοιμα προς χρήση) ελύθερο ομοκυστείνης μήτρα πρωτεΐνης/ρυθμιστικού δ/τος. 14 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

Φύλαξη: 30 μέρες (μετά το άνοιγμα) στους 2 8 C για 6 μήνες (διαχωρισμένο) στους 20 C. Ετικέτες με ραβδοκώδικα παρέχονται για χρήση με το αραιωτικό. Πριν από τη χρήση, τοποθετείστε μια κατάλληλη ετικέτα σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα 16 x 100 mm, έτσι ώστε οι ραβδοκώδικες να μπορούν να διαβαστούν από το σύστημα του αναλυτή.α. L2HOZ: 3 ετικέτες L2SUBM: Χημειοφωταυγές υπόστρωμα L2PWSM: Πλυστικό του ανιχνευτή L2KPM: Kit καθαρισμού του ανιχνευτή LRXT: Σωλήνες αντίδρασης (μιας χρήσεως) L2ZT: 250 δοκιμαστικοί σωλήνες για διάλυση του δείγματος (16 100 mm) L2ZC: 250 καπάκια για σωλήνες διάλυσης δείγματος Απαιτούνται επίσης Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό, δοκιμαστικοί σωλήνες, δείγματα ελέγχου Διαδικασία της ανάλυσης Σημειώστε ότι για το βέλτιστο αποτέλεσμα, είναι σημαντικό να ακολουθηθούν όλες οι τυπικές διαδικασίες όπως ορίζονται στο εγχειρίδιο χρήστη συστημάτων IMMULITE 2000. Βλέπε το εγχειρίδιο χρήστη συστημάτων IMMULITE 2000 για προετοιμασία, στήσιμο, αραιώσεις, ρυθμίσεις, ανάλυση και διαδικασίες ποιοτικού έλέγχου. Συνιστώμενος χρόνος μεταξύ των ρυθμίσεων: 4 εβδομάδες Δείγματα ποιοτικού ελέγχου: Εφαρμόστε τους κρατικούς κανονισμούς ή τις απαιτήσεις πιστοποίησης για τη συχνότητα του ποιοτικού ελέγχου. Χρησιμοποιήστε δείγματα ελέγχου η δείγματα ορού ή πλάσματος τουλάχιστον δύο επιπέδων (χαμηλό και υψηλό) ομοκυστεΐνης. Η Siemens Healthcare Diagnostics συνιστά τη χρήση εμπορικά διαθέσιμων υλικών ελέγχου ποιότητας με τουλάχιστον 2 επίπεδα (χαμηλό και υψηλό). Ένα ικανοποιητικό επίπεδο απόδοσης επιτυγχάνεται όταν οι τιμές που προκύπτουν βρίσκονται εντός του αποδεκτού εύρους των υλικών ελέγχου για τον αναλυτή ή εντός ενός καθορισμένου εύρους που καθορίστηκε με βάση ένα κατάλληλο πλαίσιο εσωτερικού εργαστηριακού ποιοτικού ελέγχου. Αναμενόμενες τιμές Τα επίπεδα ομοκυστεΐνης είναι δυνατόν να αποκλίνουν ανάλογα με την ηλικία, το φύλο, τη γεωγραφική περιοχή και γενετικούς παράγοντες. Συνεπώς, τα εργαστήρια θα πρέπει οπωσδήποτε να καθορίσουν το δικό τους εύρος αναφοράς με βάση τον τοπικό πληθυσμό. Η βιβλιογραφία υποδεικνύει εύρος αναφοράς 5 15 µmol/l για ενήλικες άνδρες και γυναίκες, 11 και σημειώνει ότι οι άνδρες τείνουν να παρουσιάζουν υψηλότερα επίπεδα από τις γυναίκες, ενώ οι γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση τείνουν να παρουσιάζουν υψηλότερα επίπεδα από ότι πριν την εμμηνόπαυση. 12 Με τη μέθοδο IMMULITE 2000 Ομοκυστεΐνη αναλύθηκαν εκατόν είκοσι δείγματα εμφανώς υγιών ενηλίκων ανδρών και γυναικών εθελοντών ηλικίας 22-66 ετών. Τα δείγματα ελήφθησαν σε σωλήνες ηπαρινισμένου πλάσματος και διατηρήθηκαν σε πάγο πριν το διαχωρισμού του πλάσματος από τα κύτταρα. Η διάμεση τιμή ήταν 7,7 µmol/l, με κεντρικό εύρος από 5,0 12 µmol/l. Θεωρείστε αυτά τα όρια μόνο ως κατευθυντήριες γραμμές. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να θεσπίσει τα δικά του εύρη αναφοράς. Περιορισμοί Τα δείγματα ασθενών υπό θεραπεία με S-αδενοσυλο-μεθιονίνη ενδέχεται να εμφανίσουν παραπλανητικά υψηλά επίπεδα ομοκυστεΐνης. Αν και η ανάλυση των γονικών συστατικών καρβαμαζεπίνη, φαινυτοΐνη, 6-αζαουριδίνη και ανθοπτερίνη δεν παρουσιάζει διασταυρούμενη αντίδραση, τα δείγματα που λαμβάνονται από ασθενείς υπό θεραπεία με τα ανωτέρω φάρμακα, καθώς και με μεθοτρεξάτη, υποξείδιο του αζώτου και άλλα αντιεπιληπτικά, θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή, καθώς αυτές οι ουσίες επηρεάζουν ορισμένες αναλύσεις ομοκυστεΐνης Ετεροφυλικά αντισώματα στον ανθρώπινο ορό μπορεί να αντιδράσουν με τις ανοσοσφαιρίνες που περιέχονται στα συστατικά της μεθόδου προκαλώντας IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 15

