ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΟΠΙΟΕΙΔΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΟΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟ -

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΓΩΝ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΟΠΙΟΕΙΔΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΟΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟ - ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΤΑΞΥ ΡΑΧΙΑΙΑΣ ΚΑΙ ΚΟΙΛΙΑΚΗΣ ΜΟΙΡΑΣ Σωτηροπούλου- Κοροβέση Βασιλική Α.Μ.: 300/0601010057 Επίβλέπουσα Καθηγητρια: Ε. Ασπροδίνη Λάρισα, Ιούνιος 2012

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΟΠΙΟΕΙΔΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΟΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟ- ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΤΑΞΥ ΡΑΧΙΑΙΑΣ ΚΑΙ ΚΟΙΛΙΑΚΗΣ ΜΟΙΡΑΣ Τριμελή επιτροπή: Ασπροδίνη Ε. Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φαρμακολογίας Γ ερμενής Α. Καθηγητής Εργαστηριακής Ανοσολογίας Χατζηγεωργίου Γ. Αναπληρωτής Καθηγητής Νευρολογίας 1

Σ τους γονείς μου και τον αδερφόμου.., Στον Γιάννη 2

Πρόλογος Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας της Ιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας στη Λάρισα, υπό την επίβλεψη της αναπληρώτριας καθηγήτριας Ευτυχίας Ασπροδίνη την οποία θα ήθελα να ευχαριστήσω για την άριστη συνεργασία μας. Οι συμβουλές της, η ερευνητική καθοδήγηση και η πολύτιμη βοήθειά της σε κάθε βήμα έπαιξαν καθοριστικό ρόλο για την ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Γ ερμενή Αναστάσιο, Καθηγητή Εργαστηριακής Ανοσολογίας και τον κ. Χατζηγεωργίου Γ εώργιο, Αναπληρωτή Καθηγητή Νευρολογίας για την συμμετοχή τους στην τριμελή επιτροπή. Τέλος δεν θα μπορούσα να μην αναφερθώ στους Κουβαρά Ευάγγελο και Μπέγα Ηλία, των οποίων η βοήθεια σε θέματα εργαστηρίου ήταν σημαντική καθ' όλη τη διάρκεια της Μεταπτυχιακής Διατριβής. 3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΤΟ 1: Ο ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΣ 1.1 Γενικά... 5 1.2 Δομή και Στοιβάδες... 6 1.3 Ενδονευρώνες του ιπποκάμπου...10 1.4 Διασυνδέσεις του ιπποκάμπου...13 1.5 Λειτουργίες του ιπποκάμπου... 16 1.6 Διαφοροποίηση ραχιαίου και κοιλιακού ιπποκάμπου... 19 ΚΕΦΑΛΑΤΟ 2: γ-αμινοβουτυρικο ΟΞΥ (GABA) ΚΑΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΟΥ 2.1 GABA... 23 2.2 Υποδοχείς GABA... 27 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΟΠΙΟΕΙΔΗ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ 3.1 Γενικά χαρακτηριστικά... 30 3.2 Φεντανύλη... 35 ΣΚΟΠΟΣ... 37 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 38 Πειραματόζωα... 38 Χορήγηση Φεντανύλης - Πειραματικές ομάδες... 38 Παρασκευή τομών... 38 Μονιμοποίηση ολόκληρου εγκεφάλου... 41 Ανοσοϊστοχημική μελέτη... 41 Μικροσκοπία... 52 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 44 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 57 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 61 SUMMARY 62 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 63 4

