ΑΣΚΗΣΗ ΚΑΜΠΥΛΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

ΑΣΚΗΣΗ ΚΑΜΠΥΛΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών 1

Σκοπός της άσκησης Πειραματικός προσδιορισμός του ρυθμού ανάπτυξης βακτηρίων κάτω από διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας και οξυγόνου μέσω κατανόησης και εκτέλεσης έμμεσης μέτρησης της βακτηριακής ανάπτυξης χρησιμοποιώντας μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας της καλλιέργειας σε φασματοφωτόμετρο Ο σχεδιασμός καμπύλης ανάπτυξης βακτηρίων και η παρατήρηση των διαφόρων φάσεων ανάπτυξης του πληθυσμού των βακτηρίων Η απόκτηση γνώσεων και ικανότητας χρήσης του φασματοφωτόμετρου. 1. ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Οι μικροοργανισμοί από άποψη κυτταρικής οργάνωσης διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τους προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς. Οι προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί είναι απλούστεροι και το γενετικό τους υλικό δεν περιβάλλεται από μεμβράνη. Όλα τα βακτήρια είναι προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί. Αντίθετα οι ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί είναι περισσότερο σύνθετοι μορφολογικά, και το γενετικό τους υλικό περιβάλλεται από μεμβράνη (την πυρηνική μεμβράνη) και σε αυτούς ανήκουν ορισμένα φύκη, οι μύκητες και τα πρωτόζωα Τα βακτήρια είναι απλοί μονοκύτταροι προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί με μικρό μέγεθος της τάξης του 1μm. Το σχήμα τους μπορεί να είναι ραβδόμορφο, σφαιρικό ή σπειροειδές. 2. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών απαιτεί πρόσβαση σε πηγές ενέργειας και σε ενώσεις απαραίτητες για την σύνθεση των κυτταρικών τους δομών. Η ανάπτυξη των οργανισμών απαιτεί διαθέσιμο άνθρακα, υδρογόνο, οξυγόνο, άζωτο, θείο, φωσφόρο και ποικιλία άλλων μεταλλικών στοιχείων. Τα κύτταρα λαμβάνουν τα απαραίτητα θρεπτικά στοιχεία μέσω των μεμβρανών τους και τα μετατρέπουν με ενζυμικές αντιδράσεις σε προϊόντα χρήσιμα για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό τους. Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών οδηγεί σε αύξηση του αριθμού τους όταν τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται με διαίρεση. Στην περίπτωση αυτή τα κύτταρα αυξάνουν σε μέγεθος και διαιρούνται σε δύο θυγατρικά κύτταρα περίπου ίσου μεγέθους. Η μελέτη της ανάπτυξης των βακτηριακών κυττάρων δεν ακολουθεί την παρακολούθηση του μεγέθους τους (λόγο του μικρού τους μεγέθους), αλλά την παρακολούθηση της αύξησης του αριθμού τους. 2.1. Η καμπύλη ανάπτυξης Η παρακολούθηση της αύξησης του πληθυσμού των μικροοργανισμών γίνεται μέσω της 2

καμπύλης ανάπτυξης της μικροβιακής καλλιέργειας. Όταν οι μικροοργανισμοί καλλιεργούνται σε υγρά θρεπτικά μέσα, σε κλειστά συστήματα, δεν υπάρχει προσθήκη νέου θρεπτικού μέσου. Για τον λόγο αυτό η συγκέντρωση των θρεπτικών μειώνεται, ενώ η συγκέντρωση των προϊόντων μεταβολισμού αυξάνει. Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών που πολλαπλασιάζονται με κυτταρική διαίρεση μπορεί να παρασταθεί ως ο λογάριθμος του αριθμού των κυττάρων σε σχέση με τον χρόνο. Σχήμα 1. Γραφική παράσταση τυπικής μορφής καμπύλης ανάπτυξης μικροοργανισμών Η μορφή της καμπύλης (Σχήμα 1) που προκύπτει έχει τέσσερις διακριτές περιοχές: (α) Φάση προσαρμογής (Lag phase) Όταν οι μικροοργανισμοί προστίθενται σε νέο θρεπτικό μέσο, συνήθως δεν παρατηρείται αύξηση του αριθμού τους για κάποιο χρονικό διάστημα. Το στάδιο αυτό ονομάζεται φάση προσαρμογής. Αν και τα κύτταρα στην φάση αυτή δεν διαιρούνται και δεν υπάρχει καθαρή αύξηση της κυτταρικής τους μάζας, ωστόσο συνθέτουν νέα συστατικά. Το στάδιο αυτό πριν την έναρξη της διαδικασίας διαίρεσης των κυττάρων είναι απαραίτητο για διάφορους λόγους, όπως για παράδειγμα η προσαρμογή στην διαφορετική σύσταση του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας, η ανάγκη ανάπτυξης ενζύμων για τον μεταβολισμό των στοιχείων που τους παρέχονται κλπ. Η διάρκεια της φάσης προσαρμογής, εξαρτάται από την «κατάσταση» στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα, την φύση και την θερμοκρασία του θρεπτικού μέσου, τον όγκο του εμβολίου (δηλαδή 3