αλληλεπιδράσεις με in vitro ανοσοαναλύσεις. [Βλ. Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem 1988:34: 27-33.] Δείγματα ασθενών που εκτίθενται συστηματικά σε ζώα ή προϊόντα ζωικού ορού μπορούν να παρουσιάσουν αυτού του τύπου την αλληλοεπίδραση που προκαλεί δυνητικά ένα ανώμαλο αποτέλεσμα. Αυτά τα αντιδραστήρια έχουν μορφοποιηθεί έτσι, ώστε, να ελαχιστοποιούν τον κίνδυνο της αλληλοεπίδρασης παρόλ αυτά, πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των σπάνιων ορών και των συστατικών της μεθόδου μπορεί να εμφανιστούν. Για διαγνωστικούς σκοπούς, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από αυτή τη μέθοδο θα πρέπει πάντα να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τις κλινικές εξετάσεις, το ιατρικό ιστορικό του ασθενούς και άλλα ευρήματα. Απόδοση Βλέπε Πίνακες και Γραφήματα για αντιπροσωπευτικά δεδομένα της εκτέλεσης της μεθόδου. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε µmol/l. (Εκτός εάν δίδονται διαφορετικά στοιχεία, όλα παρήχθησαν σε δείγματα ηπαρινισμένου πλάσματος.) Εύρος μέτρησης: 2 έως 50 µmol/l Η εξέταση είναι ιχνηλάσιμη σε ένα εσωτερικό πρότυπο που κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας κατάλληλα υλικά και μετρήσιμες διαδικασίες. Αναλυτική ευαισθησία: 1,2 µmol/l Ακρίβεια: Για αρκετές ημέρες κάποια δείγματα εξετάστηκαν εις τετραπλούν, συνολικά 20 φορές ή 80 επαναλήψεις. (Βλέπε "Precision" πίνακα.) Γραμμικότητα: Τα δείγματα αναλύθηκαν σε διάφορες αραιώσεις. (Βλ. Πίνακα Linearity.) Ανάκτηση: Κάποια δείγματα (1 με 19) εμπλουτίστηκαν με τρία διαλύματα ομοκυστεΐνης (125, 250 και 500 µmol/l) και αναλύθηκαν. (Βλ. Πίνακα Recovery για τα αντιπροσωπευτικά δείγματα.) Ειδικότητα: Το αντίσωμα έχει υψηλή εξειδίκευση στην ομοκυστεΐνη. (Βλ. Πίνακα Specificity.) Χολερυθρίνη: Παρουσία χολερυθρίνης σε συγκεντρώσεις μέχρι 200 mg/l δεν επιδρά στα αποτελέσματα της εξέτασης, μέσα στα όρια ακρίβειας της ανάλυσης. Αιμόλυση: Παρουσία αιμοσφαιρίνης σε συγκεντρώσεις μέχρι 512 mg/dl δεν επιδρά στα αποτελέσματα της εξέτασης, μέσα στα όρια ακρίβειας της ανάλυσης. Λιπιδαιμία: Παρουσία τριγλυκεριδίων σε συγκεντρώσεις μέχρι 3000 mg/dl δεν επιδρά στα αποτελέσματα της εξέτασης. (Δες Πίνακα Lipemia.) Εναλλακτικός τύπος δείγματος: Προκειμένου να διαπιστωθεί εάν είναι δυνατή η χρήση ορού με τη διαδικασία IMMULITE 2000 Ομοκυστεΐνη, συλλέχθηκε αίμα από 34 εθελοντές εργαστηρίου σε απλούς, ηπαρινισμένους και EDTA δοκιμαστικούς σωλήνες. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν από τα κύτταρα, τα αντιστοιχισμένα δείγματα εμπλουτίστηκαν με ομοκυστεΐνη και στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη διαδικασία IMMULITE 2000 Ομοκυστεΐνη με τα ακόλουθα αποτελέσματα. (EDTA) = 0,98 (Ηπαρίνη) + 0,85 µmol/l r = 0,954 (Ορός) = 1,02 (Ηπαρίνη) 0,53 µmol/l r = 0,975 Μέσοι: 20,2 µmol/l (Ηπαρίνη) 20,7 µmol/l (EDTA) 20,1 µmol/l (Ορός) Για να αποτιμηθεί η επίδρασης της θερμοκρασίας φύλαξης, συλλέχθηκαν ηπαρινισμένοι, EDTA και απλοί δοκιμαστικοί σωλήνες από πέντε εθελοντές για κάθε τύπο σωλήνα. Ορισμένοι σωλήνες φυλάχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ άλλοι διατηρήθηκαν σε πάγο για διάφορα χρονικά διαστήματα πριν το διαχωρισμό. Τα ακόλουθα γραφήματα παρουσιάζουν τις επιδράσεις του χρόνου και της θερμοκρασίας φύλαξης για σωλήνες ηπαρίνης, EDTA και ορού. (Βλέπε γραφήματα 1 3.) Σύγκριση μεθόδου 1: Η ανάλυση συγκρίθηκε με μια διαθέσιμη στο εμπόριο μη αυτοόματη ενζυμική ανοσοανάλυση (Kit A) σε 168 δείγματα πλάσματος. (Εύρος συγκέντρωσης: περίπου 4 ως 43 µmol/l. Βλ. Γραφ 1.) Με γραμμική παλινδρόμηση: (IML 2000) = 1,0 (Kit A) + 0,024 µmol/l r = 0,966 16 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