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΣ 1.1 ΓΕΝΙΚΑ Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός του εγκεφάλου οφείλει το όνομά του στον ανατόμο Julius Ceasar Arnazi, ο οποίος παρατήρησε την ομοιότητά του με τον θαλάσσιο ιππόκαμπο (εικ. 1). O ιππόκαμπος αποτελεί έναν σχηματισμό που βρίσκεται στην έσω πτυχή του κροταφικού λοβού (του πρόσθιου εγκεφάλου) και θεωρείται εξελικτικά μία από τις αρχαιότρερες δομές του φλοιού του εγκεφάλου. Ο ρόλος του στην παγίωση της μνήμης θεωρείται θεμελιώδης αφού μαζί με τους κροταφικούς λοβούς και με άλλες δομές του μεταιχμιακού συστήματος (Papez circuit) εμπλέκονται σε διαδικασίες μνήμης και μάθησης (Sotirios Papachileos, Μηχανισμός Παγίωσης Μνήμης - Ιππόκαμπος και Κύκλωμα Papez). Αποτελεί μια από τις πιο καλά μελετημένες δομές του εγκεφάλου, το οποίο οφείλεται στη διακριτή και εύκολα αναγνωρίσιμη δομή του τόσο σε ανατομικό επίπεδο, όσο και σε ιστολογικό λόγω της οργανωμένης στιβάδωσής του. (Shepherd, 1998). Από τη δεκαετία του 1950 και μετά, με αφορμή την δημοσίευση του περιστατι^ύ του ασθενούς Η.Μ ο οποίος υποβλήθηκε σε εγχείρηση αφαίρεσης του ιπποκάμπειου σχηματισμού και των περιβαλλόντων ιστών (Scoville and Milner, 1957), αναγνωρίσθηκε ο σημαντικός του ρόλος στη μνήμη και τη μάθηση. Αυτό το γεγονός προσέλκυσε ακόμα περισσότερο το ερευνητικό ενδιαφέρον για τον ιππόκαμπο. Εικ.1 Ανθρώπινος ιππόκαμπος και θαλάσσιος ιππόκαμπος (Source Professor Laszlo Seress, University o f Pecs) 5

1.2 ΔΟΜΗ ΚΑΤ ΣΤΟΤΏ ΑΛΕΣ Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός του επίμυος αποτελεί μια επιμήκη δομή η οποία μοιάζει με το σχήμα του γράμματος C, συμμετρική ως προς την μέση γραμμή του εγκεφάλου, που εκτείνεται προσθιοραχιαία από το διαφραγματικό πυρήνα του πρόσθιου εγκεφάλου και αφού κυρτωθεί καταλήγει στην αρχή του κροταφικού λοβού οπισθιοκοιλιακά. Στον αρουραίο το τμήμα του ιππόκαμπου πλησιέστερα προς τους πυρήνες του διαφράγματος αποτελεί τον διαφραγματικό ή ραχιαίο ιππόκαμπο, ενώ το τμήμα προς τον κροταφικό λοβό αποτελεί τον κροταφικό ή κοιλιακό ιππόκαμπο. (εικ. 2Α). Στον άνθρωπο ονομάζονται οπίσθιος και πρόσθιος αντίστοιχα (εικ. 2Ώ). Cerebral cortex Septal Pole Prefrontal cortex Striatum 7 Am ygdala T*mpoial Pol* Cerebellum Parahippocampal region Εικ.2Α Θέση του ιπποκάμπου στον εγκέφαλο του ενήλικα αρουραίου (http://www.scripps.edu/cnad/mandyam/researc Εικ.2Β Θέση του ιπποκάμπου στον ανθρώπινο εγκέφαλο /http://www.sfn.org/index.aspx?pagename=core concents glossary&print=on) Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός συγκροτείται από τρεις διακριτές περιοχές: την οδοντωτή έλικα (Dentate Gyrus), το αμμώνιο κέρας (Cornu Ammonis) ή κυρίως ιππόκαμπο (Hippocampus Proper), ο οποίος διακρίνεται στις περιοχές CA1 CA2 και CA3, και το υπόθεμα (Subiculum), (Εικ.3). Στον ιπποκάμπειο σχηματισμό θεωρείται ότι ανήκουν και άμεσα γειτονικές δομές όπως το προϋπόθεμα (Presubiculum), το παραϋπόθεμα (Parasubiculum) και ο ενδορινικός φλοιός (Entorhinal Cortex). Το υπόθεμα, το προϋπόθεμα και το παραϋπόθεμα αναφέρονται συνήθως μαζί και ως σύμπλεγμα υποθέματος (Amaral and Witter, 1989). 6

