دا ؽکذ عل م پبی گر زیعتؼ بظی )گرایػ ثی ؼیوی( ت ٤ یس VHH ف ی ٦ ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض VEGF ا ١ ؿب ١ ی ٣ تقیی ٠ ذه ٤ نیبت آ اظ: ػیذ ؿیشی ؿب یب اؾبتیس ضا ٢٧ ب: دوتش سضب حؼ ػبخذی دوتش صبدق حؼ یب دوتش سیحب ػشیشی اؾبتیس كب ٣ ض: دوتش ح ذ ح ذی دوتش دیذ تمذیش )اؾي ٢ س 93(
رد نهایت سپاط و احتشام تقذ ي م هب سوح رپفتىح پذس زبسضىاسم و تقذ ي م هب مارد انصنیه و بی نظیشم هم س ش زعزیم تقذ ي م هب هک تمام آنچو امروص هس ت م ثمره فذا کاسی اه و صزشت اهی ایطان است هک رد امکل صبىسی رد همو ی احىال یاسی سسا ن م بىد و تقذ ي م هب همو زبسگانی هک رد صنذگی ما اتثیشات مثبت و هب یاد مانذنی داسنذ خصىصا اساتیذ ساهنمای لرانقذسم هب پاط صحمات بیرديغ تالشاهی بیوقفو و ساهنمايیاهی اسص شم نذضان ة
هب انم یکتا سهنمايی هک آفریذهاش سا هب هذا یت کتاب و قذا ست قل م منت نهاد هب انم او و ربای او...سپاط خذا ونذ یکتا و آفریذگاس تىاان سا هک همو خىبیاه اص اوست و زبسگی سضاواس او... ابتذا الصم می بین م اص دستانی هک د ست م سا رد ساه ربشیپد ایه سساهل حمایت و هذا یت كردنذ قذسدانی کن م. اتمام ایه سساهل مرهىن الطاف و ساهنمايیاهی بیرديغ استاد لرانقذس جناب آاقی دکتش سضا حس هساجذی میباشذ. خذا سا ضاكرم هک تى فی ق فراگیشی عل م و اخالق و ادب سا رد محضش ایطان دا شت م و آسصوی سالمتی و ضادکامی ربای ایطان می کن م.اص استاد بسیاس زعزیم جناب آاقی دکتش صادق حس ه نیا هک رد نهایت زبسضىاسی صبش و حىصلو رد انجام سساهلام یاسی ام سسانذنذ صمیماهن تشکر می کن م و اص خذا ونذ منان بهتشیه اه سا ربایطان آسصوم نذم. همخنیه اص استاد لرانقذسم سشکاس خا ن م رپو فس ىس سیذاهن سشریی هک همیشو اص الطاف و ساهنمايی اهی مذا ومطان بهره ربده ام امکل تشکر سا داسم و اص رپوسدگاس متعال ربایطان سالمتی و بهروصی آسصومنذم. متق ب ل شذنذ و با مساعذت بیرديغ ایطان ایه رپوژه هب هجیتنی مطلىب سسیذ خاضعاهن اص اساتیذ ف ر هیختو و زبسضىاسم جناب آاقی دکتش مح مذ مح مذی و جناب آاقی دکتش مج یذ تقذری هک ص حم ت مطاوسه ایه سساهل س ا سپاطل زاسم. اص پذس و مارد بی نظیش و فذا کاسم و هم س ش مهربان و همیشو همراه م اص صم ی م قلب سپاسگزاسم. اص اساتیذ اس جم نذم سشکاس خا ن م دکتش صیىس صا لح ی جناب آاقی دکت ش مح م ىردضا آاقمعالی و جناب آاقی دکت ش سامان حسینخانی هب خاطر دق ت فىق العاده ای طان رد تصح ی خ و داوسی سساهلام و جناب آاقی دکتش شهریاس سعیذی نمای نذه محت شم تحصیالت تکم یلی هب خاطر همراهی و تجاسب اسصنذهضان نهایت تشکر سا داسم. اص کلیو اساتیذ ف ر هیختو لروه ص یس تشناس ی بخصىظ جناب آاقیان دکتش فراهد مطا یخ ی دکتش س یذ مح س ه اصغری دکتش انرد شعبانی پىس و دکتش منصىس افطاس مح مذیان هک رد طىل سالاهی هب یادمانذنی ضالردیطان تج ربیات فراوان کس ب نم ىدم قذسدانی می کن م. اص تمامی اساتیذ زبسضىاس لروه بیى شیم ی و بیى فیضیک دااگشنه رتبیت مذسط خصىصا استاد ف ر هیختو و زعزیم جناب آاقی دکتش سیذ شهریاس رعب نیض امکل تشکر سا داسم. اص دوست زبسضىاسم سشکاس خا ن م دکتش شیشیه جلیلی بخاطر لطف اه و کمک اهی صمیماهن ضان قذسدانی می نما ي م. اص دوست بسیاس د لس ىص و زعزیم د ا نش ج ىی زبسضىاس دوسه دکتشی خا ن م فهیمو قىامی پىس هب خاطر همراهیاه و الطاف بیذسيغضان صمیماهن تشکر مینما ي م. اص دوست مهربا ن م د ا نش ج ىی زبسضىاس دوسه دکتشی خا ن م مر ي م مالكر یم ی هک سال ها هم چ ىن خىارهی مهربان رد کناسم بىدنذ سپاسگزاسم. اص دوستان زعزیم رد لروه بیى شیم ی و بیىفیضیک و ژنتیک دااگشنه رتبیت مذسط دااگشنه تهران لروه ص یس ت شناسی دااگشنه گیالن و ژپو هش گاه ملی مهنذسی ژنتیک هب خصىظ آاقیان محسنی سحمانی ساستی ضالی مىرن صا ده جلیلیان قرائت بیات دکتش اعتضاد و خا ن ماه ت کلى صمانی مح مذی سپهری پ ى لکچ ی داتمزاده سضائی دکتش مالعباسی دکتش ملکىتیان دکتش دبیش من ص دکتش دوکاهن ای فرد و دکتش مج یذی امکل تشکر و سپاطل زاسی سا داسم و رد اگشیپه خذا ونذ متعال آسصوی تنذسستی و م ى فقیت سوصافزون رد تمام رعهصاهی صنذگی ربای آناه داسم. اص کاسش ناسان محتشم لروه ص یس ت شناسی دااگشنه گیالن سشکاس خا ن م اه ضای گان و اهدوی نیض قذسدانی می نما ي م. ت