Μέσοι: 12,9 µmol/l (IMMULITE 2000) 12,7 µmol/l (Kit A) Σύγκριση μεθόδου 2: Η εξέταση επίσης συγκρίθηκε με μία ενδοεργαστηριακή HPLC που χρησιμοποιείται σε ένα εργαστήριο αναφοράς στις Η.Π.Α., σε 95 δείγματα ηπαρινισμένου πλάσματος. (Εύρος συγκέντρωσης: περίπου 4 έως 44 µmol/l. Βλέπε γράφημα Method Comparison 2.) Η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα: (IML 2000) = 0,97 (HPLC) + 0,71 µmol/l r = 0,974 Μέσοι: 13,4 µmol/l (IMMULITE 2000) 13,2 µmol/l (HPLC) Σύγκριση 3: Η μέθοδος συγκρίθηκε με μία άλλη εμπορικά διαθέσιμη μέθοδο (Kit B) σε 113 δείγματα πλάσματος. (Εύρος συγκέντρωσης: περίπου 4 έως 23 µmol/l. Βλέπε γράφημα Method Comparison 3.) Η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα: (IML 2000) = 0,90 (Kit B) 0,02 µmol/l r = 0,925 Μέσοι: 8,7 µmol/l (IMMULITE 2000) 9,6 µmol/l (Kit B) Τεχνική Υποστήριξη Για τεχνική υποστήριξη αποταθείτε στον αντιπρόσωπο της χώρας σας. www.siemens.com/diagnostics Το Σύστημα Ποιότητας της Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. είναι επικυρωμένο με ISO 13485:2003. Polski IMMULITE 2000 Homocysteina Przeznaczenie: Test diagnostyczny in vitro dla analizatorów systemów IMMULITE 2000 przeznaczony do ilościowego oznaczenia poziomu L-homocysteiny w osoczu i surowicy ludzkiej. Test znajduje zastosowanie w diagnostyce i leczeniu hiperhomocysteinemii i homocystynurii. Numer katalogowy: L2KHO2 (200 testów) L2KHO6 (600 testów) Kod testu: HCY Kolor: Ciemnoszary Ostrzeżenie: Terapia specyfikami zawierającymi S-adenozylo-metioninę prowadzić może do fałszywie zawyżonych wyników oznaczenia homocysteiny. Wyniki oznaczeń homocysteiny u osób przyjmujących methotrexat, karbamazepinę, fenytoinę, podtlenek azotu, leki przeciwdrgawkowe i trójoctan 6-azurydyny powinny być interpretowane ostrożnie ze względu na możliwy wpływ tych specyfików na oznaczenie. Wprowadzenie Całkowita homocysteina (thcy) okazała się być ważnym czynnikiem ryzyka w ocenie chorób układu sercowonaczyniowego. 3-7,12 Hcy aminokwas zawierający grupę tiolową powstaje na drodze wewnątrzkomórkowej demetylacji metioniny. Hcy stanowi pulę, która może być metabolizowana przez syntazę metioninową do metioniny na drodze remetylacji zależnej od kwasu foliowego jako koenzymu, lub do cysteiny na drodze transulfuracji z witaminą B6 jako koenzymem. 1,2 Hcy w osoczu występuje głównie w formie połączonej z białkiem, aczkolwiek obecne są również utlenione formy wolne w postaci dwusiarczków. Wysoko podniesiony poziom thcy stwierdzany jest u chorych na homocystynurię, rzadką chorobę genetyczną związaną z brakiem enzymów zaangażowanych w metabolizm Hcy. 1,2,3 U chorych na homocystynurię występują zakrzepy z zatorami tętnic, niedorozwój umysłowy i wczesna arterioskleroza. 1 Mniej dotkliwe defekty genetyczne wiążą się z umiarkowanie podniesionym poziomem Hcy. 3,4,5 Homocysteina została uznana za wskaźnik chorób układu sercowonaczyniowego. Analiza 27 studiów epidemiologicznych sugeruje, że wzrost thcy o 5 µmol/l może wiązać się ze wzrostem współczynnika ryzyka chorób naczyń wieńcowych (CAD) do 1,6 dla mężczyzn i 1,8 dla kobiet, co odpowiada wzrostowi ryzyka związanemu z IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 17