Εικ.3 Κάθετη τομή κατα μήκος του αξονα του ραβδομορφου σχηματισμού που αποτελεί τον αριστερό ιππόκαμπο. Αποκαλύπτεται η οδοντωτή έλικα (DG), το αμμώνειο κέρας (CA) και το υπόθεμα (S) (Amaral et al 1989). Στην εσοχή της οδοντωτής έλικας, η περιοχή μέσα στον ημικυκλικό σχηματισμό που δημιουργούν τα κύτταρα της κοκκώδους στιβάδας, θεωρείται ότι είναι η περιοχή CA4. Η περιοχή αυτή θεωρείται περιοχή της οδοντωτής έλικας που καλείται Hilus. Στην περιοχή αυτή, η πυκνότητα της στιβάδας των πυραμιδικών κυττάρων του αμμωνείου κέρατος, που παρατηρείται στις των περιοχές CA1-3 αρχίζει να αποδομείται και τα πυραμιδικά κύτταρα εντοπίζονται αραιά και διασπαρμένα. Η οδοντωτή έλικα, και το Αμμώνιο κέρας αποτελούνται το κάθε ένα από ευδιάκριτα μορφώματα (εικ. 4, 5): Οδοντωτή έλικα: > Κοκκιώδης στοιβάδα (granular) ^ περιέχει τα κύρια κύτταρα της οδοντωτής έλικας με σφαιρικό σώμα, τα κοκκιώδη κύτταρα τα οποία είναι διάμεσοι νευρώνες > Μοριώδης στοιβάδα (molecular) ^ όπου εκτείνονται οι δενδρίτες των κοκκιωδών κυττάρων > Πολύμορφη στοιβάδα (polymorphic) ^ περιέχει κύτταρα ποικίλης μορφολογίας τα οποία συνάπτονται μόνο τοπικά 7

Ενοορρινικος Φλοιος ϊποθεμα (Subiculum) jkjsv Οδοντωτή έλικα ",(Dentate Gyrus) Αμμωνειο Κεράς (CA1) Κοκκιώδη Κύτταρα Παράπλευρη οδός S chatter Λ,μμώναο Κέρας CA2).ικαφη Λ,μμώναο Κέρα; (C-A3) Γιγαντιαιοί πυραμιδικοί νευρώνες Αμμώνειο Κέρας (CA4 Βρυώόεις Ίνες Εικ.4. Στοιχεία του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Διακρίνονται: το υπόθεμα, μέρος του ενδορρινικού φλοιού, η οδοντωτή έλικα και οι περιοχές CA1-CA3. Επίσης υποσημαίνονται τα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας, οι πυραμιδικοί νευρώνες του αμμωνείου κέρατος, η σκάφη, και οι βρυώδεις ίνες και η παράπλευρη οδός του Schaffer του τρισυναπτικού κυκλώματος.. Χειρόγραφο σχέδιο του Ramon y Cajal, 191.(http://www.pageoneuroplasticity.info/). Αμμώνειο κέρας: > Σκάφη (alveus) ^ μικρού εύρους στοιβάδα που διατρέχεται κυρίως από εξερχόμενες αλλά και εισερχόμενες αξονικές ίνες, οι οποίες αρχικά σχηματίζουν την παρυφή και τελικά την ψαλίδα. > Στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων (oriens) ^ βρίσκονται οι βασικοί δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων του ιππόκαμπου και τα καλαθοειδή κύτταρα (Basket cells), τα οποία είναι ανασταλτικοί διάμεσοι νευρώνες των πυραμιδικών κυττάρων. > Πυραμιδική στοιβάδα (pyramidale) ^ περιλαμβάνει τα κυτταρικά σώματα των πυραμιδοειδών νευρώνων, των κυρίως νευρώνων του αμμωνίου κέρατος. Τα πυραμιδικά κύτταρα είναι απαγωγοί νευρώνες (η πυραμιδική στοιβάδα του αμμωνίου κέρατος διακρίνεται σε τρεις επιμέρους 8

