ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ. ΠΑΝΑΓΙΩΤΑΣ Γ. ΤΣΑΦΡΑΚΙΔΟΥ Πτυχιούχου Γεωπόνου

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑΣ Γ. ΤΣΑΦΡΑΚΙΔΟΥ Πτυχιούχου Γεωπόνου ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ NSLAB ΑΠΟ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΗ ΓΡΑΒΙΕΡΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012 1

ΠΑΝΑΓΙΩΤΑΣ Γ. ΤΣΑΦΡΑΚΙΔΟΥ Πτυχιούχου Γεωπόνου ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ NSLAB ΑΠΟ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΗ ΓΡΑΒΙΕΡΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή Τομέας : Επιστήμης &Τεχνολογίας Τροφίμων Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης : 14 Μαρτίου 2012 Εξεταστική Επιτροπή 1. Κουτσουμανής Κωνσταντίνος, επίκουρος καθηγητής της Γεωπονικής Σχολής του ΑΠΘ. (Υπεύθυνος καθηγητής). 2. Μοσχάκης Θωμάς, Λέκτορας της Γεωπονικής Σχολής του ΑΠΘ. 3. Μπιλιαδέρης Κωνσταντίνος, καθηγητής της Γεωπονικής Σχολής του ΑΠΘ. 2

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ NSLAB ΑΠΟ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΗ ΓΡΑΒΙΕΡΑ ISBN Παναγιώτα Γ. Τσαφρακίδου Α.Π.Θ. «Η έγκριση της παρούσης Μεταπτυχιακής Διατριβής από τη Γεωπονική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών της συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2). 3

Αφιερωμένο στην οικογένεια μου και σε όσους συνεχίζουν να βλέπουν φως. 4

Abstract In the present study, the non starter lactic acid bacteria (NSLAB) microflora of traditional Graviera Kritis P.D.O cheese, was studied. Fifty four strains of LAB were isolated and identified. The identification was conducted by SDS-PAGE of whole cell proteins. From a total of 54 strains, the 52 were grouped into 4 species : Lb. brevis (51.85%), Lb. paracasei subsp. paracasei (33%), Lb. casei (5.5%) and Lb. curvatus (5.5%). The characterization of the isolates at strain level was based on the genotypic methods of PFGE and RAPD-PCR. Low genetic heterogeneity between strains was determined as well as dispersion of the same strains in different dairies. The technological properties of the strains, acidification ability, proteolytic activity, peptidolytic ability and their amine-formation capacity were also studied. The strains exhibited different phenotypes. They exhibited a low acidification activity and two groups of strains were distinguished, the low and the medium acidification ability strains. The first group included the majority of the strains of dairy I (81.4%) and the second group constituted all but one strain from dairy II. Significant (P<0.05) interstrain differences were recorded. In respect of their casein breakdown ability, the strains exhibited similar profile regardless their source of isolation, while statistically significant differences (P<0.05) between the strains were noted in respect of both, their peptidolytic activity and their amino acid accumulation capacity. The probiotic potential of the strains, was approached by the main qualitative in vitro traits, growth at low ph and in the presence of bile salts. All the strains were able to grow in ph values of 1.5 and 3.0 and in the presence of bile salts at 0.3 and 2%. None of them exhibited antibacterial activity against pathogens and/or spoilage microorganisms, used in this study. None of the strains exhibited haemolytic activity or formed biogenic amines and in this respect, they are considered as safe. The results of this study suggest selected isolates that could be used as adjunct cultures for Graviera Kritis manufacture, such as : Lb. paracasei subsp. paracasei D731, F784, F783, D729, D718, F781, E768, C3 and Lb. casei F812. 5

Περίληψη Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δευτερεύουσα μικροχλωρίδα του παραδοσιακού Π.Ο.Π τυριού, Γραβιέρα Κρήτης. Συνολικά απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 54 γαλακτικά βακτήρια. Η ταυτοποίηση των βακτηρίων έγινε με την φαινοτυπική μέθοδο SDS- PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου. Από τα 54 στελέχη δεν ταυτοποιήθηκαν 2, ενώ τα υπόλοιπα ομαδοποιήθηκαν σε 4 είδη: Lb. brevis, Lb. paracasei subsp. paracasei, Lb. casei και Lb. curvatus. Ο χαρακτηρισμός των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους έγινε βάσει των γενοτυπικών μεθόδων PFGE και RAPD-PCR. Παρατηρήθηκε μικρή γενοτυπική ετερογένεια μεταξύ των στελεχών και διασπορά των ίδιων στελεχών σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Μελετήθηκαν επίσης οι τεχνολογικές ιδιότητες των απομονώσεων, η ικανότητα οξίνισης, η πρωτεολυτική τους δράση, η πεπτιδολυτική τους ικανότητα καθώς και η ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης των αμινοξέων. Τα στελέχη φάνηκε να παρουσιάζουν διαφορετικούς φαινοτύπους. Παρουσίασαν μικρή ικανότητα οξίνισης και διακρίθηκαν δύο ομάδες στελεχών, στελέχη μικρής και στελέχη μεσαίας ικανότητας οξίνισης. Η πρώτη ομάδα περιελάμβανε την πλειοψηφία των στελεχών του τυροκομείου Ι (81,4%) και η δεύτερη ομάδα συγκέντρωνε όλα, εκτός από ένα, τα στελέχη του τυροκομείου ΙΙ. Σημειώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ<0.05) μεταξύ των στελεχών. Όσον αφορά την πρωτεολυτική τους ικανότητα, τα στελέχη παρουσίασαν παρόμοια προφίλ ανεξαρτήτως της πηγής απομόνωσης τους, ενώ στατιστικά σημαντικές διαφορές εμφανίστηκαν στην πεπτιδολυτική τους ικανότητα. Η εύρεση πιθανής προβιοτικής δράσης των στελεχών προσεγγίστηκε με τον έλεγχο των κύριων ποιοτικών χαρακτηριστικών, όπως η ανάπτυξη σε χαμηλό ph και η ανάπτυξη παρουσία χολικών αλάτων. Όλα τα στελέχη αναπτύχθηκαν σε τιμές ph 1.5 και 3.0 και παρουσία χολικών αλάτων 0.3 και 2.0%. Τα στελέχη δεν παρουσίασαν αντιβακτηριακή δράση έναντι των παθογόνων ή/και των αλλοιογόνων μικροοργανισμών, που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Τέλος, τα στελέχη δεν παρουσίασαν αιμολυτική δράση και δεν ήταν ικανά να παράγουν βιογενείς αμίνες συνεπώς υπό αυτή την σκοπιά θεωρούνται ασφαλή. Τα αποτελέσματα της έρευνας υποδεικνύουν ορισμένα στελέχη, που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πρόσθετη καλλιέργεια για την βιομηχανική παραγωγή Γραβιέρας Κρήτης, όπως τα : Lb. paracasei subsp. paracasei D731, F784, F783, D729, D718, F781, E768, C3 και Lb. casei F812. 6

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η μεταπτυχιακή μου διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Υγιεινής και Μικροβιολογίας Τροφίμων του Α.Π.Θ. Θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς την καθηγήτρια μου κα. Εύα Λιτοπούλου - Τζανετάκη πρώτα απ όλα για την αγάπη και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε κι έπειτα για τις ευκαιρίες και την αμέριστη βοήθεια που μου έδωσε. Κυρία Εύα σας ευχαριστώ που μου μάθατε να εκτιμώ τη μικροβιολογία, την έρευνα και την παράδοση. Ευχαριστώ επίσης τον κ. Κουτσουμανή Κωνσταντίνο, επίκουρο καθηγητή του τομέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ που δέχτηκε να είναι επιβλέπων καθηγητής της παρούσας εργασίας, τον κ. Μοσχάκη Θωμά, Λέκτορα του τομέα Ε.Τ.Τ, Α.Π.Θ και τον κ. Μπιλιαδέρη Κωνσταντίνο, καθηγητή του τομέα Ε.Τ.Τ, Α.Π.Θ που δέχτηκαν να αποτελέσουν μέλη της εξεταστικής μου επιτροπής. Ευχαριστώ πολύ την κα. Μάγδα Χατζηκαμάρη μέλος ΕΕΔΙΠ του τομέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ και την κα. Ευγενία Χαριτωνίδου, μέλος ΕΕΔΙΠ του τομέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ, που με δέχτηκαν με αγάπη στο εργαστήριο καθώς και για τις συμβουλές και τις λύσεις που πάντα είχαν να μου δώσουν! Θα ήταν παράλειψη μου να μην ευχαριστήσω θερμά την κα. Σοφία Μπελιμπασάκη, διευθύντρια του Ινστιτούτου Κτηνιατρικών Ερευνών, ΕΛ.Γ.Ο. ΔΗΜΗΤΡΑ, που με δέχτηκε στο Ινστιτούτο ώστε να πραγματοποιήσω μέρος του πειράματος μου αλλά περισσότερο την ευχαριστώ για τις όμορφες εμπειρίες που μοιραστήκαμε στο ταξίδι μας στην Ιταλία. Ευχαριστώ επίσης τον κ. Ζδράγκα Αντώνη, τακτικό ερευνητή του Ινστιτούτου Κτηνιατρικών Ερευνών, ΕΛ.Γ.Ο. ΔΗΜΗΤΡΑ και τον κ. Παπαδόπουλο Θεόφιλο, υποψήφιο διδάκτορα της Κτηνιατρικής Σχολής, Α.Π.Θ για τις συμβουλές και τη βοήθεια τους στην κατανόηση και την εφαρμογή της PFGE. Ευχαριστώ την κα. Λουκία Αικατερινιάδου, τακτική ερευνήτρια του Ινστιτούτου Κτηνιατρικών Ερευνών, ΕΛ.Γ.Ο. ΔΗΜΗΤΡΑ και την κα. Μπουκουβάλα Ευρυδίκη για την πολύτιμη βοήθεια και συμβολή τους στην ολοκλήρωση της RAPD-PCR. Ένα ξεχωριστό ευχαριστώ οφείλω στην κα. Σοφία Παυλίδου, για την αμέριστη βοήθεια της σε όλη την πορεία της έρευνας μου, την άριστη συνεργασία μας αλλά και για την φιλία της. Ευχαριστώ επίσης την κα. Μποζούδη Δέσποινα, υποψήφια διδάκτορα της Γεωπονικής Σχολής, Α.Π.Θ για την βοήθεια της όπου τη χρειάστηκα, τη στήριξη και την ευχάριστη παρέα της. 7

Για το τέλος, άφησα τους δικούς μου ανθρώπους που είναι πάντα δίπλα μου, με ανέχονται και με στηρίζουν. Ευχαριστώ τους φίλους μου και συμφοιτητές μου για τα υπέροχα χρόνια που πέρασα μαζί τους και για όλες τις ευχάριστες στιγμές που ομόρφυναν τη δύσκολη πορεία του μεταπτυχιακού. Ειρήνη, Ιωάννα, Μαρία, Χριστίνα, Ζάφη, Ελευθερία σας ευχαριστώ!! Μαμά, Μπαμπά, Πέτρο, Στέλλα, Εβελίνα σας χρωστάω τα πάντα. Είστε η δύναμη που μου δίνει κουράγιο να αγωνίζομαι, δεν υπάρχουν λέξεις για να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου, ευχαριστώ!!! 8

Συντμήσεις APS bis CEPs GRAS Lb LH-PCR Met NSLAB o-pa PCR PDO PFGE RAPD-PCR SDS-PAGE SDS TEMED α s -CN β-cn ΠΟΠ Υπερθειϊκό αμμώνιο N,N-μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο Cell envelope πρωτεϊνάσες Generaly recognized as safe Lactobacillus Length Heterogeneity Methionine Non Starter Lactic Acid Bacteria o-phthaldialdehyde Polymerase Chain Reaction Protected Designation of Origin Pulsed Field Gel Electrophoresis Randomly Amplified Polymorphic DNA PCR Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis Δωδεκυλοξυθειικό νάτριο Ν,Ν, Ν, Ν-τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη α s -καζεΐνη β-καζεΐνη Προστατευόμενη Ονομασία Προέλευσης 9

Περιεχόμενα Συντμήσεις... 9 Εισαγωγή... 12 2.ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ... 15 2.1Συμβολή των NSLΑΒ στη διαδικασία ωρίμανσης....15 2.2 Μεταβολισμός αμινοξέων σχηματισμός βιογενών αμινών....18 2.3 Προστατευτικές ιδιότητες των NSLAB....20 2.4 Οφέλη υγείας που προσφέρουν τα NSLAB....22 2.4.1 Προβιοτικές καλλιέργειες...22 2.4.2 Εφαρμογή προβιοτικών καλλιεργειών σε τρόφιμα...25 2.5 Συμπληρωματική καλλιέργεια...26 2.6 Πολυφασική ταξινόμηση...27 2.6.1Φαινοτυπικές μέθοδοι...27 2.6.2 Γενοτυπικές Μέθοδοι...28 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης βασισμένη στον πολυμορφισμό τυχαία πολλαπλασιαζόμενου DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR, RAPD-PCR)...30 2.7 Ελληνικά Παραδοσιακά Τυριά Π.Ο.Π...32 2.7.1 Γραβιέρα Κρήτης....37 3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ... 38 4. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 39 4.1 Βακτηριακά στελέχη και πηγές απομόνωσης γαλακτικών βακτηρίων....39 4.2 Μικροβιολογικές και χημικές αναλύσεις τυριών....40 4.2.1 Μικροβιολογικές αναλύσεις....40 4.2.2 Χημικές αναλύσεις...41 4.3. Απομόνωση και διατήρηση των στελεχών...43 4.4 Ταυτοποίηση των απομονώσεων με βιοχημικές και φυσιολογικές μεθόδους....44 4.4.1 Χρώση Gram...44 4.4.2 Δοκιμή παραγωγής καταλάσης....45 4.4.4 Δοκιμή παραγωγής CO 2 από γλυκόζη...45 4.4.5 Δοκιμή παραγωγής αμμωνίας από αργινίνη....46 4.4.6 Υδρόλυση εσκουλίνης....46 4.5 Ταυτοποίηση των απομονώσεων με τη μέθοδο SDS PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) των πρωτεϊνών του εσωτερικού εκχυλίσματος του όλου κυττάρου....46 4.6 Διερεύνηση της γενοτυπικής ετερογένειας των στελεχών....51 4.6.1 Ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόμενου πεδίου ( Pulsed Field Gel Electrophoresis,...51 PFGE)....51 4.6.2 RAPD-PCR...53 4.7 Διερεύνηση των τεχνολογικών και προβιοτικών ιδιοτήτων των στελεχών....53 4.7.1 Έλεγχος παραγωγής οξέος σε γάλα....53 4.7.2 Πρωτεολυτική δραστηριότητα....54 4.7.3 Πεπτιδολυτική δραστηριότητα άθικτων κυττάρων...56 4.7.4 Ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης αμινοξέων...57 4.7.5 Αφομοίωση των κιτρικών....57 4.7.6 Έλεγχος ανάπτυξης σε χαμηλό ph...57 10

4.7.7 Έλεγχος ανάπτυξης παρουσία χολικών αλάτων...58 4.7.8 Αντιβακτηριακή δράση....58 4.7.9 Έλεγχος τύπου αιμόλυσης....59 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 60 5.1 Μικροβιολογικά και χημικά χαρακτηριστικά των τυριών....60 5.1.1 Μικροχλωρίδα ώριμων τυριών....60 5.1.2 Χημικά χαρακτηριστικά ώριμων τυριών....62 5.2 Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο είδους με την SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου...63 5.3 Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους...66 5.3.1 Ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόμενου πεδίου (PFGE)...66 5.3.2 RAPD-PCR...68 5.4 Ικανότητα οξινίσεως...71 5.5 Πρωτεολυτική δραστηριότητα....75 5.5.1 Εκτίμηση καζεϊνολυτικής δραστηριότητας στελεχών....75 5.6 Πεπτιδολυτική δραστηριότητα άθικτων κυττάρων....82 5.7 Ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης αμινοξέων...84 5.8 Αφομοίωση κιτρικών....84 5.9 Προβιοτικές ιδιότητες....84 5.10 Παθογένεια στελεχών....85 6. Συζήτηση... 87 7. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 97 8. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 99 9. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ... 108 9.1 Πρωτεολυτική δραστηριότητα...108 9.2 Καζεϊνολυτική δραστηριότητα...108 9.3 SDS-PAGE...109 9.4 Ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης αμινοξέων...113 9.5 Αντίδραση RAPD-PCR...113 11

Εισαγωγή Τα γαλακτικά βακτήρια (LAB) αποτελούν μια ετερογενή ομάδα ειδών που παρουσιάζουν παρόμοια φυσιολογικά χαρακτηριστικά. Τα LAB οφείλουν την ονομασία τους στην ιδιότητα τους να ζυμώνουν τα σάκχαρα, μετατρέποντας τα κυρίως σε γαλακτικό οξύ μέσω ομο- ή ετεροζυμωτικού μεταβολισμού (Salminen and von Wright, 1998). Χαρακτηρίζονται ως Gram θετικοί, αρνητικοί στην καταλάση, μη σπορογόνοι και αεροάντοχοι μικροοργανισμοί που έχουν μικρό ποσοστό G + C (Kandler and Weiss, 1986). Τα LAB είναι επίσης γνωστά ως μη κινητοί μικροοργανισμοί με εξαίρεση το Lactobacillus agilis, το πρόσφατα χαρακτηρισμένο είδος Lactobacillus ghanensis (Nielsen et al.,2007) και το Lactobacillus capillatus (Chao et al.,2008). Η ετερογένεια αυτής της βακτηριακής ομάδας γίνεται σαφής από τη μορφολογική τους διαφοροποίηση αφού μπορεί να έχουν σχήμα κόκκου ή ραβδιού, να εμφανίζονται σε δυάδες, μονά κύτταρα, τετράδες, μικρές ή μεγάλες αλυσίδες. Εξαιτίας των περιορισμένων βιοσυνθετικών τους δυνατοτήτων (Klaenhammer et al.,2005) και τις υψηλές τους απαιτήσεις σε πηγές άνθρακα και αζώτου (Salminen and von Wright, 1998) βρίσκονται ως φυσική μικροχλωρίδα σε περιβάλλοντα που χαρακτηρίζονται πλούσια, όσο αφορά τα θρεπτικά τους χαρακτηριστικά. Τέτοια περιβάλλοντα είναι συνήθως φυτικοί ή ζωικοί ιστοί, ζυμούμενα προϊόντα καθώς και μεμβράνες του βλεννογόνου. Χάρη στις μεταβολικές τους ιδιότητες, τα LAB χρησιμοποιούνται ευρέως καθώς συνεισφέρουν στη γεύση, τη δομή, τη θρεπτική αξία και τη μικροβιακή σταθερότητα των ζυμούμενων τροφίμων (Caplice and Fitzerald, 1999; Settani and Corsetti, 2008). Για τους παραπάνω λόγους βρίσκουν θέση σε πολυάριθμες εφαρμογές στη βιομηχανία τροφίμων. Τα LAB που χρησιμοποιούνται περισσότερο ανήκουν στα γένη: Lactococcus (γάλα), Lactobacillus (γάλα, κρέας, λαχανικά, δημητριακά), Leuconostoc (λαχανικά, γάλα), Pediococcus (λαχανικά, γάλα), Oenococcus (κρασί) και Streptococcus (γάλα) (De Vuyst and Tsakalidou, 2008). Τα LAB εμφανίζουν επίσης ανταγωνιστική δράση έναντι παθογόνων βακτηρίων και εγκαθίστανται στην γαστρεντερική οδό (Corfield et al., 2001) κατά συνέπεια, χρησιμοποιούνται σε τρόφιμα για τις ευεργετικές τους προβιοτικές ιδιότητες. Μεταξύ των ζυμούμενων προϊόντων, τα γαλακτοκομικά είναι αυτά που παράγονται και καταναλώνονται σε μεγάλες ποσότητες σε όλο τον κόσμο και τα τελευταία χρόνια ακόμη και σε χώρες της Νότιο-ανατολικής Ασίας στις οποίες τα τυριά και τα ζυμούμενα γαλακτοκομικά δεν θεωρούνταν παραδοσιακά καταναλωτικά αγαθά. Τα τυριά μπορούν να κατηγοριοποιηθούν με βάση πολλά κριτήρια, ένα από τα οποία μπορεί να είναι οι 12

μικροοργανισμοί που εμπλέκονται στη διαδικασία ωρίμανσης. Ένα από τα πιο πρόσφατα σχήματα κατηγοριοποίησης (Mucchetti and Neviani, 2006) περιλαμβάνει τη διαφοροποίηση νωπών υλικών και εμβολίου : παστεριωμένο γάλα και επιλεγμένες καλλιέργειες εκκίνησης (selected starters) παστεριωμένο γάλα και φυσική μικροχλωρίδα εκκίνησης (natural starters) θερμισμένο γάλα και φυσική μικροχλωρίδα εκκίνησης νωπό γάλα και επιλεγμένες καλλιέργειες εκκίνησης νωπό γάλα και φυσική μικροχλωρίδα εκκίνησης νωπό γάλα χωρίς καλλιέργεια εκκίνησης Τα ελληνικά τυριά παρασκευάζονται παραδοσιακά από νωπό γάλα χωρίς την προσθήκη καλλιεργειών εκκίνησης και η ανάπτυξη της χαρακτηριστικής γεύσης και δομής βασίζεται στη φυσική μικροχλωρίδα γαλακτικών βακτηρίων (Zygouris, 1952) καθώς και βακτηρίων που επιμολύνουν το τυρί από το τυροκομείο και τα σκεύη τυροκόμησης. Γάλα καλής ποιότητας μπορεί να δώσει ένα ποιοτικό τυρί με πλούσια γεύση και ταχύτερη ωρίμανση, η πρακτική αυτή όμως οδηγεί πολλές φορές σε τυριά με μεγάλο αριθμό σφαλμάτων, ειδικά σε περιόδους με υψηλή θερμοκρασία περιβάλλοντος. Επιπλέον, για λόγους δημόσιας υγείας και ασφάλειας των τροφίμων οι παραγωγοί οδηγήθηκαν στην χρήση παστεριωμένου γάλακτος. Τα τελευταία χρόνια δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στις συνθήκες υγιεινής, στην παραγωγή ενός ασφαλούς τελικού προϊόντος καθώς και στη μείωση του κινδύνου αλλοίωσης. Αυτές οι πρακτικές, μαζί με τη χρήση επιλεγμένων καλλιεργειών εκκίνησης ανθεκτικών στους βακτηριοφάγους, με συγκεκριμένες τεχνολογικές ιδιότητες έχουν ως αποτέλεσμα την παραγωγή τυριών με σταθερή ποιότητα και ασφάλεια αλλά και με έλλειψη πλούσιων οργανοληπτικών χαρακτηριστικών (Law, 1999). Γίνεται λοιπόν σαφές ότι για την παραγωγή τυριών που θα έχουν συνέπεια στην ποιότητα και την ασφάλεια αλλά δεν θα υστερούν σε ιδιαίτερη γεύση και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, είναι απαραίτητη η χρήση επιλεγμένων πρόσθετων καλλιεργειών (adjunct cultures). Τα παραδοσιακά τυριά από νωπό γάλα μπορούν να αποτελέσουν πηγή τέτοιων καλλιεργειών και η χρήση τους έχει ήδη μελετηθεί από πολλούς ερευνητές (Antonsson et al.,2003; Gomez-Ruiz et al., 2008; Lynch et al., 1996). Τα επιλεγμένα στελέχη πρέπει να μελετηθούν προσεκτικά ως προς τις τεχνολογικές και τις πιθανές προβιοτικές ιδιότητες τους πριν να εισαχθούν σε παραγωγή μεγάλης κλίμακας 13

καθώς μπορεί να ανακύψουν προβλήματα συμβίωσης με τις καλλιέργειες εκκίνησης ή/και να προκληθούν ποιοτικά σφάλματα. Στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια απομόνωσης και μελέτης τέτοιων καλλιεργειών από το παραδοσιακό τυρί Γραβιέρα Κρήτης. 14