podniesieniem cholesterolu o 0,5 mmol/l. 7 Podniesiony poziom thcy stwierdzany jest u osób z chronicznymi chorobami nerek powikłanymi chorobami układu sercowonaczyniowego o tle miażdżycowym, co wiąże się z niezdolnością nerek do usuwania Hcy z krwi. 1,2,3 Zasada testu Test immunoenzymatyczny, kompetycyjny. IMMULITE 2000 przeprowadza automatycznie wstepną obróbkę próbki osocza lub surowicy z hydrolazą S-adenozylo-L-homocysteiny (SAH) i roztworem ditiothreitolu (DTT) w kuwecie reakcyjnej bez kulki. Po 30-minutowej inkubacji, wstepnie przygotowana próbka jest przenoszona do drugiej kuwety reakcyjnej zawierającej kulkę opłaszczoną SAH i alkaliczną fosfatazę sprzęgniętą z mysim przeciwciałem monoklonalnym specyficznym w stosunku do SAH. W trakcie 30 minutowej inkubacji konwertowana SAH z próbki współzawodniczy z SAH na kulce o miejsca wiążące przeciwciała anty-sah z koniugatu. Niezwiązany koniugat usuwany jest w procesie wirowania i płukania. Po dodaniu substratu chemiluminescencyjnego oznaczenie przebiega w typowy sposób. Czas inkubacji: 2 30 minut. 2 miejsca testowe na jedno oznaczenie: 1 kuweta do wstępnej obróbki; 1 kuweta reakcyjna. Cykl 1: Uwolnienie związanej homocysteiny i konwersja do SAH Cykl 2: Reakcja immunologiczna Czas do pierwszego wyniku: 65 minut Preparatyka próbek Osocze heparynowe i EDTA są materiałem z wyboru, lecz użycie surowicy jest również dopuszczalne. Istotne jest możliwie jak najszybsze oddzielenie osocza lub surowicy od elementów morfotycznych krwi, gdyż w erytrocytach obecnych w próbce nieprzerwanie zachodzi synteza homocysteiny.w okresie pomiędzy pobraniem krwi i wirowaniem próbka powinna być przechowywana w lodzie. Należy brać pod uwagę, że wymóg przechowywania materiału w lodzie jest szczególnie trudny do dochowania w przypadku oznaczeń w surowicy. Zalecane jest klarowanie próbek lipemicznych przez ultrawirowanie. Hemoliza próbki może świadczyć o nieprawidłowym postępowaniu z próbką na etapie przedlaboratoryjnym. Fakt ten należy brać pod uwagę przy interpretacji wyników. Odwirowanie próbki krwi przed zakończeniem wykrzepiania może spowodować, że w supernatancie pozostanie fibryna stanowiąca przyczynę fałszywych wyników. Przed przystąpieniem do wirowania należy mieć pewność, że skrzep jest ostatecznie uformowany. Niektóre próbki, a zwłaszcza pochodzące od osób poddanych leczeniu antykoagulantami, wymagają dłuższego czasu na wytworzenie skrzepu. Stosowane przy pobieraniu krwi probówki różnych producentów mogą różnie wpływać na uzyskiwane wyniki. Istotny jest materiał i czynniki dodatkowe jak żel lub bariery oddzielające skrzep, aktywatory krzepnięcia oraz antykoagulanty. Wpływ wszystkich możliwych wariantów probówek na test IMMULITE 2000 Homocysteina nie został określony. Informacje o przetestowanych wariantach podano w akapicie Wpływ materiału na oznaczenie. Wymagana objętość próbki: 15 µl osocza lub surowicy. Przechowywanie: 14 dni w 2 8 C, lub 6 miesięcy w 20 C. Ostrzeżenia i warunki wstępne Test diagnostyczny in vitro. Odczynniki: Przechowywać w 2 8 C. Usuwać zgodnie z instrukcją. Zachowywać środki ostrożności konieczne przy pracy z materiałem potencjalnie zakaźnym. W materiałach pochodzących z krwi ludzkiej wykluczono reaktywność w kierunku syfilisu, obecność przeciwciał anty-hiv1/2, HBsAg i przeciwciał anty-hcv. Azydek sodu w stężeniu mniejszym niż 0,1 g/dl jest dodawany jako konserwant. Wykorzystane odczynniki usuwać w dużej ilości wody, by zapobiec osadzaniu azydku sodu w rurach miedzianych lub ołowianych, co może doprowadzić do 18 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

