Μαρία Τσοπανοµίχαλου PhD. Μοριακής Βιολογίας ΝΕΕΣ Κοργιαλένειο Μπενάκειο
Καταφεύγουµε στις µοριακές τεχνικές Συλλέγουµε το δείγµα για µοριακές τεχνικές
ιάσπαση ιστικών δοµών ιαχωρισµός των κυττάρων ιάσπαση των κυτταρικών µεµβρανών ιάσπαση των πυρηνικών µεµβρανών Αποµόνωση πρωτεϊνών, DNA, RNA συνολικά ή κλασµατικά
DNA genomics RNA transcriptomics Πρωτεΐνη πρωτεΐνες proteomics
genomics
genomics
genomics
οριζόντια κάθετη
genomics
genomics
Μέτρηση Απορρόφησης στα 260nm και 280nm (ratio A 260/280 ) Καθαρό DNA ~1.8 Καθαρό RNA ~2.0 % νουκλεϊκό οξύ % πρωτεΐνη A 260/280 100 0 2.00 95 5 1.99 90 10 1.98 70 30 1.94 ΟΠΤΙΚΗ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ (OD): 1OD=50µgr/ml dsdna genomics
genomics
genomics
ΜΕΓΑΛΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΜΕΤΑΘΕΣΕΙΣ ΕΛΛΕΙΨΕΙΣ ΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟΙ Μέθοδοι ανίχνευσης ΙΝ SITU ΥΒΡΙ ΙΣΜΟΣ SOUTHERN BLOT PCR ΜΙΚΡΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ genomics ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ Μέθοδοι ανίχνευσης PCR Sequencing
genomics
genomics
genomics
genomics
genomics
genomics
transcriptomics
transcriptomics
ΑΛΛΑΓΕΣ ΕΠΙΠΕ ΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Που οφείλονται σε αλλαγές του DNA ΑΥΞΗΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΜΕΙΩΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Μέθοδοι ανίχνευσης NORTHERN BLOT qpcr Που δεν οφείλονται σε αλλαγές του DNA transcriptomics
transcriptomics
transcriptomics
transcriptomics
transcriptomics
transcriptomics
in situ hybridization PCR, qpcr υνατότητα ανίχνευσης ιών υνατότητα ανίχνευσης DNA, RNA υνατότητα ανίχνευσης µεταθέσεων υνατότητα ανίχνευσης µεταλλάξεων υνατότητα ιών ανίχνευσης υνατότητα ανίχνευσης DNA, RNA υνατότητα ανίχνευσης µεταθέσεων υνατότητα µεταλλάξεων ανίχνευσης
in situ hybridization PCR, qpcr Ανίχνευση µεταθέσεων, ελλείψεων, διπλασιασµό σχετικά µεγάλων τµηµάτων DNA Ανίχνευση µεταθέσεων, ελλείψεων, διπλασιασµό και µικρών τµηµάτων DNA Ηµι-ποσοτική εκτίµηση ιατήρηση της δοµής Ηµι-ποσοτική και απόλυτη εκτίµηση Εκχύλιση συστατικών συνολικά και κλασµατικά
in situ hybridization PCR, qpcr Ελάχιστη απαιτούµενη ποσότητα DNA 10 mg (10-3 g) καθαρού DNA εν επηρεάζεται από την παρουσία παραφίνης Χρόνος πειράµατος 4-24h Ελάχιστη απαιτούµενη ποσότητα DNA 200 ng (200 X10-9 g) καθαρού DNA Ιδιαίτερα ευαίσθητα στην παρουσία αναστολέων Χρόνος πειράµατος 2-3h
Η PCR ως µεθοδολογία είναι δυσκολότερη τεχνικά αλλά µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε µικρές ποσότητες DNA/RNA και να ανιχνεύσει σηµειακές µεταλλαγές
proteomics
proteomics
proteomics
proteomics
ΑΛΛΑΓΕΣ ΠΟΣΟΤΗΤΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ Που οφείλονται σε αλλαγές του DNA ΑΥΞΗΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΜΕΙΩΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗς Μέθοδοι ανίχνευσης WESTERN BLOT ELISA MASS SPECTROMETRY 2D SDS PAGE Που οφείλονται σε αλλαγές του RNA Που δεν οφείλονται σε αλλαγές του DNA Που δεν οφείλονται σε αλλαγές του RNA proteomics
ΑΛΛΑΓΕΣ ΠΡΟΣ ΕΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΤΗΤΑΣ ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ (π.χ φωσφορυλιώση, µεθυλίωση) Μέθοδοι ανίχνευσης WESTERN BLOT MASS SPECTROMETRY 2D SDS PAGE ELISA proteomics
proteomics
proteomics
proteomics
proteomics
proteomics
proteomics
ΑΝΟΣΟΙΣΤΟΧΗΜΕΙΑ ιατήρηση της δοµής WESTERN BLOT, SDS PAGE, ELISA Μη διατήρηση της δοµής Συσχέτιση έκφρασης πρωτεϊνών µε δοµή Συσχέτιση έκφρασης πρωτεϊνών µε λειτουργικότητα Μη ακριβής ποσοτικοποίηση Ακριβής ποσοτικοποίηση
Καθαρότητα δείγµατος Αποστειρωµένες συνθήκες Απουσία καταστροφικών ενζύµων (Dnase, Rnase, πρωτεάσες) Μέθοδοι ορισµού του κατώτερου επιπέδου ανίχνευσης Μέθοδος ορισµού ειδικότητας αντίδρασης Ποσοστό καρκινικών/ φυσιολογικών κυττάρων δυνατότητα ανίχνευσης 1 µεταλλαγµένου κυττάρου µεταξύ 2.5 10 3 wild-type alleles
Λήψη δείγµατος µε καθαρά (ει δυνατόν αποστειρωµένα) εργαλεία και τοποθέτηση σε αποστειρωµένα φιαλίδια. Αν υπάρχει ένδειξη για χρήση µοριακών τεχνικών όχι έγκλειση σε παραφίνη. Φύλαξη σε -20 ο C για βραχύχρονη φύλαξη. Φύλαξη σε -70 ο C για µακρόχρονη φύλαξη. Φύλαξη περισσότερων του ενός φιαλιδίου ΌΧΙ ΠΑΓΩΜΑ ΚΑΙ ΞΕΠΑΓΩΜΑ.
Λήψη αµιγών ιστικών δειγµάτων (π.χ.αµιγής καρκίνος ή µικρό ποσοστό φυσιολογικών κυττάρων). Συγκεκριµένο ζητούµενο άρα συγκεκριµένη τεχνική Συγκεκριµένο ζητούµενο άρα συγκεκριµένη τεχνική προσέγγιση
Milbury CA, Li J, Makrigiorgos GM. PCR-Based Methods for the Enrichment of minority Alleles and Mutations. Clin Chem. 2009 April ; 55(4): 632 640. Anne-Claude Gingras AC, Matthias Gstaiger M, Brian Raught B, Aebersold R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 645-654 (August 2007) Netto GI, Saad RD, Dysert DA. Diagnostic molecular pathology: current techniques and clinical applications, part I. BUMC PROCEEDINGS 2003;16:379 383 Cordon-Cardo C. Applications of Molecular Diagnostics: Solid Tumor Genetics Can Determine Clinical Treatment Protocols. Mod Pathol 2001;14(3):254 257