της πυκνής καλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό του θρεπτικού υλικού) κλπ. Όταν το εμβόλιο προέρχεται από καλλιέργεια που βρίσκεται στην εκθετική φάση ανάπτυξης και η σύνθεση του μέσου καλλιέργειας είναι όμοια με αυτή του εμβολίου τότε η φάση προσαρμογής είναι μικρότερη σε διάρκεια. (β) Φάση εκθετικής ανάπτυξης (Exponential phase) Κατά την διάρκεια της εκθετικής φάσης ανάπτυξης οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται και πολλαπλασιάζονται με έναν μέγιστο, για τα δεδομένα της καλλιέργειας, σταθερό ρυθμό ανάπτυξης, οποίος μπορεί να προσδιριστεί πειραματικά, σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα. Επειδή κάθε κύτταρο διαιρείται σε διαφορετική χρονική στιγμή η μορφή της καμπύλης ανάπτυξης είναι ομαλή χωρίς να παρατηρείται απότομη βηματική αύξηση και χαρακτηρίζεται από ένα μέσο ρυθμό ανάπτυξης k ο οποίος αντιστοιχεί στον αιθμό των γενεών n στην μονάδα του χρόνου. (γ) Φάση στασιμότητας (Stationary phase) Μετά το πέρας της εκθετικής φάσης η ανάπτυξη των κυττάρων σταματά και η καμπύλη ανάπτυξης γίνεται οριζόντια. Στην φάση στασιμότητας ο πληθυσμός των ζωντανών κυττάρων παραμένει σταθερός με εξισορρόπηση των ρυθμών ανάπτυξης και θανάτου. Η φάση στασιμότητας παρατηρείται στην βακτηριακή ανάπτυξη όταν ο πληθυσμός των κύτταρων είναι περίπου 10 9 ανά ml ενώ στα πρωτόζωα και στα φύκη η τιμή αυτή φθάνει περίπου 10 6 ανά ml. Ο μικροβιακός πληθυσμός εισέρχεται στην φάση στασιμότητας για διαφόρους λόγους. Ένας προφανής λόγος είναι η έλλειψη των θρεπτικών από το μέσο καλλιέργειας ή η μείωση ενός σημαντικού θρεπτικού παράγοντα. Στις περιπτώσεις αερόβιας καλλιέργειας το διαλυμένο οξυγόνο είναι ο περιοριστικός παράγοντας της ανάπτυξης διότι το οξυγόνο έχει χαμηλή διαλυτότητα στο νερό και δεν επαρκεί για να διατηρήσει την μικροβιακή καλλιέργεια σε ρυθμούς εκθετικής ανάπτυξης. Η ανάπτυξη των κυττάρων δύναται επίσης να σταματήσει λόγο της συσσώρευσης «τοξικών» μεταβολικών προϊόντων στο μέσο ανάπτυξης. Για παράδειγμα οι στρεπτόκοκκοι μπορεί να παράγουν μεγάλες ποσότητες γαλακτικού οξέος με αποτέλεσμα να μειωθεί το ph του διαλύματος και να σταματήσει η περαιτέρω ανάπτυξη. (δ) Φάση θανάτου (Death phase) Η μείωση των θρεπτικών παραγόντων και η αύξηση των «τοξικών» συστατικών στο μέσο ανάπτυξης οδηγούν την καλλιέργεια στη φάση θανάτου. Ο θάνατος των κυττάρων όπως και η ανάπτυξη είναι συνήθως λογαριθμική δηλαδή σταθερό ποσοστό κυττάρων νεκρώνεται κάθε ώρα. Αυτή η σχέση ισχύει ακόμη και όταν ο συνολικός αριθμός των κυττάρων παραμένει σταθερός εξαιτίας της μη λύσης των νεκρών κυττάρων. 2.2. Συνθήκες που επηρεάζουν τον ρυθμό ανάπτυξης των βακτηρίων 4