wytworzenia potencjalnie wybuchowych azydków tych metali. Substrat chemiluminescencyjny: Unikać zanieczyszczenia i chronić przed bezpośrednim światłem słonecznym (patrz ulotka). Woda: Dejonizowana lub destylowana. Elementy zestawu Elementy zestawu tworzą całość. Kody na wewnętrznych pokrywach pudełka są niezbędne do wykonania oznaczenia. Homocysteina Pojemnik z Kulkami (L2HO12) Z kodem kreskowym. 200 kulek opłaszczonych S-adenozylo-Lhomocysteiną (SAH). Stabilne w 2 8 C do daty ważności. L2KHO2: 1 opakowanie L2KHO6: 3 opakowania Homocysteina Klin odczynnikowy (L2HOA2) Z kodem kreskowym. Jeden klin z 3 odczynnikami: 15,5 ml bydlęcej hydrolazy S-adenozylo-L-homocysteiny w buforze z konserwantem. 18,5 ml ditiothreitolu (DTT) w buforze. 11,5 ml alkalicznej fosfatazy (izolowanej z jelita cieląt) sprzęgniętej z mysim przeciwciałem monoklonalnym specyficznym w stosunku do SAH, w buforze. Stabilne w 2 8 C do daty ważności. L2KHO2: 1 klin L2KHO6: 3 kliny Przed użyciem zerwać taśmę zabezpieczającą nie uszkadzając kodu kreskowego. Usunąć foliową uszczelkę komór odczynnikowych. Wsunąć przesuwne zamknięcie komór w prowadnice w pokrywie klina. Homocysteina Kalibratory (LHOL, LHOH) Dwie bursztynowe fiolki (kalibrator niski i wysoki), po 2,0 ml każda, zawierające syntetyczną SAH w buforowanej matrycy białkowej. Po otwarciu stabilne przez 30 dni w 2 8 C lub 6 miesięcy w 20 C. (rozpipetować). L2KHO2: 1 zestaw L2KHO6: 2 zestawy Przed przystąpieniem do kalibracji umocuj na probówkach odpowiednie nalepki z kodem kreskowym (dostarczane z zestawem) rozpoznawane przez czytnik kodów kreskowych aparatu. Materiały dostarczane oddzielnie Homocysteina Rozcieńczalnik próbek (L2HOZ) Do automatycznego rozcieńczania wysokich próbek. 25 ml skoncentrowanej (gotowej do użycia), pozbawionej homocysteiny buforowanej matrycy białkowej. Po otwarciu stabilny przez 30 dni w 2 8 C lub 6 miesięcy w 20 C (rozpipetować). Nalepki z odpowiednimi kodami kreskowymi są dostarczane wraz z rozcieńczalnikiem. Nalepkę umieścić na probówce (16 100 mm), by umożliwić jej rozpoznanie przez czytnik kodów aparatu. L2HOZ: 3 nalepki L2SUBM: Substrat chemiluminescencyjny L2PWSM: Roztwór płuczący L2KPM: Roztwór czyszczący LRXT: Probówki reakcyjne (jednorazowe) L2ZT: 250 probówek do rozcieńczania próbek 16 100 mm L2ZC: 250 korków do probówek na rozcieńczalnik Ponadto niezbędne Woda destylowana lub dejonizowana, probówki testowe, kontrole Procedura oznaczenia Przestrzeganie procedur dotyczących utrzymania aparatu, zawartych w Podręczniku operatora do obsługi systemów IMMULITE 2000 poprawia charakterystykę uzyskiwanych wyników. Procedury: przygotowania aparatu, ustawień aparatu, przygotowania i rozcieńczania próbek, rekalibracji, oznaczenia i kontroli jakości zgodnie z Podręcznikiem operatora do obsługi systemów IMMULITE 2000. Zalecany odstęp pomiędzy rekalibracjami: 4 tygodnie Próbki kontrolne: Przestrzegać przepisów państwowych i wymogów kontrolnych w zakresie częstotliwości kontroli jakości. Stosować kontrole lub pule osocza lub surowic co najmniej o niskim i wysokim poziomie homocysteiny. IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 19

Siemens Healthcare Diagnostics zaleca stosowanie dostępnych w handlu próbek kontroli jakości o co najmniej 2 poziomach (niskim i wysokim). Uznaje się, że test przebiega prawidłowo, gdy uzyskane wartości analitu plasują się w przyjętym dla Kontroli zakresie dla danego analizatora lub w zakresie opracowanym w ramach wewnątrzlaboratoryjnego systemu zapewnienia jakości. Oczekiwane wartości Poziom homocysteiny może być różny w zależności od wieku, płci, uwarunkowań geograficznych i czynników genetycznych. Istotne jest, by laboratorium ustaliło własny zakres referencyjny charakterystyczny dla miejscowej populacji. Zgodnie z piśmiennictwem zakres referencyjny homocysteiny u dorosłych obu płci wynosi 5 do 15 µmol/l. 11 Równocześnie jednak, inne źródła podają, że poziom homocysteiny u mężczyzn jest wyższy niż u kobiet, a poziom homocysteiny u kobiet po menopauzie przekracza poziom u kobiet w okresie przed menopauzalnym. 