2.ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 2.1Συμβολή των NSLΑΒ στη διαδικασία ωρίμανσης. Μετά το σχηματισμό του τυροπήγματος, τα ενζυμικά συστήματα στοχεύουν διαφορετικά συστατικά του με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ουσιών που εμφανίζονται κατά την ωρίμανση του τυριού. Ο χρόνος, η θερμοκρασία καθώς και η σχετική υγρασία του περιβάλλοντος ωρίμανσης ποικίλλουν και εξαρτώνται από τον τύπο του κάθε τυριού. Τα ένζυμα που συμμετέχουν στο φαινόμενο της ωρίμανσης προέρχονται από το γάλα, την πυτιά και τους μικροοργανισμούς. Τα ένζυμα του γάλακτος, κυρίως η πλασμίνη και η όξινη πρωτεάση που επιδρούν πάνω στην β- και την α s καζεΐνη, βρίσκουν δυσμενές το περιβάλλον του γάλακτος όπου σταδιακά μειώνεται το ph. Επίσης τα ένζυμα της πυτιάς αδρανοποιούνται κατά την θέρμανση του τυροπήγματος ή αναστέλλουν τη λειτουργία τους εξαιτίας της αυξημένης συγκέντρωσης χλωριούχου νατρίου. Ως εκ τούτου, τον βασικό ρόλο στο μετασχηματισμό του τυροπήγματος σε τυρί κατέχουν τα ένζυμα που απελευθερώνονται από την καλλιέργεια εκκίνησης (SLAB), τη δευτερεύουσα καλλιέργεια (NSLAB) και/ή άλλους μικροοργανισμούς που βρίσκονται στο γάλα ή προστίθενται από τον τυροκόμο (ΜcSweeney, 2004; Upadhyay et al., 2004) καθώς και από μικροοργανισμούς που επιμολύνουν το τυρί κατά τη διάρκεια ωρίμανσης μέσω του αλατιού, του εξοπλισμού και του περιβάλλοντος αποθήκευσης. Έτσι, είναι πιθανό να μετατραπεί ή να επιταχυνθεί η διάρκεια ωρίμανσης αυξάνοντας το επίπεδο αυτών των ενζύμων στο τυρόπηγμα (Upadhyay et al., 2007). Η πρωτεόλυση στα τυριά είναι πρωταρχικής σημασίας για την τελική τους δομή και γεύση. Εκτός από την λακτόζη που δεν έχει ζυμωθεί από τα SLAB και βρίσκεται σε μικρές συγκεντρώσεις, τα NSLAB χρησιμοποιούν υδατάνθρακες που προέρχονται από τα γλυκομακροπεπτίδια των καζεϊνών και τις γλυκοπρωτεΐνες των λιποσφαιρίων των μεμβρανών. Ετεροζυμωτικά NSLAB μπορούν να ζυμώσουν πεντόζες που απελευθερώνονται με τη λύση των κυττάρων των SLAB. Τα κιτρικά άλατα που υπάρχουν σε μικρές συγκεντρώσεις καθώς και το λίπος δεν αποτελούν θρεπτικές πηγές. Συνεπώς, τα πεπτίδια και τα αμινοξέα που βρίσκονται σε αφθονία στο τυρόπηγμα, συνιστούν τα κύρια θρεπτικά συστατικά των NSLAB (Fox et al., 2004). Η γεύση των τυριών είναι αποτέλεσμα της δράσης πολλών ενζύμων. Σε γενικές γραμμές, τα LAB κατέχουν ένα πολύπλοκο πρωτεολυτικό ενζυμικό σύστημα, εξαιτίας των απαιτήσεων τους σε αμινοξέα (McSweeney, 2004). Έχουν καθοριστικό ρόλο στην διάσπαση των καζεϊνών και των πεπτιδίων οδηγώντας με αυτό τον τρόπο στην παραγωγή ελεύθερων 15

αμινοξέων (FAA). Τα αμινοξέα που παράγονται συνεισφέρουν άμεσα στη γεύση των τυριών και έμμεσα στο άρωμα τους, αφού είναι πρόδρομες ουσίες για άλλες καταβολικές διεργασίες από τις οποίες προέρχονται πτητικά συστατικά. Καταβολικές αντιδράσεις και τροποποιήσεις των πλευρικών αλυσίδων έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό κετοξέων, αμμωνίας, αμινών, αλδεϋδών, οξέων και αλκοολών. Τα NSLAB χαρακτηρίζονται από ένα ευρύ φάσμα υδρολυτικών ενζύμων συνεισφέροντας έτσι στην ωρίμανση του τυριού. Τα κυριότερα είδη NSLAB που έχουν μελετηθεί είναι λακτοβάκιλλοι. Η προσθήκη επιλεγμένων λακτοβακίλλων στην πρώτη ύλη που προορίζεται για τυροκόμηση, οδηγεί σε υψηλότερα επίπεδα τη συγκέντρωση FAA στο τυρί η οποία όπως είναι αναμενόμενο συνοδεύεται από αυξημένη ένταση γεύσης (Lane and Fox, 1996;Ur-Rehman et al., 2000). Οι Mauriello et al. (2001) παρατήρησαν ότι οι λακτοβάκιλλοι παράγουν υψηλότερο αριθμό ουσιών από τους λακτοκόκκους. Έχοντας τα παραπάνω υπ όψιν, αρκετές ερευνητικές ομάδες αξιολόγησαν διαφορετικά στελέχη NSLAB, σε συνδυασμό ή μη με SLAB, με σκοπό την ενίσχυση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των τυριών. Οι Awad et al. (2007) δοκίμασαν SLAB, με ή χωρίς NSLAB, απομονωμένα από αιγυπτιακά γαλακτοκομικά προϊόντα, ώστε να παράγουν πειραματικά Ras τυρί από παστεριωμένο γάλα. Τα καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά την ένταση της γεύσης, τη γεύση και τη δομή έδωσαν τα δείγματα στα οποία είχαν προστεθεί καλλιέργειες Lb. helveticus, Lb. paracasei subsp. paracasei, Lb. delbrueckii subsp. lactis και E. faecium. Τα επιλεγμένα στελέχη φαίνεται να ενίσχυσαν τη συσσώρευση αυξημένων συγκεντρώσεων τόσο ελεύθερων αμινοξέων (FAA) όσο και ελεύθερων λιπαρών οξέων (FFA), παραγόντων δηλαδή που επηρεάζουν τη γεύση του τυριού Ras. Η προσθήκη Lb. plantarum στην καλλιέργεια εκκίνησης είχε παρόμοια αποτελέσματα στο τυρί Manchego, σε σύγκριση με τα τυριά που παράγονται μόνο με την εμπορική καλλιέργεια εκκίνησης (Poveda et al., 2004), ενώ ο Lb. reuteri επηρέασε την παραγωγή πτητικών FFA σε μειωμένης λιποπεριεκτικότητας τυρί Edam (Tungjaroenchai et al., 2004). Στέλεχος Lb. casei subsp. rhamnosus το οποίο δοκιμάστηκε μαζί με Lc. lactis, φάνηκε να έχει θετική επίδραση στην πρωτεόλυση κατά την ωρίμανση Κεφαλογραβιέρας με χαμηλά λιπαρά (Michaelidou et al., 2003). Άλλα NSLAB (Lb. paracasei), μεμονωμένα ή σε συνδυασμό (Lb. paracasei μαζί με Lb.plantarum) έδειξαν καλή προσαρμοστικότητα στο περιβάλλον του τυριού και φάνηκε να έχουν συνεργιστική αλληλεπίδραση με λακτοκόκκους (Ortigosa et al., 2006). Το αποτέλεσμα που θα δώσει η χρήση ενός NSLAB, μπορεί να ποικίλει ανάλογα με τον τύπο της καλλιέργειας εκκίνησης που χρησιμοποιείται (Skeie et al., 2008). Αναφορικά με την αίσθηση του αρώματος, η εφαρμογή στελέχους Lb. casei subsp. casei ως πρόσθετη καλλιέργεια μαζί με καθαρή πυτιά οδήγησε στη γρήγορη ανάπτυξη πικάντικης αίσθησης που είναι χαρακτηριστική για το τυρί Majorero (Calvo et al., 2007). Οι Randazzo 16

et al. (2008) αξιολόγησαν τα αποτελέσματα της χρήσης άγριων στελεχών NSLAB, που περιελάμβαναν E. durans, Lb. rhamnosus Lb. casei, στα πτητικά συστατικά του Pecorino Siciliano. Τα άγρια στελέχη, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με εμπορικά στελέχη, ήταν ικανά να παράγουν 3- μέθυλο 1 βουτανόλη και αρκετούς αιθυλεστέρες, που σχετίζονται με τυπικά αρώματα όπως αυτά των λουλουδιών, του πορτοκαλιού και οι φρουτώδεις νότες.. Εικ.2.1 Μεταβολικά μονοπάτια μετατροπής των πρωτεϊνών σε πρόδρομες ουσίες γεύσης. Smit et al., 2005. 17

2.2 Μεταβολισμός αμινοξέων σχηματισμός βιογενών αμινών. Η μεταβολική δραστηριότητα των γαλακτικών βακτηρίων δεν έχει μόνο θετικές επιδράσεις και ενισχυτικό ρόλο στην ωρίμανση των τυριών. Ο μεταβολισμός των αμινοξέων της πρώτης ύλης μπορεί να δώσει εκτός από τα επιθυμητά αρωματικά συστατικά, ουσίες που κρίνονται τοξικές για την υγεία του ανθρώπου. Τέτοιες ουσίες είναι οι βιογενείς αμίνες. Οι βιογενείς αμίνες είναι μικρού μοριακού βάρους οργανικές βάσεις που έχουν βιολογική δραστηριότητα. Αρκετές από αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο σε φυσιολογικές διεργασίες του ανθρώπινου οργανισμού (Halasz et al., 1994). Παρόλα αυτά η κατανάλωση τροφίμων που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις αυτών των συστατικών μπορεί να αποβεί τοξική για ευαίσθητα άτομα. Μετά τα ψάρια, το τυρί θεωρείται το πιο κοινό τρόφιμο που ευθύνεται για δηλητηριάσεις που σχετίζονται με την ισταμίνη (Stratton, 1991). Στα ζυμούμενα τρόφιμα, οι βιογενείς αμίνες, σχηματίζονται από την δράση των καρβοξυλασών των μικροοργανισμών. Η δράση των καρβοξυλασών έγκειται στην απελευθέρωση του CO 2 από την καρβοξυλική ομάδα του αμινοξέως με σύγχρονη απελευθέρωση της αντίστοιχης αμίνης. Το συνένζυμο της αντίδρασης είναι συνήθως η 5- φωσφορική πυριδοξάλη και το ιδανικό ph της αντίδρασης είναι γύρω στο 5,5 (Hemme et al., 1982). Η ικανότητα σχηματισμού βιογενών αμινών των διαφόρων βακτηρίων ποικίλει. Ως εκ τούτου, δεν μπορεί να σχετιστεί άμεσα η συγκέντρωση των βιογενών αμινών με τον βακτηριακό πληθυσμό (Halasz et al., 1994). Μεταξύ των γαλακτικών βακτηρίων που βρίσκονται στο τυρί, οι εντερόκοκκοι έχουν την ικανότητα να αποκαρβοξυλιώνουν τα αμινοξέα ιστιδίνη, τυροσίνη, ορνιθίνη και λυσίνη με τις αποκαρβοξυλάσες που διαθέτουν και να παράγουν τις βιογενείς αμίνες ισταμίνη, τυραμίνη, κανταβερίνη και πουτρεσκίνη, αντίστοιχα (Joosten και Northold, 1989; Giraffa et al., 1995). Μεγάλες ποσότητες τυραμίνης και ισταμίνης προκαλούν υπέρταση ή υπόταση, πονοκεφάλους, αλλεργικά συμπτώματα, ναυτία και εμετό. Η πουτρεσκίνη και η κανταβερίνη, από την άλλη μεριά, αντιδρούν με τα νιτρώδη άλατα και σχηματίζουν νιτροζαμίνες καρκινικής φύσεως. Τα αλλεργικά συμπτώματα που προκαλεί πολλές φορές, ειδικότερα η ισταμίνη, μπερδεύουν την διάγνωση και τις περισσότερες φορές το νόσημα αποδίδεται σε αλλεργική αντίδραση (Silla Santos, 1996). Εκτός από τους εντεροκόκκους, βιογενείς αμίνες είναι δυνατό να σχηματίσουν βακτήρια του γένους Lactobacillus (ισταμίνη), του γένους Micrococcus, της οικογένειας Enterobacteriaceae (κανταβερίνη και πουτρεσκίνη) και στελέχη του υποείδους Lc. lactis subsp. cremoris (ισταμίνη) που διαθέτουν αποκαρβοξυλάσες. 18

Στα τυριά που περιέχουν υψηλές ποσότητες ελεύθερων αμινοξέων, οι αμίνες μπορούν να σχηματιστούν ταχύτατα ακόμη και με την ύπαρξη ελάχιστων λακτοβακίλλων που έχουν αποκαρβοξυλάσες (Joosten & Northolt, 1989). Φαίνεται πως οι μικροοργανισμοί που παράγουν βιογενείς αμίνες ασκούν ανταγωνιστική δράση έναντι άλλων (Joosten & Stadhouders, 1987). Πολλοί παράγοντες, όπως ο βακτηριακός πληθυσμός, συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των οργανισμών, ο βαθμός της πρωτεόλυσης (διαθεσιμότητα υποστρώματος), το ph, ο συντελεστής άλατος καθώς και η θερμοκρασία ωρίμανσης και συντήρησης του τυριού φαίνεται να επηρεάζουν τον σχηματισμό των αμινών (Edwards & Sandine, 1981; Joosten & van Boekel, 1988; Schneller, Good & Jenny, 1997; Stratton at al., 1991). Αξίζει να σημειωθεί, ότι τυριά με παρόμοιο μικροβιακό προφίλ μπορούν να διαφέρουν εξαιρετικά σημαντικά στη συγκέντρωση βιογενών αμινών. Η ικανότητα δηλαδή αποκαρβοξυλίωσης των αμινοξέων παρουσιάζει διαφορές μεταξύ ακόμη και στελεχών του ίδιου είδους. Οι αμίνες είναι πολύ δύσκολο να καταστραφούν με παστερίωση ή άλλη μέθοδο επεξεργασίας μετά το σχηματισμό τους, για το λόγο αυτό πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη φροντίδα στην σωστή υγιεινή του περιβάλλοντος της τυροκόμησης, της πρώτης ύλης καθώς και της επιλογής στελεχών που θα προστεθούν στο τυρί. 19

2.3 Προστατευτικές ιδιότητες των NSLAB. Προστατευτικές καλλιέργειες θεωρούνται οι μικροοργανισμοί που εκχωρούν ένα πρόσθετο παράγοντα προστασίας συνεισφέροντας με αυτόν τον τρόπο στη μικροβιακή σταθερότητα των τροφίμων, μειώνοντας τον κίνδυνο ανάπτυξης και επιβίωσης παθογόνων και αλλοιογόνων βακτηρίων (Holzapfel et al., 1995). Η ανάπτυξη των LAB από μόνη της αποτελεί αναχαιτιστικό παράγοντα για τους ανεπιθύμητους μικροοργανισμούς, αφού δρουν ως ανταγωνιστική μικροχλωρίδα. Παρόλα αυτά, η ικανότητα τους να παράγουν βακτηριοσίνες είναι βασικής σημασίας σε στρατηγικές βιολογικής συντήρησης τροφίμων (βιοσυντήρηση), όπου επιτυγχάνεται η επέκταση της διάρκειας ζωής και της ασφάλειας των προϊόντων με τη χρήση μικροοργανισμών και/ή των μεταβολιτών τους (Ross et al., 2002). Οι βακτηριοσίνες είναι αντιμικροβιακά πεπτίδια παραγόμενα στο ριβόσωμα των βακτηρίων, που έχουν την ιδιότητα να «σκοτώνουν» συγγενικά βακτήρια (Klaenhammer, 1993). Σύμφωνα με τον Klaenhammer (1988), το 99% των βακτηρίων παράγει έστω και μία βακτηριοσίνη και ο μόνος λόγος που δεν έχουν απομονωθεί περισσότερες είναι ότι λίγοι ερευνητές έχουν προσπαθήσει. Οι βακτηριοσίνες προερχόμενες από τα γαλακτικά βακτήρια έχουν εις βάθος μελετηθεί καθώς και η εφαρμογή τους στα τρόφιμα. Η κύρια διαφορά τους από τις βακτηριοσίνες των Gram-αρνητικών βακτηρίων είναι ότι η παραγωγή τους δεν σημαίνει και θάνατο του βακτηριοσινογόνου στελέχους (Riley και Wertz, 2002), Οι βακτηριοσίνες διαιρούνται σε 3 ή 4 ομάδες (Klaenhammer, 1993). Στην ομάδα Ι, ανήκουν οι λαντιβιοτικές βακτηριοσίνες. Είναι μικρά (<5kDa) πεπτίδια με 19 μέχρι το πολύ 50 αμινοξέα. Χαρακτηρίζονται από την παρουσία σπάνιων αμινοξέων όπως λανθιονίνη και β- μεθύλ-λανθιονίνη. Η ομάδα Ι χωρίζεται σε δύο υποομάδες, Ιa και Ιb. Η υποομάδα Ιa αποτελείται από κατιονικά και υδρόφοβα πεπτίδια ελικοειδούς μορφής τα οποία προκαλούν πόρους στην κυτταρική μεμβράνη των βακτηρίων-στόχων και έχουν πιο ελαστική δομή από την υποομάδα Ιb. Στην υποομάδα αυτή ανήκει η νισίνη. Η υποομάδα Ιb αποτελείται από κυκλικά πεπτίδια τα οποία δεν έχουν καθαρό αρνητικό φορτίο και αναστέλλουν το σχηματισμό κυτταρικού τοιχώματος ή ζωτικών για το κύτταρο ενζύμων. Η ομάδα ΙΙ αποτελείται από μικρά, θερμοανθεκτικά (100 o C, 121 o C) πεπτίδια (μη λαντιβιοτικές βακτηριοσίνες) και υποδιαιρείται σε 3 υποομάδες. Η υποομάδα ΙΙa περιλαμβάνει τύπουπεδιοσίνης πεπτίδια δραστικά έναντι της λιστέριας. Η ομάδα ΙΙb αποτελείται από βακτηριοσίνες με δύο διαφορετικά πεπτίδια, και ο ρόλος και των δύο είναι σημαντικός για να είναι δραστική η ουσία. Η αρχική σύνθεση των αμινοξέων των δύο πεπτιδίων είναι διαφορετική και το καθένα κωδικοποιείται από διαφορετικό γονίδιο, παρόλ αυτά, ένα γονίδιο χρειάζεται για την δράση τους. Η υποομάδα ΙΙc περιλαμβάνει βακτηριοσίνες που περιέχουν κυστεΐνη. Η ομάδα ΙΙΙ αποτελείται από μεγάλες (>30 kda) και ασταθείς στη 20

θέρμανση βακτηριοσίνες για τις οποίες δεν υπάρχουν πολλές πληροφορίες. Μια τέταρτη ομάδα έχει προταθεί με σύμπλοκες βακτηριοσίνες οι οποίες σχηματίζουν σύμπλοκο με άλλα μακρομόρια (υδατάνθρακες, λιπίδια), τα οποία, πιστεύεται, ότι είναι απαραίτητα για την δράση τους (Piard και Desmazeaud, 1992; Cleveland et al., 2001). H παραγωγή βακτηριοσινών από τα γαλακτικά βακτήρια εξαρτάται από το στέλεχος και τη φάση ανάπτυξής του, από το θρεπτικό μέσο ή καλύτερα τη σύνθεση του τροφίμου και από τις συνθήκες παρασκευής ενός τροφίμου (π.χ. τεχνολογία και συνθήκες ωρίμασης ενός τυριού όπως ph, θερμοκρασία) (Yang και Ray, 1994; Parente και Ricciardi, 1999). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι βακτηριοσίνες δεν είναι αντιβιοτικά και οι δύο αυτοί όροι δεν πρέπει να συγχέονται. Διαφέρουν και ως προς τον τρόπο σύνθεσης και ως προς τον μηχανισμό δράσης. Επίσης, βακτήρια που παρουσιάζουν ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά δεν σημαίνει ότι είναι ανθεκτικά σε βακτηριοσίνες και η ανθεκτικότητα σε βακτηριοσίνες δεν είναι συνήθως γενετικής προέλευσης. Η ανθεκτικότητα σε βακτηριοσίνες προκύπτει συνήθως από φυσιολογικές αλλαγές στην μεμβράνη των βακτηρίων-στόχων (Mazzotta et al., 1997; Crandall και Montville, 1998). Για την L. monocytogenes, μια πιο συμπαγής μεμβράνη λόγω μικρότερης αναλογίας C15:C17 έχει ως αποτέλεσμα της ανθεκτικότητα της στην νισίνη (Crandall και Montville, 1998). Η εφαρμογή των βακτηριοσινών στα τρόφιμα μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους (Guinane et al., 2005). Μπορούν να χρησιμοποιηθούν βακτηριοσινογόνα στελέχη ως εκκινητές ή ως συμπληρωματική καλλιέργεια. Αυτή η εκδοχή έχει ως πλεονέκτημα ότι δεν θεωρούνται ως πρόσθετα λόγω της παραγωγής τους από στελέχη που προέρχονται από το τρόφιμο και επίσης έχει χαμηλό κόστος (Ross et al., 2000). Τα τελευταία χρόνια ορισμένες μελέτες στόχευσαν στη μελέτη της επίδρασης βακτηριοσινογόνων NSLAB στον μικροβιακό πληθυσμό τυριών κατά την πορεία της ωρίμανσης τους. Οι Giannou et al. (2009) μελέτησαν τα αποτελέσματα της χρήσης ενός στελέχους E. faecium, ικανού να παράγει βακτηριοσίνη, έναντι της Listeria monocytogenes σε Γραβιέρα που αποθηκεύτηκε σε διαφορετικές συνθήκες ωρίμανσης. Τα κύρια ευρήματα, έδειξαν ότι οι βακτηριοσίνες μείωναν τη συγκέντρωση του παθογόνου, αλλά σε χαμηλές θερμοκρασίες η επιβίωση της Listeria ήταν μεγαλύτερη χρονικά. Παρόμοια αποτελέσματα δίνουν έρευνες που έγιναν σε άλλα τυριά με τη χρήση βακτηριοσινογόνων στελεχών (Nascimento et al., 2008; Izquierdo et al., 2009). 21

2.4 Οφέλη υγείας που προσφέρουν τα NSLAB. 2.4.1 Προβιοτικές καλλιέργειες Τα προβιοτικά είναι ζωντανά μικροβιακά συμπληρώματα των τροφίμων, τα οποία ωφελούν την υγεία του καταναλωτή διατηρώντας ή ενισχύοντας την ισορροπία της εντερικής μικροχλωρίδας. Εξαιτίας των παρατηρούμενων πλεονεκτημάτων τους, τα προβιοτικά βακτήρια προστίθενται με αυξανόμενο ρυθμό σε γιαούρτια και άλλα ζυμούμενα προϊόντα γάλακτος τις τελευταίες δύο δεκαετίες. Τα πιο κοινά είναι οι λακτοβάκιλλοι όπως ο Lactobacillus acidophilus και τα bifidobacteria που συχνά αναφέρονται ως bifidus (Daly and Davis, 1998). Μια μεγάλη εξέλιξη στα βιο-λειτουργικά τρόφιμα σχετίζεται με τα τρόφιμα που περιέχουν προβιοτικά και πρεβιοτικά τα οποία ενισχύουν την υγεία προάγοντας την μικροβιακή χλωρίδα στο έντερο. Επιστημονικά στοιχεία στηρίζουν την υπόθεση ότι η διατήρηση μιας υγιούς εντερικής μικροχλωρίδας μπορεί να παρέχει προστασία από γαστρεντερικές δυσλειτουργίες συμπεριλαμβανομένων των γαστρεντερικών λοιμώξεων, των εντερικών φλεγμονών ακόμα και του καρκίνου (Haenel and Bendig, 1975;Mitsuoka, 1982; Salminen et al., 1998). Η χρήση των προβιοτικών βακτηρίων διεγείρει την ανάπτυξη επιθυμητών μικροοργανισμών, μειώνει τον πληθυσμό των πιθανά επιβλαβών βακτηρίων και ενισχύει τους φυσικούς αμυντικούς μηχανισμούς του σώματος. Σήμερα, υπάρχει πληθώρα στοιχείων που αποδεικνύει τις θετικές επιδράσεις των προβιοτικών στην ανθρώπινη υγεία. Παρόλα αυτά, τα στοιχεία προήλθαν κυρίως από μελέτες σε πληθυσμούς ασθενών. Για το λόγο αυτό υπάρχει επείγουσα ανάγκη για έρευνες και στοιχεία σε μέσους πληθυσμούς (γενικώς θεωρούμενους υγιείς)( Salminen et al., 1998). Προτού κάποιο προβιοτικό θεωρηθεί ότι έχει ωφέλιμες επιδράσεις στην υγεία του ανθρώπου, πρέπει να πληροί ορισμένες προϋποθέσεις : πρέπει να έχει καλές τεχνολογικές ιδιότητες ώστε να μπορεί να ενσωματωθεί σε βιομηχανικά προϊόντα τροφίμων χωρίς να χάνει τη ζωτικότητα και τη λειτουργικότητα του ή να παράγει δυσάρεστες οσμές, γεύσεις και υφές πρέπει να επιβιώνει από το πέρασμα του στον άνω γαστρεντερικό σωλήνα και να φθάνει ζωντανό στον τόπο δράσης του και τέλος πρέπει να είναι ικανό να λειτουργεί στο περιβάλλον του εντέρου. Για να μελετηθεί το προβιοτικό στέλεχος στο γαστρεντερικό σωλήνα, πρέπει να χρησιμοποιηθούν μοριακές τεχνικές ώστε να γίνει διάκριση μεταξύ των προβιοτικών στελεχών και των πιθανά χιλιάδων άλλων βακτηριακών στελεχών που φθάνουν γαστρεντερικό οικοσύστημα. Επιπροσθέτως, χρειάζονται και τεχνικές που μπορούν να επιβεβαιώσουν την επίδραση των προβιοτικών στα άλλα βακτήρια και κυρίως στον ξενιστή. Αυτό περιλαμβάνει όχι μόνο τις θετικές επιδράσεις τους στην υγεία, αλλά και τη 22