Ο ρυθμός ανάπτυξης των μικροοργανισμών και κατ επέκταση των βακτηρίων εξαρτάται εκτός από την επάρκεια χημικών στοιχείων στο θρεπτικό υλικό (οξυγόνο, άνθρακας, άζωτο, θείο, φώσφορος, μέταλλα και ιχνοστοιχεία) και απο τις περιβαλλοντικές συνθήκες (θερμοκρασία, ph, ωσμωτική πίεση).οι συνθήκες που δύναται να επηρεάσουν τον ρυθμό ανάπτυξης των βακτηρίων μπορούν να μελετηθούν σε υγρή βακτηριακή καλλιέργεια καθώς θα επηρέασουν διαφορετικά η κάθε μία την καμπύλη ανάπτυξης της καλλιέργειας. 2.2.1. Θρεπτικά συστατικά Τα βακτηριακά κύτταρα λαμβάνουν τα απαραίτητα χημικά στοιχεία (οξυγόνο, άνθρακας, άζωτο, θείο, φώσφορος, μέταλλα και ιχνοστοιχεία) από το θρεπτικό υλικό τους μέσω των μεμβρανών τους και τα μετατρέπουν με ενζυμικές αντιδράσεις σε προϊόντα χρήσιμα για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό τους. Έλλειψη ενός ή περισσοτέρων θρεπτικών συστατικών αναστέλλει την βακτηριακή ανάπτυξη και μπορεί να οδηγήσει τον βακτηριακό κλώνο σε θάνατο. Σε υγρές καλλιέργειες βακτηρίων σταθερού όγκου θρεπτικού υλικού, τα συστατικά αυτά εξαντλούνται με την αύξηση του πληθυσμού των βακτηρίων με αποτέλεσμα ο ρυθμός πολλαπλασιασμού να ελλατώνεται σταδιακά και τέλος να μηδενίζεται. 2.2.1.1. Οξυγόνο Με βάση την ανάγκη των βακτηρίων για μοριακό οξυγόνο (Ο 2 ) διακρίνονται σε πέντε κατηγορίες: Α) Υποχρεωτικά αερόβια βακτήρια (Pseudomonas), τα οποία απαιτούν οξυγόνο για την ανάπτυξή τους Β) Προαιρετικά αναερόβια βακτήρια (E.coli, Staphylococcus, εντεροβακτήρια κ.α.) τα οποία μπορούν να χρησιμοποιούν το οξυγόνο όταν είναι διαθέσιμο αλλά επιβιώνουν και χωρίς αυτό. Γ) Υποχρεωτικά αναερόβια βακτηρία (Clostridium), για τα οποία η παρουσία οξυγόνου είναι τοξική. Δ) Αναερόβια βακτήρια ανεκτικά στο οξυγόνο (lactobacillus), τα οποία δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν το οξυγόνο αλλά διαθέτουν μηχανισμούς με τους οποίους ανέχονται την παρουσία του και διασπούν τις τοξικές για αυτές μορφές οξυγόνου. Ε) Μικροαερόφιλα βακτήρια (campylobacter), τα οποία απαιτούν χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου για την ανάπτυξή τους και είναι ευαίσθητα στην παρουσία υψηλότερων συγκεντρώσεων οξυγόνου. Ένας πολύ απλός τρόπος υστέρησης μοριακού οξυγόνου από υγρές καλλιέργειες είναι η έλλειψη ανακίνησης των καλλιεργειών. 2.2.2. Περιβαλλοντικές συνθήκες 2.2.2.1 Θερμοκρασία Κάθε είδος βακτηρίου εμφανίζει ένα χαρακτηριστικό εύρος θερμοκρασίας στο οποίο μπορεί και 5

πολλαπλασιάζεται. Ανάλογα με αυτό κριτήριο τα βακτήρια διακρίνονται σε ψυχρόφιλα, μεσόφιλα και θερμόφιλα. Πιο αναλυτικά, τα ψυχρόφιλα διακρίνονται σε δύο υποκατηγορίες: τα πραγματικά ψυχρόφιλα που αναπτύσσονται βέλτιστα σε θερμικρασίες 15 ο C και κάτω ενώ είναι όντως ευαίσθητα σε θερμοκρασίες άνω των 20 ο C και τα ψυχρότροπα, τα οποία αναπτύσσονται βέλτιστα σε θερμοκρασίες μεταξύ 20 ο C και 30 ο C. Τα μεσόφιλα βακτήρια αναπτύσσονται σε εύρος των θερμοκρασιών που μεταξύ 30 ο C και 40 ο C με βέλτιστη θερμοκρασία τους 37 ο C και γι αυτό στη κατηγορία αυτή συμπεριλαμβάνονται τα περισσότερα είδη παθογόνων βακτηρίων. Τέλος, τα θερμόφιλα βακτήρια αναπτύσσονται βέλτιστα σε θερμοκρασίες μεταξύ 50 ο C και 60 ο C και τα ενδοσπόρια που σχηματίζουν είναι εξαιρετικά ανθεκτικά ακόμη και σε θερμοκρασία 80 ο C. Οι καμπύλες ανάπτυξης όλων των ανωτέρω περιγραφόμενων κατηγοριών βακτηρίων ανάλογα με την εξάρτηση της ανάπτυξής τους από την θερμοκρασία απεικονίζεται στο Σχήμα 2. Σχήμα 2. Γραφική παράσταση των τυπικών μορφών καμπύλης ανάπτυξης βακτηρίων ανάλογα με την βέλτιστη θερμοκρασία Γίνεται αντιληπτό ότι απόκλειση από τα όρια θερμοκρασιακού εύρους ανάπτυξης μιας βακτηριακής καλλιέργειας θα έχει επιπτώσεις στον ρυθμό πολλαπλασιασμού των βακτηρίων, οι οποίες θα απεικονίζονται και στην αντίστοιχη γραφική παράσταση της καμπύλης ανάπτυξής τους. 6

