Για διαγνωστική χρήση in vitro

ΙΣΚΟΙ ΓΙΑ ΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΤΩΝ ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΩΝ ΣΕ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΣΙΑΚΟΥΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΣΕΤΑ 50 ΙΣΚΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΤΟΥ ΕΙ ΟΥΣ CANDIDA ΣΕ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΣΙΑΚΟΥΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΡΙΑΖΟΛΗΣ (ΦΛΟΥΚΟΝΑΖΟΛΗ, ΒΟΡΙΚΟΝΑΖΟΛΗ) Για διαγνωστική χρήση in vitro 1-ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Οι δίσκοι αυτοί χρησιµοποιούνται για τον προσδιορισµό της ευαισθησίας του είδους Candida σε αντιµυκητισιακούς παράγοντες τριαζόλης (φλουκοναζόλη, βορικοναζόλη) µε τη δοκιµή διάχυσης σε δίσκο. Η µέθοδος αυτή ακολουθεί µια πρότυπη διαδικασία που δηµοσιεύτηκε από το CLSI/NCCLS(1) Τα πιο πρόσφατα έγγραφα του CLSI/NCCLS θα πρέπει να χρησιµοποιούνται ως καθοδήγηση κατά την εκτέλεση της δοκιµής διάχυσης σε δίσκους και την ερµηνεία της. 2-ΑΡΧΗ Χάρτινοι δίσκοι εµποτισµένοι µε καθορισµένη συγκέντρωση αντιµυκητισιακού παράγοντα τοποθετούνται στην επιφάνεια άγαρ MHGMB (άγαρ Mueller Hinton +2% γλυκόζη και 0,5µg/ml κυανό του µεθυλενίου) το οποίο έχει προηγουµένως υποβληθεί σε ενοφθαλµισµό µε βαθµονοµηµένο ενοφθάλµισµα από καθαρή καλλιέργεια των προς εξέταση ζυµοµυκήτων. Η συγκέντρωση του αντιµυκητισιακού παράγοντα εµφανίζεται σε βαθµιδώσεις γύρω από τους δίσκους που τοποθετούνται στο άγαρ. Μετά την επώαση, η διάµετρος των ζωνών αναστολής που παρατηρούνται γύρω από τους δίσκους χρησιµοποιείται για τον υπολογισµό της Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης (MIC) των διαφόρων αντιµυκητισιακών παραγόντων (φλουκοναζόλη, βορικοναζόλη) στο στέλεχος που εξετάστηκε και των κατηγοριών ερµηνείας: Ανθεκτικό (R), Ευαίσθητο-Εξαρτώµενο από δόση (S-DD), Ευαίσθητο (S). 3-ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Οι δίσκοι, οι οποίοι πρέπει να είναι από ψηλής ποιότητας απορροφητικό χαρτί, έχουν διάµετρο 6,5 mm και εµποτίζονται µε αντιµυκητισιακούς παράγοντες σε συγκεκριµένες συγκεντρώσεις. Οι δίσκοι αυτοί αναγνωρίζονται εύκολα από ένα σύµβολο που περιλαµβάνει 3 γράµµατα και στη συνέχεια το περιεχόµενο του δίσκου που εκφράζεται σε µg. Τα στοιχεία αυτά αναγράφονται σε κάθε πλευρά του δίσκου (Πίνακας 1). Οι δίσκοι της Bio-Rad κυκλοφορούν σε κασέτες των 50 τεµαχίων συσκευασµένες σε σφραγισµένους περιέκτες µε αποξηραντικό υλικό. Πίνακας 1 ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΣΙΑΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΙΣΚΩΝ ΣΥΜΒΟΛΟ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ ΑΡΙΘΜΟΣ ΠΑΡΑΓΓΕΛΙΑΣ Φλουκοναζόλη 25 µg FCA25 1 x 50 δίσκοι 62802 Βορικοναζόλη 1 µg VCZ1 1 x 50 δίσκοι 62803