διαβεβαίωση ότι τα προβιοτικά στελέχη δεν έχουν κάποια αρνητική επίπτωση. Οπλισμένοι με αυτή τη γνώση, τα προβιοτικά μπορούν να εισαχθούν σε πιλοτικές έρευνες σε ανθρώπους ώστε να εκτιμηθούν οι επιδράσεις τους στην υγεία των καταναλωτών (Mattila-Sandholm and Salminen, 1998; Mattila-Sandholm et al.,1999). Εικ. 2.4.1 Το θεωρητικό πλαίσιο με το οποίο γίνεται η επιλογή των προβιοτικών μικροοργανισμών, περιλαμβάνει την ασφάλεια, την λειτουργικότητα και τις τενολογικές ιδιότητες. M. Saarela et al.,2000. Η ασφάλεια των προβιοτικών είναι πρωταρχικής σημασίας και κατευθυντήριες γραμμές για την εκτίμηση της ασφάλειας τους βρίσκονται σε διάφορα άρθρα. Υπάρχουν αρκετές προσεγγίσεις για την εκτίμηση της ασφάλειας των προβιοτικών: (α) έρευνες για τις εγγενείς ιδιότητες του προβιοτικού στελέχους, (β) έρευνες της φαρμακοκινητικής του προβιοτικού στελέχους και (γ) έρευνες για τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προβιοτικών στελεχών και του ξενιστή. Εικ. 2.4.2 Διαστάσεις της ασφάλειας των προβιοτικών. M. Saarela et al.,2000. 23

Η γνώση της επιβίωσης των προβιοτικών στο γαστρεντερικό σωλήνα, οι ιδιότητες της μετεγκατάστασης και του αποικισμού και ο τόπος δράσης των ενεργών ουσιών που προέρχονται από τα προβιοτικά είναι σημαντικά για την αξιολόγηση των πιθανών θετικών ή αρνητικών επιδράσεων της κατανάλωσης προβιοτικών. Η επιβίωση διαφορετικών προβιοτικών στελεχών σε διαφορετικά σημεία του γαστρεντερικού σωλήνα ποικίλει: κάποια στελέχη θανατώνονται άμεσα στο στομάχι ενώ άλλα διασχίζουν όλο το έντερο και επιβιώνουν σε μεγάλους πληθυσμούς. Η φαρμακοκινητική των προβιοτικών μελετήθηκε in vivo χρησιμοποιώντας διασωλήνωση, αιμάτωση και τεχνικές βιοψίας. Μερικές ενζυμικές ιδιότητες όπως η εκτεταμένη αποικοδόμηση των χολικών αλάτων και της βλέννας έχουν θεωρηθεί πιθανά επιβλαβείς. Οι ιδιότητες αυτές μπορούν να μελετηθούν in vitro. Ιδιότητες συσσωμάτωσης αιμοπεταλίων, ένζυμα που εγκαθίστανται στις καρδιακές βαλβίδες και ο σχηματισμός ανεπιθύμητων μεταβολιτών μπορούν επίσης να μελετηθούν in vitro. Η εκτίμηση των κινδύνων που ενέχει η κατανάλωση προβιοτικών μπορεί να είναι μια εξαιρετικά ακριβή και χρονοβόρα διαδικασία. Ένα μικρό ποσοστό κινδύνου πρέπει να λαμβάνεται υπ όψιν όταν συστήνεται η κατανάλωση τους σε ανοσσοκατεσταλμένους, και σε κάθε περίπτωση να εδραιώνεται η αναγκαιότητα τους και η πιθανή τους θετική επίδραση. Αυτό απαιτεί σχετικές πληροφορίες για την αποδοτικότητα και την ασφάλεια των προϊόντων. Μέχρι σήμερα, οι διαθέσιμες πληροφορίες για τα πιο διαδεδομένα προβιοτικά γαλακτικά βακτήρια παρέχουν αρκετή ασφάλεια. 24

2.4.2 Εφαρμογή προβιοτικών καλλιεργειών σε τρόφιμα. Τα ζυμούμενα προϊόντα γάλακτος έχουν μελετηθεί εκτενώς για την ιδιότητα τους να φέρουν προβιοτικά βακτήρια ως λειτουργικά τρόφιμα (Saxelin et al., 2005). Μεταξύ τους, τα τυριά αποδεικνύονται άριστα προϊόντα μεταφορείς ζωντανών βακτηρίων. Η μάζα του τυριού χαρακτηρίζεται ως συμπαγής και στερεή μήτρα, υψηλότερου ph, λιποπεριεκτικότητας και ρυθμιστικής ικανότητας (buffering capacity), που προστατεύει αποτελεσματικότερα το βακτηριακό κύτταρο, απ ότι αντίστοιχα υγρά ζυμούμενα προϊόντα γάλακτος, κατά την μεταφορά του στον γαστρεντερικό σωλήνα (Ross et al., 2002). Οι da Cruz et al.(2009) και οι Grattepache et al. (2008) έκαναν πρόσφατα ανασκόπηση σε εργασίες που αφορούν τα NSLAB. Εστίασαν κυρίως στις έρευνες πάνω σε λακτοβακίλλους και εντεροκόκκους που χρησιμοποιήθηκαν ως προβιοτικές καλλιέργειες σε τυριά διαφόρων ποικιλιών. Είναι σημαντικό τα προβιοτικά να διατηρούν τη ζωτικότητα τους κατά τη διάρκεια της παραγωγής και συντήρησης των προϊόντων. Έχοντας αυτό υπ όψιν, ο Lb. paracasei LPC-37 αξιολογήθηκε για τη βιωσιμότητα του σε τυριά ελβετικού τύπου, κατά την ωρίμανση (Aljewicz et al., 2009). Οι συγγραφείς έδειξαν ότι η ανάπτυξη των προβιοτικών ήταν εντονότερη κατά τις δύο πρώτες εβδομάδες ωρίμανσης. Η ανάπτυξη ενός άλλου στελέχους Lb. paracasei (Α13) μελετήθηκε σε τυριά Αργεντινής στην πορεία της παρασκευής τους και κατά τη διάρκεια αποθήκευσης τους υπό ψύξη (Vinderola et al., 2009). Ο πληθυσμός του Lb. paracasei A13 αυξήθηκε κατά μισό λογάριθμο στους 43 C κατά τη διαδικασία παραγωγής και άλλο μισό λογάριθμο κατά τη διάρκεια αποθήκευσης στους 5 C τις πρώτες 15 ημέρες. Αρκετά στελέχη Lb. plantarum απομονωμένα από βουλγάρικα τυριά και επιλεγμένα για τις πιθανές προβιοτικές τους ιδιότητες, δοκιμάστηκαν για την ικανότητα τους να παράγουν αλειφόμενα τυριά. Ο πληθυσμός τους παρέμενε σε συγκεντρώσεις κοντά στα 10 7 cfu/g έπειτα από 3 μήνες συντήρησης στους 4 C (Georgieva et al., 2009). Οι Kalavrouzioti et al. (2005) επίσης αναφέρουν ότι η χρήση προβιοτικών λακτοβακίλλων στην παραγωγή τυριού τύπου Κεφαλογραβιέρας έγινε με επιτυχία, σημειώνουν μάλιστα πως το τυρί που χρησιμοποιήθηκε ως πρόσθετη καλλιέργεια προβιοτικό στέλεχος Lb. paracasei subsp. paracasei αποτελεί κατάλληλο μέσο μεταφοράς προβιοτικών στη γαστρεντερική οδό. Η θερμοκρασία συντήρησης είναι το ο παράγοντας κλειδί για τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τυριού. Οι Vinderola et al.(2009) έδειξαν ότι η προσθήκη προβιοτικών σε τυριά Αργεντινής δεν επηρέασαν το προφίλ των προϊόντων όταν τα τελευταία συντηρήθηκαν στους 5 C, σε αυξημένες θερμοκρασίες όμως οι πρόσθετοι προβιοτικοί μικροοργανισμοί είχαν αρνητικές συνέπειες στη γεύση. 25

2.5 Συμπληρωματική καλλιέργεια Η συμπληρωματική καλλιέργεια προστίθεται στα αρχικά στάδια της τυροκόμησης, μαζί με την καλλιέργεια εκκίνησης, με σκοπό την επιτάχυνση της ωρίμανσης και την ανάπτυξη χαρακτηριστικού προφίλ γεύσης και αρώματος. Η συμπληρωματική καλλιέργεια χρησιμοποιείται για οποιονδήποτε άλλο σκοπό, εκτός της παραγωγής οξέως. Ο έλεγχος της γεύσης και του αρώματος έχει ιδιαίτερη σημασία, γιατί με αυτόν τον τρόπο το προϊόν μπορεί να αποκτήσει σταθερή ποιότητα. Η συμπληρωματική καλλιέργεια μπορεί μέσω των πρωτεολυτικών και λιπολυτικών της ιδιοτήτων, να διαμορφώσει το άρωμα και τη γεύση του τυριού ή και να επιταχύνει την ωρίμαση. Γαλακτικά βακτήρια από τη δευτερεύουσα μικροχλωρίδα ενός τυριού μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συμπληρωματική καλλιέργεια. Δύο είναι οι βασικές προϋποθέσεις για την επιλογή και τη χρησιμοποίηση της συμπληρωματικής καλλιέργειας, η προσεκτική επιλογή των στελεχών, έτσι ώστε η συνεισφορά τους στην ωρίμαση των τυριών να είναι θετική και ισορροπημένη και η υπεροχή της ως προς την ανταγωνιστικότητα με τα άλλα NSLAB, ώστε να παραμένει επικρατέστερη σε σχέση με την υπόλοιπη δευτερεύουσα μικροχλωρίδα του τυριού (Crow et al. 2001). Για να γίνει λοιπόν η επιλογή των στελεχών που θα χρησιμοποιηθούν ως πρόσθετη συμπληρωματική καλλιέργεια, πρέπει να μελετηθούν οι τεχνολογικές τους ιδιότητες και να γίνει η ταυτοποίηση τους. Ο καλύτερος τρόπος για να ταυτοποιηθούν τα στελέχη είναι μέσω της πολυφασικής ταξινόμησης. 26

2.6 Πολυφασική ταξινόμηση Η ταυτοποίηση των μικροοργανισμών βάσει των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών δεν οδηγεί πάντα σε σωστά αποτελέσματα. Η ακριβής και αξιόπιστη ταυτοποίηση ενός στελέχους δεν είναι πάντα δυνατή ενώ παράλληλα οι φυσιολογικοί και βιοχημικοί έλεγχοι που εφαρμόζονται είναι χρονοβόροι (Alves et al., 2004). Η πολυφασική ταξινόμηση βασίζεται στα γενοτυπικά, φαινοτυπικά και φυλογενετικά χαρακτηριστικά ενός βακτηρίου. Οι γενοτυπικές πληροφορίες προκύπτουν από την ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων (DNA και RNA) που υπάρχουν στο κύτταρο, ενώ οι φαινοτυπικές πληροφορίες βασίζονται στην έκφραση των πρωτεϊνών του κυττάρου και σε χημειοταξινομικούς δείκτες. 2.6.1Φαινοτυπικές μέθοδοι Οι φαινοτυπικές μέθοδοι ταξινόμησης των βακτηρίων προσδιορίζουν τον φαινότυπό τους. Φαινότυπος είναι η έκφραση του γενότυπου δηλαδή είναι τα παρατηρούμενα βιοχημικά, φυσιολογικά ή μορφολογικά χαρακτηριστικά ενός κυττάρου που προκύπτουν από την έκφραση του γενoτύπου του μέσα στο περιβάλλον που βρίσκεται. Οι φαινοτυπικές μέθοδοι εφαρμόζονται για την ανάλυση των συστατικών του κυττάρου εκτός του DNA και RNA. Βάσει αυτής της λογικής μπορούν αναλυθούν συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος, της κυτταρικής μεμβράνης και του κυττoπλάσματος (Vandamme et al. 1996). Οι κλασσικές φαινοτυπικές δοκιμές περιλαμβάνουν εξέταση των μορφολογικών, καλλιεργητικών, φυσιολογικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών. Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά αναφέρονται στην εξέταση της μορφολογίας του κυττάρου (σχήμα, κατανομή στο χώρο, τυχόν αθροίσματα, ύπαρξη βλεφαρίδων, ύπαρξη σπορίων) και στην κατανομή τους στα Gram θετικά ή στα Gram αρνητικά βακτήρια. Τα καλλιεργητικά χαρακτηριστικά είναι μια κατηγορία χαρακτηριστικών όχι και τόσο σημαντική για την ταυτοποίηση των βακτηρίων, και αναφέρεται στην εμφάνιση της αποικίας του βακτηρίου όταν αναπτύσσεται σε θρεπτικό υπόστρωμα. Τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά είναι οι απαιτήσεις του βακτηρίου σε παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη του όπως θερμοκρασία (έλεγχος ανάπτυξης σε διαφορετικές θερμοκρασίες), ώσμωση (έλεγχος ανάπτυξης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυμένων ουσιών, π.χ. NaCl), ph (έλεγχος ανάπτυξης σε διαφορετικές τιμές ph) και οξυγόνο (έλεγχος ανάπτυξης σε διαφορετικές ατμοσφαιρικές συνθήκες). Τέλος, τα βιοχημικά χαρακτηριστικά αναφέρονται στον ενζυμικό εξοπλισμό του βακτηρίου δηλαδή ποια ένζυμα διαθέτει για τις μεταβολικές αντιδράσεις του κυττάρου του (ενζυμική δραστηριότητα, μεταβολισμός ουσιών όπως υδατάνθρακες, πρωτεΐνες, αμινοξέα κ.α.). 27

Ανάλυση του πρωτεϊνικού προτύπου του κυττάρου (Whole-cell protein analysis). Η ταυτοποίηση των μικροοργανισμών βασίζεται στον πολυμορφισμό που παρουσιάζει το πρωτεϊνικό τους πρότυπο. Εφαρμόζεται διάρρηξη του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων και λαμβάνεται το εσωκυτταρικό τους εκχύλισμα. Οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται με μερκαπτοαιθανόλη και SDS και ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με SDS. Οι προκύπτουσες πρωτεϊνικές ζώνες μπορούν στη συνέχεια να συγκριθούν, με τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή, με τις αντίστοιχες ζώνες των πρότυπων στελεχών. 2.6.2 Γενοτυπικές Μέθοδοι Οι γενοτυπικές μέθοδοι βασίζονται στην ανάλυση των αλληλουχιών του DNA και RNA, ειδικότερα στην ανάλυση μικρών αλληλουχιών οι οποίες είναι μοναδικές για ένα συγκεκριμένο είδος βακτηρίου. Οι μέθοδοι αυτές επικρατούν, όσον αφορά την επαναληψιμότητα και την αξιοπιστία από τις φαινοτυπικές μεθόδους λόγω του γεγονότος ότι τα γενετικά χαρακτηριστικά ενός βακτηρίου είναι πιο σταθερά. Παρόλα αυτά δεν υποτιμάται η αξία των αποτελεσμάτων των φαινοτυπικών δοκιμών. Οι γενοτυπικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται περισσότερο για τη διερεύνηση της γενετικής ετερογένειας των στελεχών ενός γένους ή είδους και κατά δεύτερο λόγο, για την ταυτοποίηση τους. Εφαρμόζονται σε όλα τα βακτήρια και είναι μέθοδοι αξιόπιστες, απλές, επαναλήψιμες και με μεγάλη διακριτική ικανότητα. Η σύνδεση της ταξινόμησης με τα γενετικά χαρακτηριστικά των βακτηρίων δίνει τη δυνατότητα να κατανοηθεί η κατανομή των βακτηριακών ειδών και η ποικιλομορφία του πληθυσμού τους (Farber, 1996; Olive και Bean, 1999). 28

Ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόμενου πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) Η PFGE είναι μια γενοτυπική μέθοδος που βασίζεται στην ανάλυση όλου του χρωμοσωμικού DNA και θεωρείται ως η πιο αξιόπιστη ανάμεσα στις μοριακές μεθόδους (Tenover et al., 1995). Σε συγκεκριμένες περιπτώσεις (ζύμες) η PFGE μπορεί να εφαρμοστεί σε άθικτα χρωμοσώματα. Συνήθως όμως, το χρωμοσωματικό DNA επεξεργάζεται με ειδικό ένζυμο περιορισμού το οποίο αναγνωρίζει αλληλουχίες 6-8 βάσεων (low frequency cutting enzyme) και κόβει το DNA σε λίγα (5-20) κομμάτια μεγάλου μεγέθους (10-800 kb). Tα κομμάτια του DNA που προκύπτουν διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόμενου πεδίου (Farber, 1996). Η πηκτή χρωματίζεται με τη χρωστική βρωμιούχο εθίδιο και, αφού φωτογραφίζεται, γίνεται επεξεργασία με ειδικό πρόγραμμα στον υπολογιστή. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της μεθόδου είναι η απομόνωση και η κοπή του DNA που γίνεται μέσα σε μπλοκ (κύβους) αγαρόζης έτσι ώστε να αποφευχθεί το σπάσιμο των μεγάλων τμημάτων DNA που προκύπτουν. Τα κύτταρα του βακτηρίου παγιδεύονται στους κύβους αγαρόζης και μέσα σε αυτά γίνεται η όλη διαδικασία: λύση των κυττάρων και εξαγωγή του DNA, επεξεργασία με πρωτεϊνάσες (απομάκρυνση των πρωτεϊνών), επεξεργασία με ένζυμο περιορισμού. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) αποτελεί μια in vitro μέθοδο για τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης DNA ακολουθίας με σκοπό την εκθετική της αύξηση. Ακόμη και ένα αντίγραφο γονιδίου μπορεί μέσα σε λίγες ώρες να πολλαπλασιαστεί σε εκατομμύρια αντίτυπα Η αντίδραση PCR διεξάγεται μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων μετουσίωσης, υβριδισμού και επιμήκυνσης του DNA. Για μια αντίδραση PCR απαιτούνται, το DNA-στόχος, ο εκκινητής της αντίδρασης, η DNA πολυμεράση, τα δεοξυριβονουκλεοτίδια και το μέσο αντίδρασης με τα κατάλληλα μέταλλα (Mg 2+ ). Η θερμοκρασία είναι η κυριότερη παράμετρος για την αντίδραση PCR. Τα κυριότερα στάδια σε έναν κύκλο PCR καθορίζονται από την τιμή και τον χρόνο επίδρασης της θερμοκρασίας PCR και αποτελούνται από: την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA (μετουσίωση) σε μονόκλωνο DNA με επώαση σε υψηλή θερμοκρασία. Η θερμοκρασία όπως και ο χρόνος επώασης εξαρτώνται από το ποσοστό γουανίνης-κυτοσίνης (τρείς δεσμοί υδρογόνου) διότι είναι πιο σταθερά σε σύγκριση με τα ζεύγη αδενίνης-θυμίμης (δύο δεσμοί υδρογόνου), 29

τον υβριδισμό των εκκινητών (primers) με την αλληλουχία στόχο DNA. Οι εκκινητές είναι μονόκλωνα τμήματα DNA, μεγέθους 15 έως 30 νουκλεοτιδίων, τα οποία είναι συμπληρωματικά προς τα 5 άκρα των αλυσίδων της αλληλουχίας στόχου. Οι εκκινητές υβριδίζονται λόγω συμπληρωματικότητας στις κατάλληλες περιοχές του DNA στόχου. Η θερμοκρασία όπως και ο χρόνος επώασης εξαρτάται από το ποσοστό γουανίνης-κυτοσίνης του συγκεκριμένου DNA, την επιμήκνυνση του DNA κατά μήκος της αλληλουχίας στόχου, μέσω της δράσης της DNA πολυμεράσης με την προσθήκη νουκλεοτιδίων στο 3 άκρο των εκκινητών. H DNA πολυμεράση είναι ένα θερμοάντοχο ένζυμο, το οποίο απομονώνεται από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus (Williams et al. 1991). Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης βασισμένη στον πολυμορφισμό τυχαία πολλαπλασιαζόμενου DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR, RAPD-PCR) Με την εφαρμογή της RAPD-PCR μελετάται ο πολυμορφισμός των βακτηριακών γονιδιωμάτων με τον πολλαπλασιασμό, μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, τυχαίας ακολουθίας του DNA, με σκοπό την εκθετική της αύξηση (Williams et al. 1991). Η διαφορά της από την κλασσική PCR έγκειται στο γεγονός ότι οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται στοχεύουν σε τυχαίες ακολουθίες DNA που βρίσκονται στο γονιδίωμα. Το μέγεθος των εκκινητών κυμαίνεται περίπου στις 10 βάσεις. Κάθε αλληλουχία που πολλαπλασιάζεται εμφανίζεται ως ένα πρότυπο ζώνης στην πηκτή αγαρόζης. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης βασισμένη στον πολυμορφισμό τυχαία πολλαπλασιαζόμενου DNA ως μέθοδος, χαρακτηρίζεται ταχεία, ευαίσθητη και με σχετικά χαμηλό κόστος.. Η RAPD-PCR είναι η πιο διαδεδομένη τεχνική για τη μελέτη της μικροκλωρίδας των τυριών. Επιτρέπει τη διαφοροποίηση σε επίπεδο είδους και σε επίπεδο στελέχους (Ben Amor et al. 2007). Συνήθως χρησιμοποιείται για τη διάκριση στελεχών (Bouton et al. 2002). Έχει εφαρμοστεί με επιτυχία στον προσδιορισμό της γενετικής ετερογένειας στελεχών του γένους Lactococcus που απομονώθηκαν από τυριά Π.Ο.Π από νωπό γάλα, Camembert, (Corroler et al. 1998), Mozzarella (Morea et al. 1999), Toma Piemontese (Fortina et al. 2003), Μπάτζος (Psoni et al. 2007), Raschera και Castelmagno (Dolci et al. 2008a,b), Majorero (de la Plaza et al. 2006), Manchego (Gaya et al. 1999; Nieto-Arribas et al. 2009). Η στατιστική ανάλυση των προφίλ που προκύπτουν από την RAPD-PCR μπορούν να επιτρέψουν την ομαδοποίηση των στελεχών με βάση την 30

γεωγραφική τους προέλευση και συνάμα τη γεωγραφική προέλευση του τυριού (Moschetti et al. 1998). Σημαντικός είναι ο καθορισμός του ποσοστού επαναληψιμότητας της μεθόδου έτσι ώστε να επεξηγηθούν σωστά τα αποτελέσματα. Απομονώσεις με ποσοστό ομοιότητας ίσο ή μεγαλύτερο με το ποσοστό επαναληψιμότητας, θεωρούνται απομονώσεις του ίδιου στελέχους. Διαφορές στους θερμικούς κύκλους, στη συγκέντρωση της DNA πολυμεράσης, στην προετοιμασία του DNA, στη συγκέντρωση των εκκινητών καθώς και στη συγκέντρωση του μαγνησίου μπορούν να προκαλέσουν παραλλαγές στα προϊόντα της RAPD-PCR με αποτέλεσμα να μην είναι συγκρίσιμα. 31

2.7 Ελληνικά Παραδοσιακά Τυριά Π.Ο.Π. Στη χώρα μας υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία παραδοσιακών τυριών, που δυστυχώς δεν είναι ακόμη γνωστά στο ευρύ καταναλωτικό κοινό. Παράγονται κατά κύριο λόγο από κατσικίσιο, αγελαδινό ή πρόβειο γάλα και χαρακτηρίζονται από τη μοναδική και ιδιαίτερη γεύση τους αλλά και το πλούσιο άρωμά τους. Η ιδέα να προστατεύονται και να διατηρούνται τα παραδοσιακά προϊόντα της κάθε περιοχής είναι αρκετά παλιά και χρονολογείται από το 1883, οπότε η συνθήκη του Παρισιού πρότεινε τον όρο Appelation d Origine Contrôlée (AOC, Ονομασία ελεγχόμενης προέλευσης), όρος που χρησιμοποιείται ακόμα και σήμερα από τους Γάλλους (Bertozzi και Panari, 1993). Αυτή η ιδέα διαδόθηκε σε όλη την Ευρώπη και ο όρος AOC αντικαταστήθηκε από τον όρο PDO. Ο FAO/WHO έχει δημοσιεύσει πρότυπα για πολλά είδη τυριών σε διάφορες εκδόσεις του Κώδικα περί Προτύπων Ποιότητας για τυριά ως μέλος του FAO/WHO Κώδικα Τροφίμων. Στην Ευρωπαϊκή Ένωση έχουν καταχωρηθεί, μέχρις στιγμής, 750 ονομασίες τροφίμων ως ΠΟΠ ή ΠΓΕ. Από τις 750 ονομασίες οι 155 αφορούν τυριά, εκ των οποίων μόνο οι 12 έχουν καταχωρηθεί ως ΠΓΕ. Η Γαλλία έχει κατοχυρώσει 47 ονομασίες τυριών, η Ιταλία 42, η Ισπανία 26, η Πορτογαλία 13 και το Ηνωμένο Βασίλειο 12. To 1992, η Ευρωπαϊκή Ένωση εξέδωσε δύο κανονισμούς, 2081/92 και 2082/92 και δύο οδηγίες 46/92 και 47/92 που έχουν σκοπό την προστασία των παραδοσιακών τροφίμων της κάθε χώρας-μέλους. Ο κανονισμός 2081/92, αντικαταστάθηκε πρόσφατα από τον κανονισμό 510/2006, σύμφωνα με τον οποίο ως «Προστατευμένη Ονομασία Προέλευσης (ΠΟΠ ή PDO) νοείται το όνομα μιας περιοχής, ενός συγκεκριμένου τόπου ή σε εξαιρετικές περιπτώσεις μιας χώρας, το οποίο χρησιμοποιείται στην περιγραφή ενός γεωργικού προϊόντος ή ενός τροφίμου που κατάγεται από αυτήν την περιοχή, το συγκεκριμένο τόπο ή τη χώρα, και του οποίου η ποιότητα ή τα χαρακτηριστικά οφείλονται κυρίως ή αποκλειστικά στο γεωγραφικό περιβάλλον, που περιλαμβάνει τους φυσικούς και ανθρώπινους παράγοντες και του οποίου η παραγωγή, η μεταποίηση και η επεξεργασία λαμβάνουν χώρα στην οριοθετημένη γεωγραφική περιοχή». Όσον αφορά τα τυριά, οι φυλές των αγροτικών ζώων, ο τρόπος διαχείρισης και εκτροφής των ζώων, οι εδαφοκλιματικές συνθήκες της περιοχής μαζί με τη μέθοδο παρασκευής και ωρίμανσης των τυριών αποτελούν τους παράγοντες εκείνους οι οποίοι κάνουν ένα τυρί να ξεχωρίσει και να αποτελέσει τμήμα της παράδοσης μιας περιοχής. Η παρασκευή και η ωρίμανση των τυριών πρέπει να πραγματοποιούνται σε εγκαταστάσεις που βρίσκονται εντός της οριοθετημένης γεωγραφικής περιοχής. Κατά την παρασκευή τους απαγορεύεται η συμπύκνωση, η προσθήκη σκόνης ή συμπυκνώματος γάλακτος, πρωτεϊνών γάλακτος, καζεϊνικών αλάτων, χρωστικών, συντηρητικών και αντιβιοτικών ουσιών. Η προστασία των 32