2.2.2.2 ph Με βάση την εξάρτηση των μικροοργανισμών από το ph αυτοί διακρίνονται σε 3 κατηγορίες: Α) τα οξεόφιλα βακτήρια (Lactobacillus) τα οποία αναπτύσσονται βέλτιστα σε ph από 0.1 έως 5.4 Β) τα ουδετερόφιλα βακτήρια (τα περισσότερα ανθρώπινα παθογόνα), τα οποία αναπτύσσονται βέλτιστα σε ph μεταξύ 5.4 και 8.5 Γ) στα βασεόφιλα βακτήρια (Agrobacterium) τα οποία αναπτύσσονται βέλτιστα σε εύρος ph μεταξύ 7 και 12 ή και παραπάνω 2.2.2.3 Ωσμωτική πίεση Όλα τα κύτταρα συμπεριλαμβανομένων και των βακτηρίων αποτελούνται από 80-90% νερό το οποίο τος αποδίδει και μια ενδοκυτταρική ωσμωτική πίεση. Όταν βρεθούν σε υποτονικά περιβάλλοντα, νερό εισέρχεται στα βακτήρια μέσω των ημιπερατών περιβλημάτων τους με αποτέλεσμα την διόγωσή τους και εν τέλει την ρήξη αυτών. Αναλόγως, όταν βρεθούν σε υπερτονικά περιβάλλοντα, νερό εξέρχεται από τα βακτήρια με αποτέλεσμα την συρίκνωσή τους. Αν και υπάρχουν βακτήρια τα οποία ανέχονται ή και απαιτούν υψηλή αλατότητα (υπερτονικά) περιβάλλοντα τα περισσότερα είναι ευαίσθητα σε ακραίες αλλαγές της αλατότητας του περιβάλλοντός τους και κατά συνέπεια του θρεπτικού υλικού στο οποίο αναπτύσσονται. 2.3. Τα μαθηματικά της ανάπτυξης Κατά την διάρκεια της εκθετικής φάσης ανάπτυξης κάθε κύτταρο διαιρείται σε προκαθορισμένο χρονικό διάστημα. Έτσι ο πληθυσμός διπλασιάζεται σε αριθμό σε προκαθορισμένο χρονικό διάστημα που ονομάζεται χρόνος διπλασιασμού (Δt). Για παράδειγμα αν εμβολιάσουμε μια καλλιέργεια με ένα κύτταρο το οποίο διαιρείται κάθε 20 λεπτά, θα έχουμε 2 κύτταρα σε 20 λεπτά, 4 κύτταρα σε 40 λεπτά κοκ. Επειδή ο πληθυσμός διπλασιάζεται κάθε γενιά σε n γενιές θα έχουμε 2 n κύτταρα στην καλλιέργεια. Αν λοιπόν N (0) είναι ο αρχικός αριθμός των κυττάρων σε χρόνο t=0 Ν (t) ο αριθμός των κυττάρων την χρονική στιγμή t και n = t / Δt, ο αριθμός των γενιών στον χρόνο t τότε ισχύει η σχέση ισχύει [1] N (t) = N (0) 2 n 7

Για τον υπολογισμό του αριθμού των γενεών n σε χρόνο t, λύνοντας την εξίσωση [1] ως προς n=αριθμός γενεών έχουμε: n = (log N (t) - log N (0) / log 2 = (log N (t) - log N (0) ) / 0.301 Ο μέσος ρυθμός ανάπτυξης k που είναι ο αριθμός των γενιών ανά μονάδα χρόνου (συνήθως ανά ώρα) υπολογίζεται ως: [2] k = n / t = (log N (t) - log N (0) ) / (0.301 t) Ο χρόνος διπλασιασμού του βακτηριακού πληθυσμού της καλλιέργειας υπολογίζεται από τον τύπο k = n / t όπου n=1 και t=δt. Άρα, [3] Δt = 1/k Παράδειγμα υπολογισμών: Αρχικός πληθυσμός κυττάρων πολλαπλασιάζεται από 10 3 σε 10 9 κύτταρα εντός 10 ωρών. Ο μέσος ρυθμός ανάπτυξης k υπολογίζεται από την εξίσωση [2]: k= [(log N (t) - log N (0) ] / 0.301 t =(log 10 9 - log 10 3 ) / 0.301 10 hr =(9-3)/3.01 hr =2.0 γενιές / hr Ο χρόνος διπλασιασμού Δt του πληθυσμού της βακτηριακής καλλιέργειας ή μέσος χρόνος ανά γενιά υπολογίζεται από την εξίσωση [3]: 1/k = 1 / (2.0 γενιές / hr) = 0.5 hr / γενιά ή 30 λεπτά / γενιά Ο αριθμός των γενιών n στην διάρκεια των 10 ωρών υπολογίζεται από την εξίσωση [1]: n = t / Δt = 10 ώρες 0.5 hr/ γενιά = 20 γενιές κυττάρων 8

3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Η ανάπτυξη μιας μικροβιακής καλλιέργειας και άρα ο αριθμός των κυττάρων της καλλιέργειας ανά πάσα χρονική στιγμή μπορεί να μετρηθεί με διάφορους τρόπους. Οι διάφορες τεχνικές παρακολούθησης της μικροβιακής ανάπτυξης των κυττάρων βασίζονται στην μέτρηση του αριθμού ή της μάζας αυτών, παράμετροι που μεταβάλλονται κατά την διάρκεια της ανάπτυξης. 3.1. Άμεση μέτρηση του αριθμού των κυττάρων 3.1.1. Άμεση μέτρηση του συνολικού αριθμού των βακτηριακών κυττάρων με την χρήση αιματοκυτόμετρου Ο πλέον προφανής τρόπος μέτρησης του πλήθους των κυττάρων είναι η απευθείας μέτρηση του αριθμού τους. Η χρήση διατάξεων μέτρησης είναι απλή, φθηνή, γρήγορη και δίνει πληροφορίες για το μέγεθος και την μορφολογία των μικροοργανισμών. Το αιματοκυτόμετρο (Σχήμα 3) είναι ένα γυάλινο πλακίδιο με χαραγές που σχηματίζουν τετράγωνα γνωστού εμβαδού. Σχήμα 3. Διάταξη μέτρησης του συνολικού αριθμού των κυττάρων σε αιματοκυτόμετρο με μικροσκόπιο. (α) άνω όψη (β) σχηματική απεικόνιση μέτρησης (γ) μέθοδος μέτρησης των κυττάρων σε διαφορετικά τετράγωνα. 9