ى ٨ طؾت فهرست مطالب چىیذ فبرسی... چىیذ ا گلیسی...ل فصل ا ل: همذه تئ ری...1 1-1 آ ١ ػی ٤ غ ١ ع 2... 1-1-1 ض عایی ىیعی ٤ ٤ غی...3 2-1-1 ض عایی پبت ٤ ٤ غی...4 1-2-1-1 ض عایی ت ٤ ٤ ض ٧ ب...4 2-1 ىب ت ٤ ض ضقس ا ١ س ٣ ت یب ض ی ٣ ضقس ت ٤ ٤ ض... 6 1-2-1 ذب ٤١ از ٥ 7...VEGF 8... VEGF-A 1-1-2-1 1-1-1-2-1 ؾبذتبض ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض...9 VEGF-A 2-1-2-1 ؾبیطافضبی ذب ٤١ از ٥... VEGF 11 VEGF 2-2-1 چ ٦١٤ ىقب یت ذ ٤ ز ضا ا ف ب ی ٢ س... 12 3-2-1 یط ١ س ٧٥ بیVEGF... 13 3-1 ضا ٧ بض ٧ بی ٨ بض آ ١ ػی ٤ غ ١ ع... 15 ٧ سه 1-3-1 طاض زاز ٨ بض ٣ VEGF آ ١ ػی ٤ غ ١ ع... 15 ٨ بض ٢٢ س ٥ 1-1-3-1 ٧ بی ؿیط ٧ بی ؾی ٢ ب ی...VEGF 16 17... 18... 19... 19... ث AVASTIN (BEVACIZUMAB) 1-1-1-3-1 VATALINIB 2-1-1-3-1 SEMAXANIB 3-1-1-3-1 RANIBIZUMAB 4-1-1-3-1 19... IMC-IC11 5-1-1-3-11 19... SUNITINIB 6-1-1-3-1 20... PEGAPTANIB 7-1-1-3-1 4-1 ای ٤١٤ تطاپی ض ٣ قی زض زض ب ؾطعب... 21 1-4-1 بضثطز ١٤ ٤٢ ب آ ١ تی ثبزی ٧ بزض زض ب ؾطعب... 23 5-1 تبضیرچ ٦ آ ١ تی ثبزی ٧ ب... 24 6-1 ؾبذتبض آ ١ تیثبزی ٧ ب... 26 7-1 غقبت ٢٨ سؾی قس ٥ آ ١ تی ثبزی ٧ ب... 26 8-1 آ ١ تی ثبزی ٧ بی ظ ١ زیط ٥ ؾ ٢ ی ٠ (HCAB)... 29
ى ٨ طؾت 1-8-1 تيب ٣ ت ٧ بی ٤ ر ٤ ز ثی ٠ ت ٤ ا ی ز ی ٠ تنیط VHH ثب VH آ ١ تی ثبزی ٧ بی ق ٤ ی... 30 2-8-1 تيب ٣ ت ٧ ب ٣ قجب ٧ ت ٧ بی ؾبذتبضی ثی ٠... VH ٣ VHH 32 ٣ یػ ی 3-8-1 ٧ بی ٢ حهط ثيطز ٧ ب VHH... 33 4-8-1 بضثطز ٧ بزض VHH ثی ٤ ت ٤ ٤٢ غی... 35 ٧ بزض VHH 1-4-8-1 زض ب... 35 1-1-4-8-1 ؾطعب... 35 2-1-4-8-1 اذتالالت ذ ١٤ ی... 37 3-1-4-8-1 ثی بضی ٧ بی في ١٤ ی... 38 2-4-8-1 بضثطز ٧VHHب زض ته ٤ یطثطزاضی ٣ تكریم ثی بضی... 40 9-1 ضط ٣ ضت ا ١ زب تح ی... 43 فصل د م: ه اد ر ش ب... 45 1-2 زؾت ب ٥ ٧ ب ٤ از ٣ ی ط ٣ اض ب ١ یؿ ٧ ب... 46 1-1-2 زؾت ب ٥ ٧ بی ٤ ضز اؾتيبز ٥... 46 ٤ از... 2-1-2 46 3-1-2 یت ٧ ب... 47 4-1-2 آ ١ تی ثبزی ٧ ب... 47 5-1-2 ی ط ٣ اض ب ١ یؿ ٧ ب ؾ ٤ ٧ ب ٣ حیظ ٧ بی كت ٤ ضز اؾتيبز ٥... 48 2-2 ض ٣ ٧ ب... 49 1-2-2 ت ٤ یس ٣ آ بز ٥ ؾبظی ای ٤١٤ غ / آ ١ تی غ... 49 1-1-2-2 ا ١ ت ب پالؾ یس حب غ ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض VEGF ث ٦ ثب تطی.E COLI ؾ ٤ ی ٦...DH5Α 50 1-1-1-2-2 ت ٨ ی ٦ ثب تطی ؿتقس... 50 2-1-1-2-2 ا ١ ت ب پالؾ یس ٤١ تط یت ث ٦ ثب تطی ٧ بی ؿتقس... 50 2-1-2-2 ا ١ ت ب پالؾ یس ٤١ تط یت ث ٦ یعثب ٧ بی ثیب ١ ی... 51 3-1-2-2 ثیب ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض...VEGF 51 4-1-2-2 رساؾبظی ارؿب ا ٤ ١ غ ١ ی... 52 5-1-2-2 تبذ ٤ ضز ی زسز پط ٣ تئی ٠ ٤١ تط یت... 52 6-1-2-2 تر یم پط ٣ تئی ٠ ٤١ تط یت ضى س قس ٥... 52 7-1-2-2 ؾ ٢ زف م ؾت پط ٣ تئی ٠... 53 2-2-2 ض ٣ ٧ بی ثطضؾی نحت تبذ ٤ ضز ی زسز پط ٣ تئی ٠ ٤١ تط یت... 53 SDS-PAGE 1-2-2-2 احیبیی ٣ میطاحیبیی... 53 2-2-2-2 تقیی ٠ تقساز ط ٧٥٣ بی SH آظاز زض...VEGF 53 د
ی ٧ ب ی ٧ ب ى ٨ طؾت 3-2-2-2 ز ٣ ض ١ ١ بیی ز ٣ ضا ١ ی... 54 4-2-2-2 غب قبت ىقب یت پط ٣ تئی ٠ زض قطایظ...IN VITRO 54 1-4-2-2-2 احط پط ٣ تئی ٠ ٤١ تط یت ثط ت خیط 2 ؾ ٨ ٤ بی ا ١ س ٣ ت یب ث ٢ س ١ به ا ١ ؿب ١ ی...)HUVEC( 54 2-4-2-2-2 ثطضؾی احط آ ١ ػی ٤ غ ١ ی پط ٣ تئی ٠ ٤١ تط یت ت ٤ ؾظ آظ ٤ تك ی ٦ ٤ ٤ یط ی اظ ؾ ٤ 55... HUVEC 1-2-4-2-2-2 ت ٨ ی ٦ غ الغ ر ٨ ت آظ ٤ تك ی ٧٦ ٤ بی ٤ یط ی... 55 5-2-2-2 ثطضؾی ٤ ٧ غ ١ یتی پط ٣ تئی ٠... 56 3-2-2 ای ٢ ی ظایی قتط ف ی ٦ ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض...VEGF 56 4-2-2 ت ٤ یس آ ١ تی ثبزی حب ٤١ ی ٦ ذط ٤ قی ف ی ٦ ای ٤١٤ ج ٤ ی ٠ ٧ بی )IGS( قتطی... 57 1-4-2-2 تر یم ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی قتطی... 57 2-4-2-2 ای ٢ ی ظایی ذط ٤ ثب ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی قتطی... 58 3-4-2-2 تر یم ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی ذط ٤ قی... 58 5-2-2 ؾبذت تبثرب ٦١ ١ بیف ىبغی... 59 1-5-2-2 تر یم ٢ ي ٤ ؾیت رساؾبظی RNA ؾبذت تبثرب ٦١ ٣ CDNA ت خیط غ ٨١ بی... VHH 59 ٧ ض 2-5-2-2 غقبت غ ١ ی ٣ VHH ىبغ یس ٣ PCOMB3X ا حب غ زض ىبغ یس... 61 3-5-2-2 ا ١ ت ب حه ٤ ا حب ث ٦ ثب تطی ث ٦ ض ٣ ا تطی ی... 62 1-3-5-2-2 ت ٨ ی ٦ ثب تطی ؿتقس... 62 2-3-5-2-2 ا ١ ت ب ث ٦ ض ٣ ا تطی ی... 63 4-5-2-2 تأییس ا حب غقبت غ DNA ٣ VHH ىبغ یسی... 64 PCR 1-4-5-2-2 ؿت ی اظ ١٤ ی ٧ ب... 64 ٧ ض 2-4-5-2-2 آ ١ عی ی... 64 5-5-2-2 شذیط ٥ ؾبظی