ονομασιών προέλευσης μπορεί να αποτελέσει μοχλό ανάπτυξης των μειονεκτικών και απομακρυσμένων περιοχών, αυξάνοντας την αναγνωρισιμότητα των προϊόντων και κατά συνέπεια τα εισοδήματα των παραγωγών. Ταυτόχρονα οι προστατευόμενες ονομασίες κατοχυρώνουν και τους καταναλωτές, σχετικά με την προέλευση των προϊόντων που αγοράζουν. Οι ονομασίες στις οποίες έχει δοθεί προστασία υπάγονται σε σύστημα ελέγχου, ώστε να κατοχυρώνονται τόσο οι παραγωγοί από απομιμήσεις, όσο και οι καταναλωτές από παραπλανητικές ενδείξεις στα τρόφιμα. Οι έλεγχοι αφορούν την ορθή τήρηση των προδιαγραφών και την ορθή χρήση της επισήμανσης. Απαγορεύεται η παραγωγή, εισαγωγή, εξαγωγή διακίνηση και εμπορία τυριού με κάποια από τις Προστατευμένες Ονομασίες Προέλευσης, εφόσον δεν πληρούνται όλες οι προδιαγραφές παραγωγής του (Υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, 2007). Δυστυχώς ακόμα, η ισχύουσα νομοθεσία δεν περιλαμβάνει χώρες εκτός της Ευρωπαϊκής ένωσης όπου τα κατοχυρωμένα ως ΠΟΠ προϊόντα μπορούν να παράγονται και να διακινούνται ελεύθερα. Η Ευρωπαϊκή ένωση κάνει ιδιαίτερες προσπάθειες, στο πλαίσιο του Παγκόσμιου Οργανισμού Εμπορίου, να επιβάλλει σε παγκόσμιο επίπεδο την κατοχύρωση των παραδοσιακών της προϊόντων. Για το τυρί Φέτα υπήρξε μεγάλη διαμάχη επειδή παραγόταν και από άλλες ευρωπαϊκές χώρες. Παρόλο που από 1994 γίνεται σημαντική προσπάθεια για την κατοχύρωση της Φέτας ως Ελληνικού προϊόντος και τον Οκτώβριο του 2002 (ΕΚ 1829/2002), η Ευρωπαϊκή Επιτροπή εξέδωσε ρύθμιση που επιβάλλει την παραγωγή Φέτας από την Ελλάδα, το ζήτημα λύθηκε μόλις τον Οκτώβριο του 2005 τελικά στο Ευρωπαϊκό Δικαστήριο, έπειτα από προσφυγή της Δανίας και της Γερμανίας με την υποστήριξη της Γαλλίας και της Μεγάλης Βρετανίας, και η Φέτα χαρακτηρίστηκε τελικά ως Ελληνικό ΠΟΠ τυρί. Οι παραγωγοί τυριού Φέτας σε άλλες χώρες είχαν περιθώριο μέχρι τον Οκτώβριο του 2007 να συμμορφωθούν με τη συγκεκριμένη απόφαση. Στην Ελλάδα έχουν κατοχυρωθεί 21ελληνικά παραδοσιακά τυριά ως τυριά ΠΟΠ και φαίνονται στον Πίνακα 2.7.1 και υπάρχουν και πολλά άλλα που αναμένουν την αναγνώρισή τους. 33

Πίνακας2.7.1. Ελληνικά παραδοσιακά τυριά ΠΟΠ Όνομα τυριού Περιοχή Τύπος γάλακτος Ανεβατό Νομός Γρεβενών και Επαρχία Βοϊου Κοζάνης πρόβειο ή γίδινο ή μίγματα αυτών Γαλοτύρι Ήπειρος & Θεσσαλία πρόβειο, γίδινο ή μίγματα αυτών Μακεδονία, Θράκη, Ήπειρος, πρόβειο ή μίγμα πρόβειου και Στερεά Ελλάδα, Πελοπόννησος, Φέτα γίδινου έως 30% κ.β. Ν. Λέσβου & Θεσσαλία Γραβιέρα Αγράφων Περιοχή Αγράφων πρόβειο ή μίγμα πρόβειου με γίδινο έως 30% κ.β. Γραβιέρα Κρήτης Κρήτη πρόβειο ή μίγμα πρόβειου με γίδινο έως 20% κ.β. Γραβιέρα Νάξου Νάξος αγελαδινό, ή μίγμα αυτού με γάλα πρόβειο και γίδινο μέχρι 20% κ.β. Καλαθάκι Λήμνου Λήμνος πρόβειο ή μίγμα πρόβειου με γίδινο έως 30% κ.β. Κασέρι Μακεδονία, Θεσσαλία & Νομοί Λέσβου και Ξάνθης πρόβειο ή μίγμα πρόβειου και γίδινου έως 20% κ.β. Κατίκι Δομοκού Δομοκός γίδινο ή μίγμα αυτού με πρόβειο Κεφαλογραβιέρα Δυτικής Μακεδονία, Ήπειρος, Ν. πρόβειο ή μίγμα πρόβειου και Αιτωλοακαρνανία & Ν. γίδινου έως 10% κ.β. Ευρυτανία Κοπανιστή Κυκλάδες αγελαδινό, πρόβειο ή γίδινο Λαδοτύρι Μυτιλήνης Μυτιλήνη πρόβειο ή μίγμα αυτού με γίδινο Μανούρι Μετσοβόνε Μπάτζος Θεσσαλία, Κεντρική & Δυτική Μακεδονία Μέτσοβο Θεσσαλία, Κεντρική & Δυτική Μακεδονία Τυρόγαλα από πρόβειο ή γίδινο γάλα ή μίγμα αυτών και γάλα πρόβειο ή γίδινο ή κρέμα αυτού αγελαδινό, ή μίγμα αυτού με πρόβειο και γίδινο μέχρι 20% κ.β. πρόβειο ή γίδινο ή μίγμα αυτών Τυρόγαλα από γάλα πρόβειο, γίδινο Ξυνομυζήθρα Κρήτη ή μίγμα αυτών Κρήτης Πηχτόγαλο Χανίων Κρήτη γίδινο ή πρόβειο ή μίγμα αυτών Σαν Μιχάλη Σύρος Γάλα αγελαδινό Σφέλα Νομός Μεσσηνίας και Νομός Λακωνίας πρόβειο ή γίδινο ή μίγμα αυτών Φορμαέλλα Αράχωβα Αράχωβας Παρνασσού γίδινο ή πρόβειο ή μίγμα αυτών Ξύγαλο Σητείας κατσικίσιο ή πρόβειο γάλα ή και μείγμα αυτών Από τα τυριά άλμης, ο Μπάτζος είναι ένα ημίσκληρο, χαμηλής λιποπεριεκτικότητας τυρί, που προέρχεται από τη Δυτική Μακεδονία. Παρασκευάζεται παραδοσιακά είτε από νωπό κατσικίσιο γάλα είτε από νωπό πρόβειο γάλα ως παραπροϊόν του Μανουριού για τον πρώτο 34

ή του βουτύρου για τον δεύτερο τύπο γάλακτος. Η πραγματική πρόθεση ήταν να αποκτηθεί άριστης ποιότητας Μανούρι ή μεγάλη ποσότητα βουτύρου από τον ορό. Για το λόγο αυτό, το γάλα χτυπιόταν με ξύλινο έμβολο περίπου 500 φορές κατά τη διάρκεια της πήξης και έτσι μεγάλο ποσοστό του λίπους μεταφέρονταν στον ορό. Η Φέτα γίνεται στην ηπειρωτική χώρα κυρίως, από πρόβειο γάλα ή από μίγμα πρόβειου με κατσικίσιο (μέχρι 30%). Ο παραδοσιακός τρόπος παρασκευής περιλαμβάνει τη χρησιμοποίηση πυτιάς από το στομάχι μικρών μηρυκαστικών, η οποία συμβάλλει στην ανάπτυξη πολύ ευχάριστου αρώματος και πιπεράτης γεύσης. Το τυρί αλατίζεται επιφανειακά και ωριμάζει αρχικά στους 16 0 C και έπειτα είτε σε ξύλινα βαρέλια είτε σε λευκοσιδηρά δοχεία στους 4 0 C. Η Σφέλα είναι ημίσκληρο τυρί που παρασκευάζεται στη νότια Πελοπόννησο, στην επαρχεία Μεσσηνίας. Το τυρί συχνά ονομάζεται «Φέτα της φωτιάς» γιατί το τυρόπηγμα αναθερμαίνεται στους 36-38 0 C. Το τυρί παρασκευάζεται από νωπό πρόβειο γάλα, ή μίγματα πρόβειου και κατσικίσιου και ωριμάζει σε βαρέλια όπως η Φέτα. Το καλαθάκι Λήμνου παρασκευάζεται στο νησί Λήμνος με τεχνολογία παρόμοια της Φέτας, με την εξαίρεση ότι το τυρόπηγμα στραγγίζει σε στρογγυλά καλαθάκια, όπου επίσης αλατίζεται επιφανειακά. Από τα μαλακά τυριά, το Ανεβατό είναι αλειφόμενου τύπου τυρί που γίνεται από νωπό πρόβειο ή κατσικίσιο γάλα ή μίγματά τους στην ορεινή περιοχή της Δυτικής Μακεδονίας. Παραδοσιακά, το Ανεβατό παρασκευαζόταν από βοσκούς με μεγάλα κοπάδια ζώων, που πύτιαζαν το πρωινό γάλα και σε λίγες ώρες το γάλα ήταν πηγμένο και το πήγμα είχε ανέβει στην επιφάνεια (από όπου το όνομα Ανεβατό). Η Κοπανιστή γίνεται στα κυκλαδίτικα νησιά του Αιγαίου, από αγελαδινό γάλα. Το τυρόπηγμα ζυμώνεται με το χέρι και σχηματίζονται μικρές μπάλες που αφήνονται σε πήλινα δοχεία για αρκετές μέρες, ωσότου να σχηματιστεί στην επιφάνειά τους μα πράσινη ή κυανοπράσινη μούχλα. Το τυρί ζυμώνεται κατά την ωρίμανση αρκετές φορές και το προϊόν αποκτά τελικά χαρακτηριστική πιπεράτη γεύση. Το Γαλοτύρι είναι μαλακό τυρί που γίνεται από πρόβειο γάλα στο τέλος της γαλακτικής περιόδου και έχει υπόξινη γεύση. Παρασκευάζεται σε ολόκληρη τη χώρα με μεθόδους που διαφέρουν από περιοχή σε περιοχή. Σε γενικές γραμμές, το γάλα βράζεται, τοποθετείται σε πήλινο δοχείο και μετά από 24h αλατίζεται και αφήνεται για άλλες δύο ημέρες. Έπειτα μεταφέρεται σε ασκό από δέρμα ζώου. Η προσθήκη προϊόντος συνεχίζεται μέχρι ο ασκός να γεμίσει. Το Κατίκι προέρχεται από την περιοχή της Δομοκού. Το πηγμένο γάλα στραγγίζεται, προσθέτεται αλάτι και το τυρί διατηρείται στους 4 0 C για κατανάλωση. 35

Το πηχτόγαλο Χανίων είναι μαλακό αλειφόμενο τυρί. Το γάλα αφήνεται να ξινίσει για 24h. Το πήγμα στραγγίζεται, προσθέτεται αλάτι σε ποσοστό 1% και το προϊόν είναι έτοιμο για κατανάλωση. Το Κασέρι είναι ημίσκληρο τυρί τύπου «pasta filata». Η παρασκευή του μεταφέρθηκε στην Ελλάδα από την Ιταλία. Παρασκευάζεται από πρόβειο γάλα ή μίγμα πρόβειου και κατσικίσιου γάλακτος. Ο τύπος αυτός του τυριού παρασκευάζεται κυρίως στην ορεινή Θεσσαλία, Μακεδονία και Ήπειρο. Η Κεφαλογραβιέρα είναι σκληρό τυρί που παρασκευάζεται κυρίως στην ορεινή Ελλάδα, συνήθως από μίγμα 60:40 αγελαδινό/πρόβειο γάλα. Είναι δυνατό επίσης να χρησιμοποιηθεί και κατσικίσιο γάλα σε αναλογία όχι μεγαλύτερη από 20%. Όπως δείχνει η ονομασία του τυριού, η τεχνολογία παρασκευής του έχει ομοιότητες με το Κεφαλοτύρι και τη Γραβιέρα. Το Λαδοτύρι γίνεται από πρόβειο γάλα ή μίγμα πρόβειου και κατσικίσιου γάλακτος στο νησί της Μυτιλήνης. Το τυρί διατηρείται σε ελαιόλαδο μετά από ωρίμανση για περίπου δύο μήνες. Η Φορμαέλλα παρασκευάζεται στην ορεινή περιοχή του Παρνασσού από νωπό πρόβειο γάλα ή μίγμα του με κατσικίσιο. Το τυρόπηγμα κόβεται σε κομμάτια και τοποθετείται σε ειδικά για το τυρί καλάθια που λέγονται «τυροβόλια». Στη συνέχεια τα τυροβόλια βυθίζονται σε ορό 60 0 C για λίγο χρόνο ώστε να αναθερμανθεί το τυρί. Το Μετσοβόνε γίνεται κυρίως από νωπό αγελαδινό γάλα, χρησιμοποιούνται όμως και μίγματά του με πρόβειο και κατσικίσιο γάλα. Είναι σκληρό καπνιστό τυρί τύπου «pasta filata» και παρασκευάζεται στο Μέτσοβο της Ηπείρου. Το Σαν Μιχάλη παρασκευάζεται στο νησί Σύρος από αγελαδινό γάλα. Πήρε την ονομασία του από το όνομα της καθολικής εκκλησίας του νησιού Το Μανούρι και η Ξινομυζήθρα είναι τυριά τυρογάλακτος. Το Μανούρι είναι τυρί με εξαιρετικά γευστικά χαρακτηριστικά, που προέρχεται από τη Δυτική Μακεδονία. Παραδοσιακά γινόταν από τον ορό που προέκυπτε κατά την παρασκευή του Μπάτζου από κατσικίσιο γάλα. Είναι γλυκό, ελαφρά αλατισμένο τυρί. Η Ξινομυζήθρα παρασκευάζεται στην Κρήτη με τεχνολογία που της επιτρέπει να ξινίσει και να διατηρείται σε βαρέλια για περισσότερο από δύο μήνες. 36

2.7.1 Γραβιέρα Κρήτης. Η Γραβιέρα Κρήτης είναι ένα είδος τυριού που παράγεται στο νησί της Κρήτης, στην Ελλάδα, και αποτελεί τυρί Προστατευμένης Ονομασίας Προέλευσης (Π.Ο.Π.). Παρασκευάζεται από πρόβειο γάλα ή μίγμα πρόβειου με κατσικίσιο γάλα. Το κατσικίσιο γάλα μπορεί να αποτελεί μέχρι το 20% του γάλακτος που χρησιμοποιείται για την παραγωγή της Γραβιέρας Κρήτης. Είναι ένα από τα καλύτερα ελληνικά σκληρά τυριά, που διακρίνεται για το ευχάριστο άρωμα και την εκλεπτυσμένη γεύση του. Στην Κρήτη το τυρί παράγεται ως εξής: το νωπό γάλα συλλέγεται μέσα σε δοχεία, προστίθεται παραδοσιακή πυτιά (από στομάχι μικρού αρνιού) στους 35 0 C και η πήξη επιτυγχάνεται μετά από 30min. Το πήγμα κόβεται σε μικρά κομμάτια και έπειτα η θερμοκρασία του αυξάνεται μέχρι τους 50 0 C (1 0 C/min) υπό συνθήκες συνεχούς ανάδευσης. Το πήγμα στραγγίζεται με εφαρμογή πίεσης για 20 ώρες και έπειτα το τυρί τοποθετείται σε άλμη (20%) για τρεις μέρες στους 17 0 C. Το τυρί έπειτα απομακρύνεται από την άλμη και αφήνεται να ωριμάσει για τουλάχιστον τρεις μήνες. Σύμφωνα με το Ελληνικό Κώδικα Τροφίμων (2006), η Γραβιέρα Κρήτης επιτρέπεται να καταναλωθεί μετά από τουλάχιστον 3 μήνες ωρίμανσης. Το ώριμο τυρί έχει μια ιδιαίτερη και διακριτή οσμή και γεύση, μια επιφάνεια με γλοιώδη φλοιό και σχισμές διαφόρων μεγεθών. 37

3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Σκοπός της έρευνας ήταν: (i) η ταυτοποίηση των λακτοβακίλλων που απομονώθηκαν από παραδοσιακές Γραβιέρες Κρήτης, οι οποίες παρασκευάστηκαν σε δύο τυροκομεία, σε επίπεδο είδους με τη φαινοτυπική μέθοδο SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου, (ii) η εκτίμηση της γενοτυπικής ετερογένειας τους, με τη χρήση γενοτυπικών μεθόδων (RAPD-PCR, PFGE) και (iii) η μελέτη της ετερογένειας των απομονώσεων όσον αφορά τις τεχνολογικές τους ιδιότητες. Τα ευρήματα της μελέτης αυτής, επιτρέπουν την επιλογή στελεχών με ενδιαφέρουσες τεχνολογικές ιδιότητες και τη χρήση τους ως πρόσθετη καλλιέργεια, ενώ παράλληλα εξετάζουν την πιθανή προβιοτική δράση των στελεχών και θέτουν τη βάση για περαιτέρω έρευνες. 38

4. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Βακτηριακά στελέχη και πηγές απομόνωσης γαλακτικών βακτηρίων. Συνολικά μελετήθηκαν 54 στελέχη γαλακτικών βακτηρίων που απομονώθηκαν από διαφορετικές τυροκομήσεις της ελληνικής Π.Ο.Π Γραβιέρας Κρήτης (Πίνακας). Πιο συγκεκριμένα, 27 στελέχη απομονώθηκαν από ώριμα τυριά τριών διαφορετικών τυροκομήσεων που πραγματοποιήθηκαν σε παραδοσιακό τυροκομείο της Κρήτης, σε ορεινή περιοχή (A,B,C), ενώ τα υπόλοιπα 27 είχαν απομονωθεί από τυριά, τριών διαφορετικών τυροκομήσεων, με γάλα ζώων που έβοσκαν σε χαμηλότερο υψόμετρο (D,E,F) (Bozoudi et al. unpublished data). Τα τυριά ήταν παρασκευασμένα από νωπό γάλα με την παραδοσιακή τεχνολογία. Πίνακας 4.1.1 Πηγές απομόνωσης γαλακτικών βακτηρίων και βακτηριακά στελέχη που μελετήθηκαν. Τυροκομείο Δείγμα Τυριού Απομονώσεις NSLAB Ι Α Α1 - Α10 Ι Β Β1 - Β10 Ι C C1 - C7 ΙΙ D D711, D713,D715,D716,D718,D729,D731 ΙΙ E E759,E763,E764,E766,E767,E768,E760,E801,E802,E803 ΙΙ F F781,F783,F784,F785,F786,F787,F810,F811,F812,F813 39

4.2 Μικροβιολογικές και χημικές αναλύσεις τυριών. 4.2.1 Μικροβιολογικές αναλύσεις. Με ασηπτικό τρόπο ζυγίζονταν 10g δείγματος τυριού σε αποστειρωμένο τρυβλίο. Έπειτα το δείγμα τοποθετούνταν σε αποστειρωμένη πλαστική σακούλα και προσθέτονταν 90ml αποστειρωμένου διαλύματος κιτρικού νατρίου 2%. Ακολουθούσε ομογενοποίηση σε συσκευή Stomacher 400 (Lab-Blender, Seward, London, UK) για 2 λεπτά. Από το ομογενοποιημένο δείγμα γίνονταν οι κατάλληλες δεκαδικές αραιώσεις σε αποστειρωμένο αραιωτικό υγρό (Ringer) και ακολούθησαν εμβολιασμοί σε θρεπτικά υποστρώματα. Στον πίνακα δίνονται οι ομάδες βακτηρίων που καταμετρήθηκαν, τα αντίστοιχα υποστρώματα και οι συνθήκες επώασης. Πίνακας 4.1.2 Βακτηριακές ομάδες που καταμετρήθηκαν, τα αντίστοιχα υποστρώματα και οι συνθήκες επώασης. Βακτηριακές ομάδες Υποστρώματα Θερμοκρασία ( C) Χρόνος επώασης Κολοβακτηριοειδή Violet Red Bile Agar (VRBA) 30 24h E. coli Violet Red Bile Agar (VRBA) 44.5 24h Εντεροβακτηριοειδή Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA) 37 24h Γαλακτικά βακτήρια (συνολικός αριθμός LAB) MRS agar 30 5d Λακτόκοκκοι M17 30 48h Λακτοβάκιλλοι Acetate Agar (AcA) 30 5d Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα Plate Count Agar (PCA) 30 3d Ζύμες Μύκητες Gram - κόκκοι Potato Dextrose Agar (PDA) Nutrient Agar Crystal Violet (NACV) 25 5d 21 48h Σταφυλόκοκκοι Baird Parker Agar (BP) 37 48h Εντερόκοκκοι Kanamycin Azide Agar 37 48h 40

Μετά την επώαση των τρυβλίων, στις κατάλληλες για κάθε μικροοργανισμό συνθήκες, καταμετρούνταν οι αποικίες και υπολογιζόταν ο μέσος όρος των πληθυσμών στα τυριά της Γραβιέρας Κρήτης για κάθε υπόστρωμα. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε log 10 cfu / g τυριού 4.2.2 Χημικές αναλύσεις. 4.2.2.1 Μέτρηση του ph των τυριών. 10g δείγματος τυριού ζυγίζονταν σε ποτήρι ζέσεως και ομογενοποιούνταν με νερό θερμοκρασίας 45 C με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου. Ο όγκος συμπληρωνόταν στα 100ml και ακολουθούσε μέτρηση του ph με εμβάπτιση του ηλεκτροδίου, ηλεκτρονικού πεχαμέτρου (Hanna instruments, Padova, Italy), στο διάλυμα του τυριού. 4.2.2.2 Προσδιορισμός της υγρασίας των τυριών. Σε πορσελάνινη κάψα τοποθετούνταν γυάλινη ράβδος και 10g άμμου. Στη συνέχεια ακολουθούσε ξήρανση σε κλίβανο στους 105 C για 1h περίπου. Έπειτα η κάψα ψύχονταν σε ξηραντήρα και κατόπιν ζυγίζονταν (βάρος Α). 1g λειοτριβιμένου δείγματος ζυγίζονταν μέσα στην κάψα (βάρος Β), μεταφέρονταν σε κλίβανο στους 105 C για 24h, ακολούθως αφήνονταν να κρυώσει σε ξηραντήρα και τέλος ζυγίζονταν (βάρος Γ). Η υγρασία του δείγματος υπολογίζεται από τον τύπο: Στερεό υπόλειμμα 1- [ (Β-Γ) / (Β-Α) ] Υγρασία 1- Στερεό υπόλειμμα 4.2.2.3 Προσδιορισμός NaCl. Ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας του τυριού σε NaCl έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο Cornell. Σε ποτήρι ζέσεως ζυγίζονταν 10g δείγματος και ομογενοποιούνταν με τη βοήθεια αναμικτήρα, με νερό θερμοκρασίας 60 C. Το μίγμα μεταφερόταν σε ογκομετρικό κύλινδρο 41

