Μοριακή Ενδοκρινολογία της Αναπαραγωγής

Μοριακή Ενδοκρινολογία της Αναπαραγωγής ΕΡΑΣΜΙΑ ΚΙΑΠΕΚΟΥ ΕΝΔΟΚΡΙΝΟΛΟΓΟΣ Α ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ

Ο θεμελιώδης ρόλος του γονιδίου στη βιολογία διαπιστώθηκε και αναδείχθηκε για πρώτη φορά από τον Mendel (βασικές αρχές της κληρονομικότητας) To 1869 ο Miescher διαπίστωσε ότι το DNA αποτελεί συστατικό του πυρήνα των κυττάρων Το 1903 οι Sutton και Boveri iδιενεργώντας ανεξάρτητες έρευνες διατύπωσαν τη θεωρία της χρωμοσωμικής κληρονομικότητας. Το 1946 οι Tatum και Lederberg έδειξαν με πειράματα σε βακτήρια E.coli, ότι το DNA αποτελεί το γενετικό υλικό των βακτηρίων και σχετίζεται με την κληρονομικότητα. Το 1953 οι Watson και Crick πρότειναν το μοντέλο της διπλής έλικας του DNA, στηριζόμενοι και στα κρυσταλλογραφικά δεδομένα του Wilkins και της Franklin.

Τα νουκλεϊκά οξέα παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην αποθήκευση και έκφραση των γενετικών πληροφοριών. Διακρίνονται σε δύο τάξεις: Το δεοξυροβονουκλεϊκό οξύ (DNA) που εξυπηρετεί αποκλειστικά την αποθήκευση πληροφορίων Ταριβονουκλεϊκάοξέα οξέα (RNA) που συμμετέχουν στην έκφραση των γονιδίων και στη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών. Οι δομικοί λίθοι όλων των νουκλεϊκών οξέων είναι τα νουκλεοτίδια που αποτελούνται από τρία βασικά συστατικά: μία βάση, ένα σάκχαρο και ένα φωσφορικό φ κατάλοιπο.

Οι γενετικές πληροφορίες καταγράφονται στην ακολουθία βάσεων του DNA. Τα τμήματα του DNA των οποίων οι πληροφορίες μετατρέπονται σε λειτουργικά μόρια ονομάζονται γονίδια. Η μία άλυσος του DNA με τη διαδικασία της μεταγραφής μετατρέπεται σε RNA. Τα μόρια RNA που σχηματίζονται είτε αποτελούν το καλούπι για τη σύνθεση πρωτεϊνών (mrna) είτε αναλαμβάνουν ειδικές λειτουργίες, όπως το μεταφορικό RNA (trna) που συνδέει τα νουκλεϊνικά οξέα με τις πρωτεΐνες. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα ορισμένα μόνο τμήματα των γονιδίων που ονομάζονται εξώνια κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Τα τμήματα των γονιδίων που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες ονομάζονται εσώνια. Τα εσώνια απομακρύνονται κατά τη διαδικασία ωρίμανσης ρμ του RNA.

Η σύνθεση πρωτεϊνών ονομάζεται μετάφραση κατά την οποία μεταφράζεται η γλώσσα των νουκλεϊνικών οξέων στη γλώσσα των πρωτεϊνών.

Στη γλώσσα των νουκλεϊνικών οξέων υπάρχουν 4 γράμματα (A, G, C και U ή T). Είκοσι αμινοξέα συμμετέχουν στη διαδικασία σύνθεσης πρωτεϊνών Ο γενετικός μας κώδικας παρουσιάζεται πάντα με τη μορφή τριπλέτας νουκλεοτιδίων και τα 20 αμινοξέα κωδικοποιούνται από τριπλέτες βάσεων. Υπάρχουν και τριπλέτες που δεν κωδικοποιούν αμινοξέα, αλλά σηματοδοτούν την έναρξη ή τον τερματισμό της μετάφρασης (κωδικόνια έναρξης και τερματισμού). Η τριπλέτα έναρξης είναι η ATG, ενώ οι τριπλέτες τερματισμού μ είναι οι TGA, TAG ή TAA. Σημειακές μεταλλάξεις δηλαδή αλλαγή μιας βάσης σε μία τριπλέτα είναι δυνατό να οδηγήσει σε τελείως διαφορετική πολυπεπτιδική άλυσο και να οδηγήσει σε γενετική νόσο όπως είναι η μεσογειακή αναιμία και η κυστική ίνωση.

Στον άνθρωπο και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς τα κύτταρα έχουν το DNA στον πυρήνα. Στον πυρήνα το DNA είναι συνδεδεμένο με μόρια πρωτεϊνών και RNA (χρωματίνη). Το απλοειδές ανθρώπινο γονιδίωμα περιλαμβάνει περίπου 3 Χ 10 9 ζεύγη γηβάσεων και περιέχει περί τα 50.000 100.000 γονίδια με μέγεθος από 1.000 200.000 ζεύγη βάσεων. Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα κληρονομείται από τη μητέρα και αποτελείται από περίπου 17.000 ζεύγη βάσεων κυκλικού DNA και κωδικοποιεί πρωτεΐνες απαραίτητες για τη δομή και λειτουργία των μιτοχονδρίων, όπως διάφορα οξειδωτικά ένζυμα.

Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας

ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ Γενετικός Πολυμορφισμός Φαρμακογενετική Φαρμακογενωμική Ελεγχόμενη ωοθηκική διέγερση

ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΤΟ SNP? ΠΑΡΑΛΛΑΓΕΣ ΜΙΑΣ ΒΑΣΗΣ ΑΝΑΜΕΣΑ ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΑ ΑΤΟΜΑ ΕΝΟΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΘΕΩΡΕΙΤΑΙ ΜΙΑ ΑΠΟ ΤΙΣ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΑΙΤΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΤΩΝ ΑΤΟΜΩΝ ΣΕ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΓΙΑ ΝΑ ΘΕΩΡΗΘΕΙ ΜΙΑ ΑΛΛΑΓΗ ΣΕ ΜΙΑ ΒΑΣΗ SNP ΘΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΧΕΙ ΠΑΡΑΤΗΡΗΘΕΙ ΤΟΥΛΑΧΙΣΤΟΝ ΣΤΟ 1% ΤΟΥ ΥΠΟ ΕΞΕΤΑΣΗ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΠΑΡΑΤΗΡΗΘΕΙ ΣΕ ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΟΥΣΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΣΕ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ

Single Nucleotide polymorphism (SNP) Υπεύθυνοι για το 85% των αποκλίσεων του ανθρώπινου γονιδιώματος. Πολύ συχνά αφορούν σε περιοχές κωδικοποίησης οι οποίες είναι ειδικές για φαρμακευτικούς στόχους πχ. υποδοχείς φαρμάκων, μεταβολικά ένζυμα ή μόρια μεταφοράς.