Το δείγμα με τους μικροοργανισμούς τοποθετείται στην επιφάνεια του πλακιδίου το οποίο καλύπτεται από μια γυάλινη καλυπτρίδα. Η διάταξη παρατηρείται σε μικροσκόπιο και μετράται ο αριθμός των κυττάρων σε διαφορετικά τετράγωνα από τα οποία λαμβάνουμε τον μέσο όρο. Το δείγμα καταλαμβάνει γνωστό όγκο από τον οποίο υπολογίζουμε τον συνολικό αριθμό των κυττάρων ανά ml. Για παράδειγμα αν μετρήσαμε 28 κύτταρα ανά τετράγωνο κατά μέσο όρο σε 25 τετράγωνα της πλάκας συνολικού εμβαδού 1mm 2, στα οποία το υπερκείμενο πάχος του υγρού δείγματος είναι 0.02 mm, τότε μπορούμε να υπολογίσουμε την συγκέντρωση των κυττάρων ως: (28 κύτταρα / τετράγωνο) * 25 τετράγωνα / (1mm 2 * 0,02 mm) = 3,5 10 4 κύτταρα / mm 3 ή 3,5 * 10 7 κύτταρα /ml (μονάδες: 1m 3 =10 3 dm 3 =10 6 cm 3 = 10 9 mm 3, 1dm 3 = 1L, 1L = 10 3 ml) 3.1.2. Άμεση μέτρηση του αριθμού των ζωντανών βακτηριακών κυττάρων διαδοχικές αραιώσεις και επίστρωση σε τριβλία με στερεό θρεπτικό υλικό Σχήμα 4: Διαδοχικές αραιώσεις βακτηριακής καλλιέργειας και επίστρωση των αραιώσεων σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό υλικό Η άμεση αυτή μέθοδος προσδιορισμού του πληθυσμού των βακτηριακών κυττάρων ανά πάσα χρονική στιγμή της καλλιέργειας είναι περισσότερο χρονοβόρα από ότι εκείνη με την χρήση αιματοκυτόμετρου. Ωστόσο όμως παρουσιάζει ένα βασικό πλεονέκτημαμ ως προς την ακρίβεια των μετρήσεων: προσδιορίζει μόνο τα ζωντανά βακτηριακά κύτταρα καθώς είναι εκείνα μόνο 10

που θα δώσουν αποικίες στο στερεό θρεπτικό και όχι το σύνολο των κυττάρων (ζωντανά και νεκρά). Κατά την μέθοδο αυτή, λαμβάνονται δείγματα της καλλιέργειας ανά 30 λεπτά της ώρας και αραιώνονται 1:10 διαδοχικά σε στείρο υγρό θρεπτικό υλικό κατά το Σχήμα 4 Μικρός καί ίσος όγκος από κάθε αραίωση επιστρώνεται σε στερεή καλλιέργεια. Τα τρυβλία επωάζονται στους 37 ο C για 24 ώρες και κατόπιν υπολογίζεται ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων. Το τρυβλίο (και άρα η αντίστοιχη αραίωση) που επιλέγεται για τον προσδιορισμό του πληθυσμού των ζωντανών κυττάρων σε κάθε χρονική στιγμή είναι εκείνο με αριθμό αποικιών μεταξύ 30 και 300. Ο υπολογισμός του πληθυσμού γίνεται ως εξής: Αριθμός κυττάρων / ml καλλιέργειας = αριθμός αποικιών στο τρυβλίο /όγκος δείγματος αραίωση Για παράδειγμα, εάν παρατηρηθούν 32 αποικίες σε ένα τρυβλίο που αντιστοιχεί σε αραίωση 1/10.000 τότε ο αριθμός των κυττάρων ανά mlτης αρχικής καλλιέργειας είναι Ν=32/1mL (1/10.000)=320.000 βακτήρια ανά ml καλλιέργειας 3.1.3. Άμεση μέτρηση της μάζας των μικροοργανισμών Κατά την ανάπτυξη των μικροβιακών καλλιεργειών ο αριθμός των κυττάρων καθώς και η μάζα τους αυξάνει. Ως εκ τούτου, τεχνικές άμεσης μέτρησης της μάζας των κυττάρων χρησιμοποιούνται στην παρακολούθηση της μικροβιακής ανάπτυξης, όπως για παράδειγμα φυγοκέντριση του υγρού δείγματος, έκπλυση του στερεού ιζήματος, ξήρανση και ζύγιση. Η μέθοδος της απευθείας μέτρησης της μικροβιακής μάζας είναι χρονοβόρα και όχι ιδιαίτερα ευαίσθητη, και χρησιμοποιείται κυρίως για την παρακολούθηση της ανάπτυξης των μυκήτων. Για τις περιπτώσεις βακτηριακών καλλιεργειών επειδή η μάζα των κυττάρων είναι σχετικά μικρή απαιτείται φυγοκέντριση μεγάλου όγκου υγρού δείγματος προκειμένου να έχουμε αξιόπιστα αποτελέσματα. 3.2. Έμμεση μέτρηση της ποσότητας των κυττάρων 3.2.1. Έμμεση μέτρηση της ποσότητας των βακτηριακών κυττάρων μέσω προσδιορισμού ενός μεταβολίτη. Η ποσότητα των πρωτεϊνών ή άλλων σημαντικών βιολογικών μορίων στα κύτταρα (π.χ. ATP, χλωροφύλλη κλπ) είναι περίπου σταθερή ανά κύτταρο και αυξάνει σε μια καλλιέργεια ανάλογα με την αύξηση της μάζας και του αριθμού των κυττάρων. Έτσι, η μέτρηση του πρωτεϊνικού αζώτου ή της χλωροφύλλης είναι έμμεση ένδειξη της ποσότητας των κυττάρων ή των φωτοσυνθετικών φυκών αντίστοιχα που υπάρχουν σε ένα υγρό δείγμα. 3.2.2. Μέτρηση μικροοργανισμών με τη μέθοδο της απορρόφησης ακτινοβολίας 11