και συμπληρώνονταν με ζεστό νερό ως τα 250ml, όπου έπειτα από καλή ανάδευση αφήνονταν σε ηρεμία για 30min. Από το διάλυμα λαμβάνονταν 25ml υπερκείμενου υγρού, τοποθετούνταν σε κωνική φιάλη και προστίθεντο 2ml δείκτη χρωμικού καλίου 2%. Στη συνέχεια ακολουθούσε ογκομέτρηση με διάλυμα νιτρικού αργύρου (0,171Ν) μέχρι να παραμείνει ο καστανός χρωματισμός τουλάχιστον 10sec. 1ml δια/τος AgNO 3 (0.171N) 1% NaCl στο δείγμα 4.2.2.4 Πρωτεόλυση τυριών. Από τις διεργασίες των τυριών η πιο πολύπλοκη, μακρόχρονη και εκτεταμένη είναι η πρωτεόλυση, μια σύνθετη ενζυμική διεργασία, η οποία ξεκινά με την προσθήκη της πυτιάς και των καλλιεργειών εκκίνησης στο προς τυροκόμηση γάλα. Κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης οι καζεΐνες υδρολύονται με την συνδυασμένη δράση της χυμοσίνης, των ενζύμων των καλλιεργειών και των ενζύμων του γάλακτος, σε μικρομοριακά υδατοδιαλυτά πεπτίδια και αμινοξέα. Η πρωτεόλυση στα δείγματα των τυριών εκτιμήθηκε με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο της ο-φθαλδιαλδεϋδης (ο-ρα) σύμφωνα με τους Church et al. (1983) και την ηλεκτροφορητική μέθοδο της UREA-PAGE σύμφωνα με τον Andrews (1983), ενώ για τη στερέωση και χρώση των πρωτεϊνών εφαρμόζεται η μέθοδος των Blakesley & Boezi (1977). Τεχνική ο-ρα: 5.0 g δείγματος μεταφέρονται σε δοκιμαστικό σωλήνα με βιδωτό πώμα (ως τυφλό 5.0 g παστεριωμένου πλήρους γάλακτος). Εφόσον η συγκέντρωση γλυκίνης στο δείγμα είναι >1150 (όριο γραμμικότητας), το δείγμα πρέπει να αραιωθεί, σε βαθμό που εξαρτάται από το βαθμό πρωτεόλυσης του εξεταζόμενου τυριού. Πάντα στον υπολογισμό τής συγκέντρωσης γλυκίνης στο δείγμα λαμβάνεται υπόψιν η αραίωση. προσθήκη 10 ml TCA (18%), ώστε η τελική συγκέντρωση του TCA στο δείγμα να είναι 12%, και καλή ανάδευση σε vortex παραμονή σε ηρεμία για 15 min καλή ανάδευση σε vortex 1g ζυγίζεται σε eppendorf 42

φυγοκέντρηση 12000 rpm x 5 min, 10 o C διατήρηση υπερκείμενου υγρού υπό ψύξη, μέχρι την ανάλυση (σε -60 ο C, αν η ανάλυση δεν πρόκειται να γίνει την ίδια μέρα) 150 μl υπερκείμενου υγρού (κάτω, όμως από την επιφανειακή στοιβάδα τού λίπους που πιθανώς να εμφανισθεί) παραλαμβάνονται και προστίθενται σε 3 ml διαλύματος ΟΡΑ, μέσα σε σωλήνα καλή ανάδευση σε vortex παραμονή ακριβώς 2 min, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ανάγνωση οπτικής πυκνότητας σε 340 nm, σε φασματοφωτόμετρο Shimadzu. Από την οπτική πυκνότητα τού δείγματος αφαιρείται η αντίστοιχη του τυφλού. Τεχνική UREA-PAGE: δείγμα 0.50g τυριού κατεργάζεται με ανάδευση σε φιαλίδιο με 20ml sample treatment buffer A το αιώρημα διατηρείται σε 40 ο Cx15min ακολουθεί φυγοκέντρηση (3000g, 4 ο C, 15min) παραλαμβάνεται 1ml υπερκείμενου υγρού, κάτω από την στερεοποιημένη στοιβάδα του λίπους και μεταφέρεται σε eppendorf στο eppendorf προστίθενται 20μl διάλυμα χρωστικής-δείκτη τοποθετείται σε βαθιά κατάψυξη μέχρι την ανάλυση 11μl δείγματος σε STB(A) φορτώνονται στην πηκτή. Οι συνθήκες της ηλεκτροφόρησης περιγράφονται στην παράγραφο 4.7.4 4.3. Απομόνωση και διατήρηση των στελεχών. Η απομόνωση των γαλακτικών βακτηρίων γινόταν από τρυβλία με MRS agar, από τα οποία πάρθηκαν με κρίκο δέκα απομονώσεις από κάθε δείγμα. Κάθε αποικία μεταφέρονταν σε δοκιμαστικό σωλήνα με MRS broth (ζωμό) και επωάζονταν για 24h στους 30 C. Έπειτα γινόταν καθαρισμός της αποικίας με streak, σε MRS agar με κάθετες γραμμές και επώαση στους 30 C για 24h. Μεμονωμένες καθαρές αποικίες μεταφέρονταν σε MRS broth και επωάζονταν εκ νέου στους 30 C για 24h. Οι Gram +, αρνητικοί στην καταλάση μικροοργανισμοί διατηρούνταν σε MRS broth με γλυκερόλη (70:30) στους -80 C. 43

Για την δραστηριοποίηση των μικροοργανισμών πριν από κάθε δοκιμή, πραγματοποιούνταν δύο διαδοχικές ανακαλλιέργειες σε MRS broth. Τα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε όλη τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας ήταν προϊόντα των εταιρειών Oxoid (Oxoid Ltd., Hampshire, England) και Merck (Darmstadt, Germany), με εξαίρεση ορισμένες περιπτώσεις που αναφέρονται διαφορετικά. 4.4 Ταυτοποίηση των απομονώσεων με βιοχημικές και φυσιολογικές μεθόδους. 4.4.1 Χρώση Gram. Η χρώση Gram χρησιμοποιείται για την μελέτη της μορφολογίας του κυττάρου, την παρουσία ενδοκυτταρικών εγκλείστων καθώς επίσης και για ταξινομικούς σκοπούς. Τεχνική : 1. Προετοιμασία μόνιμου παρασκευάσματος του προς εξέταση μικροοργανισμού. Μια κρικιά αναπτύξεως της κάθε απομονωσης σε MRS broth τοποθετούνταν σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Το παρασκεύασμα μονιμοποιούνταν, περνώντας την αντικειμενοφόρο πλάκα πάνω από τη φλόγα λύχνου Bunsen. 2. Χρωματισμός για 1min με διάλυμα Crystal Violet. 3. Προσθήκη του ιωδιούχου διαλύματος Lugol για 1min. 4. Ξέπλυμα με νερό βρύσης. 5. Αποχρωματισμός του παρασκευάσματος 3 φορές με αλκοόλη 95% και νερό, εναλλάξ για 30sec. 6. Μεταχρωματισμός του παρασκευάσματος με διάλυμα Carbol Fuchsin για 30sec. 7. Ξέπλυμα με νερό βρύσης και στέγνωμα της αντικειμενοφόρου πλάκας μεταξύ φύλλων διηθητικού χαρτιού. 44

Ακολουθεί μικροσκοπική παρατήρηση σε μεγέθυνση Χ100 (με ελαιοκατάδυση). Οι θετικοί κατά Gram (Gram + ) μικροοργανισμοί χρωματίζονται μπλε ιώδεις ενώ οι αρνητικοί κατά Gram (Gram - ) μικροοργανισμοί ρόδινοι. Τα αντιδραστήρια της χρώσης βρίσκονται αναλυτικά στο παράρτημα. 4.4.2 Δοκιμή παραγωγής καταλάσης. Σκοπός της δοκιμής είναι να ελεγχθεί εάν το βακτήριο διαθέτει ή όχι το ένζυμο καταλάση. Η καταλάση είναι υπεύθυνη για τη διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) σε οξυγόνο και νερό σύμφωνα με την αντίδραση : Τεχνική : καταλάση 2 Η 2 Ο 2 2Η 2 Ο + Ο 2 1. Τα στελέχη αναπτύσσονται σε πλάγιο MRS agar με 0,5% γλυκόζη και επωάζονται στους 30 C για 24h. 2. Σε αντικειμενοφόρο πλάκα μεταφέρεται μια ποσότητα από την καλλιέργεια του προς εξέταση μικροοργανισμού, με τη βοήθεια αποστειρωμένου βακτηριολογικού κρίκου. 3. Η ποσότητα της ανακαλλιέργειας αναμιγνύεται με μια σταγόνα διαλύματος Η 2 Ο 2 (3% w/v). Παραγωγή φυσαλίδων οξυγόνου μέσα σε ένα λεπτό υποδηλώνει θετική δοκιμή. 4.4.3 Δοκιμή ανάπτυξης σε διάφορες θερμοκρασίες. Έγινε έλεγχος της ικανότητας ανάπτυξης των στελεχών στους 15 C και στους 45 C. Καλλιέργεια 24h εμβολιάζονταν σε 10ml MRS broth (εμβόλιο 1% w/v) και επωάζονταν στους 15 C για μια εβδομάδα και στους 45 C για 2 ημέρες. Κατόπιν ελέγχονταν για ανάπτυξη (Schillinger and Lucke 1987). 4.4.4 Δοκιμή παραγωγής CO2 από γλυκόζη. Έγινε έλεγχος της ικανότητας των βακτηρίων να παράγουν CO 2 από τη ζύμωση της γλυκόζης. 45

Τεχνική : Δραστηριοποιημένη καλλιέργεια των στελεχών εμβολιαζόταν σε σωλήνες που περιείχαν λιωμένο MRS agar εμπλουτισμένο με 5% γλυκόζη. Μετά τον εμβολιασμό, προστίθετο σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα agar 2%, σε ύψος 2cm ώστε να δημιουργηθούν αναερόβιες συνθήκες. Τα στελέχη στη συνέχεια επωάζονταν στους 30 C για 15 μέρες και ελέγχονταν καθημερινά για πιθανή παραγωγή CO 2. Η θετική δοκιμή υποδηλώνεται από την ανύψωση του agar που προστέθηκε μετά τον εμβολιασμό (Schillinger and Lucke 1987). 4.4.5 Δοκιμή παραγωγής αμμωνίας από αργινίνη. 5ml υποστρώματος Niven εμβολιάζονταν (1%) με δραστική καλλιέργεια του στελέχους και επωάζονταν στους 30 C για 48h. Μετά το τέλος της επώασης προσθέτονταν το αντιδραστήριο Νessler (Merck). Η εμφάνιση καφέ χρωματισμού υποδήλωνε ην παραγωγή αμμωνίας (Schillinger and Lucke 1987). 4.4.6 Υδρόλυση εσκουλίνης. Εμβολιάζονταν καλλιέργειες 24h σε δοκιμαστικούς σωλήνες με υπόστρωμα εσκουλίνης (εμβόλιο 1% w/v) και επωάζονταν στους 30 C για μια εβδομάδα. Οι καλλιέργειες ελεγχόταν καθημερινά για την αλλαγή χρώματος που σήμαινε την υδρόλυση της εσκουλίνης. Σκούρο χρώμα υποδηλώνει θετική δοκιμή. 4.5 Ταυτοποίηση των απομονώσεων με τη μέθοδο SDS PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) των πρωτεϊνών του εσωτερικού εκχυλίσματος του όλου κυττάρου. Η SDS-PAGE πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο του Laemmli (1970), ώστε να ταξινομηθούν οι 54 απομονώσεις των λακτοβακίλλων σε επίπεδο είδους. Αρχή της μεθόδου: όπως όλες οι ηλεκτροφορητικές μέθοδοι, έτσι και η SDS PAGE στηρίζεται στη μετακίνηση των φορτισμένων σωματιδίων ( π.χ πρωτεΐνες) πάνω σε πηκτή υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η SDS PAGE ανήκει στις ηλεκτροφορήσεις ζώνης. Η χρησιμοποίηση στερεού φορέα ελαχιστοποιεί τη διάχυση και επιτρέπει την ελεύθερη μετακίνηση των ιόντων και το διαχωρισμό τους σε ευδιάκριτες ζώνες. Ο φορέας λειτουργεί και ως μοριακό κόσκινο, εξασφαλίζοντας καλύτερο διαχωρισμό. Η κινητικότητα των μορίων 46

εξαρτάται από το μοριακό βάρος του φορτισμένου σωματιδίου ενώ άλλοι παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την κινητικότητα είναι το ph και η συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος, η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, η θερμοκρασία καθώς και η φύση του υλικού μέσα στο οποίο γίνεται η ηλεκτροφόρηση. Τεχνική: 1. Ανακαλλιέργεια των απομονώσεων 2 φορές σε MRS broth και επώαση στους 30 C για 24h. 2. Τελική ανακαλλιέργεια (1% εμβόλιο) σε 20ml MRS broth και επώαση στους 30 C για 24h. 3. Μεταφορά σε σωλήνες φυγοκέντρησης. 4. Φυγοκέντρηση στις 4000rpm x 10min. 5. Απομάκρυνση υπερκείμενου υγρού. 6. Ξέπλυμα κυττάρων με 10ml διαλύματος KH 2 PO 4 (0.01M, ph=7.0) και φυγοκέντρηση ξανά στις 4000rpm x 10min. 7. Απόρριψη του υπερκείμενου υγρού και επανάληψη του σταδίου 6. 8. Τελικό ξέπλυμα κυττάρων με 5ml διαλύματος KH 2 PO 4 (0.01M, ph=7.0) και φυγοκέντρηση ξανά στις 4000rpm x 10min. 9. Προσθήκη 1ml διαλύματος KH 2 PO 4 στην τελική βιομάζα και καλή ανατάραξη σε vortex στην υψηλότερη ταχύτητα. 10. Μεταφορά κυττάρων σε eppendorf των 1.5ml. 11. Φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στις 12000rpm x 10min στους 4 C. 12. Απόρριψη υπερκείμενου από το eppendorf. 13. Προσθήκη, στο ίδιο eppendorf, σωματιδίων διαμέτρου 0,1mm ποσότητας ~0,150g. 14. Μηχανικό σπάσιμο των κυττάρων στην ειδική συσκευή τύπου vortex (Vortex-Genie 2T, Scientific Industries, Inc., NY, USA) σε υψηλή ταχύτητα για 10min. 47

15. Προσθήκη 1ml διαλύματος KH 2 PO 4 και φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στις 12000rpm x 10min στους 4 C. 16. Το υπερκείμενο κυτταρικό εκχύλισμα συλλέγεται προσεκτικά σε καθαρό eppendorf και διατηρείται στην κατάψυξη μέχρι να αναλυθεί. Το πρωτεϊνικό περιεχόμενο των κυτταρικών εκχυλισμάτων προσδιορίστηκε σύμφωνα με τους Lowry et al. (1951), όπως ακολουθεί: 1. 50μl κυτταρικού εκχυλίσματος μεταφέρονται σε σωλήνες με βιδωτό πώμα. 2. Προστίθενται 2ml μείγματος διαλυμάτων Lowry (παράρτημα) 3. Ανάδευση σε χαμηλή ταχύτητα για λίγο χρόνο. 4. Παραμονή σε ηρεμία για 10min. 5. Προσθήκη 0,2 ml Folin Ciocaltau (1:1 με νερό) με ταυτόχρονη ανάδευση. 6. Παραμονή σε σκοτεινό μέρος για 30min σε ηρεμία και θερμοκρασία δωματίου. 7. Το μείγμα μεταφέρεται σε κυβέτα του 1ml και μετράται η απορρόφηση στα 520 nm. Αφού προσδιοριστεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών το κυττάρου του μικροοργανισμού, υπολογίζεται η κατάλληλη ποσότητα εμβολίου και οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται με θέρμανση, μερκαπτοαιθανόλη και δωδεκυλοξυθεϊικό νάτριο (SDS) και ακολουθεί η ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE με διαστάσεις πηκτής 141x160x1.5mm. Η προετοιμασία των δειγμάτων περιλαμβάνει: 1. Ανάμιξη σε eppendorf ανάλογων όγκων κυτταρικού εκχυλίσματος με STB που περιέχει 2% SDS και χρωστική βρωμοφαινόλης. 2. Θέρμανση των δειγμάτων σε υδατόλουτρο στους 95 C για 10min. Η μερκαπτοαιθανόλη σε υψηλές θερμοκρασίες διασπά τους δισουλφιδικούς δεσμούς της πρωτεΐνης, το SDS προσδίδει ανά δύο υπολείμματα αμινοξέων αρνητικό φορτίο. Συνεπώς, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται μόνο με βάση το μέγεθός τους καθώς περνούν από τους πόρους της πηκτής. 48

Αρχικά στήνεται προσεκτικά η συσκευή της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί έλεγχος με προσθήκη απεσταγμένου νερού ανάμεσα στις πλάκες για τυχόν διαρροές. Έπειτα απομακρύνεται το νερό, σκουπίζονται οι πλάκες με διηθητικό χαρτί και στη συνέχεια προετοιμάζεται η πηκτή διαχωρισμού. Για την παρασκευή δυο πηκτών διαχωρισμού (12%Τ, 2,67%C bis ) αναμιγνύονται με τη σειρά, 26,8ml δις απεσταγμένο νερό, 20ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής διαχωρισμού, 32ml διάλυμα μονομερών ακρυλαμιδίου και δις-ακρυλαμιδίου (monomer solution), 0,8ml υδατικό διάλυμα SDS, 280μl υπερθειϊκό αμμώνιο APS, και 40μl TEMED. Το ακρυλαμίδιο πολυμερίζεται παρουσία N,N-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου (bis) με το οποίο σχηματίζει πλέγμα. Ως καταλύτης πολυμερισμού χρησιμοποιείται το υπερθειϊκό αμμώνιο σε συνδυασμό με Ν,Ν, Ν, Ν-τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (TEMED). Τα παραπάνω υλικά αναδεύονται ήπια και προστίθενται αμέσως και μονομιάς 25ml του διαλύματος ανάμεσα στις πλάκες, ώστε να φτάσει το ύψος της πηκτής από τη βάση των πλακών στα 12,6cm. Στη συνέχεια, επιστρώνεται πάνω από το διάλυμα της πηκτής ορισμένη ποσότητα ισοπροπανόλης (2ml), ώστε να επιτευχθεί επίπεδη επιφάνεια και αναερόβιες συνθήκες. Η παρουσία περίσσειας οξυγόνου εμποδίζει τον πολυμερισμό. Το επάνω μέρος των πλακών καλύπτεται με παραφίλμ για την αποφυγή εισόδου του αέρα και εξάτμισης της ισοπροπανόλης και οι πηκτές παραμένουν σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου μια ώρα και 30 λεπτά, ώστε να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός. Μέτα το πέρας του απαιτούμενου χρόνου, απορρίπτεται η ισοπροπανόλη, ξεπλένεται η πηκτή με απεσταγμένο νερό τρεις φορές και επιστρώνεται με 1,6ml αραιωμένου στο ¼ ρυθμιστικού διαλύματος πηκτής διαχωρισμού το οποίο περιέχει 2,5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής διαχωρισμού, 0,1ml SDS και 7,4ml απεσταγμένο νερό. Παραμονή της πηκτής σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 18 ώρες. Στη συνέχεια απομακρύνεται το υπερκείμενο υγρό και ξεπλένεται η πηκτή δύο φορές με απεσταγμένο νερό. Οι πλάκες αναστρέφονται σε διηθητικό χαρτί ώστε να στεγνώσουν. Έπειτα προετοιμάζεται η πηκτή συσσώρευσης. Για την παρασκευή δυο πηκτών συσσώρευσης (πηκτή συσσώρευσης, 5%Τ, 2,67%C bis ) αναμιγνύονται με τη σειρά, 11,3ml δις απεσταγμένο νερό, 5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης, 3,4ml monomer solution, 0,2ml υδατικό διάλυμα SDS, 100μl APS, 25μl TEMED και αναδεύονται ήπια (παράρτημα 4.6). Έπειτα, προστίθεται αμέσως και μονομιάς ανάμεσα στις πλάκες, αφού προηγουμένως έχουν τοποθετηθεί τα χτένια (πάχους 1,5mm 20 θέσεων), τόση ποσότητα ώστε η στάθμη να φτάσει το πάνω όριο των τζαμιών. Παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 30 λεπτά ώστε να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός. Ακολούθως, απομακρύνονται με προσοχή τα χτένια και οι «τσέπες» που σχηματίζονται, γεμίζονται με αραιωμένο στο ¼ ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης, το οποίο 49

περιέχει 2,5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης, 0,1ml SDS και 7,4ml απεσταγμένο νερό. Πριν από τον εμβολιασμό των πηκτών με το πρωτεϊνικό εκχύλισμα, το υγρό απομακρύνεται από τις τσέπες που ξεπλένονται δυο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής και τελικά πληρώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής. Με τη βοήθεια μικροσύριγγας, εμβολιάζεται ο κάθε υποδοχέας (τσέπη) με την κατάλληλη ποσότητα εμβολίου, η οποία κυμαίνεται από 10-20μl και εξαρτάται από τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο εκχύλισμα. Το εμβόλιο περιέχει πρωτεϊνικό εκχύλισμα και ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος σε ίσο όγκο, (STB, 2% SDS, 0,001% μπλε βρωμοφαινόλης) (παράρτημα 4.6). Οι ακριανοί υποδοχείς δεν εμβολιάζονται, παραμένουν κενοί ή πληρώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Ανά 4 υποδοχείς εμβολιάζεται το εκχύλισμα πρότυπου στελέχους (Psychrobacter immobilis LMG 1125). Το Psychrobacter immobilis χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της επαναληψιμότητας των συνθηκών της ηλεκτροφόρησης έχει όμως και ένα δεύτερο σημαντικό λειτουργικό ρόλο, χρησιμοποιείται παράλληλα ως στέλεχος αναφοράς για την απαιτούμενη ευθυγράμμιση των ζωνών των πηκτών κατά την επεξεργασία τους στο λογισμικό πρόγραμμα Gel Compar. Αμέσως μετά τον εμβολιασμό, πληρώνεται η κάτω δεξαμενή με το ρυθμιστικό διάλυμα και η συσκευή με τις στερεωμένες πηκτές βυθίζεται στην δεξαμενή. Γεμίζεται αργά η πάνω δεξαμενή με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και συνδέεται η μονάδα της ηλεκτροφόρησης με την ψύξη και το ρευματοδότη. Η ένταση του ηλεκτρικού ρεύματος είναι σταθερή στα 12mA (6mA/πηκτή) και η τάση ελεύθερη. Η ηλεκτροφόρηση διαρκεί περίπου 18 ώρες (παραμονή όλο το βράδυ) και το μέτωπό της διανύει απόσταση περίπου 9,5cm από την πηκτή διαχωρισμού. Μόλις ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση, ακολουθεί στερέωση των πρωτεϊνών σε διάλυμα TCA 10% για περίπου 2 ώρες. Οι πηκτές ανακινούνται σε μηχανή γραμμικής ανάδευσης. Στη συνέχεια, απομακρύνεται το διάλυμα TCA και προστίθεται το διάλυμα χρώσης (0,25% Coomasie Blue R-250 σε 50% v/v μεθανόλη και 10v/v οξικό οξύ) και οι πηκτές χρωματίζονται για 12 ώρες υπό ανακίνηση σε μηχανή γραμμικής ανάδευσης. Έπειτα, απομακρύνεται η χρωστική και οι πηκτές αποχρωματίζονται σε διάλυμα 25%(v/v) μεθανόλης και 10% (v/v) οξικού οξέως για 3 ώρες. Μετά τον αποχρωματισμό, οι πηκτές φωτογραφίζονται και μπορούν να διατηρηθούν σε διάλυμα οξικού οξέος 10%. Στη συνέχεια, οι πηκτές σαρώνονταν (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) και η επεξεργασία της εικόνας των ηλεκτροφορητογραφημμάτων των πρωτεϊνικών προφίλ, διεξήχθη μέσω του λογισμικού προγράμματος Gel Compar v. 4.6 (Applied Maths, Kortrijk Belgium). Ο συντελεστής συσχέτισης που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο Pearson product moment correlation coefficient (r) και η ομαδοποίηση των στελεχών σε δενδρογράμματα 50

έγινε με βάση τον αριθμητικό αλγόριθμο UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Average linkages). Η ταυτοποίηση των απομονώσεων παραγματοποιείται με σύγκριση του πρωτεϊνικού τους προφίλ με το πρωτεϊνικό προφίλ των στελεχών αναφοράς. Τα πρότυπα στελέχη αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν στα πλαίσια της έρευνας ανήκουν στις παρακάτω διεθνείς συλλογές μικροοργανισμών : ATCC : American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (USA). LMG : Laboratorium voor Microbiologie Gent, Culture Collection (Belgium). NCFB (NCDO) : National Collection of Food Bacteria. AFRC Institute of Food Research, Reading, Berkshire (England). 4.6 Διερεύνηση της γενοτυπικής ετερογένειας των στελεχών. Οι γενοτυπικές μέθοδοι βασίζονται στην ανάλυση των αλληλουχιών του DNA και RNA, ειδικότερα στην ανάλυση μικρών αλληλουχιών οι οποίες είναι μοναδικές για ένα συγκεκριμένο είδος βακτηρίου. Οι μέθοδοι αυτές, επικρατούν, όσον αφορά την επαναλληψιμότητα και την αξιοπιστία από τις φαινοτυπικές μεθόδους λόγω του γεγονότος ότι τα γενετικά χαρακτηριστικά ενός βακτηρίου είναι πιο σταθερά. Παρόλα αυτά δεν υποτιμάται η αξία των αποτελεσμάτων των φαινοτυπικών δοκιμών. Οι γενοτυπικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται περισσότερο για τη διερεύνηση της γενετικής ετερογένειας των στελεχών ενός γένους ή είδους και κατά δεύτερο λόγο, για την ταυτοποίηση τους. 4.6.1 Ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόμενου πεδίου ( Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE). H PFGE είναι μια γενοτυπική μέθοδος που βασίζεται στην ανάλυση όλου του χρωμοσωμικού DNA και θεωρείται ως η πιο αξιόπιστη ανάμεσα στις μοριακές μεθόδους. Η προετοιμασία του άθικτου χρωμοσωμικού DNA μέσα σε μπλοκάκια αγαρόζης έγινε σύμφωνα με τους Jacobsen et al. (1999) με μια μικρή διαφοροποίηση. 51