ΈΝΑ ΑΤΟΜΟ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΦΕΡΕΙ ΈΝΑΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟ ΜΟΝΟΥ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΟΥ ΣΕ ΤΡΕΙΣ ΜΟΡΦΕΣ: ΟΜΟΖΥΓΗ ΓΙΑ ΤΟ ΠΙΟ ΣΥΧΝΟ ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΟ ΕΤΕΡΟΖΥΓΗ ΟΜΟΖΥΓΗ ΓΙΑ ΤΟ ΛΙΓΟΤΕΡΟ ΣΥΧΝΟ ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΟ

Φαρμακογενετική Περιγράφει τη σχέση μεταξύ των γενετικών αποκλίσεων και της φαρμακευτικής απάντησης (Anon, 2001). Φαρμακογενωμική Μελετά το γονιδίωμα και τα παράγωγά γ του (RNA, πρωτεΐνες) σε σχέση με την ανταπόκριση του ατόμου σε φαρμακευτικές ουσίες (Lewis, 2005). Ο σχεδιασμός και εναρμονισμός των φαρμακευτικών θεραπειών σύμφωνα με τη γενετική προδιάθεση ενός συγκεκριμένου ασθενή προβάλλει τα τελευταία χρόνια σαν ένα καινούριο πεδίο έρευνας που στοχεύει να βελτιώσει την ισορροπία μεταξύ των επιθυμητών και ανεπιθύμητων δράσεων των φαρμακευτικών ουσιών

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ SNP ΜΕ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΗΜΕΙΟΥ ΤΗΞΗΣ (MELTING CURVE ANALYSIS) Tm: Η ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΕΚΕΙΝΗ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΤΟ ΔΙΚΛΩΝΟ ΜΟΡΙΟ ΤΟΥ DNA ΓΙΝΕΤΑΙ ΜΟΝΟΚΛΩΝΟ ΑΛΛΑΓΗ ΣΕ ΜΙΑ ΒΑΣΗ ΑΛΛΑΓΗ ΣΤΟ Tm

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ(SNP): ΣΤΑΔΙΑΚΗ ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ: ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΟ Tm ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ: ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟ Tm

Γονοτύπηση με χρήση των Καμπυλών Τήξης Melting Curve Genotyping Analysis

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μρ ης(polymerase chain reaction-pcr) είναι τεχνική πολλαπλασιασμού συγκεκριμένων τμημάτων DNA και RNA. H PCR αντίδραση χρησιμοποιείται: Στον διαγνωστικό εντοπισμό μεταλλάξεων, Στη μηχανική του DNA, Στη δημιουργία και έλεγχο βιβλιοθηκών DNA (Library screening), Στην διάγνωση λοιμώξεων από μικροοργανισμούς, Στη διάγνωση γενετικών ασθενειών με τον προγεννητικό και προεμφυτευτικό έλεγχο, Στην ιατροδικαστική αλλά και σε επιστήμες όπως η αρχαιολογία.

Το πρώτο στάδιο της PCR είναι η μετουσίωση του DNA (denaturation). Αποδιάταξη του δίκλωνου DNA το οποίο οίο μετατρέπεται σε μονόκλωνο. Η μετουσίωση επιτυγχάνεται σε θερμοκρασία 94 95 95 0 C για περίπου 30 sec. Κατά το δεύτερο στάδιο της αντίδρασης συνδέονται (υβριδίζονται) ζ οι εκκινητές ς( (συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια,, που έχουν συμπληρωματική δομή με το DNA στόχο) με το DNA στόχο σε θερμοκρασία 50 65 0 C(υβριδισμός εκκινητών primer annealing). Σε θερμοκρασία 72 0 C δρα το ένζυμο Taq πολυμεράση που καταλύει την προσθήκη βάσεων στο 3 άκρο κάθε εκκινητή (επέκταση των εκκινητών extension). Με αυτόν τον τρόπο σχηματίζονται δύο νέες αλυσίδες DNA συμπληρωματικές των αλυσίδων του DNA στόχου. Ανοδος της θερμοκρασίας ρ ς94 9595 0 C απόδιατάσσει το δίκλωνο DNA και ένας νέος κύκλος αποδιάταξης σύνθεσης ξεκινά. Θεωρητικά σε κάθε κύκλο διπλασιάζεται το ποσό του DNA.

Η PCR αντίδραση μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τον πολλαπλασιασμό RNA. Επειδή όμως το RNA είναι μονόκλωνο μόριο πριν την PCR γίνεται μετατροπή του RNA στο συμπληρωματικό του DNA (cdna) με τη δράση του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση με τη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής (RT).

Αλληλοςσία αποδιάηαξη πολςμεπιζ μόρ ζηόσορ και ςβπιδιζ μόρ αποδιάηαξη και ςβπιδιζ μόρ πολςμεπιζ μόρ Απσικό DNA Νέο DNA Εκκινηηήρ 1 Εκκινηηήρ 2

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real-time PCR) Ποσοτικοποιεί τα νουκλεϊκά οξέα με τεράστια ευκολία και ακρίβεια. Χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό παθογόνων μικροοργανισμών και τον υπολογισμό του τίτλου τους, για τον υπολογισμό του ιϊκού φορτίου, στην ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε σχέση με τη νόσο, την παθογένεση και την ογκογένεση.

Το ποσό του DNA μπορεί να μετρηθεί στο τέλος κάθε κύκλου της αντίδρασης, δηλαδή σε πραγματικό χρόνο και όχι μόνο στο τέλος όπως συμβαίνει με την κλασική αντίδραση PCR. Η παρακολούθηση της διαδικασίας πολλαπλασιασμού λ της αλληλουχίας λ του DNA γίνεται με φθορισμό, που ανιχνεύεται από έναν αναλυτή και τα αποτελέσματα της αντίδρασης δίνονται με τη μορφή γραφικής παράστασης.

ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ: SYBR GREEN HYBRIDIZATION PROBES TAQMAN BEACONS

Χρωστική SYBR Green. Χρωστική που εισδύει στη διπλή έλικα του DNA και συνδέεται με αυτό. Σε ελεύθερη μορφή δεν εκπέμπει φθορισμό, όταν όμως συνδεθεί με το DNA αρχίζει την εκπομπή φθορισμού. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί με οποιουσδήποτε εκκινητές ρ χρη μ η μ ή η ς και όχι με ειδικούς ανιχνευτές (φθηνότερη από άλλες μεθόδους, με μειωμένη ειδικότητα λόγω της πιθανότητας πολλαπλασιασμού μη ειδικών προϊόντων).

Hybridization probes

Ανίχνευση με SimpleProbe ανιχνευτές

Παρακολούθηση PCR αντίδρασης με HybProbe ανιχνευτές

Μοριακοί φάροι (Molecular Beacons). Μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια των οποίων η δομή χαρακτηρίζεται από μία θηλιά (loop) και ένα μίσχο (stem). Ο ανιχνευτής περιέχει στη θηλιά του αλληλουχία συμπληρωματική με την αλληλουχία στόχο. Ο μίσχος του ανιχνευτή αποτελείται από δύο συμπληρωματικές αλληλουχίες (βραχίονες). Ο ένας βραχίονας είναι συνδεδεμένος με μια φθορίζουσα χρωστική και ο έτερος με έναν αποσβέστη. Οι μοριακοί φάροι χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές υβριδοποίησης και εκπέμπουν φθορισμό μόνο όταν επιδράσουν με την κατάλληλη αλληλουχία στόχο μέσω αναδιαμόρφωσης της στερεοδιάταξής τους. Λόγω της ειδικής σύνδεσης μεταξύ μοριακού φάρου και στόχου αποφεύγεται ο μη ειδικός φθορισμός, ενώ η τεχνική αυτή δίνει τη δυνατότητα ανάπτυξης πολλαπλών αντιδράσεων με πολλαπλασιασμό περισσότερων ρ από μία αλληλουχιών.

