Έλεγχος αντοχής βλαστομυκήτων και νηματοειδών μυκήτων κατά EUCAST

Transcript

1 Ημερίδα ΕΚΜΕΔ 2019 Έλεγχος αντοχής βλαστομυκήτων και νηματοειδών μυκήτων κατά EUCAST Ιωσήφ Μελετιάδης, PhD, FECMM Επικ. Καθηγητής Μικροβιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο «Αττικόν», Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τηλ: ,

2 Ανακάλυψη νέων φαρμάκων Turner et al. Expert Opin Emerg Drugs. 2006;11(2): Maertens et al. Curr Med Chem-Anti-infective Agents. 2002;1: Γιατί πρέπει να ελέγχουμε την ευαισθησία των μυκήτων? Διαφορετικά προφίλ ευαισθησίας - μεταξύ στελεχών, μεταξύ ειδών Μεταβαλλόμενη επιδημιολογία λοιμώξεων - νέα είδη με ενδογενή αντοχή - επίκτητη αντοχή ευαίσθητων ειδών Πρόβλεψη κλινικού αποτελέσματος Πολλά φάρμακα περισσότερες επιλογές -Βελτιστοποίηση θεραπείας

3 Αντιμυκητιασικά φάρμακα Σιδηροφόρος VL-2397 Atlas of fungal Infections, Richard Diamond Ed Introduction to Medical Mycology. Merck and Co Κυτταρική μεμβράνη (εργοστερόλη) - Πολυένια à αμφοτερικίνη Β - Αζόλες à φλουκοναζόλη, ιτρακοναζόλη, ποσακοναζόλη βορικοναζόλη ισαβουκοναζόλη Νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA) - 5-φθοριοκυτοσίνη Κυτταρικό τοίχωμα (β-d-glucan συνθετάση) Εχινοκανδίνες à κασποφουγκίνη ανιντουλαφουγκίνη μικαφουγκίνη Olorofim (F901318) Rezafungin (CD101) Ibrexafungerp (SCY078)

4 Μέθοδοι αναφοράς κατά EUCAST - E.def. 7.3 Broth microdilution for yeasts - E.def. 9.3 Broth microdilution for moulds - E.Def Agar screening method for azole resistance in Aspergillus fumigatus

5 EUCAST μέθοδος για ζυμομύκητες E.DEF 7.3: Method for the determination of broth dilution of antifungal agents for fermentative yeasts Μικροπλάκεςμε επίπεδο πυθμένα RPMI με 2% glucose και MOPS Διαλύτης φαρμάκων= DMSO (0.5% τελικό) x10 5 κονίδια/ml (1/10 0.5McFarlαnd) Επώαση στους 35±2 o C (30 ο C Cryptococcus) 24h με OD 0.2 Φωτομετρικά AMB=90% αναστολή ανάπτυξης Λοιπά φάρμακα=50% αναστολή ανάπτυξης * Διαφορές από CLSI

6 Πρότυπη μέθοδος μικροαραιώσεων σε ζωμό για υφομύκητες κατά EUCAST Πρωτόκολλο EUCAST E.Def 9.3 Τύπος μικροπλάκας Θρεπτικό μέσο 96-βοθρίων με επίπεδο πυθμένα RPMI1640+ MOPS ph % γλυκόζη Διαλύτης DMSO, 0.5% Θερμοκρασία Εναιώρημα (CFU/ml) Επώαση Ανάγνωση ο C 0.1% Tween20, Αιμοκυτ/μετρο (Θολερότητα για Aspegillus) x h για Zygomycetes 48h για Aspergillus και λοιπούς υφομύκητες 72h για Scedosporium Οπτική (φωτομετρικά) Αν >5% υφές, φιλτράρισμα MIC Endpoints- % αναστολής 100% (AMB, και αζόλες), MEC (εχινοκανδίνες )

7 Οπτική ανάγνωση μικροπλακών μεθοδολογία EUCAST Low High Χρήση ασπρόμαυρου χαρτιού MB ANI OR ITR Μικροσκοπική παρατήρηση FLU ON < EUCAST E.DEF. 9.3 Growth control ANI 0.06mg/l

8 Φωτομετρική ανάγνωση μικροπλακών μεθοδολογία EUCAST για Aspergillus spp. Απορρόφηση στα 490nm Ποσοστά ανάπτυξης Endpoints: <5-10% απορρόφηση OD 490 Συμφωνία: 92-99% με την οπτική ανάγνωση Σφάλματα: 0% πολύ μεγάλα (VME), <3% μεγάλα (ME) <6% μικρά (MiE) Meletiadis et al, CMI 2016

9 Πρότυπα στελέχη για εσωτερικό έλεγχο ποιότητας

10 Κλινικά όρια ευαισθησίας κατά EUCAST Azoles Echinocandins Candida spp. (S: X; R: >Y ) Aspergillus spp. (S: X; R: >Y ) AMB 1; >1 1; >2 (fum, nig) ANF 0.032; >0.032 (alb) ; >0.06 (glab, krus, trop) 0.002; >4 (para)(guillier IE) CSF - - CSF S αν ΑΝF και MFG S MFG 0.016; >0.016 (alb) 0.03; >0.03 (glab) 0.002; >2 (para) IE (trop, krus, guillier) Fluco 2; >4 (alb, trop, para) 0.002; >32 (glab) (krus poor target) Vori 0.125; >0.125 (alb, trop, para) IE (glab/krus) Itra 0.06 >0.06 (alb, dubl) >0.125 (lus, para, trop) (glab/krus IE) Posa 0.06; >0.06 (alb, trop, para) - Not a good target 1; >2 (fum) 1; >2 (fum, flav, nid, ter) >0.25 (fum, ter) IE (glab/krus) Isa - 1 >1 (fum, ter) 0.25 >0.25 (nid)