υπό-περιοχές, ξεκινώντας από τα όρια της οδοντωτής έλικας, στην πορεία προς το υπόθεμα: τις CA3, CA2, και CA1, κατά σειρά). > Ακτινωτή στιβάδα (radiatum) και Βοθριώδης-Μοριακή στοιβάδα (Lacunosum moleculare) οι οποίες περικλείουν τμήματα κορυφαίων δενδριτών των πυραμιδοειδών κυττάρων. Εικ.5 Στοιβάδες Αμμώνιου κέρατος και Οδοντωτής έλικας (http://medscience.us/kc1.html). 9

1.3 ΕΝΔΟΝΕΥΡΩΝΕΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ Οι νευρώνες του ιπποκάμπου χωρίζονται σε δυο κατηγορίες: στους προβλητικούς (principal) και στους διάμεσους (non-principal) νευρώνες. Οι προβλητικοί νευρώνες σε κάθε περιοχή του ιπποκάμπου είναι κυρίως γλουταμινεργικοί, ομοιογενείς και αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων του ιπποκάμπου, ενώ η πλειοψηφία των διάμεσων νευρώνων είναι GABA-εργικοί, ετερογενείς και αποτελούν το 10-20% των νευρώνων του ιπποκάμπου (Svoboda et al., 1999). Ο ετερογενής πληθυσμός των GABAεργικών ενδονευρώνων (non-principal) στον ιππόκαμπο συνίσταται από νευρικά κύτταρα τα οποία συνθέτουν και απελευθερώνουν γ-αμινοβουτυρικό οξύ ως νευροδιαβιβαστή προκαλώντας υπερπόλωση της μετασυναπτικής μεμβράνης. Διαχωρίζoνται με βάση την μορφολογία και την θέση τους στις στιβάδες. Κυρίως, τους χαρακτηρίζουν η θέση του κυτταρικού σώματος, η κατεύθυνση προς την οποία εκτείνονται οι δενδρίτες τους, η απόσταση και οι στοιβάδες στις οποίες εκτείνεται ο άξονας, καθώς και οι μεταξύ τους διασυνδέσεις.. Επίσης, οι ενδονευρώνες χαρακτηρίζονται από τις πρωτεΐνες δέσμευσης του ασβεστίου (όπως καλρετινίνη, παρβαλβουμίνη), τα νευροπεπτίδια που εκφράζουν (όπως σωματοστατίνη, νευροπεπτίδιο Υ, εντεροδραστικό πεπτίδιο), καθώς και το πώς απαντούν σε ρυθμιστικές ουσίες όπως η ακετυλοχολίνη και η σεροτονίνη (Parra et al., 1998). Εντούτοις, οι ενδονευρώνες του ιπποκάμπου, με ελάχιστες εξαιρέσεις, εμφανίζουν τα κλασικά χαρακτηριστικά των ενδονευρώνων (Freund and Buzsaki, 1996). Κάποιοι από αυτούς σχηματίζουν ανασταλτικές συνάψεις στα σώματα των πυραμιδικών νευρώνων ή στο αρχικό τμήμα του νευράξονα, ενώ άλλοι συνάπτονται με τους δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων (Svoboda et al., 1999). Ανοσοϊστοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής του ΚΝΣ, το γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA), καθώς και τα ένζυμα που λαμβάνουν χώρα στην σύνθεση του όπως η αποκαρβοξυλάση του γλουταμινικού οξέος (GAD) συνεκφράζονται στους ενδονευρώνες με πρωτεΐνες που δεσμεύουν ασβέστιο και τους χαρακτηρίζουν. Οι κύριοι υποπληθυσμοί των GABAεργικών διάμεσων νευρώνων του ιππόκαμπου του επίμυος χωρίζονται με βάση την Ca2+ δεσμευτική πρωτεΐνη, καθώς και το νευροπεπτίδιο το οποίο φέρουν. Οι ποιο βασικοί μάρτυρες που χαρακτηρίζουν τους κύριους υποπληθυσμούς των GABAεργικών νευρώνων στον ιππόκαμπο του 10