REAL TIME PCR: ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ PCR ΗΟΠΟΙΑ: 1. ΕΠΙΤΡΕΠΕΙ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΣΤΟΧΟΥ 2. ΑΝΙΧΝΕΥΕΙ ΑΛΛΑΓΕΣ ΕΝΟΣ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΟΥ (ΓΟΝΟΤΥΠΗΣΗ)

ΒΑΣΙΖΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΚΠΟΜΠΗ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ: ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ ΠΟΣΟΤΗΤΑΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ

Ο όρος bioinformatics υοθετήθηκε το 1978 από τους Paulien Hogeweg και Ben Hesper για τη μελέτη και εφαρμογή της επιστήμης της πληροφορικής σε βιολογικά συστήματα. Η πρωτεύουσα χρήση της βιοπληροφορικής έως και τα 8Oς ήταν στη γενωμική και στη γενετική με large scale DNA sequencing. Σήμερα η βιοπληροφορική περιλαμβάνει τη δημιουργία αλγορίθμων, databases, στατιστικές αναλύσεις, τεχνικές υπολογιστών που στόχο έχουν να λύσουν πρακτικά προβλήματα που προκύπτουν από την ανάλυση βιολογικών δεδομένων.

Κύρια ερευνητικά πεδία: Έυρεση γονιδίων Ανακάλυψη Σχεδιασμός νέων φαρμάκων Ανάλυση πρωτεϊνών (protein structure prediction) Αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών Μελέτες γονιδιώματος Δημιουργία μοντέλων για την ανάλυση της εξέλιξης (evolution modeling)

Sequence analysis Genome annotation Computational evolutionary biology Analysis of gene expression Analysis of regulation Analysis of protein expression Analysis of mutations in cancer Comparative a genomics Modeling biological systems High-throughput g image analysis Structural Bioinformatic Approaches - Prediction of protein structure - Molecular Interaction - Docking algorithms

Sequence analysis Οι αλληλουχίες αναλύονται για τον καθορισμό γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεϊνες, RNA, regulatory sequences, structural motifs (μοτίβα δομής πρωτεϊνών), ϊώ) και repetitive sequences. Η σύγκριση γονιδίων ενός είδους ή και διαφορετικών ειδών δείχνει τις ομοιότητες ή διαφορές των πρωτεϊνών, σχέσεις μεταξύ ειδών (χρήση μοριακών συστημάτων για κατασκευή φυλογενετικών δένδρων) Τη χειροκίνητη ανάλυση έχουν αντικαταστήσει προγράμματα όπως το BLAST Χρησιμοποιούνται καθημερινά για τη διερεύνηση αλληλουχιών 260.000 οργανισμών και 190 δισεκατομμυρίων νουκλεοτιδίων

Genome annotation Annotation: Είναι η διαδικασία της σήμανσης γονιδίων και άλλων βιολογικών δομών σε μια αλληλουχία DNA. Το 1 ο λειτουργικό σύστημα σχεδιάστηκε το 1995 από τον Dr. Owen White (Institute for Genomic Research, Maryland) Ανάλυση γονιδιώματος του αιμόφιλου της ινφλουένζας Λειτουργικό σύστημα έυρεσης γονιδίων, trna. Αντιστοιχία γονιδίου με συγκεκριμένη λειτουργία Σήμερα ίδια φιλοσοφία με πιο πολύπλοκα λ και εξελιγμένα προγράμματα.

Computational evolutionary biology Εξελικτική Βιολογία: Μελέτη προέλευσης - καταγωγής των ειδών Μελέτη των αλλαγών τους στο χρόνο Με τη νέα τεχνολογία : - Μέτρηση αλλαγών στο DNA των οργανισμών - Σύγκριση γονιδιωμάτων (Μελέτη σύνθετων εξελικτικών διαδικασιών: οριζόντια μεταφορά γονιδίων, διπλασιασμός γονιδίων,πρόβλεψη παραγόντων που οδηγούν σε 2 νέα είδη -speciation ) - Χτίσιμο σε υπολογιστή πολύπλοκων μοντέλων πληθυσμών που προβλέπουν το μέλλον του κάθε συστήματος

Analysis of gene expression Η έκφραση πολλών γονιδίων με μέτρηση του mrna γίνεται με πολλές τεχνικές: Μικροσυστοιχίες (Microarrays Technology) EST (expressed cdna sequence tag), SAGE (serial analysis of gene expression) MPSS (massively parallel signature sequencing)

Analysis of regulation Regulation: είναι η πολύπλοκη ενορχήστρωση γεγονότων που αρχίζουν με ένα εξωτερικό ερέθισμα (ορμόνη), που οδηγεί στην αύξηση ή μείωση της δραστικότητας μιας ή περισσότερων πρωτεϊνών Με τις τεχνικές της βιοπληροφορικής γίνεται: Σύγκριση γονιδίων που εκφράζονται σε συγκεκριμένη κατάσταση ενός οργανισμού (stress, OEM) Σύγκριση σταδίων του κυτταρικού κύκλου υπό την επίδραση θερμότητας,στέρησης τροφής (πειραματόζωα)

Analysis of mutations in cancer Χρησιμοποιούνται νέες τεχνικές Oligonucleotide microarrays: αναγνωρίζουν χρωμοσωμικές μ αλλαγές γς Single nucleotide polymorphism arrays : προσδιορίζουν γνωστές σημειακές μεταλλάξεις Μέτρηση εκατοντάδων χιλιάδων σημείων του γονιδιώματος σε χιλιάδες δείγματα Συγκεντρώνονται terabytes δεδομένων ανά πείραμα Χρησιμοποιούνται μαθηματικά στατιστικά μοντέλα για τη μείωση της μεταβλητότητας

Comparative genomics Μελέτη της αντιστοιχίας μεταξύ γονιδίων διαφορετικών οργανισμών (orthology analysis) ημιουργούνται διαγονιδιακοί χάρτες που αναδεικνύουν τις εξελικτικές διαδικασίες που είναι υπεύθυνες για το διαχωρισμό 2 γονιδιωμάτων στο παρελθόν Αναλύονται: Σημειακές μεταλλάξεις ενός νουκλεοτιδίου Μεγάλα τμήματα χρωμοσωμάτων για διπλασιασμό, μετάθεση, διαγραφή. Ολόκληρο το γονιδίωμα (speciation) Χρησιμοποιούνται και εδώ πολύπλοκα μαθηματικά μοντέλα.

Modeling biological systems Στη βιολογία των συστημάτων χρησιμοποιούνται προσομοιώσεις στον υπολογιστή κυτταρικών υποσυστημάτων (δίκτυα μεταβολιτών, ένζυμα που επηρεάζουν το μεταβολισμό, τη μετάδοση σήματος), για ανάλυση και οπτικοποίηση των σύνθετων διασυνδέσεων αυτών των κυτταρικών διαδικασιών.