Μια γρήγορη τεχνική μέτρησης του πλήθους των μικροοργανισμών βασίζεται στην αρχή της σκέδασης του φωτός όταν αυτό προσπίπτει σε ένα δείγμα με αιωρούμενα κύτταρα. Επειδή το μέγεθος των κυττάρων είναι περίπου σταθερό το ποσό της ακτινοβολίας που σκεδάζεται είναι ανάλογο της συγκέντρωσης των κυττάρων στο δείγμα. Όταν η συγκέντρωση των κυττάρων είναι περίπου 10 εκατομμύρια κύτταρα ανά ml (10 7 /ml) τότε το δείγμα δείχνει νεφελώδες ή θολό ενώ υψηλότερες συγκεντρώσεις κυττάρων κάνουν το δείγμα περισσότερο αδιαπέραστο από το φως. Ο βαθμός σκέδασης της ακτινοβολίας μπορεί να μετρηθεί από φωτόμετρα, και σχετίζεται γραμμικά με την συγκέντρωση των βακτηρίων σε χαμηλές τιμές απορρόφησης. Με τον τρόπο αυτό δύναται να παρακολουθηθεί η ανάπτυξη των βακτηρίων αρκεί αυτά να βρίσκονται σε συγκεντρώσεις τέτοιες που να δίνουν αισθητή θολερότητα στο δείγμα (Σχήμα 5). Η μονάδα οπτικής πυκνότητας σε μήκος κύματος 600nm (ΟD 600 =1,0) αντιστοιχεί σε 10 9 βακτηριακά κύτταρα ανά μιλιλίτρο θρεπτικού υλικού (10 9 κύτταρα/ml). Σχήμα 5: Μέτρηση μικροοργανισμών με βάση την μέτρηση της οπτικής απορρόφησης με φασματοφωτόμετρο 12

3.2.3. Σχεδιασμός της γραφικής παράστασης της καμπύλης ανάπτυξης των βακτηρίων Σχήμα 6: Μέτρηση μικροοργανισμών με βάση την μέτρηση της οπτικής απορρόφησης με φασματοφωτόμετρο Εφόσον, ολοκληρωθεί η συλλογή των μετρήσεων της οπτικής απορρόφησης της καλλιέργειας των βακτηρίων ανά τακτά χρονικά διαστήματα (έστω ανά 30 min), αναπτύσσονται τα δεδομένα όπως περιγράφεται στο Σχήμα 6. Σε αυτή την περίπτωση, ο υπολογισμός του χρόνου διπλασιασμού του πληθυσμού των βακτηρίων γίνεται διαλέγοντας δύο σημεία της οπτικής απορρόφησης της καλλιέργειας στη λογαριθμική φάση της ανάπτυξής της, όπου η μία τιμή είναι διπλάσια της άλλης. Έστω το OD1 = 0.4 και το OD2 = 0.8. Χρησιμοποιώντας ένα χάρακα προσδιορίζονται οι χρόνοι που αντιστοιχούν σε κάθε οπτική απορρόφηση όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 6. Έστω ότι το OD1 = 0.4 έχει προσδιοριστεί σε χρόνο καλλιέργειας 60 λεπτά και το OD2 = 0.8 σε χρόνο καλλιέργειας 90 λεπτά. Ο χρόνος διπλασιασμού υπολογίζεται από την εξίσωση: Δt = t (OD=0.8) -t (OD=0.4) = 90 min 60 min = 30 min 13

4. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΕΜΜΕΣΗΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ 4.1. Υλικά και όργανα Κορεσμένη καλλιέργεια E. coli. Θρεπτικό υλικό LB σε θερμοκρασία και 37 C και 20 C. Αποστειρωμένες πιπέτες (5mL και 1mL) και μικροπιπέτες των 200 μl. Φασματοφωόμετρο και πλαστικές κυβέτες φωτομέτρου. Δύο μικροβιολογικοί αναδευτήρες ρυθμισμένοι στους 37 C και 20 C αντίστοιχα. Λύχνος bunsen. 6 500mL αποστειρωμένες βακτηριολογικές φλάσκες. δις απιονισμένο (di-distilled - dd) H 2 O. Αλκοόλη εμπορίου. Χρονόμετρο. 4.2. Πειραματική πορεία 1. Κάθε ομάδα φοιτητών έχει παρασκευάσει, στην σχετική άσκηση παρασκευής διαλυμάτων, διάλυμα θρεπτικού μέσου LB (Luria-Bertani), ph=7, το οποίο έχει αποστειρωθεί σε διάταξη υγρής αποστείρωσης και είναι αποθηκευμένο σε θερμοκρασία δωματίου ή στους +4 C μέχρι την χρήση του. Σε τρεις κωνικές φιάλες των 500 ml τοποθετείτε 200 ml θρεπτικό σε κάθε μία φιάλη. 2. Εμβολιάζετε τα 200 ml θρεπτικού υλικού LB κάθε κωνικής φιάλης με 3 ml από κορεσμένη καλλιέργεια E. coli σε άσηπτες συνθήκες. Προσέχετε το θρεπτικό υλικό πριν τον εμβολιασμό να βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου. Οι φιάλες του θρεπτικού υλικού ανοίγονται πάντα κάτω από τη φλόγα λύχνου και ποτέ δεν αφήνονται ανοιχτά σε επαφή με τον αέρα. Οι πιπέτες που χρησιμοποιούνται είναι αποστειρωμένες και η συσκευασία τους ανοίγεται μόλις πριν από το πείραμα και κάτω από τη φλόγα του λύχνου, επίσης. Σημείωση: Η προετοιμασία της κορεσμένης καλλιέργειας έχει γίνει από την προηγούμενη ημέρα από τους επιβλέποντες της άσκησης σε θρεπτικό υλικό ίδιας σύστασης (LB) με αυτό που θα χρησιμοποιήσετε και από μία αποικία βακτηρίων E. coli που έχει προηγουμένως αναπτυχθεί σε στερεό υπόστρωμα (θρεπτικό μέσο). Η κορεσμένη καλλιέργεια έχει επωαστεί στον ανακινούμενο επωαστή των 37 C Ο/Ν (overnight) ώστε να είναι αρκετά πυκνή και έτοιμη για χρήση. 14