تبثرب ٦١ غ ١ ی... 64 6-5-2-2 ض ٧ بؾبظی ٣ تر یم ىبغ ٤١ تط یت... 65 1-6-5-2-2 ت ٨ ی ٦ ىبغ ی... 65 2-6-5-2-2 تقیی ٠ تیتط ىبغ... 66 6-2-2 م ٢ ی ؾبظی تبثرب ٦١ ىبغ ٧ بی ١ بیك ط ٧ بی VHH اذتهبنی ف ی ٦... VEGF 67 1-6-2-2 ت خیط ىبغ ٧ بی اذتهبنی رسا قس ٥ زض ٧ ط طح ٦ اظ م ٢ ی ؾبظی... 69 2-6-2-2 اضظیبثی پیكطىت طاح م ٢ ی ؾبظی... 69 1-2-6-2-2 تقیی ٠ تیتط ىبؤ ٧ بی ذط ٣ ری ٧ ط ز ٣ ضم ٢ ی ؾبظی... 69 2-2-6-2-2 االیعای ىبغ ٧ بی پ ی ١٤ ب... 70 7-2-2 مطثب طی ىبغ ٧ بی ١٤ ٤١٤ ب ثب ثیكتطی ٠ ت بی اتهب ث ٦... VEGF 70 8-2-2 مطثب طی ٧ بی VHH ض بثت ٢٢ س ٥ ثب ٣ VEGFR2 تقیی ٠ ت ٤ ا ی آ ٨١ ب... 71 ح
ى ٨ طؾت 9-2-2 االیعای ض بثتی جت ٢ ی ثط ؾ ٤... 71 10-2-2 اضظیبثی اتهب ٧ بی VHH ض بثت ٢٢ س ٥ ثب VEGFR2 ث ٦ ٤١ احی اتهب ث ٦ ضؾپت ٤ ض... VEGF 72 11-2-2 تؿت ض بثت ت بع ٧ بی VHH ٢ ترت... 72 12-2-2 ثیب آ ١ تی ثبزی ٧ بی ت ز ی ٢ ی ٢ ترت زض ٣ ت ٤ ض ٧ ب ٣ ؾ ٤ ی ٦ ٧ بی پط ٣ بضی ٤ تی تيب ٣ ت... 73 1-12-2-2 ىبغ یس ٣ PCOMB3X ثب تطی E.COLI ؾ ٤ ی ٦ TOP10F... 73 ٣ ت ٤ ض 2-12-2-2 ٣ PHEN6C ثب تطی ٧ بی E.COLI ؾ ٤ ی ٦ ٧ بی...WK6 ٣ BL21 73 1-2-12-2-2 ا حب حه ٤ PCR زض ٣ ٣ ت ٤ ض...PTG19-T 74 ٧ ض 2-2-12-2-2 آ ١ عی ی غ ٧ بی VHH ا حب قس ٥ زض ٣ ت ٤ ض ٣ ت ٤ ض ٣ PTG19-T...PHEN6C 74 3-2-12-2-2 ا حب غ ٧ بی ثط یبىت ٦ زض ٣ ٣ ت ٤ ض ٣ PHEN6C ا ١ ت ب ٣ ت ٤ ض ٤١ تط یت ث ٦ ثب تطی ٧ بی E.COLI ؾ ٤ ی ٦ ٧ بی BL21 75...WK6 ٣ 4-2-12-2-2 ثیب ٧ ب VHH زض ثب تطی ٧ بی E.COLI ؾ ٤ ی ٦ ٧ بی ٣ BL21 76...WK6 5-2-12-2-2 اؾترطاد پط ٣ تئی ٠ ٧ بی پطی پالؾ ی... 76 13-2-2 س ؾبظی بیؿ ٦ ای... 77 14-2-2 قجی ٦ ؾبظی زی ٢ ب ی ٤ ٤ ی (MD)... 77 15-2-2 قجی ٦ ؾبظی زا ی ٢ ٤ ٤ ی... 78 1-15-2-2 ق ٢ بؾبیی حت تطی ٠ ربی ب ٥ اتهب ٧ ب VEVHH ثط ض ٣ ی...VEGF 78 2-15-2-2 زض ١ ؾط طىت ٠ ت بض VEGFزض قجی ٦ ؾبظی یب ٢ ١ ف ٤ ٤ ی... 79 3-15-2-2 ثطضؾی پتب ١ ؿی ٧ بزض VHH اتهب ث ٦ آ ی ٤٢ اؾیس ٧ بی یسی... VEGF 79 16-2-2 قجی ٦ ؾبظی زی ٢ ب ی ٤ ٤ ی پ ؽ ٧ بی ثط عیس ٥... 80 فصل س م: تبیح... 81 1-3 ت ٨ ی ٦ ای ٤١٤ غ /آ ١ تی غ... 82 1-1-3 ثیب ٣ تر یم... VEGF-RBD 82 2-1-3 تبذ ٤ ضز ی زسز پط ٣ تئی ٠ ٤١ تط یت... 83 1-2-1-3 زای طیعاؾی ٤ پط ٣ تئی ٠ ضى س قس ٥... 83 2-2-1-3 تأییس تك ی پی ١٤ س ٧ بی زی ؾ ٤ يیس زض... VEGF 84 3-2-1-3 غب ق ٦ ؾبذتبض ز ٣ پط ٣ تئی ٠ ضى س قس ٥... 84 4-2-1-3 ثطضؾی ىقب یت ثی ٤ ٤ غی پط ٣ تئی ٠... 85 5-2-1-3 ثطضؾی ٤ ٧ غ ١ یتی پط ٣ تئی ٠ ضى س قس ٥... 86 2-3 ت ٨ ی ٦ آ ١ تی ثبزی ٧ بی ذط ٤ قی حب ٤١ ی ٦ ف ی ٦ ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی قتطی... 86 1-2-3 تر یم ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی قتطی... 86 2-2-3 ثطضؾی پبؾد ای ٢ ی ذط ٤ ف ی ٦ ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی قتطی... 87 خ
ى ٨ طؾت 3-2-3 تر یم ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی ذط ٤ قی... 88 3-3 ای ٢ ی ظایی قتط... 89 4-3 ؾبذت تبثرب ٦١ غ ١ ی آ ١ تی ثبزی ت ز ی ٢ یVHH ف ی ٦ ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض...VEGF 89 5-3 م ٢ ی ؾبظی ٢ زی ٦٢ ىبغی ١ بیك ط ٧ بی VHH اذتهبنی ف ی ٦ ٣ VEGF اضظیبثی پیكطىت آ 91... 1-5-3 االیعای ىبغ ٧ بی پ ی ١٤ ب... 92 2-5-3 تیتطاؾی ٤ ىبغ ٧ بی ٤١ تط یت ز ٣ ض ٧ بی م ٢ ی ؾبظی... 93 3-5-3 ثطضؾی ٣ ر ٤ ز غ VHH زض ١٤ ی ٧ بی ذط ٣ ری ز ٣ ض ٧ بی م ٢ ی ؾبظی... 93 6-3 ا ١ تربة ىبغ ٧ بی ١٤ ٤١٤ ب ١ بیك ط ٧ بیی VHH ثب ثیكتطی ٠ سضت اتهب ث ٦ آ ١ تی غ... 94 7-3 مطثب طی ٧ بی VHH اذتهبنی ثب سضت اتهب ح ث ٦ ٤١ احی ف طزی ٣VEGF تقیی ٠ ت ٤ ا ی آ ٨١ ب... 95 1-7-3 آ ١ ب یع ت ٤ ا ی ٧ ب... 96 8-3 بضایی ٧ بی VHH ٢ ترت زض ٨ بض اتهب VEGF ث ٦ VEGFR2 زض ؾغح ؾ ٤ ٧ بی 100...HUVEC 9-3 تأییس ت ٤ ا ١ بیی اتهب ٧ بی VHH ٢ ترت ث ٦ ربی ب ٥ اتهب ث ٦ ضؾپت ٤ ض 101...VEGF 10-3 ثیب ٧ بی VHH ٢ ترت زض یعثب ٧ بی پط ٣ بضی ٤ تی... 102 1-10-3 ثیب زضثب تطی E.COLI ؾ ٤ ی ٦ F 102...TOP10 ١٤ ی ٢ 2-10-3 غ ٧ بی VHH ٢ ترت زض ٣ ت ٤ ض 102...PHEN6C 3-10-3 ثیب ٧ ب VHH زض ثب تطی ٧ بی E.coli ؾ ٤ ی ٦ ٧ بی...103 WK6 ٣ BL21 چ 2 4-11-3 پیك ٤ یی ربی ب ٥ اتهب ٧ ب VHH ثط ض ٣ ی 104...VEGF 1-11-3 س ؾبظی ؾبذتبض ٧ ب VHH...104 2-11-3 قجی ٦ ؾبظی زی ٢ ب ی ٤ ٤ ی ٣ ث ٨ ی ٦٢ ؾبظی ؾبذتبض ٧ بی س ؾبظی قس ٥...105 3 11-3- قجی ٦ ؾبظی زا ی ٢ ٤ ٤ ی... 110 12 3- ثطضؾی ت ٤ ا ١ بیی آ ١ تی ثبزی ٧ بزض پ ٤ قب ١ س ٤١ احی ف طزی 115...VEGF 13 3- غب ق ٦ پبیساضی پ ؽ ٧ بی آ ١ تی غ -آ ١ تی ثبزی...118 14-3 اضظیبثی ٣ بیؿ ٦ پط ٣ ىبی ٧ یسض ٣ پبتی ٧ ب... 120 VHH 15-3 بیؿ ٦ ٧ ب VEVHH اظ ١ ؾط ق ٢ بؾبیی اپی ت ٤ ح ٧ بی كتط ثط ض ٣ ی...121 VEGF فصل چ برم: ثحث...123 1-4 ثیب ؿأ 124...