High-throughput g image analysis Η σύγχρονη ανάλυση εικόνας πολλαπλασιάζει την ικανότητα του παρατηρητή να κάνει μετρήσεις σε μεγάλο αριθμό ή/και σε πολύπλοκες εικόνες, βελτιώνοντας την ακρίβεια, την αντικειμενικότητα και την ταχύτητα. Ίσως τέτοια συστήματα αντικαταστήσουν τον παρατηρητή!! Παραδείγματα εφαρμογών: Ιστοπαθολογία Καθορισμός του μοτίβου αερισμού στους πνεύμονες σε πραγματικό χρόνο Μέτρηση με απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο του μεγέθους της απόφραξης αρτηρίας Μέτρηση μεταβολισμού ανάλογα με τη δραστηριότητα

Τεχνολογία Μικροσυστοιχιών Microarrays Technology DNA μικροσυστοιχία: Μικρογραφία συστηματικής καθήλωσης τμημάτων νουκλεϊκών οξέων, τα οποία παράγονται από μεμωνομένα γονίδια, σε συμπαγή βάση, που επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση χιλιάδων γονιδίων. Αντιπροσωπεύει το συνδυασμό βιολογίας Η/Υ

ΓΕΝΕΤΙΚΗ Χαρτογράφηση PCR Northern blot Πρόκληση η μεταλλάξεων Προσδιορισμός Αλληλουχίας (Sequencing) Ανάλυση πρωτεϊνών ΓΕΝΩΜΙΚΗ Ανάλυση χιλιάδων γονιδίων σε ένα μόνο πείραμα

Καρκινικά κύτταρα Φυσιολογικά Κόκκινο + ø = Κόκκινο ø + Πράσινο = Πράσινο Κόκκινο + Πράσινο = Κίτρινο ø + ø = Μαύρο

ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ Πρόβλεψη κατηγορίας ασθένειας Σταδιοποίηση 40 γονίδια σταδιοποίηση Ca ουρ.κύστεως (Dyrskot et al., 2003) 32 γονίδια διαφοροποίηση καλοήθους κακοήθους όγκου εντέρου (Bicciato et al,. 2003)

ΕΚΒΑΣΗ ΝΟΣΟΥ Ανταπόκριση στη θεραπεία Θνησιμότητα/θνητότητα

Εντόπιση ό γονιδίων που σχετίζονται με αντίσταση στα φάρμακα Νευροβλάστωμα: μεταλλάξεις στο p 53 οδηγεί σε αντίσταση στη χημειοθεραπεία (Wang et al,. 2001) Ca μαστού: διαταραχή στην έκφραση ενζύμων (Kudoh et al,. 2000)

Πρόβλεψη ευαισθησίας στη χημειοθεραπεία 52 (9216) γονίδια ΟΝ σε Ca οισοφάγου που ανταποκρίνεται στη θεραπεία (Shimokuni et al,. 2006) 63 γονίδια ΟΝ, 372 OFF σε ΟΜΛ (Okutsu et al,. 2002, Park et al,. 2007) 28 γονίδια διαφορετικά επίπεδα έκφρασης σε ανταπόκριση ή μη στη θεραπεία

Προγνωστικοί Δείκτες Νόσου Λέμφωμα, Λευχαιμία: συγκεκριμένα γονίδια ΟΝ (334 γονίδια) σε παθολογικά κύτταρα σε σχέση με φυσιολογικά (ύφεση) (Chen X et al,. 2001, Mussolin et al,. 2007) Μεταμοσχεύσεις Α α ώρ η ε ε κώ δε κ ώ ου Αναγνώριση γενετικών δεικτών που σχετίζονται με οξεία απόρριψη

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ Κατανόηση μηχανισμού πρόκλησης ασθενειών Διατατική/υπερτροφική ή φ ή μυοκαρδιοπάθεια Ν. Parkinson Αλοπεκία Γονίδια που σχετίζονται με οξειδωτικό stress, φλεγμονώδη διαδικασία,, μετάδοση σήματος, υψηλά επίπεδα τροφικών παραγόντων (Barth et al,. 2006)

ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ 1 RNA έκφραση= πρωτεϊνική δραστηριότητα Όχι πάντα Ανάλυση έκφρασης πρωτεϊνών Ποια γονίδια χαλούν και προκαλούν νόσο Θεραπεία νόσου Αναγνώριση κάθε γονιδίου που συμπεριφέρεται διαφορετικά

ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ 2 Καθορισμός ορίων όπου τα γονίδια είναι ON ή OFF Δεν υπάρχουν ομάδες δεδομένων αναφοράς για αξιολόγηση των αποτελεσμάτων Ευαισθησία 70% Ειδικότητα 60%

Η ανάπτυξη του εμβρύου εξαρτάται από μητρικούς παράγοντες που ενεργοποιούνται στα όψιμα στάδια της ωρίμασης του ωαρίου Ειδικοί παράγοντες του ωαρίου απαραίτητοι για την ανάπτυξη του εμβρύου θεωρούνται υπεύθυνοι για κυτταρικές λειτουργίες Έλεγχος παραγόντων ανάπτυξης ωαρίουεμβρύου στον επίμυ

MII PMSG hcg 48h Συλλογή ωαρίων το επόμενο πρωΐ (ωάρια χωρίς καλλιέργεια) 48h PMSG 48h αφαίρεση ωοθηκών συλλογή, καλλιέργεια ωαρίων συλλογή ΜΙΙ

MII 48h PMSG 48h hcg Συλλογή ωαρίων ΜΙΙ PMSG 48h Συλλογή ωαρίων Καλλιέργεια ωαρίων ΜΙΙ

MII 48h PMSG 48h hcg Collection of oocytes ΜΙΙ PMSG 48h Collection of oocytes Oocytes culture ΜΙΙ

