ΕΟΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΜΟΡΦΟΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ & ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΟΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΡΗΣΤΟΣ ΚΙΤΤΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ ΕRβΙ ΚΑΙ ΕRβ2 ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥΣ ΩΣ ΔΕΙΚΤΩΝ ΠΡΟΓΝΩΣΗΣ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ ~... ΧΑΝΤΖΗ ΝΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΘΗΝΑ 2011
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα οιστρογόνα ασκούν τη δράση τους μέσω των υποδοχέων οιστρογόνων τύπον άλφα και βήτα (ΕRα και ΕRβ). Στον άνθρωπο υπάρχουν 5 τουλάχιστον ισομορφές τον ΕRβ, εκ των οποίων στο μαστό εκφράζονται μόνο δύο (ΕRβ 1 και ΕRβ2), ενώ μόνο μια (ΕRβ1) μπορεί να προσδέσει 17β-οιστραδιόλη με υψηλή χημική συγγένεια. O ΕRα είναι καθιερωμένος δείκτης πρόγνωσης και πρόβλεψης ανταπόκρισης σε ορμονοθεραπεία τον καρκίνου τον μαστού. Η κλινική σημασία της έκφρασης των ΕRβ1 και ΕRβ2 στο καρκίνο τον μαστού δεν έχει ακόμα διευκρινισθεί, ενώ ακόμη λιγότερο γνωστά είναι η έκφραση και ο ρόλος τους σε καλοήθεις υπερπλαστικές αλλοιώσεις τον μαστού. Για τη μελέτη του ρόλου των ΕRβ 1 και ΕRβ2 στο καρκίνο και στις καλοήθεις υπερπλαστικές αλλοιώσεις τον μαστού, χαρακτηρίσαμε σειρά νέων μονοκλωνικών και πολνκλωνικών αντισωμάτων αξιοποιώντας συστήματα παροδικής και μόνιμης έκφρασης των ΕRα, ΕRβ1 και ΕRβ2 όπως π.χ. κλώνονς ανθρώπινων εμβρυϊκών κυττάρων νεφρού ΗΕΚ-293 που παράξαμε για να εκφράζουν σταθερά τον ΕRα ή τον ΕRβ 1. Αξιοποιώντας τα πλέον κατάλληλα από τα ως άνω καλά χαρακτηρισμένα αντισώματα διαπιστώσαμε ότι ο ΕRβ 1 εκφράζεται συχνότερα από τους ΕRα και ΕRβ2 στις υπερπλαστικές (HUT) και μη διηθητικές νεοπλασματικές αλλοιώσεις (ADH, DCIS) τον ανθρώπινου μαστού. Επίσης, διαπιστώσαμε ότι ενώ το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζει τον ΕRα αυξάνεται σταδιακά από την αλλοίωση HUT στην ADH και στο DCIS σε σχέση με το φυσιολογικό μαστό, αυτό τον ΕRβ2 μειώνεται από το φυσιολογικό μαστό προς την ADH. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι ο ρυθμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού συσχετίζεται σημαντικά με την υψηλή έκφραση τον ΕRα στη HUT και τη χαμηλή έκφραση τον ΕRβ2 στο DCIS. Τα 143
ευρήματα αυτά υποστηρίζουν ότι η έκφραση του ΕRβ2 ρυθμίζεται δυναμικά προϊούσης της προκαρκινικής εξαλλαγής τον επιθηλίού και ότι μείωση της έκφρασης τον ΕRβ2 στο DCIS μπορεί να υποδηλώνει αυξημένο κίνδυνο εξέλιξής τον σε διηθητικό καρκίνωμα. Αναφορικά με τους ΕRβ1 και ΕRβ2 στον ΕRα-αρνητικό διηθητικό καρκίνωμα μαστού διαπιστώσαμε ότι Θετική πυρηνική έκφραση του ΕRβ 1 εντοπίστηκε στις 66 από τις 97 (68%) και τον ΕRβ2 στις 65 από τις 96 (68%) περιπτώσεις. Ο βαθμός διαφοροποίησης τον καρκινώματος ήταν σημαντικά υψηλότερος στις ΕRβ1αρνητικές περιπτώσεις σε σχέση με τις Θετικές, ενώ η έκφραση του ΕRβ2 συσχετίστηκε Θετικά με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. H έκφραση τον ΕRβ1 δεν συσχετίζεται με τη συνολική ή την ελεύθέρα νόσού επιβίωση. Αντίθετα, ο ΕRβ2 αναδείχθηκε ως ο πιο σημαντικός προγνωστικός δείκτης μετά το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου. Ασθενείς με ΕRα-αρνητικό καρκίνο του μαστού που νπερεκφράζουν τον ΕRβ2 εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερη ελεύθέρα νόσού επιβίωση, ανεξαρτήτως τον τύπου μετεγχειρητικής θεραπείας. H παρούσα διατριβή υποστηρίχθηκε από το έργο 03ΕΔ644 τον προγράμματος ΩΕΝΕΔ 2003, το οποίο συυχρηματοδοτείτατ κατά το 75% της ηςδημόσιας ~~ S Δαπάνης η~ από την η Ευρωπαϊκή Ενωση - Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο κατ κατά το 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο - Υπουργείο Ανάπτυξης - Γενική Γραμματεία Ερευνας και Τεχνολογίας, καθώς και από τον Ιδιωτικό Τομέα, στο πλαίσιο τον Μέτρον 8.3 τον Ε.Ω. Ανταγωνιστικότητα - Γ" Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης. 144
SUMMARY Estrogen action is primarily mediated by the two subtypes of estrogen receptor (ER), ΕRα and ΕRβ. There are at least five ΕRβ isoforms in humans, of which two, namely ERβl and ΕRβ2, are primarily expressed in breast tissue, with ERβl being the only isoform that is able to bind hormone with high affinity. While ΕRα is established since long ago a marker of favorable breast cancer prognosis and responce to hormone therapy, the clinical significance of ΕRβ 1 and ΕRβ2 is not clear as yet. In addition, little is known about the role of ERβ1 and ΕRβ2 in benign hyperplastic lesions of the breast and, in particular, the breast cancer risk of these lesions. To study the role of ERβ1 and ΕRβ2 in breast cancer and benign breast lesions, we characterized a series of new monoclonal and polyclonal antibodies using cells transieltly or stably trasnfected with ΕRα, ΕRβ 1 or ΕRβ2, including e.g. clones of human embryonic kidney cells ΗΕΚ-293 engineered to stably express ΕRα and ΕRβ 1. Using antibodies characterized as most suitable for immunohistochemistry, we found that, compared to ΕRα and ΕRβ2, ERβ1 is more frequently expressed in hyperplastic (HUT) and non-invasive neoplastic lesions (ADH, DCIS) of human breast. We also found that, while the percentage of ERa-expressing cells increases progressively from HUT to ADH and DCIS, that of ΕRβ2-expressing cells decreases from normal breast to ADH. In addition, we found that expression of Κi-67 was associated with ΕRα positivity in HUT and inversely associated with ΕRβ2 positivity in DCIS. These findings are taken to indicate that ΕRβ2 expression is dynamically regulated during mammary carcinogenesis and that ΕRβ2 could have a protective role with respect to DCIS progression. 145
In ΕRa-negative breast cancer, ΕRβ1(+) was detected in 66 out of 97 (68%) cases and ΕRβ2(+) in 65 out of 96 (68%) cases. Tumour grade was significantly higher in ΕRβ1-negative cases compared to positive cases, while ΕRβ2 expression was positively correlated with lymph node metastasis. We did not find any relation between ΕRβ 1 expression and patient overall or disease free survival. In contrast, ΕRβ2 has emerged as the most important prognostic variable after tumour grade. Patients with ΕRa-negative breast carcinomas that overexpress ΕRβ2 had lower disease free survival, independent of the type of post-operative treatment. This PhD thesis was supported by research project 03ED644, which was implemented within the framework of PENED 2003 programme, cο-financed by E. U. -European Social Fund (75%) and the Greek Ministry of Development-GSRT (25%). 146