12 Badania referencyjne przeprowadzone testem IMMULITE 2000 Homocysteina objęły grupę 120 zdrowych osób obu płci w wieku od 22 do 66 lat. Próbki pobierano do probówek z heparyną i przechowywano w lodzie do momentu oddzielenia elementów morfotycznych. Mediana wyniosła 7,7 µmol/l, a zakres środkowych 95% 5,0 12 µmol/l. Powyższe wartości należy traktować jako orientacyjne. Każde laboratorium powinno wyznaczyć własne zakresy referencyjne. Ograniczenia Leczenie specyfikami zawierającymi S-adenozylo-metioninę prowadzić może do fałszywie zawyżonych wyników oznaczenia homocysteiny. Chociaż składniki macierzyste karbamazepiny, fenytoiny, 6-azurydyny i anthopteryny nie wykazują reaktywności krzyżowej przy oznaczaniu homocysteiny, to jednak wyniki oznaczeń w próbkach od osób zażywających te specyfiki, a również methotrexat, podtlenek azotu i inne leki przeciwdrgawkowe powinny być interpretowane ostrożnie ze względu na doniesienia świadczące o możliwość takiej interferencji w niektórych typach testów. Przeciwciała heterofilne obecne w surowicy ludzkiej mogą wchodzić w reakcję z immunoglobulinami będącymi reagentami testu immunologicznego, wpływając na przebieg oznaczenia in vitro. [Porównaj: Boscato L.M., Stuart M.C.: Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays Przeciwciała heterofilne - problem wszystkich testów immunologicznych. Clin Chem 1988:34: 27-33]. Wpływ przeciwciał heterofilnych może ujawnić się w oznaczeniach wykonywanych w surowicy osób mających ciągły kontakt ze zwierzętami lub zwierzęcymi produktami krwiopochodnymi, stanowiąc potencjalną przyczynę błędnych wyników. W teście ryzyko interferencji przeciwciał heterofilnych zostało zminimalizowane przez odpowiedni dobór proporcji odczynników, tym niemniej interferencja taka może potencjalnie nastąpić w rzadkich przypadkach. W postępowaniu diagnostycznym wyniki uzyskane tą metodą powinny być z zasady interpretowane w połączeniu z badaniem klinicznym pacjenta, jego historią choroby oraz innymi okolicznościami. Parametry testu Dane charakteryzujące test przedstawiono w tabelach i rysunkach. Wyniki wyrażano w µmol/l. (O ile nie podano inaczej, wszystkie wyniki dotyczą próbek osocza heparynowego.) Zakres raportowania: 2 do 50 µmol/l Test wykazuje zgodność pomiarową z wewnętrznymi standardami wytwarzania dzięki zastosowaniu kwalifikowanych materiałów i metod pomiaru. Czułość analityczna: 1,2 µmol/l Precyzja: Próbki były oznaczane w czterech powtórzeniach przez okres dwudziestu dni, co dało w sumie 20 serii i 80 powtórzeń. (Patrz: Tabela Precyzja.) Liniowość: Oznaczano próbki poddane kolejnym rozcieńczeniom. (Patrz: Tabela Liniowość.) Odzysk: Oznaczano próbki wzbogacane w stosunku objętościowym 1 do 19 roztworami homocysteiny o stężeniach, kolejno: 125, 250 i 500 µmol/l. (Patrz: Tabela Odzysk.) 20 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