4-ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Η ηµεροµηνία λήξης ισχύει µόνο για δίσκους σε άθικτες κασέτες που αποθηκεύονται σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ηµεροµηνία λήξης και ο αριθµός παρτίδας αναγράφονται σε κάθε συσκευασία (κασέτα και περιέκτη). Οι κασέτες των δίσκων θα πρέπει να αποθηκεύονται στον περιέκτη τους σε θερµοκρασία µεταξύ 2 και + 8 C σε ξηρό µέρος. Αφήστε τις κασέτες να αποκτήσουν θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C) πριν τις ανοίξετε. Όταν χρησιµοποιήσετε τους δίσκους, τοποθετήστε ξανά τις µη χρησιµοποιηµένες κασέτες σε θερµοκρασία µεταξύ + 2 και + 8 C. Μη χρησιµοποιείτε τους δίσκους µετά το πέρας της αναγραφόµενης ηµεροµηνίας λήξης. Αν οι κασέτες αποθηκευτούν στο διανεµητή µετά τη χρήση, ο διανεµητής πρέπει να αποθηκευτεί στους + 2-8 C σε ξηρό µέρος µε αποξηραντικά υλικά. Η σταθερότητα των δίσκων που προέρχονται από ανοικτές κασέτες και τοποθετούνται σε διανεµητές επαληθεύτηκε υπό συνθήκες ρουτίνας για 6 εβδοµάδες. 5-ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ διανεµητής δίσκων: 6 δίσκων-κωδικός 50271, 8 δίσκων-κωδικός 50270, 12-16 δίσκων-κωδικός 50295 µέσο καλλιέργειας MHGMB (Mueller Hinton +2% γλυκόζη και 0,5µg/ml κυανό του µεθυλενίου) µέσο καλλιέργειας: άγαρ Sabouraud (κωδικός 56519), άγαρ Sabouraud µε χλωραµφενικόλη και γενταµικίνη (κωδικός 63774) βρόχος ενοφθαλµίσµατος πιπέτες Pasteur ορός ελέγχου θολερότητας 0,5 στην κλίµακα McFarland στελέχη µύκητα για ποιοτικό έλεγχο φούρνος σε θερµοκρασία 35 C +/- 2 C εργαστηριακό υλικό απαραίτητο για τον έλεγχο της ευαισθησίας σε αντιµυκητισιακούς παράγοντες µε δοκιµή διάχυσης σε δίσκο 6-ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ Για τη διεξαγωγή της δοκιµής διάχυσης σε δίσκο, ακολουθήστε τις ισχύουσες κατευθυντήριες οδηγίες (CLSI/NCCLS). Όλες οι δοκιµές θα πρέπει να διεξάγονται µε τις τεχνικές και τα µέτρα προφύλαξης που συνιστώνται για την προστασία από µικροβιολογικούς κινδύνους. Μετά τη χρήση, αποστειρώνετε τις καλλιέργειες και όλα τα µολυσµένα υλικά. 7- ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ α) Μέσο καλλιέργειας Η µέθοδος αναφοράς M44-A του CLSI/NCCLS συνιστά τη χρήση άγαρ MHGMB: Άγαρ Mueller-Hinton µε 2% γλυκόζη και 0,5µg/ml κυανό του µεθυλενίου. Μετά την προετοιµασία του συγκεκριµένου µέσου καλλιέργειας όπως περιγράφεται στην κατευθυντήρια οδηγία του CLSI, διοχετεύστε 25 ml από το µέσο σε ένα στρόγγυλο τριβλίο Petri διαµέτρου 90 mm ή 60 ml από το µέσο σε ένα τετράγωνο τριβλίο Petri 120 mm. Μετά τη στερεοποίηση και πριν από τη χρήση, στεγνώστε για 15 λεπτά στους 37. β) Ενοφθάλµισµα Προετοιµάστε ένα πρότυπο ενοφθάλµισµα 0,5 στην κλίµακα McFarland από καθαρή καλλιέργεια του είδους Candida 24 ωρών, που έχει ληφθεί από υποκαλλιέργεια σε άγαρ Sabouraud ή άγαρ Sabouraud µε χλωραµφενικόλη και γενταµικίνη. Το ενοφθάλµισµα προετοιµάζεται µε τη συλλογή 5 µεµονωµένων αποικιών διαµέτρου 1mm περίπου. Οι αποικίες εναιωρούνται σε αποστειρωµένο φυσιολογικό ορό. Το εναιώρηµα που προκύπτει στροβιλίζεται και η θολερότητά του προσαρµόζεται µε την προσθήκη επαρκούς ποσότητας αποστειρωµένου φυσιολογικού ορού ή επιπλέον αποικιών, ώστε η διαπερατότητα να αντιστοιχεί σε εκείνη που προκύπτει από ένα πρότυπο McFarland 0,5.