αρουραίου είναι η συνθετάση του νιτρικού οξέος (NOS), η καλρετινίνη (CR), η σωματοστατίνη (SS), η παρβαλβουμίνη (PV), η χολεκυστοκινίνη (CCK), το εντεροδραστικό πεπτίδιο (VIP) και η καλβιδίνη (calbidinin) (Nomura et al., 1997). Στην οδοντωτή έλικα διακρίνονται δύο κύριες κατηγορίες ενδονευρώνων: α) τα καλαθοφόρα κύτταρα των οποίων τα κυτταρικά σώματα εντοπίζονται στο όριο μεταξύ της κοκκιώδους και πολυμορφικής στοιβάδας και νευρώνουν τα κοκκιώδη κύτταρα, β) τα αξο-αξονικά κύτταρα που εντοπίζονται στη πολυμορφική στοιβάδα και νευρώνουν τη ζώνη εκκίνησης των αξόνων κοκκιωδών κυττάρων. A^o-cJJowim. ΚοΑαΒοειδή Διστοιβοίωτά TpdDti3aioj/nx Ακτιυατυα 0-LM κύτταρα κύτταρα κύ reap α κύτταρα τριστοιβαδωτά κύτταρα κύτταρα Εικ. 6. Οι ενδονευρώνες του ιπποκάμπου. Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν τα σώματα, οι γραμμές τους δενδρίτες και τα τετράγωνα τους νευράξονες των ενδονευρώνων (Freund et al., 1996). Στο Αμμώνιο κέρας διακρίνονται έξι κατηγορίες ενδονευρώνων (Εικ. 6), με κυριότερες τις εξής τρεις (Εικ. 7): α) τα καλαθοειδή κύτταρα που εντοπίζονται στην πυραμιδική στοιβάδα και σχηματίζουν πολλαπλές συνάψεις στα σώματα των πυραμιδικών κυττάρων β) τα αξο-αξονικά κύτταρα στα όρια της πυραμιδικής στοιβάδας που νευρώνουν τη ζώνη εκκίνησης των αξόνων πυραμιδικών κυττάρων 11

γ) τα διστοιβαδωτά κύτταρα τα οποία συνάπτονται τόσο σε κορυφαίους όσο και σε βασικούς δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων. Οι δενδρίτες των ενδονευρώνων και των τριών κατηγοριών διακλαδίζονται τόσο στην ακτινωτή όσο και στην στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων (Freud and Buzsaki, 1996) Εικ. 7. Κύριοι τύποι ενδονευρώνων: Bis-διστρωματικά, Axo-αξο-αξονικά, Basketκαλαθιοφόρα, SO-πολυμορφική στιβάδα, SPπυραμιδική στιβάδα, SR-ακτινωτή στιβάδα, SLM-μοριώδης-βοθριώδης στιβάδα. Οι μαύροι κύκλοι συμβολίζουν το σώμα των ενδονευρώνων, οι μαύρες γραμμές την έκταση των δενδριτών τους και τα σκιασμένα παραλληλόγραμμα την έκταση του αξονικού τους δικτύου. Δεξιά απεικονίζεται ένα πυραμιδικό κύτταρο (Pawelzik et al. 2002). Οι ενδονευρώνες που έχουν τα σώματά τους στη στιβάδα πολύμορφων κυττάρων στη CA1 περιοχή του ιππόκαμπου διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με την έκφραση μ- ή δ-οπιοειδικών υποδοχέων και το τμήμα του πυραμιδικού κυττάρου όπου συνάπτεται ο άξονάς τους. Έχει διαπιστωθεί ότι οι ενδονευρώνες που εκφράζουν μ-οπιοειδικούς υποδοχείς συνάπτονται zto σώμα των πυραμιδικών κυττάρων, ενώ αντίθετα οι ενδονευρώνες που εκφράζουν δ-υποδοχείς συνάπτονται σε απομακρυσμένους δενδρίτες των πυραμιδικών νευρώνων. Η διαπίστωση αυτή έχει σημασία καθώς η αναστολή σε διαφορετικά τμήματα του πυραμιδικού νευρώνα μπορεί να επιφέρει διαφορετικό λειτουργικό αποτέλεσμα. Δηλαδή, η αναστολή στην περισωματική περιοχή μπορεί να αναστείλει την εξαρτώμενη από τα ιόντα νατρίου παραγωγή δυναμικών ενέργειας, με αποτέλεσμα τη μειωμένη πιθανότητα εκφόρτισης των πυραμιδικών νευρώνων. Αντίθετα, αναστολή σε δενδρίτες των πυραμιδικών νευρώνων έχει ως συνέπεια τη μείωση του εύρους των εισερχόμενων διεγερτικών μετασυναπτικών δυναμικών (EPSPs) και τη μείωση της πρόκλησης ασβέστιο-εξαρτώμενων δυναμικών ενέργειας, με αποτέλεσμα τη ρύθμιση των εισερχόμενων πληροφοριών από άλλες περιοχές του εγκεφάλου (Svoboda et al., 1999). 12