Τεχνική: 1 η ημέρα: ανακαλλιέργεια των στελεχών σε 5ml MRS broth εμπλουτισμένο με κυστεϊνη και θρεονίνη. 2 η ημέρα: 1. Μεταφορά 1,5ml καλλιέργειας σε eppendorf. 2. Φυγοκέντρηση στις 7000rpm x 7min. 3. Απομάκρυνση υπερκείμενου και πλύσιμο της βιομάζας με 1ml SE buffer. 4. Επαναιώρηση της βιομάζας σε SE buffer. 5. Φυγοκέντρηση 7000rpm x 7min και επανάληψη του σταδίου 4 για 2 φορές. 6. Απομάκρυνση υπερκείμενου και επαναιώρηση των κυττάρων σε 400μl SE buffer. 7. Σε κωνική φιάλη παρασκευάζεται διάλυμα αγαρόζης 2% με SE buffer. 8. Στα eppendorf που βρίσκονται τα κύτταρα προστίθενται 400μl από το διάλυμα της αγαρόζης, αναμιγνύονται με την πιπέτα και τοποθετούνται στην ειδική μήτρα. 9. Ψύξη για περίπου 1 ώρα, μέχρι να στερεοποιηθούν τα μπλοκ. 10. Τοποθέτηση των μπλοκ σε eppendorf που περιέχουν το διάλυμα λύσης των κυττάρων (Lysis buffer). 11. Επώαση στους 37 C για 16h με ταυτόχρονη ανακίνηση (100rpm). 3 η ημέρα: 1. Απομάκρυνση του Lysis buffer 2. Προσθήκη 0,5ml διαλύματος πρωτεόλυσης (proteolysis buffer). 3. Επώαση στους 53 C για 3h με ταυτόχρονη ανακίνηση (100rpm). 4. Απομάκρυνση του διαλύματος πρωτεόλυσης και αντικατάσταση του με 1ml 50mM EDTA (ph=8.5). 52

5. Επώαση στους 50 C για 10min με ταυτόχρονη ανακίνηση (100rpm). Επανάληψη του σταδίου 3 φορές. 6. Τοποθέτηση των μπλοκ στο ψυγείο. 4.6.2 RAPD-PCR Οι απομονώσεις των λακτοβακίλλων αναπτύχθηκαν σε MRS broth. Το DNA απομονώθηκε με τη βοήθεια ειδικού κιτ (Genomic DNA Mini Kit, Invitrogen, USA). Οι αντιδράσεις της RAPD-PCR διεξήχθηκαν με τους εκκινητές M14 (Ζapparroli et al., 1998) και COC (Cocconcelli et al., 1995). Τα προϊόντα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% (w/v) 0,5 TBE buffer (0,45 mg l -1 -Tris-HCl, 0,45 mg l -1 -boric acid, 1 mg l -1 -EDTA, ph 8,3). Τα προφίλ της RAPD-PCR των πηκτών σαρώνονταν (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) υπό UV ακτινοβολία και επεξεργάζονταν με το λογισμικό πρόγραμμα Gel Compar (version 4 0, Applied Maths). Ο υπολογισμός της ομοιότητας των προφίλ των προϊόντων της αντίδρασης RAPD-PCR και η ομαδοποίησή τους στηρίχθηκε στο συντελεστή συσχέτισης Pearson product moment correlation coefficient (r) και στον αριθμητικό αλγόριθμο UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Average linkages). 4.7 Διερεύνηση των τεχνολογικών και προβιοτικών ιδιοτήτων των στελεχών. 4.7.1 Έλεγχος παραγωγής οξέος σε γάλα. Μελετήθηκε η ικανότητα οξινίσεως των 54 απομονώσεων λακτοβακίλλων σε γάλα. Τεχνική : Εμβολιάζονται 50ml αποστειρωμένης αποβουτυρωμένης ανασυσταμένης σκόνης γάλακτος, με αναζωογονημένη καλλιέργεια (δύο φορές ανακαλλιέργεια), με εμβόλιο 1% (v/v). Η τιμή του ph για τις διάφορες χρονικές περιόδους μετρήθηκε από ηλεκτρονικό πεχάμετρο (HANNA Instruments, Padova, Italy) ύστερα από 6, 16 και 24h επώασης στους 30 C. 53

4.7.2 Πρωτεολυτική δραστηριότητα. Η πρωτεολυτική δραστηριότητα των απομονώσεων που αναπτύχθηκαν σε γάλα εκτιμήθηκε μέσω της μεθόδου o-pa (o-phthaldialdehyde) (Church et al. 1983) ύστερα από 6h, 16h, 24h και 7d επώασης στους 30 C. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε ισοδύναμα L-γλυκίνης (mm L-γλυκίνης). Η καζεϊνολυτική τους δραστηριότητα εκτιμήθηκε μετά από ανάπτυξη στο γάλα για 24h και 7d μέσω της μεθόδου UREA-PAGE (Andrews, 1983). Στη συνέχεια, οι πηκτές σαρώνονταν (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) και η επεξεργασία της εικόνας γινόταν με τη βοήθεια του λογισμικού προγράμματος Gel Compar v. 4.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). 4.7.2.1 Εκτίμηση της καζεϊνολυτικής δραστηριότητας των στελεχών με την μέθοδο UREA-PAGE. Τεχνική: 1. Ανακαλλιέργεια των λακτοβακίλλων 2 φορές σε MRS broth και επώαση στους 30 C για 24h. 2. Η τελική τους ανάπτυξη έγινε σε 50 ml αποστειρωμένης αποβουτυρωμένης ανασυσταμένης σκόνης γάλακτος (εμβόλιο 1%) και ακολούθησε επώαση για 24h και 7d στους 30 C 3. Σε 0,5 ml από την τελική καλλιέργεια του δείγματος προσθέτονταν 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος (0,062 M Tris, 6M Ουρία και 0,1Μ 2-μερκαπτοαιθανόλη) 4. Πολύ καλή ανάδευση. 5. 1ml μεταφέρθηκε σε σωλήνα eppendorf και προστέθηκαν 200μl της χρωστικής κυανούν της βρωμοφαινόλης. Τα δείγματα μπορούν να συντηρηθούν στην κατάψυξη μέχρι την ημέρα ανάλυσης. Παράλληλα με τα δείγματα, προετοιμάζονταν και τα δείγματα αναφοράς με τον ίδιο τρόπο (ανεμβολίαστη αποστειρωμένη αποβουτυρωμένη ανασυσταμένη σκόνη γάλακτος). Την ημέρα της ανάλυσης, παρασκευαζόταν η πηκτή συσσώρευσης (Τ = 4%, Cbis = 5%) και η πηκτή διαχωρισμού (T = 9%, Cbis = 5%) και τα δείγματα υποβάλλονταν σε ηλεκτροφόρηση UREA-PAGE σε κάθετη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2001, LKB, Bromma, Sweden) με πλάκες διαστάσεων 140x160x1.5 mm και ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής με την εξής σύνθεση: Tris 0,025 M, Γλυκίνη 0,193 Μ και ph =8,3. Ο διαχωρισμός των προϊόντων 54

πραγματοποιούνταν υπό σταθερή ένταση 60 ma ενώ η τάση αφηνόταν ελεύθερη μέχρι τη μέγιστη τιμή της (500mA), έτσι ώστε το μέτωπο να διανύσει απόσταση περίπου 10 cm από την επιφάνεια επαφής των δύο πηκτών. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, ακολουθούσε η χρώση των πηκτών με χρωστική Coomasie Blue G-250 και ο αποχρωματισμός τους σε απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, οι πηκτές σαρώνονταν (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) και η επεξεργασία της εικόνας γινόταν με τη βοήθεια του λογισμικού προγράμματος Gel Compar v. 4.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). 4.7.2.2 Προσδιορισμός πρωτεόλυσης σε γάλα με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο της ο-φθαλδιαλδεϋδης (ο-ρα). Η ο-φθαλδιαλδεϋδη (ο-ρα) αντιδρά με τη β-μερκαπτοαιθανόλη και τις πρωτοταγείς αμίνες που απελευθερώνονται κατά την υδρόλυση των πρωτεϊνών και σχηματίζουν ένα σύμπλοκο ( 1-αλκυλθείο-2-αλκυλισοϊνδόλη), που φθορίζει και απορροφά έντονα στα 340nm. Τεχνική: 1. Ανακαλλιέργεια των λακτοβακίλλων 2 φορές σε MRS broth και επώαση στους 30 C για 24h. 2. Η τελική τους ανάπτυξη έγινε σε 50 ml αποστειρωμένης αποβουτυρωμένης ανασυσταμένης σκόνης γάλακτος (εμβόλιο 1%) και ακολούθησε επώαση για 6h, 16h, 24h και 7d στους 30 C. 3. Σε δείγμα 5ml από την τελική ανάπτυξη, προσθέτονταν 10ml 18% τριχλωροξικού οξέως (TCA), ώστε η τελική του συγκέντρωση στο δείγμα να είναι 12%. 4. Ισχυρή ανάδευση σε vortex. 5. Ηρεμία για 15 λεπτά και πάλι ισχυρή ανάδευση. 6. 1ml δείγματος μεταφερόταν σε σωλήνες τύπου eppendorf και ακολουθούσε φυγοκέντρηση στις 12000rpm x 5min στους 10 ο C. 7. Tο υπερκείμενο υγρό μεταφερόταν σε άλλο καθαρό σωλήνα. Σ αυτό το σημείο, η μέθοδος μπορεί να διακοπεί και τα δείγματα να διατηρηθούν στην κατάψυξη (-18 ο C) μέχρι την ημέρα της ανάλυσης. 55

8. Σε 150μl του υπερκείμενου υγρού προσθέτονταν 3ml πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος ο-ρα και ακολουθούσε ανάδευση. 9. 2 λεπτά παραμονής σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 10. Προσδιορισμός οπτικής πυκνότητάς (OD 340 ) του στα 340nm σε φασματοφωτόμετρο (Shimadzu UV-120-02, Shimadzu Biotech Corporation, Newcastle, UK). Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ανεμβολίαστη αποστειρωμένη αποβουτυρωμένη ανασυσταμένη σκόνη γάλακτος επεξεργασμένη υπό τις ίδιες συνθήκες. Η συγκέντρωση αμινοξέων εκφραζόταν ως ppm L-γλυκίνης σύμφωνα με πρότυπη καμπύλη που κατασκευάστηκε με γνωστές συγκεντρώσεις γλυκίνης. Πραγματοποιήθηκαν 3 επαναλήψεις για κάθε δείγμα. 4.7.3 Πεπτιδολυτική δραστηριότητα άθικτων κυττάρων Για την εκτίμηση της πεπτιδολυτικής δραστηριότητας των στελεχών χρησιμοποιούνταν τα εξής συνθετικά υποστρώματα: L- λευκίνη p-νιτροανιλίδη (Leu-pNA), L-λυσίνη p- νιτροανιλίδη (Lys-pNA) και προλίνη p-νιτροανιλίδη (Pro-pNA). Ακολουθήθηκε η μέθοδος των Requena et al. (1991) όπως τροποποιήθηκε από τους Arizcum et al.(1997). Όλα τα στελέχη δραστηριόπουνταν 2 φορές σε ΜRS broth και μια φορά σε πλάγιο ΜRS agar, στους 30 C για 16 h. Κύτταρα από την τελική καλλιέργεια μεταφέρονταν σε 3ml διαλύματος 50 mm φωσφορικού νατρίου (ph 7,0) με σκοπό τη δημιουργία εναιωρήματος κυττάρων που αντιστοιχεί στο 4 της κλίμακας Mc Farland. Σε 0,4 ml από το εναιώρημα κυττάρων του κάθε δείγματος, αφού πρώτα τα δείγματα είχαν πλυθεί δύο φορές με ρυθμιστικό φωσφορικό διάλυμα, προσθέτονταν 0,2 ml από το διάλυμα του συνθετικού υποστρώματος και 3,6 ml διαλύματος 50 mm φωσφορικού νατρίου (ph 7,0). Το μίγμα αντίδρασης επωαζόταν για μία ώρα στους 30 C με ανάδευση και η αντίδραση διακοπτόταν με την προσθήκη 1ml 30% (v/v) οξικού οξέος. Ακολουθούσε διήθηση του διαλύματος της αντίδρασης με διηθητικό χαρτί Whatman (Whatman International Limited, Maidstone, Kent, UK). Η ποσότητα της p-νιτροανιλίδης που απελευθερωνόταν, προσδιοριζόταν με τη βοήθεια φασματοφωτόμετρου στα 410nm και το αποτέλεσμα εκφραζόταν σε αυθαίρετες μονάδες αμινοπεπτιδασικής δραστηριότητας ανά λεπτό. Ως μία μονάδα καθοριζόταν η αύξηση της απορρόφησης κατά 0,001 σε 1 λεπτό. 56

4.7.4 Ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης αμινοξέων Η ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης αμινοξέων των λακτοβακίλλων ελέγχθηκε σε στερεό υπόστρωμα αποκαρβοξυλίωσης με 2% του αντίστοιχου αμινοξέως σύμφωνα με τη μέθοδο των Joosten και Northolt (1989). Τα στελέχη αναζωογονήθηκαν δύο φορές σε MRS broth που περιείχε 1gL -1 του αμινοξέως (τυροσίνη, ιστιδίνη, λυσίνη, ορνιθίνη). Τα στελέχη στη συνέχεια, εμβολιάστηκαν σε στερεό υπόστρωμα αποκαρβοξυλίωσης με κρίκο και επωάστηκαν στους 37 C για 72h και για 7d (αναερόβια επώαση). Για τα αμινοξέα ιστιδίνη, λυσίνη και ορνιθίνη ελέγχθηκε η δημιουργία έντονου μώβ χρώματος γύρω από τις αποικίες (θετική δοκιμή) ενώ για την τυροσίνη ο σχηματισμός διαυγούς ζώνης (θετική δοκιμή). 4.7.5 Αφομοίωση των κιτρικών. Τα στελέχη αφού πρώτα ενεργοποιήθηκαν σε MRS broth (30 C/24h), στη συνέχεια εμβολιάστηκαν (με κρίκο) σε δοκιμαστικούς σωλήνες με πλάγιο υπόστρωμα Simmons Citrate Agar (Oxoid Ltd, Basingstoke, USA) για να ελεγχθεί η αφομοίωση των κιτρικών. Η μεταβολή του χρώματος από πράσινο σε μπλέ, υποδήλωνε θετική δοκιμή. 4.7.6 Έλεγχος ανάπτυξης σε χαμηλό ph. Για τον έλεγχο αντοχής των στελεχών σε χαμηλό pη χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Schillinger και Lucke (1987). Δραστηριοποιημένες καλλιέργειες εμβολιάζονταν (εμβόλιο 2%) σε MRS broth με ph 1,5 και 3. Η ρύθμιση του ph του υποστρώματος γινόταν μετά την αποστείρωση του, με 1Ν HCl. Οι απομονώσεις επωάζονταν στους 30 C για 48h. Ανάπτυξη στο δοκιμαστικό σωλήνα υποδήλωνε θετική δοκιμή και συνεπώς αντοχή του στελέχους σε χαμηλό ph. 57

4.7.7 Έλεγχος ανάπτυξης παρουσία χολικών αλάτων. Για τον έλεγχο αντοχής σε περιβάλλον παρουσία χολικών αλάτων των στελεχών χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Johnson et al. (1987). Δραστηριοποιημένες καλλιέργειες εμβολιάζονταν (εμβόλιο 1%) σε MRS broth παρουσία oxgall (Ox-bile, Oxoid) σε συγκεντρώσεις 0,3, 1 και 2%. Οι απομονώσεις επωάζονταν στους 30 C για 48h. Ανάπτυξη στο δοκιμαστικό σωλήνα υποδήλωνε θετική δοκιμή και συνεπώς αντοχή του στελέχους σε χολικά άλατα. 4.7.8 Αντιβακτηριακή δράση. Η αντιβακτηριακή δράση των στελεχών μελετήθηκε με τη μέθοδο των Kekessy και Piquet (1970). Τεχνική: 1. Τα στελέχη αναζωογονήθηκαν δύο φορές σε ΜRS broth στους 30 o C για 24h. 2. Εμβολιάζονταν σε ΜRS agar με κρίκο (4 στελέχη σε κάθε τρυβλίο), επώαση των εξεταζόμενων στελεχών στους 30 o C για 48h. 3. Τα στελέχη δείκτες επωάστηκαν στο κατάλληλο θρεπτικό broth για 24h. 4. Με τη βοήθεια μιας αποστειρωμένης σπάτουλας αναστρεφόταν το agar μέσα στο τρυβλίο. 5. Στη νέα αποστειρωμένη επιφάνεια του agar επιστρωνόταν το στέλεχος δείκτης (1% εμβόλιο σε 5ml μαλακό agar). Έπειτα από επώαση, τα τρυβλία ελέγχθηκαν για την ύπαρξη ζωνών αναχαίτισης της ανάπτυξης του στελέχους δείκτη. Η εκτίμηση της αντιβακτηριακής δράσης προσδιοριζόταν με μέτρηση της διαμέτρου της ζώνης αναχαίτισης. Τα στελέχη δείκτες τα οποία εξετάστηκαν ήταν τα εξής: 58

Β.cereus, S.aureus, L.inocua, L. monocytogenes, E.coli O157:H7, Cl. sporogenes, Cl. tyrobutyricum, Salmonella Typhimurium, Y. Enterocolitica, L. helveticus, E. faecalis L. lactis subsp lactis, S. thermophilus. 4.7.9 Έλεγχος τύπου αιμόλυσης. Με τον όρο αιμόλυση εννοούμε την λύση των ερυθροκυττάρων του αίματος από την πρωτεΐνη αιμολυσίνη. Κατά την αιμόλυση απελευθερώνεται η αιμοσφαιρίνη από τα ερυθροκύτταρα. Τεχνική: Δραστηριοποιημένη καλλιέργεια εμβολιάζονταν με βακτηριολογικό κρίκο σε τρυβλία με Blood Agar Base, εμπλουτισμένο με ανθρώπινο αίμα (10%). Ακολουθούσε επώαση σε 30 o C για 48h. Παρατηρούνταν η ανάπτυξη στα τρυβλία και διακρίνονταν οι εξής τύποι αιμόλυσης (Brown 1919). α-αιμόλυση : όταν η ανάπτυξη παρουσιάζει πρασινωπή απόχρωση που οφείλεται στην οξείδωση της αιμοσφαιρίνης από το H 2 O 2 που παράγει το στέλεχος. β-αιμόλυση : όταν εμφανίζεται καθαρή ζώνη αιμόλυσης γύρω από την ανάπτυξη. Έχουμε πλήρη λύση των ερυθροκυττάρων. γ-αιμόλυση : πρόκειται για αρνητική δοκιμή, όταν δεν παρατηρείται δηλαδή καμία δράση. 59

5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1 Μικροβιολογικά και χημικά χαρακτηριστικά των τυριών. 5.1.1 Μικροχλωρίδα ώριμων τυριών. Τα δείγματα των τυριών δέχθηκαν τις κατάλληλες αραιώσεις και εμβολιάστηκαν σε εκλεκτικά υποστρώματα, όπου έγινε καταμέτρηση των αποικιών με σκοπό να καταγραφεί η ποικιλομορφία της υπάρχουσας μικροχλωρίδας, να μετρηθεί ο πληθυσμός της κάθε ομάδας μικροοργανισμών και να απομονωθούν τα προς μελέτη γαλακτικά βακτήρια. Στον Πίνακα 5.1.1 φαίνεται ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση του πληθυσμού, των τριών δειγμάτων από το κάθε τυροκομείο, για κάθε υπόστρωμα. Πίνακας 5.1.1 Μικροχλωρίδα (log 10 cfu/g, x ± sd) δειγμάτων (από τρεις παρασκευές τυριού, από κάθε τυροκομείο). Μικροοργανισμοί Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα Τυροκομείο Ι (πληθυσμός log 10 cfu/g, x ± sd) Τυροκομείο ΙΙ (πληθυσμός log 10 cfu/g, x ± sd) 6.3±0.6 A 8.1±0.4 A Εντεροβακτηριοειδή 1±0 A 2.9±1 A Κολοβακτηριοειδή 1±0 A 2.7±1.6 A Γαλακτικά βακτήρια (συνολικός αριθμός LAB) 6.1±0.5 A 7.8±0.5 A Λακτόκοκκοι 5.7±0.3 A 7.8±0.7 B Λακτοβάκιλλοι 6.1±0.6 A 7.5±0.7 A Ζύμες Μύκητες 1.4±0.3 A 4.9±3.5 A Αρνητικοί κατά Gram μικροοργανισμοί 6±0,3 A 2.1 ±0.4 B Σταφυλόκοκκοι 4.5±0.4 A 2.2±2.0 A Εντερόκοκκοι 4.6±0.5 A 6.0±2.2 A Οι τιμές στην ίδια σειρά που ακολουθούν ται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά (Ρ<0,05). t- test. Όσον αφορά τον πληθυσμ ό της ολικής μεσόφιλ ης χλωρίδας ανερχόταν σε 6.3±0.6 log 10 cfu/g για τα τυριά του τυροκομείου Ι, ενώ αυτά του τυροκομείου ΙΙ παρουσίασαν υψηλότερους πληθυσμούς, της τάξης του 8.1±0.4. Παρόμοια είναι η εικόνα και για τους πληθυσμούς τόσο των λακτοκόκκων όσο και των λακτοβακίλλων, όπου, 60

παρατηρούνται αυξημένοι πληθυσμοί στα τυριά του δεύτερου τυροκομείου (7.8±0.7 log 10 cfu/g για τους λακτοκόκκους στα τυριά του τυροκομείου ΙΙ έναντι 5.7±0.3 log 10 cfu/g στα τυριά του τυροκομείου Ι, 7.5±0.7 log 10 cfu/g για τους λακτοβακίλλους στα τυριά του τυροκομείου ΙΙ και 6.1±0.6 log 10 cfu/g στα τυριά του τυροκομείου Ι). Σε όλα τα δείγματα οι πληθυσμοί των κολοβακτηριοειδών και των εντεροβακτηριοειδών κυμάνθηκαν σε χαμηλά επίπεδα και δεν ξεπερνούσαν τους τρεις λογαρίθμους, ενώ στα τυριά του τυροκομείου Ι βρέθηκαν σαφώς υψηλότεροι πληθυσμοί αρνητικών κατά Gram μικροοργανισμών και σταφυλόκοκκων σε σύγκριση με τα τυριά του τυροκομείου ΙΙ. Από την στατιστική επεξεργασία φάνηκε ότι στα δύο τυροκομεία παρήχθησαν τυριά που δεν διέφεραν στατιστικώς σημαντικά όσον αφορά τη μικροχλωρίδα τους. Στατιστικώς σημαντικές διαφορές ανηχνέυθηκαν στον πληθυσμό των λακτοκόκκων και των αρνητικών κατά Gram μικροοργανισμών. 61

5.1.2 Χημικά χαρακτηριστικά ώριμων τυριών. Τα βιοχημικά χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν στα δείγματα των τυριών είναι: το ph, η υγρασία % και ο συντελεστής άλατος %. Επίσης εκτιμήθηκε το μέγεθος της πρωτεόλυσης και η % μείωση των καζεϊνών.τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 5.1.2.1 Πίνακας 5.1.2.1 Χημικές αναλύσεις (x ± sd) στις δυο ομάδες δειγμάτων ώριμης Γραβιέρας Κρήτης. Τυροκομείο ph % Υγρασία % Σ/Α α Πρωτεόλυση ο-ρα b % Μείωση καζεϊνών c as-cn β-cn Ι 5.1±0.1 A 34.1±2.5 A 8.4±1.6 A 20.57±1.2 A 50±2.88 A 47.4±8.1 A ΙΙ 5.07±0.07 A 33.6±1.96 A 7.1±0.14 A 120.11±25.33 B 65.36±2.88 B 14.39±2.77 B % Σ/Α α (συντελεστής άλατος): NaCl %/ (NaCl + Υγρασία) % *100 Πρωτεόλυση ο-ρα b : με τη μέθοδο της o-φθαλδιαλδεϋδης (o-pa) και εκφρασμένη σε mmol Gly L -1. % Μείωση καζεϊνών c : με την ηλεκτροφορητική μέθοδο της urea-page. Η μείωση υπολογίστηκε με βάση τις καζεΐνες των φρέσκων τυριών και με τη βοήθεια του λογισμικού προγράμματος Gel Compar version 4.0 (Applied Maths, Belgium). Οι τιμές στην ίδια στήλη που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά (Ρ<0,05). t- test. Σύμφωνα με την στατιστική σύγκριση των μέσων όρων των παραπάνω χαρακτηριστικών, τα τυριά που παρήχθησαν στα δυο τυροκομεία διέφεραν, στατιστικώς σημαντικά, μόνο σε ότι αφορά τον βαθμό πρωτεόλυσης. 62