٦ طا ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض VEGF...127 3-4 ثیب ٣ تبذ ٤ ضز ی زسز ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض...127 VEGF 4-4 ؾبذت تبثرب ٦١ ١ بیف ىبغی ٣ م ٢ ی ؾبظی ٧ بی VHH اذتهبنی ف ی ٦...130 VEGF 5-4 مطثب طی ٧ بی VHH اذتهبنی ثب سضت اتهب ح ث ٦ ٤١ احی ف طزی ٣ یػ ی ٣ VEGF ٧ بی ت ٤ ا ی آ ٨١ ب...132 6-4 پیك ٤ یی ربی ب ٥ اتهب ٧ ب VHH ثط ض ٣ ی 135...VEGF ز
ى ٨ طؾت ١ تیز ٦ 7-4 یطی... 139 8-4 پیك ٨٢ بزات 140... ه بثع... 141 ف رست ضىل ب ق 1-1 ىب ت ٤ ض ٧ ب ٣ ؾ ٤ ٧ بی زض یط زض ANGIOGENESIS. ٣ VASCULOGENESIS...2 ق 2-1 طاح رت و ىطای ٢ س آ ١ ػی ٤ غ ١ ع....3 ق 3-1 پیكط ٣ ی ضقس ت ٤ ٤ ض ٣ ا بء تبؾتبظ ث ٤ اؾغ ٦ ض عایی....5 ق 4-1 بیؿ ٦ ؾیؿت ض ی زض ثبىت ٧ بی عجیقی ٣ ؾطعب ١ ی... 6 ق 5-1 ؾبذتبض غ ١ ی افضبء ذب ٤١ از ٥ 8...VEGF ق 6-1 ١ بیف ٣ VEGF-A ا ١ غجب PIGF ٣ VEGF-A زض ق آظاز... 10 ق 7-1 اتهب افضبی ذب ٤١ از ٥ VEGF ث ٦ یط ١ س ٥ ٧ ب... 13 ق 8-1 بیؿ ٦ افضبی رت و ذب ٤١ از ٥ VEGF اظ حبػ اتهب ث ٦ یط ١ س ٥ ٣ ف طزقب ثی ٤ ٤ غی... 14 ق 9-1 ق بیی ی اظ ١ ح ٥٤ احط صاضی تط یجبت رت و ضس ض عایی ٧ سى ٢ س ثطف ی ٦ ٣ VEGF ضؾپت ٤ ض ٧ بیف... 20 ق 10-1 ض ١٣ س ت ب ی آ ١ تی ثبزی ٧ ب... 25 ق 11-1 غقبت آ ١ تی ثبزی ثب ذبنیت اتهب ث ٦ آ ١ تی غ... 27 ق 12-1 تيب ٣ ت ٤ ر ٤ ز زض ت ٤ ا ی اؾیس ٧ بی آ ی ٦٢ ثی ٠ ٢ بع تنیط آ ١ تی ثبزی ٧ بی ق ٤ ٣ ظ ١ زیط ٥ ؾ ٢ ی ٠... 32 ق 13-1 ح ٦ ٧ یب CDR ث ٦ ض ١ ؾجع ١ كب زاز ٥ قس ٥ اؾت ٦ ث ٦ ن ٤ ضت ذ ٤ ق ٦ زض ی ؾ ت VHH آضایف یبىت ٦ ا ١ س.... 34 ق 14-1 اؾتيبز ٥ اظ VHH زض زض ب ADEPT. VHH ته قس ٥ ث ٦ ی آ ١ عی... 36 ق 1-3 آ ١ ب یع ثیب ٤١ تط یت. VEGF... 82 ق 2-3 آ ١ ب یع تر یم ٣ ضى سی ٢ پط ٣ تئی ٠ ٤١ تط یت...VEGF 83 ق 3-3 ثطضؾی حت ٤ ای ؾبذتبض ز ٣ پط ٣ تئی ٠ ضى س قس ٥ ت ٤ ؾظ... FAR-UV CD 84 ق 4-3 ثطضؾی ىقب یت ثی ٤ ٤ غی پط ٣ تئی ٠ ضى س قس ٥... 85 ق 5-3 ثطضؾی ٤ ٧ غ ١ یتی پط ٣ تئی ٠ ضى س قس ٥ ت ٤ ؾظ DLS.... 86 ق 6-3 تر یم ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی قتطی.... 87 ق 7-3 ض ١٣ س ای ٢ ی ظایی ذط ٤... 88 ق 8-3 تر یم ای ٤ ٤١٤ ث ٤ ی ٠ ٧ بی ذط ٤ قی... 88 ق 9-3 ض ١٣ س ای ٢ ی ظایی قتط... 89 ق 10-3 طاح ؾبذت تبثرب ٦١ غ ١ ی...VHH 90 ق 11-3 ١٤ ی ٢ غقبت غ ١ ی...VHH 91 ق 12-3 االیعای ىبغ پ ی ١٤ ب ٣ اضظیبثی سضت اتهب ىبغ ٧ بی ١ بیك ط VHH ث ٦ VEGF پؽ اظ ٧ ط ز ٣ ض م ٢ ی ؾبظی... 92 ش
ى ٨ طؾت ق 13-3 اضظیبثی پیكطىت م ٢ ی ؾبظی... 94 ق 14-3 مطثب طی ٧ بی ٤ اذتهبنی ثب سضت اتهب ح ث ٦ VEGF ت ٤ ؾظ االیعای ىبغ ١٤ ب ٤١٤... 95 ق 15-3 تأییس ٣ ر ٤ ز غ VHH زض ٧ بی ٤ ١٤ ٤١٤ ب اذتهبنی ثب سضت اتهب ح ث ٦ ٤١ احی ف طزی...VEGF 96 ق 16-3 ت ٤ ا ی آ ی ٤٢ اؾیسی ٧ ب VHH ٣ بیؿ ٦ ثب ت ٤ ا ی آ ی ٤٢ اؾیسی VH ا ١ ؿب ١ ی... 97 ق 17-3 ثطضؾی كره ٦ ٧ بی آ ی ٤٢ اؾیسی ٧ بزض VHH ت ٤ ا ی ٧ ب VEVHH... 99 ق 18-3 االیعای ج ٢ ی ثط ؾ ٤ ٧ بی 100...HUVEC ق 19-3 تؿت ای ٤١٤ اؾی ت ٤ ؾظ ٣ اضیب ١ ت ٤ تب ١ ت...101 VEGF ق 20-3 تأییس ا ١ ت ب ىبغ یس ٧ بی ٤١ تط یت PCOMB3X حب ٧ بی VHH ٢ ترت ث ٦ یعثب ثب تطیبیی ت ٤ ؾظ...102 COLONY-PCR ق 21-3 ١٤ ی ٢ غ ٧ بی VHH ٢ ترتزض ٣ ت ٤ ض...103 PHEN6C ق 22-3 ؾبذتبض س ؾبظی ٧ ب... 105 VEVHH ق 23-3 ثطضؾی پبیساضی ؾیؿت قجی ٦ ؾبظی... 106 ق 24-3 ثطضؾی پبیساضی ؾبذتبض ٧ بی قجی ٦ ؾبظی قس ٥ ثب حبؾج ٦ ققبؿ غیطاؾی ٤...107 ق 25-3 ثطضؾی پبیساضی ؾبذتبض ٧ بی قجی ٦ ؾبظی قس ٥ ثب حبؾج ٦ RMSD تنییطات 108...RMSD ق 26-3 ثطضؾی افتجبض ؾبذتبض ٧ بی یب ١ ی ٠ ىطای ٢ س قجی ٦ ؾبظی زی ٢ ب ی ٤ ٤ ی...109 ق 27-3 ثطضؾی ربی ب ٥ طاض یطی ؾ ٦ آ ی ٤٢ اؾیس ثب ٤ قیت حيبؽت قس 110...٥ ق 28-3 ق ٢ بؾبیی آ ی ٤٢ اؾیس ٧ بی ف طزی 111...VEGF ق 29-3 ؾبذتبض پ ؽ ٧ بی VEVHH/VEGF پیف ثی ٢ ی قس ٥ ت ٤ ؾظ قجی ٦ ؾبظی یب ٢ ١ ف ثی ٠ ٤ ٤ ی...113 ق 30-3 ثطضؾی ربی ب ٥ اتهب آ ١ تی ثبزی ٧ بی VEVHH ثط ض ٣ ی آ ١ تی غ 114...VEGF ق 31-3 ربی ب ٥ اتهب ٧VHHب ثط ض ٣ ی 115...VEGF. ق 32-3 ثطضؾی ت ٤ ا ١ بیی آ ١ تی ثبزی ٧ بزض پ ٤ قب ١ س ٤١ احی ف طزی...116 VEGF ق 33-3 ثطضؾی پبیساضی پ ؽ ٧ بیآ ١ تی غ -آ ١ تی ثبزی ٣ حجبت ربی ب ٥ اتهب ت ٤ ؾظ قجی ٦ ؾبظی زی ٢ ب ی ٤ ٤ ی...118 ق 34-3 ثطضؾی پبیساضی ؾبذتبض ٧ بی قجی ٦ ؾبظی قس ٥. تنییطات...119 RMSD ق 35-3 بیؿ ٦ پط ٣ ىبی ٧ یسض ٣ پبتی ٧ ب... 121 VEVHH ق 36-3 تؿت ض بثت ت بع ٧ ب... 122 VEVHH ض