1.4 ΔΙΑΣΥΝΔΕΣΕΙΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ Το τρισυναπτικό κύκλωμα Η συνδεσμολογία του τοπικού δικτύου του ιπποκάμπειου σχηματισμού, που έχει επικρατήσει να αναφέρεται ως τρισυναπτικό κύκλωμα, το οποίο επαναλαμβάνεται σε όλο τον επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου, είναι γνωστή από την εποχή του Ramon y Cajal (1911) (Εικ. 8). Ο εγκεφαλικός φλοιός προβάλει στην δεύτερη στιβάδα του ενδορινικού φλοιού και από εκεί μέσω της διατιτραίνουσας οδού (perforant path) στα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας. Από τα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας μέσω της οδού των βρυωδών ινών (mossy fibers), η πληροφορία προβάλει στα πυραμιδικά κύτταρα της CA3 περιοχής και τα τελευταία μέσω της οδού των παράπλευρων ινών του Schaffer στα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 περιοχής. Τέλος, τα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 περιοχής προβάλουν στο υπόθεμα και στον ενδορινικό φλοιό ολοκληρώνοντας έτσι το κύκλωμα. Όλες οι παραπάνω συνδέσεις είναι διεγερτικές (Andersen et al., 1966; Amaral and Witter, 1995). Πρέπει επίσης να αναφερθεί ότι από τη στοιβάδα ΙΙΙ του ενδορινικού φλοιού εκφύονται άξονες που νευρώνουν απευθείας τα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου. Επιπλέον, νευρώνες τόσο της CA1 όσο και της CA3 περιοχής αναπτύσσουν παράπλευρους νευράξονες που καταλήγουν σε νευρώνες της ιδίας περιοχής, αντιστοίχως (Shepherd et al., 1998). The Hippocampal Nletwoiik: The hippocam pus forms a principally uni-diirectionall network, with input from the Entorhinal Cortex (EC) that forms connections with the Dentate Gyrus (DG) and CA3 pyramidal neurons via the Perforant Path (PP - split into lateral and medial). CA3 neurons also receive input from the DG via the mossy fibres (MF). They send axons to CA1 pyramidal cells via the Schaffer Collateral Pathway (SC), as well as to CA1 cells in the contralateral hippocampus via the Associatkm al Commissural pathway (AC). CA1 neurons also receive input directly from the Perforant Path and send axons to the Sulbicuhum (Sb). These neuron in turn send the main hippocampal output back to the EC, forming a loop. Εικ.8 Συνδέσεις του ιπποκάμπου - Τρισυναπτικό κύκλωμα (http://www.bris.ac.uk/depts/svnaptic/info/pathwav/himpocampal.htm) 13