11 Επιδημιολογικά όρια ευαισθησίας ποσακοναζόλης έναντι A. fumigatus Άγριου τύπου (WT) Μη άγριου τύπου (NWT) ECΟFF S I R Posaconazole MIC (mg/l) à Κλινικά όρια ευαισθησίας Espinel-Ingroff AAC 2018

12 Αναθεώρηση ορισμών EUCAST Η ενδιάμεση ευαισθησία «I» σήμαινε: Μειωμένη ευαισθησία που μπορεί να ξεπεραστεί με αυξημένες συγκεντρώσεις φαρμάκου στην εστία της λοίμωξης Ουδέτερη ζώνη (buffer zone) για την αποφυγή ME και VME σφαλμάτων Ευαισθησία σε αυξημένη έκθεση (ΕΑΕ) Susceptible Increased exposure (Ι) Περιοχή τεχνικής αβεβαιότητας (ΠΤΑ) Area of Technical Uncertainty (ATU)

13 Εφαρμογή νέων ορισμών στα αντιμυκητιακά φάρμακα Ø Candida και φλουκοναζόλη Ι C. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis (4 mg/l) C. glabrata ( 32 mg/l) Ø Aspergillus και αζόλες Ι βορικοναζόλη (2 mg/l) Ιτρακοναζόλη (2 mg/l) ποσακοναζόλη (0.25 mg/l) ισαβουναζόλη(à2 mg/l) Αύξηση δόσης σε 12 mg/kg TDM mg/l >0.5-1 >1-1.5 mg/l 2-6 mg/l (?) Ø Amphotericin B και εχινοκανδίνες Χωρίς κατηγορία I

14 Μέθοδος διάλυσης σε άγαρ κατά EUCAST Ø Απλή διαδικασία για αζόλες και Aspergillus - Ενοφθαλμισμός 25μλ κονιδίων 0.5 McFarland Ø Γρήγορο αποτέλεσμα - Επώαση στους o C για 48 ώρες (ανάπτυξη στις 24hàαντοχή) Ø Εύκολη ανάγνωση -Οπτική παρατήρηση για παρουσία ανάπτυξης κάθε βαθμού - 86% 99% συμφωνία μεταξύ παρατηρητών και κέντρων ü Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα 99% (95% 100%) στην ανίχνευση ανθεκτικών στελεχών μόνο με έλεγχο σε ITC/VRC -δυνατότητα ενσωμάτωσης 3 ου φαρμάκου ü Ανίχνευση αντοχής μικτών αποικιών 5S:1R A. fumigatus G54W ITC 4 mg/l POS 0.5 mg/l VRC 2 mg/l Control A. fumigatus TR34/L98H ITC 4 mg/l POS 0.5 mg/l VRC 2 mg/l Control Arendrup et al JAC 2018

15 Εμπορικά τεστ ευαισθησίας ü Μικροαραιώσεις σε ζωμό (με ή χωρίς δείκτες) Sensititre YeastOne (FDA approved) ATB fungus, SensiQuatro, Fungitest, Candifast, Micronaut, ü Διάχυση σε άγαρ (δισκία, ταινίες) Etest (FDA approved), MIC test strips NeoSensitab ü Αυτόματα συστήματα Vitek2 (FDA approved)

16 Vitek AST-YS06 και Candida 154 κλινικά στελέχη 4 ΑΜΒ R, 18 FC R, 85 FLC R, 57 VRC R Αποτελέσματα σε 14-18h for Candida 34 h for C. neoformans Συμφωνία (±2 διαλύσεις) Κατηγορική συμφωνία 3-4διαλ.>4διαλ. 98 στελέχη Candida 31 FKS μεταλλάξεις Cuenca-Estrella AAC 2010 Vitek Vitek 94% συμφωνία 19.4% VME 2 1 CLSI EUCAST 99% συμφωνία Caspofungin MIC Caspofungin MIC 3.3% VME Astvad AAC 2013

17 Κλινικά όρια ευαισθησίας εχινοκανδινών με Sensititre YeastOne Μεγαλύτερη συµφωνία µε τα κλινικά όρια της CLSI (100%) από ότι µε τα κλινικά όρια της EUCAST (93-97%) Aigner et al AAC 2018

18 Συμπεράσματα ü Οι πρότυπες μεθοδολογίες απαιτούν μεγάλη εξειδίκευση και εμπειρία για την εφαρμογή τους -Οι πρότυπες γρήγορες δοκιμασίες ανίχvευσης αντοχής (screening test) είναι πιο εύκολα εφαρμόσιμες ü Κλινικά όρια ευαισθησίας υπάρχουν μόνο για συγκεκριμένα φάρμακα και είδη Candida και Aspergillus ü Για τα υπόλοιπα είδη και φάρμακα δεν μπορεί να γίνει κλινική αξιολόγηση της ευαισθησίας παρά μόνο η κατηγοριοποίησή τους σε άγριου τύπου και μη άγριου τύπου με βάση επιδημιολογικά όρια ευαισθησίας Μη άγριου τύπου στέλεχος Στέλεχος με φαινοτυπικά ανιχνεύσιμη αντοχήà R Άγριου τύπου Στέλεχος χωρίς φαινοτυπικά ανιχνεύσιμη αντοχή à S ή R Χρήση κλινικών ορίων ευαισθησίας για παρόμοια είδη Candida ή Aspergillus ü Προσοχή στην εφαρμογή κλινικών ορίων ευαισθησίας κατά EUCAST σε εμπορικά τεστ που δεν δίνουν παρόμοιες τιμές MIC

19 Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο «Αττικόν»