ى ٨ طؾت ف رست خذ ل ب رس ٣ 1-1 افضبی ذب ٤١ از ٥ ٣ VEGF ىقب یت ثی ٤ ٤ غی آ ٨١ ب.... 12 رس ٣ 2-1 ٨ بض ٢٢ س ٥ ٧ بی ؿیط ؾی ٢ ب ی ٢ ٤ قیت ٣ VEGF ٧ بی ثب ی ٢ ی آ ٨١ ب... 17 رس ٣ 3-1 تقسازی اظ آ ١ تی ثبزی ٧ بیی ٦ ثطای بنس زض ب ١ ی تبییسی ٦ طىت ٦ ا ١ س... 21 رس 1 ٣-4 یعا ىط ٣ آ ١ تی ثبزی ٧ ب ث ٦ ف ٤٢ ا زاض ٣ زض چ ٢ س ؾب اذیط ١ ؿجت ث ٦ ؾبیط تط یجبت زاض ٣ یی... 23 رس ٣ 5-1 یؿت تقسازی اظ ٧ بی VHH ت ٤ یس قس ٥ ت ٤ ؾظ قط ت ABLYNX ثب اضظ زض ب ١ ی... 39 رس ٣ 1-2 كرهبت پطای ط ٧ بی PCR ا ٣ ٣ ز ٣ ر ٨ ت ت خیط ٧ ب... VHH 60 رس ٣ 2-2 ارعاء تك ی ز ٢٧ س ٥ ر ٤ ط ٣ ا ٢ ف ت خیط غقبت غ ١ ی آ ١ تی ثبزی ٧ بی VHH. ٣ VH... 60 رس ٣ 3-2 ارعاء تك ی ز ٢٧ س ٥ ر ٤ ط ٣ ا ٢ ف ت خیط غقبت غ ١ ی آ ١ تی ثبزی ٧ بی ت ز ی ٢ ی...VHH 60 رس ٣ 4-2 ؾی ٧ بی ز بیی طاح رت و ٣ ا ٢ ف ت خیط غقبت غ ١ ی آ ١ تی ثبزی ٧ بی... VHH ٣ VH 61 رس ٣ 5-2 ؾی ٧ بی ز بیی طاح رت و ٣ ا ٢ ف ت خیط غقبت غ ١ ی آ ١ تی ثبزی ٧ بی ت ز ی ٢ ی...VHH 61 رس ٣ 6-2 ارعاء ٣ ا ٢ ف ٧ ض آ ١ عی ی ىبغ یس... PCOMB3X 61 رس ٣ 7-2 ارعاء ٣ ا ٢ ف ٧ ض آ ١ عی ی غقبت غ ١ ی...VHH 62 رس ٣ 8-2 ارعاء ٣ ا ٢ ف ا حب غقبت غ ١ ی ٣ ىبغ یس... 62 رس ٣ 9-2 قطایظ قؿتك ٤ زض ز ٣ ض ٧ بی رت و م ٢ ی ؾبظی... 68 رس ٣ 10-2 كرهبت پطای ط ٧ بی ٣ ا ٢ ف ت خیط غقبت غ ١ ی آ ١ تی ثبزی ٧ بی ت ز ی ٢ ی... VHH 73 رس ٣ 11-2 ؾی ٧ بی ز بیی طاح رت و ٣ ا ٢ ف ت خیط غقبت غ ١ ی آ ١ تی ثبزی ٧ بی ت ز ی ٢ ی... VHH 74 رس ٣ 12-2. ارعاء ٣ ا ٢ ف ا حب حه ٤ PCR زض ٣ ٣ ت ٤ ض....PTG19-T 74 رس ٣ 13-2 ارعاء ٣ ا ٢ ف ٧ ض آ ١ عی ی غ ٧ بی VHH ا حب قس ٥ زض ٣ ت ٤ ض... PTG19-T 75 رس ٣ 14-2 ارعاء ٣ ا ٢ ف ٧ ض آ ١ عی ی ٣ ت ٤ ض... PHEN6C 75 رس ٣ 15-2 ارعاء ٣ ا ٢ ف ا حب غ ٧ بی ٧ ب VHH ٣ ت ٤ ضPHEN6C ٣... 76 رس ٣ 1-3 م ٢ ی قس ىبغ ٧ بی ١ بیك ط ٧ بی VHH اذتهبنی ف ی ٦ VEGF عی 6 ز ٣ ض م ٢ ی ؾبظی.... 93 رس ٣ 2-3 ٣ یػ ی ٧ بی آ ی ٤٢ اؾیسی ٧ ب VHH ٣ تيب ٣ ت ٧ بی VHH زض بیؿ ٦ ثب ز ی ٠ ٧ بی... VH 98 رس ٣ 3-3 ثطضؾی افتجبض س ؾ ٦ ثقسی ٧ ب VEVHH زض بیؿ ٦ ثب ا ٤... 104 رس ٣ 4-3 آ ١ ب یع ٧ بی آ بضی طح ٦ ا ٣ قجی ٦ ؾبظی یب ٢ ١ ف ثی ٠ ٤ ٤ ی ت ٤ ؾظ ١ ط اىعاض... HADDOCK 110 رس ٣ 5-3 آ ١ ب یع ٧ بی آ بضی طح ٦ ز ٣ قجی ٦ ؾبظی یب ٢ ١ ف ثی ٠ ٤ ٤ ی ت ٤ ؾظ ١ ط اىعاض ٣ HADDOCK بیؿ ٦ ثب طح ٦ ا ٣ قجی ٦ ؾبظی... 112 رس ٣ 6-3 آ ١ ب یع ٧ بی آ بضی قجی ٦ ؾبظی یب ٢ ١ ف ثی ٠ ٤ ٤ ی ٧ سى ٢ س ت ٤ ؾظ ١ ط اىعاض ٣ HADDOCK بیؿ ٦ ثب طح ٦ قجی ٦ ؾبظی ثس ٣ ٧ سه... 117 ظ
ى ٨ طؾت رس ٣ 7-3 آ ١ ب یع ٣ بیؿ ٦ ا ١ طغی یب ٢ ١ ف ثی ٠ ٤ ٤ ی آ ١ تی غ -آ ١ تی ثبزی زض ؾبذتبض ٧ بی ثط عیس ٥ قجی ٦ ؾبظی ٧ بی ٧ سى ٢ س ٣ ثس ٣ ٧ سه... 117 رس ٣ 8-3 حبؾج ٦ ا ١ طغی آظاز اتهب آ ١ تی غ /آ ١ تی ثبزی... 120 ؼ
چىیذ ت ٤ یس VHH ف ی ٦ ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض VEGF ا ١ ؿب ١ ی ٣ تقیی ٠ ذه ٤ نیبت آ ؾیس ٥ قیطی ٠ قب ٢٧ یب ثس ی ١ ف یسی VEGF زض ض عایی پبت ٤ ٤ غی ٨ بض آ اظ ٨ تطی ٠ اؾتطاتػی ٧ ب زض زض ب ثی بضی ٧ بی رت و ثره ٤ ل ؾطعب ی ثبقس. زض حب حبضط إحطتطی ٠ زاض ٣ ثط ف ی ٦ VEGF آ ١ تی ثبزی ٧ بی ١٤ ٤١٤ ب ی ٧ ؿت ٢ س ٦ ای ٠ ٤ ٤ ضا ٧ سه طاض ی ز ٢٧ س. آ ١ تی ثبزی ٧ بی ق ٤ ف یطم ١ ف ٨ ی ٦ زض زض ب ؾطعب ایيب ی ٢٢ س زاضای قبیجی ی ثبق ٢ س ٦ آ ١ تی ثبزی ٧ بی ت ز ی ٢ ی یب VHH ثق ٤٢ ا ٤ چ تطی ٠ غقبت آ ١ تی ثبزی ثط آ ٨١ ب ىبئ آ س ٥ ا ١ س. ذه ٤ نیبت ٢ حهط ثيطز ٧ ب VHH ٤ رت طزیس ٥ ثط آ ١ تی ثبزی ٧ بی ق ٤ ثطتطی رؿت ٦ ٣ ثق ٤٢ ا ربی عی ٢ ی ٢ بؾت ثطای آ ٨١ ب غطح ثبق ٢ س. ثقال ٥٣ ٣ یػ ی ٧ بی غ ٤ ة ىیعی ٤ قی یبیی ٣ ىبض ب ٤ ٤ غی ٧ ب VHH آ ٨١ ب ضا زض ظ ط ٥ ١ ؿ رسیس زاض ٧٣ بی اظ ٤١ ؿ آ ١ تی ثبزی طاض زاز ٥ اؾت. ثب ت ٤ ر ٦ ث ٦ ا ٧ یت ٨ بض ٣ VEGF ٣ یػ ی ٧ بی ثی ١ ؾیط ٧ ب VHH ٧ سه اظ ای ٠ غب ق ٦ ت ٤ یس VHH ف ی ٦ ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض VEGF طاض زاز ٥ قس تب ثسی ٠ تطتیت اظ اتهب VEGF ث ٦ ضؾپت ٤ ض ب ١ قت ثق آیس. ث ٢ ؾ ٤ ض رساؾبظی ٧ بیی VHH ٦ اذتهبنب ربی ب ٥ ف طزی VEGF ضا ٧ سه طاض ی ز ٢٧ س ثط اؾبؼ ؾبذتبض ز ی پ ؽ VEGF-RBD/VEGFR2 اظ ی اؾتطاتػی مطثب طی تط یجی ثط اؾبؼ ت ٢ ی ٧ بی ١ بیف ىبغی ٣ االیعای ض بثتی اؾتيبز ٥ طزیس. پؽ اظ ت ٨ ی ٦ ٢ زی ٦٢ غ ١ ی غقبت VHH اظ قتط ای ٠ تبثرب ٦١ ١ بیف ىبغی VHH ؾبذت ٦ قس. ثطای رساؾبظی ىبغ ٧ بی ١ بیك ط VHH ثب ت بی ثبال ث ٦ ز ی ٠ ته ق ١٤ س ٥ ث ٦ ضؾپت ٤ ض VEGF م ٢ ی ؾبظی ٧ بی ت ٤ ا ی ؾرت یطا ٦١ ای ا ١ زب طىت. ىبغ ٧ بی اذتهبنی ف ی ٦ پط ٣ تئی ٠ ٧ سه عی 6 ز ٣ ض م ٢ ی ؾبظی ثغ ٤ ض بث ت ٤ ر ٨ ی م ٢ ی طزیس ١ س. ١ تبیذ االیعای ض بثتی حب ی اظ ای ٠ ث ٤ ز 82 ٦ زضنس ٧ بی ٤ مطثب قس ٥ ثطای اتهب ث ٦ VEGF ٤ ٤ ثب VEGFR2 ض بثت طز ٥ ٣ ث ٦ ربی ب ٥ اتهب ث ٦ ضؾپت ٤ ض VEGF ته ی قس ١ س. ؾبذتبض ؾ ٦ ثقسی ای ٠ ٧ ب VHH س ؾبظی ٣ ت ٤ ؾظ قجی ٦ ؾبظی زی ٢ ب ی ٤ ٤ ی ث ٨ ی ٦٢ قس. ؾپؽ ثب اؾتيبز ٥ اظ قجی ٦ ؾبظی یب ٢ ١ ف ثی ٠ ٤ ٤ ی آ ١ تی غ -آ ١ تی ثبزی ثط اؾبؼ اعالفبت طیؿتب ٤ طاىی پ ؽ VEGF/VEGFR2 قجی ٦ ؾبظی زی ٢ ب ی ٤ ٤ ی ٣ حبؾجبت ا ١ طغی آظاز MM/PBSA ته ٤ یطی اظ ربی ب ٥ اتهب آ ١ تی ثبزی ٧ ب ثط ض ٣ ی آ ١ تی غ اضائ ٦ طزیس. ثط اؾبؼ ١ تبیذ غب قبت ٧ بی VHH ٢ ترت ثب ا ١ طغی اتهب ثبالیی ث ٦ ربی ب ٥ اتهب ث ٦ ضؾپت ٤ ض VEGF ته قس ١ س ٣ ثیكتطی ٠ ت بی ضا ث ٦ آ ی ٤٢ اؾیس ٧ بیی اظ ١ كب VEGF زاز ١ س ٦ ؿئ ٤ اتهب VEGF ث ٦ VEGFR2 ث ٤ ز ١ س. ١ تبیذ االیعای ض بثتی ای ٤١٤ اؾی ثب ٣ اضیب ١ ت ٤ تب ١ ت ١ یع ٣ VEGF غب قبت تئ ٤ ضی ١ كب زاز آ ١ تی ثبزی ٧ ب ثغ ٤ ض إحطی آ ی ٤٢ اؾیس ٧ بی یسی ف طزی VEGF ضا پ ٤ قف زاز ٥ ب ١ اتهب VEGF ث ٦ ضؾپت ٤ ض آ ی طز ١ س ٣ احت بال ىقب یت ثی ٤ ٤ غی آ ضا رت ی ؾبظ ١ س. ای ٠ غب ق ٦ ٧ بی VHH ٢ ترت ضا ثق ٤٢ ا ب ١ سیس ٢ بؾت ضس ٣ VEGF ضس آ ١ ػی ٤ غ ١ ع قطىی ی ٢ س. ولوبت ولیذی: رگسایی فبوت ر رضذ ا ذ تلیبل رگی )VEGF( آ تی ثبدی ته دهی ی )VHH( تى ل شی وبیطگر فبشی ضجی سبزی هیب ى ص ثیي ه لى لی
Abstract Production of VHH against receptor binding domain of human VEGF and its characterization S. Shirin Shahangian Because of the central role of VEGF in pathologic angiogenesis, its blockade provides a promising strategy for treatment of several diseases, typically cancer. Currently, monoclonal antibodies targeting VEGF are the most effective anti-vegf drugs. Despite of beneficial role in cancer therapy, monoclonal antibodies have some drawbacks which single domain antibodies (VHHs) as the smallest antibody fragment could obviate those. The unique properties enable VHHs to excel conventional therapeutic antibodies and be a valid alternative to them. Moreover, the favorable physicochemical and pharmacological properties of VHHs, leaves them ideally placed as a new generation of antibody-based therapeutics. Regarding the importance of inhibiting VEGF and unique features of VHHs, the present study aimed to generate VHHs against the receptor binding domain of VEGF, thereby blocking of VEGF binding to its receptor. Considering with high resolution crystal structure of VEGF-RBD/VEGFR2 complex, we could adopt a combinatorial screening strategy: stringent panning and competition ELISA, to direct the panning procedure to dominantly screen the favorable binders that bind and block key functional regions of VEGF. After preparing the gene repertoire of VHH fragments from an immunized camel, a VHH phage display library was constructed. We adopted a stringent successive biopanning to isolate the phages displaying VHH with high affinity to VEGF-RBD.A significant enrichment of phages that specifically bound to the target protein was obtained after six rounds of panning. Based on competition assay, the majority of the screened clones (82%) showed the VEGFR2 mimicry behavior