3. Επωάζετε παράλληλα τις τρεις καλλιέργειες βακτηρίων σε διαφορετικές συνθήκες: η μία καλλιέργεια θα τοποθετηθεί σε ανακινούμενο επωαστή στους 37 ο C, η δεύτερη σε σταθερό επωαστή στους 37 ο C και η τρίτη σε ανακινούμενο επωαστή στους 20 ο C. Η ανάδευση του υλικού καθώς η καλλιέργεια αναπτύσσεται προσφέρει επαρκή οξυγόνωση σε όλα τα επίπεδα του υγρού θρεπτικού μέσου. Στόχος είναι να παρατηρήσετε την καμπύλη ανάπτυξης των βακτηρίων σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (37 ο C και 20 ο C) αλλά και παρουσία ή όχι επαρκούς μοριακού οξυγόνου ανάλογα με το αν η καλλιέργεια ανακινείται ή όχι αντιστοίχως. 4. Κατά τη διάρκεια της επώασης και σε διαστήματα των 30 λεπτών λαμβάνονται δείγματα (3 ml) θρεπτικού υλικού και προσδιορίζεται η απορρόφησή τους στα 600nm ορίζοντας ως σημείο t = 0 τη χρονική στιγμή του εμβολιασμού της καλλιέργειας. Το φωτόμετρο μηδενίζεται με θρεπτικό υλικό. Εάν η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας υπερβεί την τιμή 0,7, τότε το δείγμα αραιώνεται με 1:1 με θρεπτικό υλικό. Μετά τη φωτομέτρηση η κυβέτα αδειάζει από το δείγμα και ξεπλένεται για την επόμενη φωτομέτρηση. 5. Τα δεδομένα των μετρήσεων από την οπτική απορρόφηση καταγράφονται στον ακόλουθο πίνακα: Συνθήκες Μέτρηση οπτικής απορρόφησης στα 600 nm καλλιέργειας 0 30min 60min 90min 120min 150min 180min t = v 37 ο C με ανακινήση 37 ο C χωρίς ανακινήση 20 ο C με ανακινήση 6. Ακολούθως, σχεδιάζετε την γραφική παράσταση της οπτικής πυκνότητας ως προς το χρόνο και για τις τρεις καλλιέργειες (βλ. Σχήμα 6) σε ημιλογαριθμικό χαρτί όπου στον οριζόντιο άξονα τοποθετούνται οι τιμές του χρόνου και στον κάθετο άξονα οι τιμές της οπτικής απορρόφησης της κάθε καλλιέργειας κάθε χρονική στιγμή. 7. Αναγνωρίστε την εκθετική φάση ανάπτυξης της κάθε καλλιέργειας και υπολογίστε τον χρόνο διπλασιασμού της για κάθε μία συνθήκη που χρησιμοποιήσατε στο πείραμά σας χρησιμοποιώντας την ημιλογοραθμική γραφική απεικόνιση των δεδομένων σας. Με βάση τις 15

πειραματικές συνθήκες που χρησιμοποιήσατε, εντοπίστε τις βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης των βακτηρίων. 8. Με βάση την τιμή της οπτικής πυκνότητας στην αρχή και το τέλος της εκθετικής φάσης ανάπτυξης της κάθε καλλιέργειας υπολογίστε τους αντίστοιχους πληθυσμούς βακτηρίων της κάθε καλλιέργειας καθώς και τον μέσο ρυθμό πολλάπλασιασμού τους. 5. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΑΥΤΟΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ 1. Ο μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης k παρατηρείται στην καλλιέργεια E. coli που αναπτύσσεται σε συνθήκες Α) 37 ο C υπό ανάδευση Β) 20 ο C υπό ανάδευση Γ) 37 ο C χωρίς ανάδευση Δ) 20 ο C χωρίς ανάδευση 2. Από την εξάρτηση του μικροοργανισμού ως προς το Ο 2, σε ποια κατηγορία θα τον εντάσσατε; Α) υποχρεωτικά αερόβιο Β) προαιρετικά αναερόβιο Γ) υποχρεωτικά αναερόβιο Δ) Αναερόβια βακτήρια ανεκτικά στο οξυγόνο 3. Μια βακτηριακή καλλιέργεια σε εκθετική φάση ανάπτυξης πολλαπλασιάστηκε για 5 γενεές σε 2 ώρες. Ο χρόνος διπλασιασμού της είναι: Α) 20 min B) 24 min Γ) 25 min Δ) 30 min 4. Μια βακτηριακή καλλιέργεια σε εκθετική φάση αυξήθηκε από τα 100 στα 100.000.000 κύτταρα σε 15 ώρες. Ο μέσος ρυθμός ανάπτυξής της είναι: Α) k = 1 Β) k = 2 Γ) k = 1,33 Δ) k = 2,22 5. Ένας μικροοργανισμός είναι απόλυτα εξαρτώμενος για την ανάπτυξή του από το μοριακό οξυγόνο. Αυτός ο μικροοργανισμός χαρακτηρίζεται Α) ανεκτικός στην ωσμωτική πίεση Β) οξεόφιλος Γ) προαιρετικά αναερόβιος Δ) υποχρεωτικά αερόβιος 6. Η βακτηριακή ανάπτυξη, κατά την μέθοδο προσδιορισμού της θολερότητας της καλλιέργειας, 16