γ) Ενοφθαλµισµός των δοκιµαστικών πλακών Εντός 15 λεπτών µετά την προσαρµογή της θολερότητας του εναιωρήµατος ενοφθαλµίσµατος, βυθίστε ένα τολύπιο βάµβακος στο εναιώρηµα. Θα πρέπει να περιστρέψετε πολλές φορές το τολύπιο βάµβακος και να το πιέσετε σταθερά στο τοίχωµα του σωληναρίου πάνω από τη στάθµη του υγρού. Η στεγνή επιφάνεια της αποστειρωµένης πλάκας άγαρ Mueller-Hinton +GMB υποβάλλεται σε ενοφθαλµισµό µε επάλειψη ολόκληρης της επιφάνειας του άγαρ µε το τολυπίο βάµβακος. Η διαδικασία αυτή επαναλαµβάνεται άλλες δύο φορές, µε περιστροφή της πλάκας περίπου κατά 60 κάθε φορά για να διασφαλιστεί η οµοιόµορφη κατανοµή του ενοφθαλµίσµατος. Τέλος, επαλείφεται η άκρη της πλάκας άγαρ µε το τολύπιο βάµβακος. Το καπάκι µπορεί να µείνει ελαφρώς ανοικτό για 3 έως 5 λεπτά, αλλά όχι για περισσότερο από 15 λεπτά, για να απορροφηθεί τυχόν πλεονάζουσα υγρασία της επιφάνειας, πριν από την τοποθέτηση των δίσκων αντιµυκητισιακών παραγόντων. δ) Τοποθέτηση των δίσκων σε πλάκες άγαρ που έχουν υποβληθεί σε ενοφθαλµισµό Οι δίσκοι αντιµυκητισιακών παραγόντων τοποθετούνται στην επιφάνεια της πλάκας άγαρ που έχει υποβληθεί σε ενοφθαλµισµό χρησιµοποιώντας το διανεµητή δίσκων (δεν πρέπει να τοποθετούνται περισσότεροι από 6 δίσκοι σε µια στρόγγυλη πλάκα 90 mm ή περισσότεροι από 9 δίσκοι σε µια τετράγωνη πλάκα 120 mm). ε) Επώαση Οι πλάκες τοποθετούνται σε επωαστήρα ρυθµισµένο στους 35 C +/- 2 C εντός 15 λεπτών µετά την τοποθέτηση των δίσκων. Η περίοδος επώασης είναι 24 ώρες. Εικόνα 1 στ) Ανάγνωση πλακών και ερµηνεία αποτελεσµάτων Μετρήστε τη διάµετρο των ζωνών αναστολής µετά από επώαση 24 ωρών. Η πλάκα βρίσκεται µερικές ίντσες πάνω µη αντανακλαστικό φόντο µαύρου χρώµατος που φωτίζεται µε αντανακλαστικό φως. Όταν διαπιστωθεί επαρκής ανάπτυξη µετά από επώαση 24 ωρών, επωάστε εκ νέου την πλάκα για άλλες 24 ώρες και προχωρήστε στην ανάγνωση σε 48 ώρες. Οι διάµετροι των ζωνών αναστολής θα πρέπει να µετρώνται έως τις αποικίες κανονικού µεγέθους (Εικόνα 1). Συχνά συναντώνται σηµειακές αποικίες στην άκρη της ζώνης ή µεγάλες αποικίες σε µια ζώνη, οι οποίες θα πρέπει να αγνοούνται. Οι αποικίες αυτές δεν αντιστοιχούν σε ανθεκτικά µεταλλαγµένα στελέχη. ζ) Σηµειώσεις είγµατα: οι δίσκοι αντιµυκητισιακών παραγόντων δεν θα πρέπει να χρησιµοποιούνται για τη διεξαγωγή της δοκιµής διάχυσης σε δίσκο απευθείας σε βιολογικά δείγµατα. Θα πρέπει να εφαρµόζονται πάντα οι ορθές εργαστηριακές πρακτικές.