5.2 Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο είδους με την SDS- PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου. Το πρωτεϊνικό προφίλ του όλου κυττάρου των 54 απομονώσεων που προέκυψαν από την SDS-PAGE συγκρίθηκαν με το πρωτεϊνικό προφίλ των πρότυπων στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση των απομονώσεων με τη βοήθεια του λογισμικού Gel Compar (Εικ. 5.2.1). Χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson (r) και η ομαδοποίηση έγινε βάσει της μεθόδου UPGMA. Η επαναληψιμότητα ήταν >85%. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της SDS-PAGE, οι απομονώσεις ομαδοποιήθηκαν στο μεγαλύτερο ποσοστό τους με δύο πρότυπα στελέχη. Πιο συγκεκριμένα το 51.85% των απομονώσεων (28 από τα 54 στελέχη) ομαδοποιήθηκε με τον Lb. brevis (DSM 2647) με r = 75.5% και το 33,3% των απομονώσεων (18 από τα 54 στελέχη) ομαδοποιήθηκε με τον Lb. paracasei subsp. paracasei (LMG 11459) με r = 75.8%. (Πίνακας 5.2.1) Διακρίθηκαν επίσης και άλλες μικρότερες ομάδες με σαφή όμως ταξινόμηση των στελεχών. Έτσι τα στελέχη D716, F786 και D711 ομαδοποιούνται με τον Lb. curvatus (LMG 9198) με r = 71,5% ενώ με τον Lb. casei (ATCC 344) ομαδοποιούνται τα στελέχη E802, F813 και F812 με r = 75.5%. Τέλος, 2 στελέχη (D713, D715) δεν ομαδοποιήθηκαν με κάποιο από τα πρότυπα στελέχη και θεωρούνται ως αταξινόμητα. Τα αποτελέσματα της SDS-PAGE καταστούν σαφή τη διάκριση των απομονώσεων με βάση το τυροκομείο προέλευσης. Στο τυροκομείο Ι απαντώνται σχεδόν αποκλειστικά Lb. brevis (92.5%). Στο τυροκομείο ΙΙ απαντάται μεγαλύτερη ετερογένεια ως προς το είδος των απομονώσεων της δευτερεύουσας μικροχλωρίδας. Οι απομονώσεις ταυτοποιήθηκαν κυρίως ως Lb. paracasei subsp. paracasei (59,2%), Lb. casei (11,1%), Lb. curvatus (11,1%). 63

48.7 Pearson correlation [0.0%-100.0%] SDS 52.2 55.9 57.7 60.6 62.3 64.1 65.4 64.8 69.7 71.1 71.5 75.5 75.8 75.5 79.4 80.9 81 82.5 82.2 83.9 84 83.8 84.1 85.9 85.2 87.1 86.6 86.1 85.7 Εικόνα 5.2.1 Δενδρόγραμμα των πρωτεϊνικών αποτυπωμάτων των NSLAB από ώριμη Γραβιέρα Κρήτης, μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου των απομονώσεων. Πίνακας 5.2.1 Ταυτοποίηση των απομονώσεων NSLAB από ώριμη Γραβιέρα Κρήτης βάσει της SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου. 90.1 89.5 88.9 88.7 90.8 90.6 92.3 91.8 91.1 93.2 92.5 92.1 91.5 93.1 92.8 92.4 92.4 93.2 92.6 92.6 94.6 94.8 94.4 94.3 95.1 96.5 97 97 96.7 97.4 98.7 98 98.7 98.2 98.2 98.3 99.1 99.2 SDS. A7. B3. A6. A5. A8. C1. A10. B1. B2. E 760. B5. A4. A9. C2. C6. C7. C4. B10. B4. A3. A1. A2. F 787. Lb. brevis DSM 2647. B7. B8. F 785. B6. C5. D 713. D 715. Lb. fermentum DSM 20052. Lb. reuteri DSM 20016. Lb. buchneri DSM 5987. Lb. collinoides DSM 20515. Lb. coryniformis subsp torquens LMG 9197. F 781. F 784. E 766. E 767. D 718. E 763. E 801. D 729. F 810. E 803. F 783. C3. B9. E 759. D 731. E 764. Lb. paracasei subsp. paracasei LMG 11459. E 768. F 811. Lb. rhamnosus LMG 6400. D 716. F 786. D 711. Lb. curvatus LMG 9198. E 802. F 813. F 812. Lb. casei ATCC 344. Lb. plantarum ATCC 20246. Lb. pentosus NCFB 363. Lb. paraplantarum LMG 16673. Lb. paracasei tolerans NCFB 2742. Lb. bifermentans LMG 9845 64

Απομονώσεις Τυροκομείο Ι Ταυτοποίηση απομονώσεων βάσει της SDS-PAGE Απομονώσεις Τυροκομείο ΙΙ Ταυτοποίηση απομονώσεων βάσει της SDS-PAGE Α1 Lb. brevis D711 Lb. curvatus Α2 Lb. brevis D713 Δεν ταυτοποιήθηκε Α3 Lb. brevis D715 Δεν ταυτοποιήθηκε Α4 Lb. brevis D716 Lb. curvatus Α5 Lb. brevis D718 Lb paracasei subsp. paracasei Α6 Lb. brevis D729 Lb paracasei subsp. paracasei Α7 Lb. brevis D731 Lb paracasei subsp. paracasei Α8 Lb. brevis E759 Lb paracasei subsp. paracasei Α9 Lb. brevis E763 Lb paracasei subsp. paracasei Α10 Lb. brevis E764 Lb paracasei subsp. paracasei Β1 Lb. brevis E766 Lb paracasei subsp. paracasei Β2 Lb. brevis E767 Lb paracasei subsp. paracasei Β3 Lb. brevis E768 Lb paracasei subsp. paracasei Β4 Lb. brevis E760 Lb. brevis Β5 Lb. brevis E801 Lb paracasei subsp. paracasei Β6 Lb. brevis E802 Lb. casei Β7 Lb. brevis E803 Lb paracasei subsp. paracasei Β8 Lb. brevis F781 Lb paracasei subsp. paracasei Β9 Lb paracasei subsp. paracasei F783 Lb paracasei subsp. paracasei Β10 Lb. brevis F784 Lb paracasei subsp. paracasei C1 Lb. brevis F785 Lb. brevis C2 Lb. brevis F786 Lb. curvatus C3 Lb paracasei subsp. paracasei F787 Lb. brevis C4 Lb. brevis F810 Lb paracasei subsp. paracasei C5 Lb. brevis F811 Lb paracasei subsp. paracasei C6 Lb. brevis F812 Lb. casei C7 Lb. brevis F813 Lb. casei 65

5.3 Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους 5.3.1 Ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόμενου πεδίου (PFGE) Τα πρότυπα των ζωνών των στελεχών με το ένζυμο περιορισμού SmaI παρουσιάζονται στην Εικόνα 5.3.1. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου ήταν 91.3% συνεπώς, ομάδες απομονώσεων με ποσοστά ομοιότητας μεγαλύτερα θεωρούνται απομονώσεις του ίδιου στελέχους. Παρατηρώντας το δενδρόγραμμα γίνεται εμφανές ότι οι απομονώσεις ομαδοποιούνται σε 12 ομάδες με ποσοστό ομολογίας μεγαλύτερο του 80%. Εμφανίζεται λοιπόν μικρή γενοτυπική ετερογένεια. Οι 28 απομονώσεις που ταυτοποιήθηκαν ως Lb. brevis σχημάτισαν VI ομάδες που περιλαμβάνουν από δύο έως εννιά στελέχη, με ομοιότητες από 85.2% έως 94.8%. Στην ίδια κατηγορία βρίσκονται και 4 μονοστελεχιακές ομάδες (C4, B7, B2, B10). Οι 18 απομονώσεις του Lb. paracasei subsp. paracasei ομαδοποιήθηκαν σε 5 υποομάδες ( VII - XI) με υψηλό βαθμό ομοιότητας μεταξύ τους, που άγγιζε το 100%. Πιο συγκεκριμένα οι ομάδες των στελεχών ήταν οι εξής: I. E760, C1, F785, A2 (85.2%) II. A6, C7 (88%) III. C2, C6, A4, A1, B5 (93.3%) IV. A5, B6, C5 (94.8%) V. B1, Lb. brevis DSM 2647 (88.3%) VI. A9, B3, A8, A10, A3, B8, A7, F787, B4 (92.7%) VII. E764, D729, F810, B9 (86.7%) VIII. E767, F784, E763, D718, E803, D731 (96.8%) IX. C3, E759, F783, F811, Lb. paracasei subsp. paracasei (97.9%) X. E766, E768 (93.3%) XI. E801, F781 (92.9%) XII. C4 XIII. B7 Mονοστελεχιακές ομάδες XIV. B2 XV. B10 66

Pearson correlation [0.0%-100.0%] PFGE 79.7 85.2 87.7 97.7 PFGE. E 760. C1. F 785. A2 88. A6. C7 95.9 94.7 96.2 93.3. C2. C6. A4. A1 78 89.8. B5 89.2. C4 87 94.8 97.3. B7. A5. B6. C5 83.2 88.3. B1. Lb. brevis DSM 2647 87 97.8 97 98.4 95.9 97.5 94.5. A9. B3. A8. A10. A3. B8 75.2 90.7 89.8 92.7 97.4. A7. F 787. B4. B2. B10 89.9 98.6. E 764. D 729 86.7. F 810. B9 98.9 98.6. E 767. F 784 69.5 85.6 98.3 96.8 100. E 763. D 718. E 803. D 731 83.8 88.7 99.3 98.4. C3. E 759 97.9 98.5. F 783. F 811. Lb. paracasei subsp. paracasei LMG 11459 93.3. E 766. E 768 92.9. E 801. F 781 Εικόνα 5.3.1 Δενδρόγραμμα προτύπων ζωνών των στελεχών με το ένζυμο περιορισμού SmaI, μετά από ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου (PFGE). 5.3.2 RAPD-PCR 67

5.3.2 RAPD-PCR Τα αποτελέσματα της RAPD-PCR παρουσιάζονται στην Εικόνα 5.3.2, στην οποία εμφανίζονται τα προϊόντα αντιγραφής του DNA από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Το δενδρόγραμμα βασίζεται στην ανάλυση των χαρακτηριστικών που προέκυψαν από την αντιγραφή της αλληλουχίας του DNA με τους πριμοδότες Μ14 και COC. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου ήταν 90.6%, και όπως ήδη αναφέρθηκε στην PFGE, ομάδες λακτοβακίλλων με ποσοστά ομοιότητας μεγαλύτερα θεωρούνται απομονώσεις του ίδιου στελέχους. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της RAPD-PCR, τα στελέχη ομαδοποιήθηκαν με τα πρότυπα των Lb. paracasei subsp. paracasei και Lb. brevis, σχηματίζοντας δύο μεγάλες ομάδες Α και Β, με ποσοστό ομοιότητας μεταξύ τους 75.5% Πιο συγκεκριμένα, τα στελέχη που ταυτοποιούνται ως Lb. paracasei subsp. paracasei σχηματίζουν 5 επιμέρους υποομάδες. Οι υποομάδες είναι οι εξής : Α 1. E764, D729, F810, B9 (89.9%) Α 2. E767, F784, E763, D718, E803, D731 (92.6%) Α 3. F783, F811, Lb. paracasei subsp. paracasei LMG11459 (92.5%) Α 4. C3, E759, E766 (94.1%) Α 5. E768, E801, F781 (90.5%) Τα στελέχη που ταυτοποιήθηκαν ως Lb. brevis, σχηματίζουν 6 ομάδες. Οι ομάδες του Lb. brevis είναι οι εξής: Β 1. F785, A2, A6, C7 (91.6%) Β 2. B3, A9, A8, A10, A3, B8 (92%) Β 3. A7, F787 (91.5%) Β 4. B1, Lb. brevis DSM2647 (88%) Β 5. C2, C6, A4, A1 (89.3%) Β 6. C1, E760, B2, B4, A5, B6, C5, B5, C4, B7 (91.5%) Τα αποτελέσματα της RAPD-PCR φανερώνουν μικρή γενοτυπική ετερογένεια μεταξύ των στελεχών. Από τα 18 στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei διακρίνονται 7 διαφορετικοί γενότυποι, ενώ από τα 28 στελέχη Lb. brevis διακρίνονται 8 γενότυποι. 68

Πρέπει να επισημάνουμε πως οι ομάδες δεν φαίνεται να διαφοροποιούνται σύμφωνα με το τυροκομείο παρασκευής. Υπάρχουν δηλαδή στελέχη που απομονώθηκαν και από τα δύο τυροκομεία σχεδόν σε όλες τις ομάδες. Αυτό φανερώνει τη μεγάλη διασπορά των στελεχών σε διαφορετικά περιβάλλοντα (Bouton et al., 2002). Η συνολική ομοιότητα μεταξύ των στελεχών του ίδιου είδους ήταν 78.8% για τα paracasei subsp. paracasei και 81.3% για τα Lb. brevis. Lb. 69

80 85 90 95 100 Pearson correlation [0.0%-100.0%] coc 2 PCR M14 coc 2 93.7 90.8.. E764 D729 89.9.. F810 B9 Α 1 88.8 93.3.. E803 D731 84.7 92.6 98 96.3 95.9... E763 D718 F784 Α 2. E767 84.1 92.8 92.5... Lb. paracasei subsp. paracasei LMG 11459 F811 F783 Α 3 78.8 94.1 99.6... C3 E759 E766 Α 4 90.5 97.6.. E801 E768 Α 5. F781 95 98.2.. F785 A2 91.6.. A6 C7 Β 1 75.5 87.5 98.5 97.3.. B3 A9 94.4. A8 82.6 85.7 92 91.5 98.2..... A10 A3 B8 A7 F787 Β2 Β 3. B10 81.3 88.. B1 Lb. brevis DSM 2647 Β 4 93.9 92.5.. C2 C6 83.4 89.3.. A4 A1 Β 5 88 94.9 93.1 95.7 91.5 96.4 95.4...... C1 E760 B2 B4 A5 B6 Β 6 94.6. C5 94.1 95.2... B5 C4 B7 Εικ. 5.3.2 Δενδρόγραμμα των προϊόντων της RAPD-PCR, χρησιμοποιώντας δύο πριμοδότες (M14 και COC), μετά από ηλεκτροφόρηση αγαρόζης των απομονώσεων λακτοβακίλλων από παραδοσιακή Γραβιέρα Κρήτης. Χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson (r) και η ομαδοποίηση έγινε βάσει της μεθόδου UPGMA. 70

5.4 Ικανότητα οξινίσεως Η μείωση του ph (ΔpH) του γάλακτος μετά από 6, 16 και 24 ώρες ανάπτυξης των στελεχών παρουσιάζεται στον Πίνακα 5.4.1 (μέσος όρος 3 επαναλήψεων ± τυπική απόκλιση). Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων ανέδειξε τις διαφορές μεταξύ των στελεχών. Η στατιστική ανάλυση (one way ANOVA) πραγματοποιήθηκε για όλες τις ώρες επώασης και οι στατιστικά σημαντικές διαφορές εντοπίστηκαν σε επίπεδο σημαντικότητας α = 0,05. Από τα αποτελέσματα γίνεται φανερό πως τα στελέχη δεν μειώνουν το ph του γάλακτος σημαντικά. Η μεγαλύτερη μείωση του pη είναι στις 24 ώρες επώασης και φτάνει τις 0,52 μονάδες. Το στέλεχος με τη μικρότερη ικανότητα οξινίσεως είναι το Β10, το οποίο μειώνει το ph μόλις 0,07 μονάδες σε 24 ώρες. Ενώ εκείνο που προκάλεσε τη μεγαλύτερη μείωση στο ph στον ίδιο χρόνο επώασης είναι το 811 (0,52 μονάδες). Τα στελέχη διακρίνονται σε δύο ομάδες σύμφωνα με την ικανότητα οξινίσεως τους μετά από 24 ώρες επώασης: Στην ομάδα (Α ομάδα) της χαμηλής ικανότητας οξινίσεως (0,07±0,01 0,17±0,05) εντάσσεται το 81,4 % των στελεχών του τυροκομείου Ι ενώ στην ομάδα (Β ομάδα) της μέσης οξινίσεως (0,2±0,04 0,52±0,03) ανήκουν όλα, εκτός από ένα των στελεχών που απομονώθηκαν από τυριά του τυροκομείου ΙΙ (77,7% του συνόλου των στελεχών) (Πίνακας 5.4.2). 71

Πίνακας 5.4.1 Αποτελέσματα ικανότητας οξίνισης στελεχών. Μέσος όρος τριών επαναλήψεων ± τυπική απόκλιση. ΔpH ΣΤΕΛΕΧΟΣ 6h 16h 24h A1 0,13 ± 0,02 b-d 0,16 ± 0,06 b-l 0,16 ± 0,06 a-e A2 0,04 ± 0,04 ab 0,13 ± 0,03 a-i 0,13 ± 0,04 a-e A3 0,05 ± 0,03 a-c 0,13 ± 0,02 a-i 0,15 ± 0,04 a-e A4 0,01 ± 0,01 a 0,12 ± 0,06 a-h 0,10 ± 0,03 a-c A5 0 ± 0 a 0,14 ± 0,06 a-l 0,14 ± 0,01 a-e A6 0,14 ± 0,03 cd 0,19 ± 0,09 d-l 0,21 ± 0,07 c-f A7 0 ± 0 a 0,11 ± 0,06 a-h 0,13 ± 0,01 a-e A8 0,03 ± 0,03 ab 0,12 ± 0,04 a-i 0,12 ± 0,01 a-e A9 0 ± 0 a 0,12 ± 0,07 a-h 0,13 ± 0,02 a-e A10 0,07 ± 0,09 a-c 0,14 ± 0,05 a-l 0,12 ± 0,03 a-e B1 0,01 ± 0,01 a 0,13 ± 0,08 a-k 0,11 ± 0,03 a-d B2 0,18 ± 0,2 d 0,14 ± 0,06 a-l 0,13 ± 0,02 a-e B3 0 ± 0 a 0,09 ± 0,04 a-b 0,21 ± 0,30 g-l B4 0,04 ± 0,04 ab 0,13 ± 0,06 a-j 0,12 ± 0,02 a-e B5 0,08 ± 0,05 a-c 0,15 ± 0,07 a-l 0,15 ± 0,06 a-e B6 0,06 ± 0,04 a-c 0,07 ± 0,02 a-c 0,13 ± 0,01 a-e B7 0,10 ± 0,05 a-d 0,07 ± 0 a-d 0,15 ± 0,01 a-e B8 0,07 ± 0,02 a-c 0,12 ± 0,01 a-h 0,33 ± 0,01 h-l B9 0,05 ± 0,03 a-c 0,15 ± 0,01 a-l 0,28 ± 0,01 f-j B10 0,03 ± 0,01 ab 0,04 ± 0 a 0,07 ± 0,01 a C1 0,06 ± 0,03 a-c 0,07 ± 0 a-c 0,28 ± 0,23 f-j C2 0,05 ± 0,03 a-c 0,05 ± 0,01 ab 0,09 ± 0,01 a C3 0,07 ± 0,02 a-c 0,12 ± 0,01 a-i 0,30 ± 0,02 f-k C4 0,07 ± 0,03 a-c 0,07 ± 0,03 a-d 0,10 ± 0,01 a-c C5 0,01 ± 0 a 0,10 ± 0 a-g 0,14 ± 0,04 a-e C6 0,08 ± 0,02 a-c 0,08 ± 0,02 a-e 0,14 ± 0,06 a-e C7 0,01 ± 0 a 0,10 ± 0 a-g 0,14 ± 0,01 a-e 72

Πίνακας 5.4.1 (συνέχεια). ΔpH ΣΤΕΛΕΧΟΣ 6h 16h 24h D711 0,05 ± 0,02 a-c 0,22 ± 0,03 h-l 0,40 ± 0,08 k-m D713 0,10 ± 0,01 a-d 0,25 ± 0,02 j-l 0,38 ± 0,01 j-m D715 0,04 ± 0,03 ab 0,12 ± 0,03 a-i 0,21 ± 0,05 c-f D716 0,03 ± 0,01 ab 0,14 ± 0,04 a-l 0,29 ± 0,06 f-k D718 0,05 ± 0,01 a-c 0,18 ± 0 c-l 0,32 ± 0,05 f-l D729 0,01 ± 0 a 0,09 ± 0,04 a-f 0,23 ± 0,08 f-j D731 0,04 ± 0,03 ab 0,16 ± 0,04 b-l 0,31 ± 0,07 f-l E759 0,07 ± 0,05 a-c 0,25 ± 0,01 j-l 0,42 ± 0,01 lm E760 0,04 ± 0,04 ab 0,13 ± 0,02 a-k 0,29 ± 0,07 f-k E763 0,09 ± 0 a-d 0,25 ± 0,01 l 0,44 ± 0,06 mn E764 0,07 ± 0,04 a-c 0,20 ± 0,03 e-l 0,34 ± 0,04 j-l E766 0,04 ± 0,03 ab 0,15 ± 0,04 a-l 0,32 ± 0,08 f-l E767 0,04 ± 0,03 ab 0,21 ± 0,02 f-l 0,37 ± 0,02 j-m E768 0,08 ± 0,04 a-c 0,21 ± 0,02 f-l 0,42 ± 0,04 lm F781 0,01 ± 0 a 0,16 ± 0,02 b-l 0,29 ± 0,03 f-k F783 0,02 ± 0,01 a 0,19 ± 0,04 d-l 0,33 ± 0,07 i-l F784 0,03 ± 0,01 ab 0,16 ± 0,06 a-l 0,33 ± 0,08 h-l F785 0,01 ± 0,01 a 0,1 ± 0 a-g 0,20 ± 0,04 b-f F786 0 ± 0 a 0,17 ± 0,02 c-l 0,32 ± 0,04 f-l F787 0,04 ± 0,04 ab 0,09 ± 0,03 a-e 0,17 ± 0,05 a-e E801 0,07 ± 0,02 a-c 0,24 ± 0,04 i-l 0,42 ± 0,02 lm E802 0,06 ± 0,01 a-c 0,11 ± 0,03 a-h 0,22 ± 0,03 d-h E803 0,06 ± 0,01 a-c 0,21 ± 0,01 f-l 0,31 ± 0,03 f-l F810 0,06 ± 0,01 a-c 0,19 ± 0,01 d-l 0,35 ± 0,04 j-m F811 0,06 ± 0,02 a-c 0,25 ± 0,01 kl 0,52 ± 0,03 n F812 0,05 ± 0,03 a-c 0,16 ± 0,04 b-l 0,22 ± 0,04 d-i F813 0 ± 0 a 0,17 ± 0,03 c-l 0,28 ± 0,05 f-j Οι τιμές στην ίδια στήλη που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά (Ρ<0,05). Duncan test. 73

Πίνακας 5.4.2 Ομάδες στελεχών σύμφωνα με την ικανότητα οξινίσεως τους. Ά ΟΜΑΔΑ Β ΟΜΑΔΑ ΣΤΕΛΕΧΟΣ Δph 6h Δph 16h Δph 24h ΣΤΕΛΕΧΟΣ Δph 6h Δph 16h Δph 24h B10 0,03 ± 0,02 0,04 ± 0,01 0,08 ± 0,02 C2 0,05 ± 0,03 0,05 ± 0,01 0,09 ± 0,01 B3 0 ± 0 0,22 ± 0,31 0,09 ± 0,04 A4 0,01 ± 0,02 0,12 ± 0,06 0,11 ± 0,03 C4 0,07 ± 0,04 0,08 ± 0,04 0,11 ± 0,01 B1 0,01 ± 0,01 0,14 ± 0,08 0,11 ± 0,03 A10 0,07 ± 0,10 0,14 ± 0,05 0,12 ± 0,03 A8 0,04 ± 0,04 0,13 ± 0,05 0,12 ± 0,02 B4 0,04 ± 0,05 0,13 ± 0,07 0,13 ± 0,03 A9 0,01 ± 0,01 0,12 ± 0,07 0,13 ± 0,02 B2 0,18 ± 0,28 0,14 ± 0,07 0,13 ± 0,03 B6 0,06 ± 0,04 0,07 ± 0,02 0,13 ± 0,01 A7 0,01 ± 0,01 0,12 ± 0,06 0,13 ± 0,02 A2 0,04 ± 0,04 0,13 ± 0,03 0,14 ± 0,05 C7 0,01 ± 0,01 0,1 ± 0 0,14 ± 0,01 C5 0,01 ± 0,01 0,1 ± 0 0,14 ± 0,04 A5 0 ± 0 0,14 ± 0,06 0,14 ± 0,01 C6 0,08 ± 0,03 0,08 ± 0,03 0,14 ± 0,06 A3 0,06 ± 0,03 0,13 ± 0,02 0,15 ± 0,04 B5 0,08 ± 0,06 0,15 ± 0,07 0,15 ± 0,06 B7 0,1 ± 0,06 0,08± 0,01 0,15 ± 0,01 A1 0,13 ± 0,02 0,16± 0,07 0,17 ± 0,07 F787 0,04 ± 0,04 0,09± 0,03 0,17 ± 0,05 F785 0,01 ± 0,01 0,10 ± 0 0,20 ± 0,05 D715 0,04 ± 0,04 0,12 ± 0,03 0,22 ± 0,06 A6 0,15 ± 0,03 0,19 ± 0,09 0,22 ± 0,08 E802 0,06 ± 0,02 0,11 ± 0,03 0,22 ± 0,03 F812 0,05 ± 0,04 0,17 ± 0,05 0,23 ± 0,04 D729 0,01 ± 0,01 0,10 ± 0,05 0,23 ± 0,09 B9 0,06 ± 0,04 0,15 ± 0,02 0,28 ± 0,01 C1 0,06 ± 0,04 0,07 ± 0,01 0,28 ± 0,23 F813 0,01 ± 0,01 0,17 ± 0,03 0,29 ± 0,06 D716 0,04 ± 0,02 0,14 ± 0,05 0,29 ± 0,07 E760 0,05 ± 0,05 0,14 ± 0,02 0,29 ± 0,08 F781 0,01 ± 0,01 0,17 ± 0,03 0,29 ± 0,03 C3 0,07 ± 0,02 0,12 ± 0,02 0,30 ± 0,03 D731 0,04 ± 0,04 0,16 ± 0,04 0,32 ± 0,08 E803 0,07 ± 0,01 0,21 ± 0,02 0,32 ± 0,03 D718 0,05 ± 0,01 0,19 ± 0,01 0,33 ± 0,05 E766 0,04 ± 0,03 0,16 ± 0,04 0,33 ± 0,09 F786 0,01 ± 0,01 0,18 ± 0,03 0,33 ± 0,04 F784 0,03 ± 0,01 0,16 ± 0,07 0,33 ± 0,09 B8 0,08 ± 0,03 0,12 ± 0,01 0,33 ± 0,01 F783 0,02 ± 0,02 0,19 ± 0,04 0,34 ± 0,08 E764 0,08 ± 0,05 0,20 ± 0,03 0,35 ± 0,04 F810 0,06 ± 0,02 0,19 ± 0,02 0,36 ± 0,04 E767 0,04 ± 0,03 0,21 ± 0,03 0,37 ± 0,03 D713 0,10 ± 0,02 0,25 ± 0,02 0,39 ± 0,02 D711 0,05 ± 0,03 0,22 ± 0,04 0,40 ± 0,08 E759 0,08 ± 0,06 0,25 ± 0,01 0,42 ± 0,01 E768 0,09 ± 0,04 0,21 ± 0,03 0,42 ± 0,04 E801 0,08 ± 0,02 0,24 ± 0,04 0,43 ± 0,03 E763 0,10 ± 0,01 0,26 ± 0,01 0,45 ± 0,07 F811 0,06 ± 0,02 0,25 ± 0,02 0,53 ± 0,03 74