1138.2 57.5363 57.5363 1174.95 0.747045 40.9844 7.04615 0 49.9892 0 0 DATA 9 1 9 66 Structural 1 1 DarkCorner DarkCorner DarkCorner 603.582 185.427 0 1 1.395145e+002 6.105410e+001 12 1 51 1.242294e+003 1230 8.186655e+001 7.153545e+001 513 4.025731e+001 40 7.621674e+000 8.154300e+000 0 0 0 0 0 0 0 0 104.905 45.9084 1 8.93115e- 009 1 0 1137.39 7.62167 1 0 1137.39 57.5363 57.5363 1221.87 0.751929 40.2573 7.62167 0 97.6589 0 0 DATA 10 1 10 66 Structural 1 1 DarkCorner DarkCorner DarkCorner 629.418 185.427 0 1 1.792500e+002 6.171249e+001 10 0 54 1.272167e+003 1250 1.551711e+002 1.061912e+002 512 4.002539e+001 40 7.444073e+000 7.413000e+000 0 0 0 0 0 0 0 0 135.666 46.7074 1 6.45575e- 013 1 0 1136.5 7.44407 1 0 1136.5 57.5363 57.5363 1251.74 0.756855 40.0254 7.44407 0 128.308 0 0 DATA 11 1 11 66 Structural 1 1 DarkCorner DarkCorner DarkCorner 654.582 185.427 0 1 8.147039e+001 5.924844e+001 10 1 53 1.198057e+003 1202 7.228268e+001 7.413000e+001 510 4.000588e+001 40 7.515666e+000 8.154300e+000 0 0 0 0 0 0 0 0 62.0461 45.1223 1 0.000420927 1 0 1136.01 7.51567 1 0 1136.01 57.5363 57.5363 1177.63 0.761578 40.0059 7.51567 0 54.9567 0 0 DATA 12 1 12 ucluster4 U024368 ref NM_007899 gb L33416 chr3:95732655-95732714 0 3 0 A_66_P103784 Ecm1 U024368 extracellular matrix protein 1 680 185.455 0 1 1.472301e+002 6.015428e+001 6 1 55 1.248436e+003 1245 8.479971e+001 8.265495e+001 513 4.041910e+001 001 40 7.343270e+000 000 7.413000e+000 0 0 0 0 0 0 0 0 112.821 46.0957 1 8.59184e-010 1 0 1135.62 7.34327 1 0 1135.62 55.8519 55.8519 1228.01 0.766291 40.4191 7.34327 0 106.106 0 0 DATA 13 1 13 0 5 0 A_66_P127928 A_66_P127928 A_66_P127928 Unknown 705.418 185.427 58.1948 1 5.819480e+001 5.797360e+001 8 0 56 1.108054e+003108054e+003 1103.5 1.106901e+002106901e+002 9.266250e+001 518 4.054247e+001 41 7.571524e+000 7.413000e+000 0 0 0 0 0 0 0 0-27.1821 44.6937 0 0.115977 1 0 1135.24 7.57152 1 0 1135.24 57.5363 57.5363 1087.63 0.770932 40.5425 7.57152 0-33.502 1 0 DATA 14 1 14 ucluster4 U040604 ref XM_149337 gb AK009081 gb BC060281 chr3:93209862-93209921 0 7 0 A_66_P135818 Sprrl1 U040604 small proline rich-like 1. [Source:RefSeq;Acc:NM_033175] 730.701701 186.052 0 1 5.968303e+001 5.792870e+001 1 2 62 1.181210e+003 1177 6.042612e+001 5.615348e+001 498 4.008635e+001 40 7.323412e+000 7.413000e+000 0 0 0 0 0 0 0 0 4

OligoName U- Cluster NAP Cluster Annotation Gene Symbol Z00217 NAP047079-1 Intronic in U018906 No Z00218 U019356 NAP123343-1 Similar to: Mus musculus similar to hypothetical protein [Macaca fascicularis] (LOC240613), mrna. Possibly wrong strand. No Z00219 NAP099799- Mus musculus NADH dehydrogenase Fe-S protein 5 U017140 001 (Ndufs5), mrna Yes Ndufs5 NAP051482- Z00220 1 UNKNOWN No Z00222 U034619 NAP097907- Mus musculus RIKEN cdna 2310002A08 gene 2310002A08Ri Z00221 U000220 001 (2310002A08Rik), mrna Yes k; NAP012181- DJ501N12.5.2 (NOVEL PROTEIN, ISOFORM 2) 001 (FRAGMENT) homolog [Homo sapiens] Yes Z00223 U004690 NAP000583- Mus musculus cdna sequence BC002292 002 (BC002292), mrna Yes BC002292;

Accession Reporter Sequence Fold Log Intensity Intensity Code Name ID Change (Ratio) P-value 1 2 U026421 A_66_P110503 1111295 1.99564 0.30008 8.23E-06 5220.08984 10417.4102 U030450 A_66_P105665 1096245 1.99583 0.30012 8.16E-06 39217.3516 78271.0625 U031968 A_66_P105989 1111843 1.99585 0.30013 8.63E-06 1630.0870408 04 3253.416023 U039063 A_66_P106063 1087784 1.99595 0.30015 7.43E-04 130.0257 259.52509 U021619 A_66_P138408 1089525 1.99665 0.3003 8.17E-06 3538.1521 7064.45312 U008773 A_66_P115107 1088785 1.99705 0.30039 8.17E-06 3048.95288 6088.92578 U030117 A_66_P108392 1119246 1.99762 0.30051 1.11E-05 663.26007 1324.94202 U029744 A_66_P127052 1099348 1.99771 0.30053 1.09E-04 04 199.0928 397.7305973059 U030370 A_66_P112902 1105246 1.99824 0.30065 8.01E-06 3535.95703 7065.67383 U019540 A_66_P129461 1116601 1.99879 0.30077 8.31E-06 1645.651 3289.30908 U002460 A_66_P130623 1110780 2.00001 0.30103 8.46E-04 125.7973 251.59531

Cell Cycle, Mitotic4.9e-04, 8/128 Matching identifiers Bub1b Bub1b Ube2d2 Ube2d2 E2f5 E2f5 Ubb Ubc, UBA52 Plk1 Plk1 Ube2d3 Ube2d3 Fbxo5 Fbxo5 Aurkc Aurkc capc/c-mediated d degradation d of cell cycle proteins6.4e-06, 64 7/50 Matching identifiers Bub1b Bub1b Ube2d2 Ube2d2 Ubb Ubc, UBA52 Plk1 Plk1 Ube2d3 Ube2d3 Fbxo5 Fbxo5 Aurkc Aurkc APC-Cdc20 mediated degradation of Nek2A5.4e-04, 4/26 Matching identifiers Bub1b Bub1b Ube2d2 Ube2d2 Ubb Ubc, UBA52 Ube2d3 Ube2d3 Cdc20:Phospho-APC/C mediated degradation of Cyclin A7.2e-04, 4/28

Από τα 21939 γονίδια, 14145 εκφράζονται και στις 2 ομάδες ισότιμα 3515 OFF 173 γονίδια στα MII ωάρια ΟΝ από την hcg 326 γονίδια στα MII ωάρια ΟFF από την hcg

Πολυδύναμα γονίδια Αντιγραφή DNA Μεταγραφή Μετάφραση Κυτταρικό κύκλο

Από τα 173 γονίδια 40 δεν έχουν γνωστή λειτουργία 29 έχουν γνωστές λειτουργίες που σχετίζονται με: ωρίμαση του ωαρίου (Tnfaip6, Cspg2, Pde3a) Πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη (Dsg2, Tnfrsf23, Procr) Όψιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη (Lox, Sfrp2, Casp7, Lhx9)

Η hcg ρυθμίζει προς τα κάτω την DNA μεθυλοτρανφεράση 2.5 φορές. 5φορές Επαναπρογραμματισμός της έκφρασης των γονιδίων του ωαρίου και του σπέρματος Η αποτυχία ολοκλήρωσης επαναπρογραμματισμού της γονιδιακής έκφρασης δύναται να οδηγεί σε καθυστέρηση της ανάπτυξης του εμβρύου

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ανάλυση των γονιδίων με τις μικροσυστοιχίες του DNA προσφέρει νέους τρόπους προσέγγισης των ασθενειών (διάγνωση, πρόγνωση, θεραπεία) Η ταξινόμηση των ασθενών σε μοριακές κατηγορίες ασθενειών θα βελτιώσει την ακρίβεια και την αποτελεσματικότητα της κλινικής ιατρικής Η ανάλυση των γονιδίων θα οδηγήσει σε εξατομικευμένη ιατρική Αποφυγή των ανεπιθύμητων ενεργειών των θεραπειών σε κατηγορίες ασθενών που δεν ανταποκρίνονται σε αυτές Η λεπτομερειακή κατανόηση των μοριακών οδών και η εύρεση μοριακών γενετικών δεικτών ανταπόκρισης στις θεραπείες θα οδηγήσει σε νέους τρόπους θεραπευτικής παρέμβασης ρμβ