8-ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΟΚΙΜΗΣ ΙΑΧΥΣΗΣ ΣΕ ΙΣΚΟ Μετρήστε µε ακρίβεια τη διάµετρο της ζώνης αναστολής. Η αντιστοιχία µεταξύ της διαµέτρου της ζώνης αναστολής, της Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης (MIC) και των κατηγοριών ερµηνείας: Ανθεκτικό (R), Ευαίσθητο-Εξαρτώµενο από δόση (S-DD), Ευαίσθητο (S) συνοψίζεται στον ακόλουθο πίνακα: Κωδικός Αντιµυκητισιακός παράγοντας Περιεχόµενο δίσκων Σύµβολο ιάµετρος της ζώνης αναστολής (mm)* Ισοδύναµα σηµεία βαθµονόµησης MIC (µg/ml)* R S-DD S R S-DD S 62802 Φλουκοναζόλη 25 µg FCA 25 14 15 18 19 64 16 32 8 62803 Βορικοναζόλη 1 µg VCZ 1 13 14 16 17 4 2 1 *Φλουκοναζόλη: Οδηγίες CLSI/NCCLS M44-A(1) Βορικοναζόλη: Παγκόσµια µελέτη παρακολούθησης αντιµυκητισιακών παραγόντων Artemis (3) 9-ΑΠΟ ΟΣΗ / ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Ο ακόλουθος πίνακας παρουσιάζει τις συνιστώµενες τιµές διαµέτρου (mm) ζωνών ποιοτικού ελέγχου που προέκυψαν από τη δοκιµή διάχυσης σε δίσκο για τα στελέχη ποιοτικού ελέγχου που αναφέρονται παρακάτω (1): Κωδικός Αντιµυκητισιακός παράγοντας Περιεχόµενο δίσκων Σύµβολο C. albicans ATCC 90028 C. parapsilosis ATCC 22019 C. tropicalis ATCC 750 C. krusei ATCC 6258 62802 Φλουκοναζόλη 25 µg FCA 25 28 39 22 33 26 37 62803 Βορικοναζόλη 1 µg VCZ 1 31 42 28 37 16 25 10- ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα προϊόντα που παρασκευάζονται και διατίθενται από τη Bio-Rad υποβάλλονται σε έλεγχο από το σύστηµα διασφάλισης ποιότητας, από την παραλαβή των πρώτων υλών µέχρι τη διάθεση των έτοιµων προϊόντων στην αγορά. Κάθε παρτίδα έτοιµου προϊόντος υποβάλλεται σε δοκιµές ποιοτικού ελέγχου και διατίθεται στην αγορά µόνο εφόσον πληροί όλα τα κριτήρια αποδοχής. Ο κατασκευαστής διατηρεί αρχεία σχετικά µε την παραγωγή και τους ποιοτικούς ελέγχους για κάθε παρτίδα. 11-ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Η απόδοση της δοκιµής εξαρτάται όχι µόνο από τη δραστηριότητα των δίσκων, αλλά και από άλλους παράγοντες όπως η χρήση πρότυπου ενοφθαλµίσµατος, κατάλληλων στελεχών ποιοτικού ελέγχου, κατάλληλων µέσων καλλιέργειας που έχουν εξεταστεί εκ των προτέρων και η σωστή θερµοκρασία αποθήκευσης των δίσκων.

12-ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts ; Approved Guideline, M44-A, Vol. 24 N 15, NCCLS, May 2004. 2. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts ; Approved Standard-Second Edition, M27-A2, Vol. 22 N.15, NCCLS, August 2002. 3. M.A. Pfaller, D.J. Diekema, M.G. Rinaldi, R. Barnes, B. Hu, A.V. Veselov, N. Tiraboshi, E. Nagy, D.L. Gibbs, and the Global Antifungal Surveillance Group. 2005. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study : a 6.5- Year Analysis of Susceptibilities of Candida and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole by Standardized Disk Diffusion Testing. J. Clin. Microbiol. 43 p. 5848-5859. 4. M.A. Pfaller, D.J. Diekema, J.H. Rex, A. Espinel-Ingroff, E.M. Johnson, D. Andes, V. Chaturvedi, M.A Ghannoum, F.C. Odds, M.G. Rinaldi, D.J. Sheehan, P. Troke, T.J. Walsh, and D.W. Warnock. 2006. Correlation of MIC with Outcome for Candida Species Tested against Voriconazole ; Analysis and Proposal for Interpretive Breakpoints. J.Clin. Microbiol. 44 : p. 819-826. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 06/2006