εκφράζεται σε: Α) κύτταρα / ml Β) αποικίες / ml Γ) οπτική απορρόφηση Δ) mg Ν 2 / ml 7. Σε ένα πείραμα άμεσου προσδιορισμού του πληθυσμού μιας υγρής καλλιέργειας με την μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων του δείγματος, από 1 ml υγρής καλλιέργειας που αντιστοιχούσε στη αραίωση 10-5 αναπτύχθηκαν 36 αποικίες σε τρυβλίο petri. Πόσα κύτταρα ήταν στην αρχική καλλιέργεια; Α) 360 Β) 36000 Γ) 360000 Δ)3600000 8. Βακτηριακή καλλιέργεια ξεκινά με 200 κύτταρα και έχει χρόνο διπλασιασμού 30 min. Ποιός θα είναι ο πληθυσμός της καλλιέργειας μετά από 2 ώρες επώασης σε ιδανικές συνθήκες; Α) 800 βακτήρια B) 24 βακτήρια C) 3200 βακτήρια D) 12800 βακτήρια E) 200 4 βακτήρια 9. Ένα είδος βακτηρίου απαιτεί για την βέλτιστη ανάπτυξή του υψηλή συγέντρωση ιόντων υδρογόνου (Η + ). Το βακτήριο αυτό κατατάσσεται στα Α) οξεόφιλα Β) ουδετερόφιλα. Γ) μεσόφιλα Δ) βασεόφιλα 10. Προαιρετικά αναερόβιο είναι ένα βακτήριο όταν Α) απαιτεί οξυγόνο για την ανάπτυξή του Β) μπορεί να χρησιμοποιεί το οξυγόνο όταν είναι διαθέσιμο αλλά επιβιώνει και χωρίς αυτό Γ) η παρουσία οξυγόνου είναι τοξική για την ανάπτυξή του Δ) δεν μπορεί να χρησιμοποιήσει το οξυγόνο αλλά διαθέτει μηχανισμούς με τους οποίους ανέχεται την παρουσία του Ο 2 και διασπά τις τοξικές για την ανάπτυξή του μορφές οξυγόνου. 11. Τοξικά προϊόντα μεταβολισμού κατά την ανάπτυξη μιας βακτηριακής καλλιέργειας παράγονται: Α) στη φάση προσαρμογής Β) στην εκθετική φάση Γ) στη στατική φάση Δ) στη φάση θανάτου Ε) σε όλες τις φάσεις 12. Σε ένα πείραμα άμεσης μέτρησης του συνολικού αριθμού των βακτηριακών κυττάρων με την χρήση αιματοκυτόμετρου μετρήσατε 18 κύτταρα ανά τετράγωνο κατά μέσο όρο σε 25 τετράγωνα της πλάκας συνολικού εμβαδού 1mm 2, στα οποία το υπερκείμενο πάχος του 17

υγρού δείγματος είναι 0.02 mm. Η συγκέντρωση των κυττάρων στην αρχική καλλιέργεια είναι: Α) 4,5 10 4 κύτταρα/mm 3 B) 2,25 10 4 κύτταρα/mm 3 Γ) 2,25 10 4 κύτταρα/ml Δ) 4,5 10 7 κύτταρα/ mm 3 13. Σε ποιά φάση της ανάπτυξης μιας βακτηριακής καλλιέργειας τα κύτταρα διαιρούνται με τον μέγιστο ρυθμό; Α) στη φάση προσαρμογής Β) στην εκθετική φάση Γ) στη στατική φάση Δ) στη φάση θανάτου Ε) σε όλες τις φάσεις 14. Ποια από τις παρακάτω προτάσεις είναι λάθος; Α) ο χρόνος διαπλασιασμού του βακτηριακού πληθυσμού εξαρτάται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες Β) τα δύο θυγατρικά βακτηριακά κύτταρα που προκύπτουν από την διαίρεση του ίδιου αρχικού κυττάρου έχουν ακριβώς το ίδιο γενετικό υλικό Γ) όλα τα βακτήρια διπλασιάζουν τον αριθμό τους κάθε μία ώρα Δ) όλα τα βακτήρια σε καλλιέργεια ξεκινούν από την φάση προσαρμογή 15. Ως βακτηριακή ανάπτυξη ορίζεται η αύξηση Α) του μεγέθους των βακτηρίων Β) του πληθυσμού των βακτηρίων Γ) της διάρκειας ζωής των βακτηρίων Δ) του χρόνου διπλασιασμού των βακτηρίων 18