Specyficzność: Przeciwciało jest wysoce specyficzne w stosunku do homocysteiny. (Patrz: Tabela Specyficzność.) Bilirubina: Obecność bilirubiny związanej i niezwiązanej w stężeniu do 200 mg/l nie wpływa na wynik w charakterystycznym dla testu zakresie precyzji. Hemoliza: Obecność hemoglobiny w stężeniu do 512 mg/dl nie wpływa na wynik w charakterystycznym dla testu zakresie precyzji. Lipemia: Obecność trójglicerydów w stężeniu do 3000 mg/dl nie wpływa na wynik w charakterystycznym dla testu zakresie precyzji. Wpływ materiału na oznaczenie: Dla oceny możliwości zastosowania surowicy jako materiału dla testu IMMULITE 2000 Homocysteina próbki od 34 wolontariuszy pobierano do umieszczonych w lodzie probówek próżniowych bez antykoagulantu, z heparyną i EDTA. Po oddzieleniu elementów morfotycznych zawartość probówek wzbogacano w homocysteinę i oznaczano testem IMMULITE 2000 Homocysteina. Otrzymano następujące równania regresji liniowej: (EDTA) = 0,98 (Heparyna) + 0,85 µmol/l r = 0,954 (Surowica) = 1,02 (Heparyna) 0,53 µmol/l r = 0,975 Średnie: 20,2 µmol/l (Heparyna) 20,7 µmol/l (EDTA) 20,1 µmol/l (Surowica) Wpływ temperatury przechowywania na próbki pobrane na heparynę, EDTA lub do probówek bez antykoagulantu oceniano w materiale od pięciu ochotników pobieranym do każdego z wymienionych rodzajów probówek. Probówki przechowywano w temperaturze pokojowej lub lodzie przez różny okres czasu przed separacją. Wpływ czasu przechowywania i temperatury na homocysteinę w próbkach heparynowych, EDTA i surowicy ilustrują wykresy. (Patrz wykresy 1 3.) Porównanie metod 1: Wyniki porównano z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu dostępnego na rynku testu immunoenzymatycznego (Kit A) na 168 próbkach osocza. (Zakres stężeń od około 4 do 43 µmol/l. Patrz wykres Method Comparison 1.) Otrzymano następujące równanie regresji liniowej: (IML 2000) = 1,0 (Kit A) + 0,24 µmol/l r = 0,966 Średnie: 12,9 µmol/l (IMMULITE 2000) 12,7 µmol/l (Kit A) Porównanie metod 2: Wyniki porównano także z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu metody HPLC w laboratorium referencyjnym w Stanach Zjednoczonych na 95 próbkach osocza heparynowego. (Zakres stężeń od około 4 do 44 µmol/l. Patrz wykres Method Comparison 2.) Otrzymano następujące równanie regresji liniowej: (IML 2000) = 0,97 (HPLC) + 0,71 µmol/l r = 0,974 Średnie: 13,4 µmol/l (IMMULITE 2000) 13,2 µmol/l (HPLC) Porównanie metod 3: Wyniki porównano z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu innego dostępnego na rynku testu immunoenzymatycznego (Kit B) na 113 próbkach osocza. (Zakres stężeń od około 4 do 23 µmol/l. Patrz wykres Method Comparison 3.) Otrzymano następujące równanie regresji liniowej: (IML 2000) = 0,90 (Kit B) 0,02 µmol/l r = 0,925 Średnie: 8,7 µmol/l (IMMULITE 2000) 9,6 µmol/l (Kit B) Pomoc techniczna i konsultacje Krajowy Dystrybutor udziela wszechstronnej pomocy technicznej. www.siemens.com/diagnostics System Kontroli Jakości Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. posiada Certyfikat Jakości ISO 13485:2003. IMMULITE is a trademark of Siemens Healthcare Diagnostics. 2013 Siemens Healthcare Diagnostics. All rights reserved. IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 21

Origin: UK 2013-02-08 Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. Llanberis, Gwynedd LL55 4EL United Kingdom PIEL2KHO 3 {21} Changes in this Edition: cc#eu21840: Removed Siemens control (CCCM) from the Kit Components Supplied Separately section. Under Quality Control Samples, added information for quality control frequency, materials, and performance. Understanding the Symbols Understanding the Symbols En English Vysvětlivky symbolů Επεξήγηση των συμβόλων Znaczenie symboli Cz Česky El Ελληνικά Pl Polski The following symbols may appear on the product labeling: / Na štítku výrobku mohou být uvedeny následující symboly: / Τα ακόλουθα σύμβολα ενδέχεται να εμφανίζονται στην επισήμανση του προϊόντος: / Na etykietach produktu mogą pojawiać się poniższe symbole: Symbol Definition En: In vitro diagnostic medical