5.5 Πρωτεολυτική δραστηριότητα. 5.5.1 Εκτίμηση καζεϊνολυτικής δραστηριότητας στελεχών. Η καζεϊνολυτική δραστηριότητα των στελεχών με τη μέθοδο της UREA-PAGE, μετά από ανάπτυξη σε ανασυσταμένη αποβουτυρωμένη σκόνη γάλακτος για 24 ώρες και 7 ημέρες, δίνεται στον Πίνακα 5.5.1 Ο βαθμός της υδρόλυσης (% μείωση) υπολογίστηκε με τη βοήθεια της αναλογίας της έντασης των αντίστοιχων ζωνών στις 24 ώρες και της 7 ημέρες ως προς τις αρχικές (χρόνος 0). Παρατηρήθηκε μια αξιόλογη διαφοροποίηση μεταξύ των στελεχών ως προς τον τρόπο δράσης τους και την ένταση της δραστηριότητας τους. Το 59% των στελεχών υδρολύει σε μεγαλύτερο ποσοστό την αs-cn από την β-cn (Πίνακας 5.5.2). Το 46% των στελεχών (25 από τα 54 στελέχη) διασπούσαν την αs-cn στις 7 ημέρες σε ποσοστό >50%, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για την β-cn ήταν 37% (20 από τα 54 στελέχη). Τη μεγαλύτερη καζεϊνολυτική δραστηριότητα εμφάνιζε το στέλεχος Β7, το οποίο στις 7 ημέρες διασπά την αs-cn σε ποσοστό 79,53% και την β-cn σε ποσοστό 85,38%. Στον αντίποδα βρίσκεται το στέλεχος F785 που επέδειξε τη μικρότερη καζεϊνολυτική δραστηριότητα από τις υπόλοιπες απομονώσεις, καθώς διασπά την αs-cn σε ποσοστό μόλις 4,67% και την β-cn σε ποσοστό 8,37% και ακολουθεί το στέλεχος F786 με τα ποσοστά διάσπασης της αs-cn και της β-cn να φτάνουν το 6,55% και 6,84%, αντίστοιχα. Τα στελέχη του τυροκομείου Ι (Α1-C7) παρουσίασαν παρόμοια καζεϊνολυτική δραστηριότητα συγκριτικά με τα στελέχη που απομονώθηκαν από γραβιέρες του τυροκομείου ΙΙ. Πιο συγκεκριμένα για την αs-cn το ποσοστό μείωσης κατά μέσο όρο στις 7 ημέρες είναι 46,12% για τα στελέχη Α1-C7 έναντι του 41,72% των στελεχών του δεύτερου τυροκομείου. Τα αντίστοιχα ποσοστά για την β-cn είναι 41,03% και 39,13%. 75

Πίνακας 5.5.1 Υδρόλυση της αs- και της β- καζεΐνης από τις απομονώσεις της Γραβιέρας Κρήτης του τυροκομείου Ι. Μείωση % β-cn Μείωση % αs-cn ΣΤΕΛΕΧΟΣ 24 h 7d 24 h 7d A1 34,2 37,57 19,39 24,83 A2 40,76 52,28 37,31 50,47 A3 47,6 67,59 48,17 53,12 A4 44,69 58,78 40,01 65,16 A5 40,86 51,15 39,33 52,13 A6 40,27 42,88 40,2 67,42 A7 28,08 41,76 25,52 59,77 A8 18,58 24,68 15,99 35,05 A9 2,52 11,86 5,26 42,83 A10 15,44 25,52 28,83 31,17 B1 18,84 18,83 3,18 43,45 B2 6,27 24,8 1,74 44,4 B3 0,16 17,52 11,98 15,92 B4 7,94 15,48 1,74 18,54 B5 2,95 32,91 7,67 24,43 B6 51,92 62,6 27,92 46,2 B7 61,62 85,38 53,22 79,53 B8 54,72 67,44 61,34 67,78 B9 57,52 66,62 53,9 60,79 B10 57,31 67,68 55,52 66,79 C1 50,5 62,5 49,3 51,31 C2 34,74 64,3 7,46 38,31 C3 18,32 27,45 33,57 38,86 C4 17,55 28,46 51,5 51,5 C5 6,8 12,48 13,33 27,88 C6 13,1 30,55 30,08 66,22 C7 0,24 8,67 1,58 21,38 76

Πίνακας 5.5.1 (συνέχεια) Μείωση % β-cn Μείωση % αs-cn ΣΤΕΛΕΧΟΣ 24 h 7d 24 h 7d D711 18,31 19,35 39,78 53,91 D716 8,31 12,2 47,37 52,44 D715 24,88 25,73 24,64 28,8 D731 5,85 11,43 4,68 26,19 F784 8,53 14,27 5,66 31,17 F812 25,88 34,72 22,14 45,41 F813 41,78 44,79 50,97 56,48 F783 26,02 44,42 30,86 38,01 D729 7,36 15,85 4,9 29,88 F787 23,98 31,35 14,51 17,84 D718 24,84 25,7 32,01 44,02 F785 2,49 8,37 1,13 4,67 F781 30,12 55,42 17,11 42,39 F786 3,61 6,84 3,54 6,65 E766 39,41 70,93 30,97 59,14 E767 36,64 46,32 39,53 59,44 E768 31,67 46,47 18,92 25,61 E802 55,18 55,46 66,12 70,92 E760 48,31 51,24 56,24 60,28 E803 39,73 57,11 63,11 76,52 F810 21,61 45,94 26,58 51,64 E764 4,46 46,14 37,98 53,91 E759 3,8 46,47 41,73 51,55 E763 39,65 62,82 47,5 52,44 E801 36,88 55,55 24,79 28,8 F811 35,89 57,02 5,57 13,12 D713 55,05 64,6 11,25 45,41 77

Πίνακας 5.5.2 Ποσοστό % μείωσης της αs- και της β- καζεΐνης στις 24 ώρες και στις 7 ημέρες, ανάλογα με την πηγή απομόνωσης των στελεχών (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση). Μείωση % αs-cn β-cn Τυροκομείο 24h 7d 24h 7d I 28,33 (±19,48) 46,12 (±17,33) 28,64 (±20,35) 41,03 (±21,89) II 28,50 (±19,08) 41,72 (±18,69) 25,93 (±16,22) 39,13 (±19,21) Η ποσότητα των ελεύθερων αμινοξέων, εκφρασμένη σε mmol L-γλυκίνης L -1, που παράχθηκε από τα στελέχη μετά από 6, 16, 24 ώρες και 7 ημέρες παρουσιάζεται στον Πίνακα 5.5.3. Τα στελέχη διαφοροποιήθηκαν στατιστικώς σημαντικά (Ρ<0,05) ως προς τις ποσότητες αμινοξέων που σχημάτιζαν ήδη από την 16 η ώρα επώασης στο γάλα. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι τα στελέχη μπορούν να ταξινομηθούν σε 3 ομάδες, τα χαμηλής, μέσης και υψηλής πρωτεολυτικής ικανότητας, ανάλογα με την ποσότητα των ελεύθερων αμινοξέων που συγκεντρωνόταν στο γάλα μετά από 7 ημέρες επώασης (Πίνακας 5.5.4). Στην ομάδα της χαμηλής ικανότητας πρωτεόλυσης ανήκουν στελέχη του τυροκομείου Ι και ειδικότερα της πρώτης τυροκόμησης (τυρί Α). Στην ομάδα αυτή τα στελέχη φαίνεται να μην παράγουν ή να παράγουν ελάχιστες ποσότητες ελεύθερων αμινοξέων., τα οποία εκφρασμένα σε mmol Gly L -1 κυμαίνονταν από 0 0,54 ± 0,50. Στη δεύτερη ομάδα, ομαδοποιείται το 66,7% των στελεχών του τυροκομείου ΙΙ και το 11,5% του τυροκομείου Ι. Οι αντίστοιχες ποσότητες κυμαίνονται από 0,69 ± 0,27 έως 1,96 ± 0,09 mmol Gly L -1. Η τρίτη ομάδα παράγει μεγαλύτερες ποσότητες που έφταναν μέχρι τα 17,18 ± 0,74 mmol Gly L -1 και αποτελείται από στελέχη τόσο του τυροκομείου Ι (50% των στελεχών) όσο και του τυροκομείου ΙΙ (33,3% των στελεχών). Είναι φανερό λοιπόν ότι παρατηρείται ετερογένεια μεταξύ των στελεχών όχι μόνο ως προς το τυροκομείο παραγωγής αλλά και ως προς την τυροκόμηση. 78

Πίνακας 5.5.3 Αποτελέσματα δοκιμής ο-ρα εκφρασμένα σε mmol Gly L -1. Μέσος όρος τριών επαναλήψεων ± τυπική απόκλιση. mmol Gly L -1 ΣΤΕΛΕΧΟΣ 6h 16h 24h 7d A1 0,21 ± 0,31 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,54 ± 0,50 a-d A2 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,05 ± 0,31 ab A3 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,23 ± 0,02 a-c A4 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a A5 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,03 ± 0,04 a A6 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a A7 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a A8 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a A9 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a A10 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a B1 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 3,54 ± 2,02 n-q B2 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 2,01 ± 0,79 d-l B3 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 3,83 ± 0,98 o-r B4 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 2,81 ± 1,96 j-q B5 0 ± 0 a 0 ± 0 a 1,32 ± 0,45 i-l 1,29 ± 0,23 a-i B6 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,15 ± 0,14 ab 3,23 ± 0,39 l-q B7 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,52 ± 0,18 a-h 17,18 ± 0,74 u B8 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,88 ± 0,55 c-i 2,05 ± 1,19 e-m B9 3,32 ± 5,76 b 0 ± 0 a 0,49 ± 0,48 a-h 2,99 ± 0,14 k-q B10 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,50 ± 0,44 a-h 1,84 ± 0,32 d-l C1 0 ± 0 a 0,72 ± 0,20 a-e 0,69 ± 0,06 a-i 5,33 ± 1,85 s C2 0 ± 0 a 0,35 ± 0,12 a-c 0,36 ± 0,47 a-e 4,05 ± 0,99 p-s C3 0 ± 0 a 0,58 ± 0,50 a-e 0,29 ± 0,08 a-c 2,49 ± 0,54 h-o C4 0 ± 0 a 0,38 ± 0,43 a bc 0,29 ± 0,15 a-c 1,32 ± 0,50 a-i C5 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,28 ± 0,27 a-c 0,86 ± 0,43 a-f C6 0 ± 0 a 0,87 ± 1,06 b-e 0,63 ± 0,55 a-h 5,11 ± 1,18 rs C7 0 ± 0 a 0,43 ± 0,53 a-d 0,39 ± 0,04 a-f 4,20 ± 0,52 q-s 79

Πίνακας 5.5.3 (συνέχεια) mmol Gly L -1 ΣΤΕΛΕΧΟΣ 6h 16h 24h 7d D711 0,77 ± 0,12 a 1,11 ± 0,20 d-g 0,91 ± 0,16 c-i 1,94 ± 0,48 d-l D713 0,86 ± 0,12 a 0,23 ± 0,20 ab 1,19 ± 0,15 h-k 2,31 ± 0,70 f-n D715 0,56 ± 0,11 a 0,78 ± 0,27 b-e 1,64 ± 0,26 j-l 1,71 ± 0,40 d-k D716 0,11 ± 0,19 a 0,60 ± 0,05 a-e 1,76 ± 0,46 kl 1,86 ± 0,64 d-l D718 0,70 ± 0,44 a 0,35 ± 0,20 a-c 1,68 ± 0,45 j-l 2,15 ± 0,61 e-n D729 0,52 ± 0,35 a 0,41 ± 0,28 a-d 1,38 ± 0,18 i-l 1,00 ± 0,29 a-g D731 1,05 ± 0,38 a 1,20 ± 1,21 e-g 1,62 ± 0,13 j-l 1,26 ± 0,67 a-h E759 0 ± 0 a 0,01 ± 0,02 a 0,48 ± 0,15 a-g 1,84 ± 0,15 d-l E760 0,76 ± 0,17 a 1,22 ± 0,35 e-g 0,56 ± 0,19 a-h 1,26 ± 0,76 a-h E763 0 ± 0 a 0,37 ± 0,18 a-c 0,32 ± 0,32 a-d 0,96 ± 0,13 a-g E764 0,04 ± 0,07 a 0,01 ± 0,01 a 0,24 ± 0,42 a-c 2,13 ± 0,12 e-n E766 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,21 ± 0,07 a-c 1,68 ± 0,16 d-k E767 0,39 ± 0,26 a 0,81 ± 0,20 b-e 0,90 ± 0,05 c-i 3,21 ± 0,41 l-q E768 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,79 ± 0,09 b-i 1,96 ± 0,09 d-l F781 0,74 ± 0,23 a 0,57 ± 0,09 a-e 1,17 ± 0,52 g-k 1,44 ± 0,47 a-j F783 0,89 ± 0,39 a 1,57 ± 0,18 fg 0,48 ± 0,50 a-g 2,74 ± 1,39 i-p F784 1,18 ± 0,35 a 0,94 ± 0,52 b-f 0,53 ± 0,72 a-h 1,48 ± 0,24 b-j F785 0,51 ± 0,07 a 1,24 ± 0,71 e-g 0,27 ± 0,27 a-c 0,69 ± 0,27 a-e F786 0,49 ± 0,46 a 1,01 ± 0,61 c-f 1,03 ± 1,02 e-j 2,44 ± 0,70 g-o F787 0,79 ± 0,25 a 1,19 ± 0,27 e-g 0,85 ± 0,42 b-i 0,71 ± 0,07 a-e E801 0,95 ± 0,08 a 0,83 ± 0,44 b-e 0,62 ± 0,08 a-h 3,46 ± 0,49 m-q E802 1,48 ± 0,12 a 0,67 ± 0,33 a-e 1,02 ± 0,18 d-j 1,53 ± 0,23 c-j E803 1,50 ± 0,38 a 1,74 ± 0,24 g 1,32 ± 0,19 i-l 1,71 ± 0,29 d-j F810 1,12 ± 0,58 a 0,89 ± 0,14 b-f 1,38 ± 0,49 i-l 6,68 ± 1,53 t F811 0,78 ± 0,96 a 1,27 ± 0,58 e-g 0,31 ± 0,35 a-d 4,90 ± 0,99 rs F812 0,39 ± 0,42 a 2,46 ± 0,88 h 1,92 ± 1,09 l 1,06 ± 0,63 a-h F813 1,25 ± 0,21 a 0,63 ± 0,57 a-e 1,08 ± 0,54 f-k 1,43 ± 0,09 a-j Οι τιμές στην ίδια στήλη που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά (Ρ<0,05). Duncan test 80

Γ ΟΜΑΔΑ Β ΟΜΑΔΑ Α ΟΜΑΔΑ Πίνακας 5.5.4 Ομάδες στελεχών σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δοκιμής ο-ρα εκφρασμένα σε mmol Gly L -1. Μέσος όρος τριών επαναλήψεων ± τυπική απόκλιση ΣΤΕΛΕΧΟΣ 6h 16h 24h 7d A10 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 A4 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 A6 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 A7 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 A8 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 A9 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 A5 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0,03 ± 0,04 A2 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0,05 ± 0,31 A3 0± 0 0 ± 0 0 ± 0 0,23 ± 0,02 A1 0,21 ± 0,31 0 ± 0 0 ± 0 0,54 ± 0,50 F785 0,51 ± 0,07 1,24 ± 0,71 0,27 ± 0,27 0,69 ± 0,27 F787 0,79 ± 0,25 1,19 ± 0,27 0,85 ± 0,42 0,71 ± 0,07 C5 0 ± 0 0 ± 0 0,28 ± 0,27 0,86 ± 0,43 E763 0 ± 0 0,37 ± 0,18 0,32 ± 0,32 0,96 ± 0,13 D729 0,52 ± 0,35 0,41 ± 0,28 1,38 ± 0,18 1,00 ± 0,29 F812 0,39 ± 0,42 2,46 ± 0,88 1,92 ± 1,09 1,06 ± 0,63 D731 1,05 ± 0,38 1,20 ± 1,21 1,62 ± 0,13 1,26 ± 0,67 E760 0,76 ± 0,17 1,22 ± 0,35 0,56 ± 0,19 1,26 ± 0,76 B5 0 ± 0 0 ± 0 1,32 ± 0,45 1,29 ± 0,23 C4 0 ± 0 0,38 ± 0,43 0,29 ± 0,15 1,32 ± 0,50 F813 1,25 ± 0,21 0,63 ± 0,57 1,08 ± 0,54 1,43 ± 0,09 F781 0,74 ± 0,23 0,57 ± 0,09 1,17 ± 0,52 1,44 ± 0,47 F784 1,18 ± 0,35 0,94 ± 0,52 0,53 ± 0,72 1,48 ± 0,24 E802 1,48 ± 0,12 0,67 ± 0,33 1,02 ± 0,18 1,53 ± 0,23 E766 0 ± 0 0 ± 0 0,21 ± 0,07 1,68 ± 0,16 D715 0,56 ± 0,11 0,78 ± 0,27 1,64 ± 0,26 1,71 ± 0,40 E803 1,50 ± 0,38 1,74 ± 0,24 1,32 ± 0,19 1,71 ± 0,29 B10 0 ± 0 0 ± 0 0,50 ± 0,44 1,84 ± 0,32 E759 0 ± 0 0,01 ± 0,02 0,48 ± 0,15 1,84 ± 0,15 D716 0,11 ± 0,19 0,60 ± 0,05 1,76 ± 0,46 1,86 ± 0,64 D711 0,77 ± 0,12 1,11 ± 0,20 0,91 ± 0,16 1,94 ± 0,48 E768 0 ± 0 0 ± 0 0,79 ± 0,09 1,96 ± 0,09 B2 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 2,01 ± 0,79 B8 0 ± 0 0 ± 0 0,88 ± 0,55 2,05 ± 1,19 E764 0,04 ± 0,07 0,01 ± 0,01 0,24 ± 0,42 2,13 ± 0,12 D718 0,70 ± 0,44 0,35 ± 0,20 1,68 ± 0,45 2,15 ± 0,61 D713 0,86 ± 0,12 0,23 ± 0,20 1,19 ± 0,15 2,31 ± 0,70 F786 0,49 ± 0,46 1,01 ± 0,61 1,03 ± 1,02 2,44 ± 0,70 C3 0 ± 0 0,58 ± 0,50 0,29 ± 0,08 2,49 ± 0,54 F783 0,89 ± 0,39 1,57 ± 0,18 0,48 ± 0,50 2,74 ± 1,39 B4 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 2,81 ± 1,96 81

Γ ΟΜΑΔΑ B9 3,32 ± 5,76 0 ± 0 0,49 ± 0,48 2,99 ± 0,14 E767 0,39 ± 0,26 0,81 ± 0,20 0,90 ± 0,05 3,21 ± 0,41 B6 0 ± 0 0 ± 0 0,15 ± 0,14 3,23 ± 0,39 E801 0,95 ± 0,08 0,83 ± 0,44 0,62 ± 0,08 3,46 ± 0,49 B1 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 3,54 ± 2,02 B3 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 3,83 ± 0,98 C2 0 ± 0 0,35 ± 0,12 0,36 ± 0,47 4,05 ± 0,99 C7 0 ± 0 0,43 ± 0,53 0,39 ± 0,04 4,20 ± 0,52 F811 0,78 ± 0,96 1,27 ± 0,58 0,31 ± 0,35 4,90 ± 0,99 C6 0 ± 0 0,87 ± 1,06 0,63 ± 0,55 5,11 ± 1,18 C1 0 ± 0 0,72 ± 0,20 0,69 ± 0,06 5,33 ± 1,85 F810 1,12 ± 0,58 0,89 ± 0,14 1,38 ± 0,49 6,68 ± 1,53 B7 0 ± 0 0 ± 0 0,52 ± 0,18 17,18 ± 0,74 5.6 Πεπτιδολυτική δραστηριότητα άθικτων κυττάρων. Οι τιμές της αμινοπεπτιδασικής δραστηριότητας των στελεχών παρουσιάζονται στο Διάγραμμα 5.6.1. Το 83.3% των στελεχών παρουσίασαν υψηλότερη δραστηριότητα έναντι της λυσίνης (αμινοπεπτιδάση PepN, PepC) απ ότι έναντι του γλουταμινικού οξέος (αμινοπεπτιδάση PepA) ή της προλίνης (ιμινοπεπτιδάση PepI). Επιπλέον, το 33.3% των στελεχών εμφάνισε υψηλότερη ιμινοπεπτιδασική δραστηριότητα σε σύγκριση με τη δραστηριότητα της PepA. Η αμινοπεπτιδασική δραστηριότητα έναντι της λυσίνης κυμαινόταν από 1910 μονάδες (F783) έως 69 μονάδες (Β5), οι τιμές για τη δραστηριότητα της PepI έναντι της προλίνης ήταν 1294 (F786) - 0 (Β5) και τέλος το εύρος τιμών για την αμινοπεπτιδασική δραστηριότητα έναντι του γλουταμινικού οξέος βρισκόταν μεταξύ των 1892 (F783) - 69 (Β5) μονάδων. Η μέση αμινοπετιδασική δραστηριότητα που εμφάνισαν τα στελέχη που ταυτοποιήθηκαν ως Lb. paracasei subsp. paracasei έναντι όλων των αμινοξέων που εξετάστηκαν, ήταν υψηλότερη από την αντίστοιχη των στελεχών Lb. brevis. Πιο συγκεκριμένα η μέση τιμή για την PepN και την PepC ήταν 2.2 φορές υψηλότερη, για την PepI 1.7 φορές και για την PepA 3.3 φορές υψηλότερη. Αξίζει να σημειωθεί βέβαια ότι παρατηρήθηκε παραλλακτικότητα μεταξύ των στελεχών του ίδιου είδους όσον αφορά την δραστηριότητα τους έναντι των χημικώνυποστρωμάτων. 82

Lb.paracasei subsp.paracasei Lb.casei Lb.curvatus Lb.brevis

5.7 Ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης αμινοξέων Κανένα στέλεχος δεν μπόρεσε να αποκαρβοξυλιώσει την ορνιθίνη, την ιστιδίνη, τη λυσίνη και την τυροσίνη. Συνεπώς τα στελέχη δεν έχουν την ικανότητα να παράγουν βιογενείς αμίνες (πουτρεσκίνη, καδαβερίνη, ισταμίνη, τυραμίνη). 5.8 Αφομοίωση κιτρικών. Η πλειοψηφία των στελεχών δεν ζύμωνε τα κιτρικά (52 από τα 54 στελέχη), ενώ αυτά που έδωσαν θετική δοκιμή ήταν τα στελέχη B10 και C7. 5.9 Προβιοτικές ιδιότητες. Όλα τα στελέχη ήταν ικανά να αναπτυχθούν παρουσία χολικών αλάτων, σε συγκέντρωση μέχρι 2%. Η ανάπτυξη τους δεν φάνηκε να επηρεάζεται ούτε από τις χαμηλές τιμές ph, αφού όλα τα στελέχη αναπτύχθηκαν σε ph : 3.0 και 1,5 (Πίνακας 5.9.1). Κανένα στέλεχος δεν είχε αντιβακτηριακή δράση έναντι παθογόνων ή/και αλλοιογόνων στελεχών δεικτών. 84

5.10 Παθογένεια στελεχών. Το 61,1% (33 από τα 54 στελέχη) των απομονώσεων παρουσίασε τύπο αιμόλυσης γ, ενώ το υπόλοιπο 38,9% (21 από τα 54 στελέχη) παρουσίασε τύπο αιμόλυσης α. Κανένα από τα στελέχη δεν εμφάνισε β-αιμόλυση που υποδηλώνει παθογένεια. Πίνακας 5.9.1 Αποτελέσματα διερεύνησης των προβιοτικών ιδιοτήτων των απομονώσεων από ώριμη Γραβιέρα Κρήτης. 0,3 bile 1% bile 2%bile ph:1,5 ph:3 A1 + + + + + A2 + + + + + A3 + + + + + A4 + + + + + A5 + + + + + A6 + + + + + A7 + + + + + A8 + + + + + A9 + + + + + A10 + + + + + B1 + + + + + B2 + + + + + B3 + + + + + B4 + + + + + B5 + + + + + B6 + + + + + B7 + + + + + B8 + + + + + B9 + + + + + B10 + + + + + C1 + + + + + C2 + + + + + C3 + + + + + C4 + + + + + C5 + + + + + C6 + + + + + C7 + + + + + 85