for binding to VEGF molecule and compete with this receptor. Using molecular simulation of antigen-antibody interaction based on the crystallographic information of VEGF/VEGFR2, molecular dynamics simulations and MM/PBSA free energy calculations, we provide a picture of the binding site of antibody on antigen. The results of studies revealed that the selected VHHs binds to the receptor binding site of VEGF with high binding energy and showed the highest affinity to the residues of VEGF which are responsible for VEGF binding to VEGFR2. The results from competition ELISA, Immunoassay using mutant variant of VEGF- RBD and theoretical studies showed that the antibodies potently cover the key functional residues of VEGF, thereby inhibiting VEGF binding to its receptor and probably abrogating its biological activity. This study may represent the selected VHHs as an anti-vegf and anti-angiogenic candidate. Keywords: Angiogenesis, Vascular endothelial growth factor (VEGF), Single domain antibody (VHH), Phage display technology, Molecular docking simulation ل
ىه ا ٣ : س ٦ ٣ تئ ٤ ضی فص ا مذ تئ سی 1
ىه ا ٣ : س ٦ ٣ تئ ٤ ضی 1-1 آ صی ش س زض ا ١ ؿب ٧ ب ای ٠ ٤ ر ٤ زات پیچیس ٥ چ ٢ س ؾ ٤ ی حیبت ت ب ی ؾ ٤ ٧ ب زض ط ٣ تأ ی ٠ ا ؿیػ ٤ از ٣ مصایی ت ٤ ؾظ ؾیؿت ٧ بی پیكطىت ٦ ض ی ی ثبقس. ا ١ تكبض ا ؿیػ ث ٦ ثبىت ٨ ب حسا خط تب ى ٤ ان 100-200 ی ط ٣ تطی ا ب پصیط اؾت ]1-2[. ث ٢ بثطای ٠ ؾیؿت ض ی ثؿیبض ت ٤ ؾق ٦ یبىت ٦ ای ١ یبظ اؾت ٦ تض ٠ ىطا ٧ قس ا ؿیػ ثطای ؾ ٤ ٧ ب زض ای ٠ ى ٤ ان ثبقس ]3[. تك ی حيؼ ٣ ث بی ای ٠ ؾیؿت ٧ بی ض ی ٣ اثؿت ٦ ث ٦ پط ٣ ؾ ٦ ی یسی ض عایی یب آ ١ ػی ٤ غ ١ ع اؾت ٦ ث ٤ اؾغ ٦ آ ض ٧ بی ذ ١٤ ی رسیسی اظ فط ٣ ج ی ایزبز ی طز ١ س. ای ٠ پسیس ٥ پیچیس ٥ حبن تقب ی ت ٢ بت ٢ یب ؾ ٤ ٧ ب ی ؾطی اظ ىب ت ٤ ض ٧ ب ٣ ارعای بتطی ؽ ذبضد ؾ ٤ ی ی ثبقس )ق 1-1(. تك ی ٣ ثبظؾبظی ض ٧ بی ذ ١٤ ی رسیس ت ٤ ؾظ ىطای ٢ س ٧ بی 2 1 فط ٣ ظایی ٣ ض عایی طح ٦ ای حیبتی زض ت ب رب ١ ساضا ١ یع ٣ ثط ٣ ظ ثؿیبضی اظ ثی بضی ٧ ب حؿ ٤ ة ی ق ٤ ز ٦ حب ی اظ ١ ف ىیعی ٤ ٤ غی ٣ پبت ٤ ٤ غی پسیس ٥ ض عایی اؾت ]4[. ٣ ؾ ٤ ٤ غ ١ ع تك ی novo ض ٧ ب اظ آ ١ ػی ٤ ثالؾت ٧ ب ٣ ؾ ٤ ٧ بی ث ٢ یبزی ٣ آ ١ ػی ٤ غ ١ ع ثبظآضایی ٣ ت ٤ ؾق ٦ قج ٦ ض ی ا ٣ ی ٦ اؾت )ق 1-1( ]5[. de ؿى 1-1. فبوت س ب ػ بی دس یش دس.Anggiogenesis vasculogenesis ؿى ثبال ت ظی و ذ بی تىب ث غ ػیؼت س ی ؿى پبیی اخضای دی اس سي بی تبص تىی یبفت ث غ یبفت سا ب ی د ذ. 1 - Vasculogenesis 2 - Angiogenesis 2
ىه ا ٣ : س ٦ ٣ تئ ٤ ضی 1-1-1 رگسایی فیسی ل شیه ف طز ثبىت ٧ بی عجیقی ٣ اثؿت ٦ ث ٦ تأ ی ٠ مصا ٣ ا ؿیػ اظ عطی ض ٧ بی ذ ١٤ ی اؾت. عی ت ب ر ٢ ی ٢ ی قج ٦ ٧ بی ض ی اظ عطی ز ٣ ىطای ٢ س ٣ ؾ ٤ ٤ غ ١ ع ٣ آ ١ ػی ٤ غ ١ ع ایزبز قس ٥ ٣ ؿتط ی یبث ٢ س. زض ٣ ؾ ٤ ٤ غ ١ ع زض ی ثبىت ىب س ض ؾ ٤ ٧ بی ا ١ س ٣ ت یب ت بیع یبىت ٦ ت خیط ی یبث ٢ س ٨١ بیتب ٣ زض ر ٢ ی ٠ ی قج ٦ ٦ ٤ ای ا ٣ ی ٦ ٦ قب آئ ٤ ضت ٣ ض ٧ بی ان ی اؾت تك ی ی ز ٢٧ س. غب قبت زؾت بضی ٣ میط ىقب ؾبظی غ ٧ ب ١ كب زاز ٥ ىب ت ٤ ض ٧ بی ضقس ٣ ضؾپت ٤ ض ٧ بی آ ٨١ ب ٦ اظ ر ٦ ٨ تطی ٠ قب ٣ VEGF ضؾپت ٤ ض ٧ بی آ ی ثبق ٢ س ١ كی ثؿیبض یسی زض ای ٠ طح ٦ ایيب ی ٢٢ س. عی آ ١ ػی ٤ غ ١ ع ض ٧ بی رسیس اظ ر ٤ ا ٦١ ظ ١ ی ٣ ایزبز پ یب ض ٧ بی ا ٣ ی ٦ ث ٤ ك ١ یبىت ٦ حبن ی ق ١٤ س. طاح آ ١ ػی ٤ غ ١ ع قب ىقب قس ؾ ٤ ٧ بی ا ١ س ٣ ت یب ت ٤ ؾظ ىب ت ٤ ض ٧ بی آ ١ ػی ٤ غ ١ ی VEGF( ٣ TGFβ bfgf...( ترطیت مكبی پبی ٦ ت خیط ٨ برطت ٣ ؾ ٤ ٧ بی ا ١ س ٣ ت یب تك ی ٣ ٦ ٤ ت بیع ؾ ٤ ٧ بی ا ١ س ٣ ت یب ث ٦ ٤ یط ٧ ب ٣ ثبظآضایی بتطی ؽ ذبضد ؾ ٤ ی اؾت )ق 2-1( ]6[. زض اىطاز ثب ل آ ١ ػی ٤ غ ١ ع ىیعی ٤ ٤ غی ت ٨٢ ب زض ىطای ٢ س ٧ بیی چ ٤ تط ی ظذ ؾی ر ٢ ؿی ظ ١ ب ٣ ث ٤ ك قج ی ٦ چك ضخ ی ز ٧ س. ای ٠ ض عایی ىیعی ٤ ٤ غی چ ٢ س طح ٦ ای ثب ترطیت مكبی پبی ٦ آمبظ قس ٥ ٣ ثب طاح ی كبث ٦ ض عایی ر ٢ ی ٢ ی ب ی ق ٤ ز ]7, 8[. ؿى 2-1. شاح خت ف فشای ذ آ ظی ط ض. 1( فعب ؿذ ػ بی ا ذ ت یب ت ػظ فبوت س بی آ ظی ط یه 2( تخشیت غبی پبی 3( تىثیش بخشت ػ بی ا ذ ت یب 4( تىی ت بیض ػ بی ا ذ ت یب ث یشي ب 5( ثبصآسایی بتشیىغ خبسج 3 ػ ی.