device Cz: Zdravotnický prostředek pro in vitro diagnostiku El: In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή Pl: Sprzęt do medycznej diagnostyki in vitro En: Catalog Number Cz: Katalogové číslo El: Αριθμός καταλόγου Pl: Numer katalogowy En: Manufacturer Cz: Výrobce El: Κατασκευαστής Pl: Producent Symbol Definition En: Authorized Representative in the European Community Cz: Autorizované zastoupení v Evropské unii El: Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Pl: Autoryzowany przedstawiciel w Unii Europejskiej En: CE Mark Cz: CE značka El: Σήμανση CE Pl: Znak CE En: CE Mark with identification number of notified body Cz: CE značka s identifikačním číslem notifikovaného orgánu El: Σήμανση CE με αριθμό αναγνώρισης του φορέα πιστοποίησης Pl: Znak CE z numerem identyfikacyjnym jednostki notyfikowanej En: Consult instructions for use Cz: Postupujte podle návodu k použití El: Συμβουλευτείτε τις οδηγίες λειτουργίας Pl: Zapoznać się z instrukcją użycia En: Caution! Potential Biohazard Cz: Pozor! Potenciální biohazard El: Πρoσοχή! Δυνητικός βιολογικός κίνδυνος Pl: Uwaga! Potencjalne zagrożenie biologiczne En: Temperature limitation (2 8 C) Cz: Teplotní rozsah (2 8 C) El: Περιορισμός θερμοκρασίας (2 8 C) Pl: Zakres temperatury (2 8 C) En: Upper limit of temperature ( -20 C) Cz: Horní teplotní limit ( -20 C) El: Ανώτερο όριο θερμοκρασίας ( -20 C) Pl: Górny zakres temperatury ( -20 C) En: Lower limit of temperature ( 2 C) Cz: Spodní teplotní limit ( 2 C) El: Κατώτερο όριο θερμοκρασίας ( 2 C) Pl: Dolny zakres temperatury ( 2 C) 22 IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08)

LOT Symbol Definition En: Do not freeze (> 0 C) Cz: Nezmrazovat (> 0 C) El: Μην καταψυχετε (> 0 C) Pl: Nie zamrażać (> 0 C) En: Do not reuse Cz: Pro jednorázové použití El: Μην κάνετε επαναληπτική χρήση Pl: Nie używać powtórnie En: Keep away from sunlight Cz: Chraňte před slunečním světlem El: Διατηρείτε μακριά από το ηλιακό φως Pl: Chronić przed światłem słonecznym En: Batch code Cz: Šarže El: Κωδικός παρτίδας Pl: Kod serii En: Contains sufficient for (n) tests Cz: Dostatečné množství pro (n) testů El: Περιεχόμενο επαρκές για (n) εξετάσεις Pl: Zawartość wystarczająca na (n) testów 2008-01 En: Date format (year-month) Cz: Formát data (rok-měsíc) El: Μορφή ημερομηνίας (έτος-μήνας) Pl: Zapis daty (rok-miesiąc) En: Use by Cz: Spotřebujte do El: Ημερομηνία λήξης Pl: Wykorzystać do En: Harmful Cz: Škodlivé El: Επιβλαβές Pl: Szkodliwy lub drażniący En: Corrosive Cz: Korozivní El: Διαβρωτικό Pl: Żrący BEAD PACK TEST UNIT REAG WEDGE REAG WEDGE A REAG WEDGE B REAG WEDGE D ADJUSTOR ADJUSTOR L ADJUSTOR H ADJUSTOR AB Symbol Definition En: Dangerous for the environment Cz: Nebezpečné pro životní prostředí El: Επικίνδυνο για το περιβάλλον Pl: Niebezpieczny dla środowiska En: Bead Pack Cz: Zásobník s kuličkami El: Συσκευασία σφαιριδίων Pl: Pojemnik z kulkami En: Test Unit Cz: Testovací Jednotky El: Μονάδες ανάλυσης Pl: Jednostki testowe En: Reagent Wedge Cz: Reagencie El: Δοχείο Αντιδραστηρίων Pl: Klin odczynnikowy En: Adjustor Cz: Kalibrátor El: Ρυθμιστής Pl: Kalibrator En: Adjustor, low Cz: Kalibrátor, nízký El: Ρυθμιστής, χαμηλό Pl: Kalibrator, niski En: Adjustor, high Cz: Kalibrátor, vysoký El: Ρυθμιστής, υψηλό Pl: Kalibrator, wysoki En: Adjustor Antibody Cz: Protilátka proti kalibrátoru El: Ρυθμιστής αντισώματος Pl: Przeciwciało Kalibratora En: Toxic Cz: Toxické El: Τοξικό Pl: Toksyczny DIL En: Sample Diluent Cz: Diluent Vzorků El: Αραιωτικό δείγματος Pl: Rozcieńczalnik próbek IMMULITE 2000 Homocysteine (PIEL2KHO-3 {21}, 2013-02-08) 23