GH, Prl, ΙGF-1

Καλλιεργήθηκαν σε α-minimal essential medium (α-mem) παρουσία : Ανασυνδυασμένης FSH (100mIU/ml), Τρανσφερρίνης 5μg/ml, Σλ Σελινίου 5μg/ml, Ινσουλίνης 5ng/ml, 5% FBS

Πρωτογενή Ωοθυλάκια 12 ημέρες 16-18h COCs Γονιμοποίηση-Εκτίμηση Κυτταροπλ/τικής Ωρίμασης HCG Εκτίμηση Πυρηνικής EGF Ωρίμασης ρμ

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ PRL ΣΕ ΙΑΦΟΡΑ ΣΤΑ ΙΑ ΩΟΘΥΛΑΚΙΚΗΣ ΚΑΙ ΠΡΩΙΜΗΣ ΕΜΒΡΥΪΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Απομόνωση RNA 20 πρωτογενή ωοθυλάκια 20 COCs 20 ωάρια πρόφασης Ικαι μετάφασης ΙΙ 10-20 ζυγώτες, έμβρυα 2, 4-κυττάρων, μορίδια, βλαστοκύστεις Κοκκώδη που περιέβαλλαν τα ωάρια Χρησιμοποιήθηκε εμπορικώς διαθέσιμο kit Χρησιμοποιήθηκε εμπορικώς διαθέσιμο kit (RNAeasy micro kit, Qiagen)

Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής αλυσιδωτής πολυμεράσης (RT-PCR) Χρησιμοποιήθηκε εμπορικώς διαθέσιμο kit (Retroscript kit, Ambion, Austin, TX USA) για τη σύνθεση του συμπληρωματικού DNA (c-dna) ύο κύκλοι PCR (nested PCR) για το mrna των υποδοχέων PRL και ένας κύκλος για το mrna του GAPDH ( glyceraldehydes-3- phosphate dehydrogenase ) που χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας.

Επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων Πραγματοποιήθηκε με ανάλυση των προϊόντων της 2ης PCR με περιοριστικά ένζυμα.

Η ωρίμανση του ωοκυττάρου περιλαμβάνει την πυρηνική και την κυτταροπλασματική ωρίμανση Η πυρηνική ωρίμανση ωρίμανση χαρακτηρίζεται από την επανέναρξη της μείωσης και την πρόοδο στη μετάφαση ΙΙ Η κυτταροπλασματική ωρίμανση χαρακτηρίζεται από την ενεργοποίηση του ωαρίου, το σχηματισμό του προπυρήνα και την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη

MPF Μη ειδικός παράγοντας (maturation promoting factor, MPF) Ο MPF είναι ένα σύμπλεγμα κυκλίνης-κινάσης και ενεργοποιεί τη μετάβαση του κυττάρου από τη φάση G2 στη φάση Μ και ρυθμίζεται από την κυκλίνη Β. Αναστολή της πρωτεινικής σύνθεσης οδηγεί σε αποτυχία ενεργοποίησης εργο ο του MPF

Γονίδια NOBOX (New Born Ovary Homeobox) Μεταγραφικοί παράγοντες που συντίθενται από τα πρωτογενή ωοθυλάκια Επάγουν την έκφραση : kit-l, GDF-9, Bmp15

Σύστημα Kit-R / Kit-L (stem cell factor, steel factor) Ο C-kit είναι διαμεμβρανικός υποδοχέας με δράση τυροσινικής κινάσης (Besmer et al. 1986, Yarden et al. 1987). Εκφράζεται στα ωοκύτταρα των αρχέγονων ωοθυλακίων σε νεογέννητους επίμυες (Manova et al. 1993) και σε έμβρυα αμνών (Clark et al. 1996), O συνδέτης του kit ligand (KL) ή stem cell factor O συ δέ ης ου ga d ( ) ή s e ce ac o παράγεται στα κοκκώδη κύτταρα των ωοθυλακίων στον επίμυ και τον άνθρωπο (Tanikawa et al. 1998, Joyce et al. 1999).

Σύστημα Kit-R / Kit-L (stem cell factor, steel factor) Ωάρια επίμυων με απώλεια του c-kit-stem cell factor συστήματος αδυνατούν να αναπτυχθούν περαιτέρω του σταδίου του αρχέγονου ωοθυλακίου (Kuroda et al. 1988). Σε καλλιέργειες in vitro ο KL σε δόσεις 10-100 ng/ml προάγει την ωρίμαση ωαρίων επίμυων ηλικίας 8 ημερών (Packer et al. 1994). Έχει δειχθεί η θετική δράση του KL στο σχηματισμό του χε δε χθε η θε ή δράση ου σοσχημα σμό ου άντρου σε καλλιέργειες ωοθυλακίων επίμυων πριν το σχηματισμό του άντρου (preantral follicles) (Reynaud et al. 2000).

Growth differentiation factor-9, GDF-9 O αυξητικός παράγοντας διαφοροποίησης-9 (growth differentiation factor-9, GDF-9) ανήκει στην οικογένεια TGFβ (μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας, transforming growth factor β) Εκφράζεται στα ωάρια επίμυων, βοοειδών, αμνών, αρουραίων και ανθρώπων (Laitinen et al. 1998, McGrath et al. 1995, Bodensteiner et al. 1999, Aaltonen et al. 1999). Η σύνθεση του mrna του GDF-9 αρχίζει σε ωάρια η ρχ ζ ρ πρωτογενών ωοθυλακίων και συνεχίζεται σε όλη τη διάρκεια της ωοθυλακικής ανάπτυξης.

Growth differentiation factor-9, GDF-9 Μελέτες που έγιναν σε επίμυες με απώλεια του γονιδίου του GDF-9 (GDF-9 null mice) έδειξαν ότι η ωοθυλακική ανάπτυξη σταματά στο στάδιο του πρωτογενούς ωοθυλακίου (Dong et al. 1996). Ο GDF-9 έχει αντίστοιχες δράσεις στην ωοθυλακική ανάπτυξη σε αρουραίους in vivo (Vitt et al. 2000). Ο GDF-9 διεγείρει την ωρίμαση των ωοθυλακίων σε αρουραίους αλλά και στον άνθρωπο in vitro (Hreinsson et al. 2002).

Growth differentiation factor-9, GDF-9 ιαφοροποίηση/πολλαπλασιασμό (IGF-1) των κοκκωδών κυττάρων Καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της LH Επάγει το γονίδιο της συνθετάσης του υαλουρονικού/πρωτεογλυκανών Επάγει το γονίδιο της συνθετάσης των προσταγλανδινών

Το σύστημα των παρόμοιων με την ινσουλίνη αυξητικών παραγόντων Το σύστημα των παρόμοιων με την ινσουλίνη αυξητικών παραγόντων (insulin like growth factors, IGFs) αποτελείται από Τους IGF-I και ΙΙ, Τύπου Ι (IGF-I-R) I και τύπου ΙΙ (IGF-II-R) II υποδοχείς και από μία ομάδα συνδετικών πρωτεϊνών (IGFBPs) οι οποίες οες και ρυθμίζουν τις δράσεις των IGFs (Giudice 1992). Ύπαρξη του υποδοχέα του IGF-I σε ωοθυλάκια από το στάδιο του αρχέγονου έως και το γραφιανό (Zhou and Bondy 1993).