ىه ا ٣ : س ٦ ٣ تئ ٤ ضی 2-1-1 رگسایی پبت ل شیه ض عایی پبت ٤ ٤ غی فب ان ی ثط ٣ ظ ٣ پیكطىت ثؿیبضی اظ ثی بضی ٧ ب ٧ چ ٤ ؾطعب آتط ٣ اؾ ط ٣ ظ ثی بضی ٧ بی ایؿ ی ضتی ٤٢ پبتی زیبثتی زغ ١ طاؾی ٤ ب ٤ ال آضتطیت ض ٣ بت ٤ ئیس پؿ ٤ ضیبظیؽ ثطذی ثی بضی ٧ بی تح ی ثط ١ س ٥ ؾیؿت فهجی ١ بضؾبیی ٣ ريتی ٣ ؾ ظ ر ٢ ی ٠ ی ثبقس. ثب ت ٤ ر ٦ ث ٦ ای ٦ ٢ ا ط ٣ ظ ٥ ؾطعب ثق ٤٢ ا ی ی اظ زمسم ٦ ٧ بی اؾبؾی ف پعق ی غطح اؾت ٣ ز ٣ ی ٠ فب ط ٣ یط زض ر ٨ ب ی ثبقس ث ٦ ثطضؾی ثیكتط ض عایی زض ای ٠ ثی بضی ی پطزاظی ]15-9[. 1-2-1-1 رگسایی ت ه ر ب ای ٠ ٤١ ؿ آ ١ ػی ٤ غ ١ ع فب ی یسی زض پیكط ٣ ی ت ٤ ٤ ض ٧ بؾت ظیطا ت ٤ ٤ ض ٧ بیی ثب ا ١ ساظ ٥ ثیف اظ 2 ی ی تط ثس ٣ ٤ ٣ ؿ ض عایی بزض ث ٦ تب ی ٠ ا ؿیػ ٤ از ٣ مصایی ١ ج ٤ ز ٥ ٣ ث ٦ تج آ ضقسقب ت ٤ و ی ق ٤ ز ]16[. زض ٣ ا ت ٤ ٤ ض ٧ ب پیف اظ ض عایی زض ی ىبظ ذيت ٦ طاض زاض ١ س ٣ حب ت پبیساضی ثی ٠ ت ؿی ٣ ط ؾ ٤ ی ٣ ر ٤ ز زاضز. ٣ ی پؽ اظ زؾتیبثی ث ٦ ؾیؿت ض ی ضقس ٤ ١ ز ٥ ٣ تبؾتبظ ذ ٤ ا ٢٧ س زاز. ج ٤ ز 2 1 ا ؿیػ ىب ت ٤ ضی یسی زض ت ٤ ؾق ٦ ٧ ئ ٤ ؾتبظی ٣ ت ٤ ٤ ض ی ثبقس. ا ٣ ی ٠ پبؾد ث ٦ ج ٤ ز ا ؿیػ اىعایف ثیب HIF-1 ٣ ث ٦ ز ١ جب آ 4 3 تحطی ثیب پط ٣ تئی ٠ ٧ بیی ٧ چ ٤ ىب ت ٤ ض ضقس ا ١ س ٣ ت یب ض ی )VEGF( ضؾپت ٤ ض ٧ بی VEGF ىب ت ٤ ض ضقس ىیجط ٣ ثالؾتی )FGF( 5 ٣ ىب ت ٤ ض ٧ بی ضقس ا ١ ت ب ز ٢٧ س ٥ )β )TGF,α ی ثبقس ٦ طح ٦ آمبظی ٠ ض عایی ت ٤ ٤ ض ضا ٢ تط ٣ ت ٢ ؾی ی ٢٢ س )ق 3-1(. ث ٤ طز آ ٨١ ب زض قطایظ آؾیت پصیطی ت ٤ ٤ ض یق ٢ ی پیف اظ ض عایی ٤ رت ت ٤ و ضقس ت ٤ ٤ ض ی طزز. زض ای ٠ یب VEGF ٨ تطی ٠ ٣ بضاتطی ٠ ت ٢ ؾی ٢٢ س ٥ آ ١ ػی ٤ غ ١ ع ی ثبقس ]17, 18[. 1 - Homeostasis 2 - Hypoxia-inducible factor 1 3 - Vascular endothelial growth factor 4 - Fibroblastic growth factor 5 - Transforming growth factor 4
ىه ا ٣ : س ٦ ٣ تئ ٤ ضی 1 2 3 ؿى 3-1. پیش ی سؿذ ت س ا مبء تبػتبص ث اػغ س ضایی. 1( حب ت خفت ت س دس شاح ا ی. 2( تشؿح فبوت س بی آ ظی ط یه ت ػظ ػ بی ت سی تىثیش ػ بی ا ذ تیب ا مبء س ضایی. 3( ت ػع ػیؼت س ی خجشا و ج د اوؼیظ اد غزایی سؿذ ت س تبػتبص. ؾیؿت ض ی ت ٤ ٤ ض ٧ ب ثب ؾیؿت ٧ بی ض ی عجیقی تيب ٣ ت ٧ بیی ١ كب ی ز ٧ س. ض ٧ بی ذ ١٤ ی زض اعطاه ثبىت ٧ بی عجیقی ا ١ كقبة ثؿیبض ٢ ؾ ی زاقت ٦ ٣ ثی ٠ ؾ ٧ ٤ بی ا ١ س ٣ ت یب اتهبالت ح ی ٣ ر ٤ ز زاضز. ١ ي ٤ شپصیطی ض ی عجیقی ىكبض بی زض ٣ قج ٦ ای پبیی ٠ ىكبض ا ؿیػ ٣ یعا ph زض حس ىیعی ٤ ٤ غی اؾت. ت ٤ ٤ ض ٧ ب ض ٧ بی میط عجیقی ثب ا ١ كقبثبت پیچ زض پیچ ١ ب ٢ ؾ ٣ زاض ١ س ٢ زط ٦ ث ٦ ایزبز رطیب ذ ٤ ١ ب ٢ بؾت ٧ یپ ٤ ؿی ٣ اؾیس ٣ ظ ی طزز )ق 4-1 (. ای ٠ قطایظ ؾرت ٢ زط ث ٦ ایزبز ت ٤ ٤ ض ٧ بی ب ٣ یق ٤ ز. ثیب ثبالی ٣ VEGF تطقح آ اظ ؾ ٧ ٤ بی ت ٤ ٤ ضی اتهبالت ح ثی ٠ ؾ ٧ ٤ بی ا ١ س ٣ ت یب ضا ؾؿت ی ٢ س ٤ رت ٣ ایزبز ؾیؿت ض ی ی طزز ١ ؿجت ٦ ث ٦ ب ط ٧ ٤ ٤ ٣ بی ؾط ١ ي ٤ شپصیط اؾت ٣ ث ٦ تج آ ىكبض زض ٣ قج ٦ ای ت ٤ ٤ ض اىعایف یبىت ٦ ٣ ب ١ تح ٤ ی زاض ٧٣ ب ث ٦ ؾ ٧ ٤ بی ت ٤ ٤ ضی ی طزز. ای ٠ اتيب ٧ ب ثب ض ٧ بیی ٧ ط چ ٦ ثیكتط VEGF ض ٣ ث ٦ ٣ ذب ت ی صاضز ]19[. 5