Το σύστημα των παρόμοιων με την ινσουλίνη αυξητικών παραγόντων Ο IGF-I I μόνος του αλλά και σε συνέργεια με την FSH ιεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κοκκωδών κυττάρων ανώριμων ρμ και ώριμων ρμ ωοθυλακίων (Angervo et al. 1991, Di Blasio et al. 1994, Hreinsson et al. 2002, Olsson et al. 1990, Yong et al. 1992), Την δραστηριότητα του mrna της αρωματάσης (Bergh et al. 1991, Christman et al. 1991, Erickson et al. 1989, Mason et al. 1993), Την παραγωγή προγεστερόνης όταν τα κοκκώδη κύτταρα καλλιεργούνται παρουσία βόειου ορού, ανεξάρτητα από την ωριμότητα των κοκκωδών κυττάρων (Bergh et al. 1991). Ο IGF-II διεγείρει την παραγωγή Ε2 και προγεστερόνης (Kubota et al. 1993).

IGFs IGFs διεγείρουν την αύξηση των ιστών Το Σ.Β. σχετίζεται θετικά με τη συγκέντρωση IGF-1 πλάσματος Πολυμορφισμοί IGF-1 αυξημένο Σ.Β. Ο IGF-1 δρα ως τροφικός αισθητήρας της αντιστοιχίας εμβρυική ανάπτυξη-προμήθεια θρεπτικών ουσιών Επηρεάζουν: πολλαπλασιασμό διαφοροποίηση αναγέννηση απόπτωση των κυττάρων ιεγείρουν τη διαφοροποίηση σε: μύες, οστά, εγκέφαλο, επινεφρίδια (late gestation)

IGFs ιεγείρουν την ανάπτυξη in utero Ανεπάρκεια γονιδίων igf1, igf2 μειωμένο σωματικό βάρος γέννησης + αναπτυξιακές ανωμαλίες Απώλεια IGF-1-R ακόμη μεγαλύτερη καθυστέρηση ανάπτυξης Μετάλλαξη του IGF1 γονιδίου σοβαρή καθυστέρηση ανάπτυξης in utero + αποτυχία ανάπτυξης μετά τοκετό ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ μακροσωμία-οργανομεγαλία (επίμυες) Σε Beckwith-Wiedemann syndrome μακροσωμία

Η αυξητική ορμόνη Η αυξητική ορμόνη (growth hormone, GH) αυξάνει τις δράσεις των γοναδοτροπινών στο επίπεδο της ωοθήκης και έχει χαρακτηριστεί ως συν-γοναδοτροπίνη (Katz et al. 1993). Η GH και η εκλυτική ορμόνη της GH (GHRH) βελτιώνουν τις επιδράσεις των γοναδοτροπινών σε ασθενείς που υποβάλλονται σε εξωσωματική γονιμοποίηση (Owen et al. 1991, Ibrahim et al. 1991, Duffy et al. 1995). Αυτόματες εγκυμοσύνες σε γυναίκες με το σύνδρομο Laron που χαρακτηρίζεται από αντίσταση των περιφερικών ιστών στην GH δείχνει ότι η κυκλοφορούσα GH και/ή ο IGF-I συμμετέχουν στη διαδικασία της ωοθυλακιογένεσης, δεν είναι όμως η συμμετοχή τους αυτή απαραίτητη (Menashe et al. 1991, Dor et al. 1992).

ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙ Η Χορήγηση γλυκοκορτικοειδών στη μητέρα / έμβρυο καθυστέρηση ανάπτυξης εμβρύου Β.Σ. και βάρους ιστών όση-είδος γλυκοκορτικοειδούς-συχνότητα-τρόπο χορήγησης-φίλο-ηλικία ηλ ία κυήσεως

ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙ Η ιεγείρουν τη διαφοροποίηση εμβρυικών ιστών (ήπαρ, μύες, πνεύμονες, λιπώδης ιστός) Dunger et al., Diabetes Care 2007 Σε κυτταρικό επίπεδο επηρεάζουν υποδοχείς, μεταφορείς, ένζυμα, κανάλια ιόντων Αλλάζουν την έκφραση σε: πρωτεΐνες, αυξητικούς παράγοντες, παράγοντες πήξης Στρέφουν τον κυτταρικό κύκλο από την αύξηση ιστών στη διαφοροποίηση Fowden et al., 2005

Συσχέτιση του πολυμορφισμού Ser680Asn του γονιδίου του υποδοχέα FSH καθώς και των πολυμορφισμών PvuII και RsaI των γονιδίων ESR1 και ESR2 των οιστρογονικών υποδοχέων ERακαι ERβ με τα βιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά των γυναικών που συμμετέχουν σε πρωτόκολλα Εξωσωματικής Γονιμοποίησης Έλλη Αναγνώστου Ιατρός Α Γυναικολογική Μαιευτική Κλινική Πανεπιστημίου Αθηνών Ιούνιος 2011

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Συσχέτιση τριών πολυμορφισμών (υποδοχέας FSH, οιστρογονικοί υποδοχείς ERα και ERβ) με τα βιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά των γυναικών που συμμετέχουν σε πρωτόκολλα Εξωσωματικής Γονιμοποίησης.

ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΓΟΝΙΔΙΟΥ FSHR Περιγραφή της πρώτης μετάλλαξης του υποδοχέα της FSH από Aittomäki et al, 1995. Πολυμορφισμοί στην περιοχή του υποκινητή: θέση 29 (G/A) Gromoll et al, 1994 Wunsch et al, 2005 Πολυμορφισμοί στις θέσεις 307 (Thr/Ala) και 680 (Ser/Asn) της πρωτεΐνης, σε σύνδεση ανισσοροπίας. Simoni et al,, 1999 Sudo et al,, 2002 Ο πιο μελετημένος πολυμορφισμός στο γονίδιο του υποδοχέα FSHR είναι ο Ser680Asn. Oι διαφορετικές ισομορφές του υποδοχέα της FSHR είναι πιθανώς υπεύθυνες για τις διαφορετικές αλληλεπιδράσεις με την FSH, λόγω μεταβολών στο επίπεδο του μοριακού μηχανισμού της γλυκοσιλίωσης και φωσφορυλίωσης.

ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΓΟΝΙΔΙΟΥ FSHR Το 2000 η πρώτη ένδειξη για συσχετισμό του γονότυπου του υποδοχέα της FSH με την ωοθηκική απάντηση στη εξωγενή χορήγηση FSH σε γυναίκες που ελάμβαναν ελεγχόμενη ωοθηκική διέγερση COS Perez Mayorga et al, 2000 Σχέση μεταξύ της γενετικής ποικιλότητας του υποδοχέα της FSH και της εξωγενούς χορήγησης FSH, των βασικών τιμών της FSH ορού de Koning et al, 2006 Laven et al, 2003 Σχέση μεταξύ της γενετικής ποικιλότητας του υποδοχέα της FSH και της έκβασης της ωοθηκικής διέγερσης de Castro et al, 2003 Jun et al, 2006 Loutradis et al, 2006 Σχέση μεταξύ της γενετικής ποικιλότητας του υποδοχέα της FSH και των ποσοστών κύησης Klinkert et al, 2006

ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΙΚΟΙ ΥΠΟ ΟΧΕΙΣ ERα και ERβ Πυρηνικοί υποδοχείς τύπου Ι (στεροειδείς δί ορμόνες) ) Μεταγραφικοί παράγοντες (ενεργοποίηση η η από τα μόρια σύνδεσης) Ρύθμιση έκφρασης γονιδίων-στόχων Πρώτη αναφορά το 1973 Ανακάλυψη ERβ το 1996 Προϊόντα δύο διαφορετικών γονιδίων: Προϊόντα δύο διαφορετικών γονιδίων: Γονίδιο ESR1 για ERα στο χρωμόσωμα 6q25.1 Γονίδιο ESR2 για ERβ στο χρωμόσωμα 14q23.2

ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ESR1 ΚΑΙ ESR2 Συσχετισμοί με: Ενδοκρινολογικές παραμέτρους, πχ. ηλικία εμμηναρχής Καρκίνος μαστού Οστεοπόρωση Συσχετισμοί με: Αυτόματες αποβολές Υπογονιμότητα Ενδομητρίωση

ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ESR1 ΚΑΙ ESR2 ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟΙ ΜΕ ΥΠΟΒΟΗΘΟΥΜΕΝΗ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ ΓΟΝΙΔΙΟ ESR1 PvuII (T/C) (/) και έκβαση ελεγχόμενης ωοθηκικής διέγερσης (COS outcome) κυήσεις Georgiou et al, 1997, Altmäe et al, 2007 Sundarrajan et al, 1999 PvuII (T/C) και προδιάθεση για ενδομητρίωση PvuII (T/C) και αυτόματες αποβολές Hsieh et al, 2007 Lehrer et al, 1993 XbaI (A/G) και ανδρική υπογονιμότητα ή γυναικεία υπογονιμότητα Επαναλαμβανόμενη αλλουχία (ΤΑ)n και POF ή έκβαση ελεγχόμενης ωοθηκικής διέγερσης

ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ESR1 ΚΑΙ ESR2 ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟΙ ΜΕ ΥΠΟΒΟΗΘΟΥΜΕΝΗ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ ΓΟΝΙΔΙΟ ESR2 RsaI (G/A) και ωοθηκική δυσλειτουργία αγνώστου αιτιολογίας Sundarrajan et al, 2001 RsaI (G/A) και παράμετροι ωοθηκικής διέγερσης/ποσοστά κύησης Altmäe et al, 2007 AluI (A/G) και έκβαση ωοθηκικής διέγερσης de Castro et al, 2004 Ενδείξεις ότι ένα σωστά επιλεγμένο σετ γονιδίων, που περιλαμβάνει συγκεκριμένους γονοτύπους πολυμορφισμών των γονιδίων FSHR, ESR1 και ESR2 μπορεί να εξηγήσει την πτωχή απάντηση στην FSH (de Castro et al, 2004)

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗΣ ΓΥΝΑΙΚΕΣ ΠΡΟΣ IVF ΚΑΙ ICSI ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΠΡΟΚΛΗΣΗΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΩΟΘΥΛΑΚΙΟΡΡΗΞΙΑΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ IVF/ICSI ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΣΤΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ FSH ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ΣΕ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΧΡΟΝΟ (Real Time PCR) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ο πληθυσμός των γυναικών αυτής της μελέτης δεν ευνοείται από την παρουσία του αλληλομόρφου Asn (γονίδιο FSHR). Οι ομόζυγες για τον πολυμορφισμό γυναίκες (Asn/Asn) είχαν ανάγκη από αυξημένες δόσεις εξωγενώς χορηγούμενων γοναδοτροπινών σε σχέση με τις γυναίκες χωρίς πολυμορφισμό (Ser/Ser) (P=0,048). Σε αντίθεση με εύρημα Perez Mayorga et al, 2000. Η ομάδα ασθενών Asn/Asn παρουσίασε ποσοστό κύησης υποδιπλάσιο του ποσοστού κύησης των ομάδων Ser/Ser και Ser/Asn (13.8% έναντι 27.5%), (P=0,13). Ενίσχυση έρευνας (Klinkert et al, 2006) με υψηλά ποσοστά κύησης ηςκαι εμφύτευσης στην ομάδα ασθενών Ser/Ser σε σχέση με την ομάδα ασθενών Asn/Asn (P=0,007 και P=0,003 αντίστοιχα).

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Νέα δεδομένα: ασθενείς με διαφορετικά γενετικά προφίλ και πιο συγκεκριμένα με διαφορετικούς γονοτυπικούς συνδυασμούς για συγκεκριμένα γονίδια έχουν διαφορές σε ότι αφορά την έκβαση της ωοθηκικής διέγερσης και τα ποσοστά κύησης Μελέτη και ανάλυση των εννέα γονοτυπικών συνδυασμών για τα γονίδια ESR1/FSHR: γονοτυπικός συνδυασμός CC/AA αντιστοιχεί σε φαινότυπο «πτωχής πρόγνωσης» πτωχό προφίλ πρόκλησης ωοθυλακιορρηξίας μικρό αριθμό συλλεχθέντων ωαρίων χαμηλό ποσοστό κυήσεων μεγάλη διεισδυτικότητα στην ομάδα των πτωχών απαντητριών (poor responders group) Ένδειξη ότι μία ομάδα γενετικών δεικτών μπορεί να Ένδειξη ότι μία ομάδα γενετικών δεικτών μπορεί να αποτελέσει παράγοντα πρόγνωσης

ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ Η επιλογή και ο συνδυασμός των κατάλληλων γενετικών δεικτών θα οδηγήσει στην καλύτερη πρόγνωση της ωοθηκικής απάντησης στη διέγερση, και επομένως σε καλύτερη ποιότητα ζωής των ασθενών Φαρμακογενετικές μελέτες σε IVF ασθενείς με στόχο την ανάδειξη γενετικών δεικτών που θα είναι χρήσιμοι για την πρόβλεψη της έκβασης της ελεγχόμενης ωοθηκικής διέγερσης: β υπομονάδα της LH (LHB), SHBG, μεταβολική οδός φυλλικού οξέος, TGFβ Genome wide association studies WGAS (2011)

Τελικά Για την πρόβλεψη της απάντησης των ωοθηκών, το πιο χρήσιμο και εφαρμοσμένο πρωτόκολλο πρόβλεψης θα περιλαμβάνει ένα συνδυασμό φαινοτυπικών χαρακτηριστικών (ηλικία ασθενούς, βάρος, μορφολογία ωοθηκών), ) εργαστηριακών τιμών (βασική ήτιμή FSH, AMH και άλλους δείκτες αίματος για την ωοθηκική εφεδρεία) και γενετικών δεικτών, το οποίο θα εφαρμόζεται ως διαγνωστικός έλεγχος ρουτίνας πριν από την έναρξη της ωοθηκικής διέγερσης, με στόχο την πρόβλεψη και τη στόχευση της κατάλληλης και επιθυμητής απάντησης, δηλαδή την ισορροπία ανάμεσα στην υψηλή απόδοση σε ωάρια, χωρίς το ρίσκο της ακύρωσης του κύκλου λόγω πολύ μεγάλου ή ανεπαρκούς αριθμού ωαρίων.