Προσαγωγές ίνες του ιπποκάμπου Η κύρια είσοδος πληροφοριών στον ιππόκαμπο γίνεται με την οδό των διατιτραινουσών ινών (Εικ. 8) οι οποίες προέρχονται από τον ενδορινικό φλοιό. Ο ενδορινικός φλοιός δέχεται ίνες από διάφορες περιοχές του φλοιού του εγκεφάλου όπως τον προαπιοειδή φλοιό, το μετωπιαίο φλοιό και την κάτω μοίρα του κροταφικού φλοιού, αλλά και από υποφλοιώδεις περιοχές όπως τον πρόσθιο πυρήνα του θαλάμου και το αμυγδαλοειδές σώμα. Ίνες που εκφύονται από την έλικα του προσαγώγιου φθάνουν στον ενδορινικό φλοιό μέσω του προσαγώγιου. Στον ιππόκαμπο καταλήγουν και νευρικές ίνες προερχόμενες από την περικοιλιακή και έξω περιοχή του ιπποκάμπου και από τον υπερμάστιο πυρήνα. Εκτός από την οδό των διατιτραινουσών ινών, πηγή εισόδου πληροφοριών στον ιππόκαμπο αποτελεί και η ψαλίδα. Η ψαλίδα είναι μία συμπαγής δεσμίδα που συνδέει τον ιππόκαμπο με τον υποθάλαμο και άλλα μορφώματα. Οι ίνες της σχηματίζουν αρχικά τη σκάφη του ιπποκάμπου, δηλαδή τη λεπτή λευκή στιβάδα της κοιλιακής επιφάνειας του αμμωνίου κέρατος και στη συνέχεια συγκλίνουν κατά μήκος της έσω επιφάνειας του ιπποκάμπου για να σχηματίσουν την παρυφή του ιπποκάμπου. Στην πορεία τους προς τα πίσω και άνω οι ίνες της παρυφής του ιπποκάμπου ενώνονται με το οπίσθιο σκέλος της ψαλίδας (Kandel et al., 1999). Η ψαλίδα αποτελεί την κύρια υποφλοιώδη είσοδο πληροφοριών του ιπποκάμπου και περιλαμβάνει νευρικές ίνες του διαφραγματο-ιπποκάμπειου μονοπατιού, το οποίο ξεκινά από τους χολινεργικούς νευρώνες του μέσου διαφράγματος, νοραδρενεργικές ίνες προερχόμενες από τον υπομέλανα τόπο και σεροτονεργικές ίνες από τους πυρήνες της ραφής. Συγκεκριμένα, μονοαμινεργικές ίνες καταλήγουν στον ιππόκαμπο προερχόμενες από το μεσοσκελιαίο πυρήνα, τον άνω κεντρικό πυρήνα της ραφής, το ραχιαίο πυρήνα της ραφής, το ραχιαίο πυρήνα της καλύπτρας και τον υπομέλανα τόπο (Nieuwenhuys et al., 1983). Επίσης, η ψαλίδα περιέχει και ίνες οι οποίες συνδέουν την ιπποκάμπεια έλικα με τον επικλινή πυρήνα του διαφράγματος. Αξίζει να σημειωθεί ότι βλάβη της ψαλίδας οδηγεί σε εξασθένηση των διαδικασιών της μάθησης και της μνήμης, η οποία προσομοιάζει με αυτή που προκύπτει μετά από βλάβη του ίδιου του ιππόκαμπου (Kandel et al, 1999). Απαγωγές ίνες του ιπποκάμπου Η οδός από τη CA1 περιοχή του ιπποκάμπου στο υπόθεμα του ιπποκάμπου και από εκεί στον ενδορινικό φλοιό αποτελεί την κύρια έξοδο πληροφοριών από τον 14

ιππόκαμπο. Ένα τμήμα των απαγωγών ινών του ιπποκάμπου ξεκινά από το υπόθεμα αυτού και οδεύει, όπως ήδη αναφέρθηκε, προς την ψαλίδα. Αυτές, σε σχέση με τον πρόσθιο σύνδεσμο, διακρίνονται σε ίνες της προσυνδεσμικής και σε ίνες της μετασυνδεσμικής ψαλίδας. Οι πρώτες καταλήγουν στο διάφραγμα, τον έσω μετωπιαίο φλοιό, την ευθεία έλικα (gyrus rectus), και τον πρόσθιο οσφρητικό πυρήνα, ενώ οι δεύτερες στον θάλαμο, υποθάλαμο και τα μαστία. Τέλος, κάποιες ίνες του αμμωνίου κέρατος προβάλουν απευθείας στον έξω πυρήνα του διαφράγματος (Nieuwenhuys et al., 1983). Συνοπτικά, to μονοπάτι περιγράφεται στην εικόνα 9 και ακολουθεί την παρακάτω πορεία: η πληροφορία από τον ενδορινικό φλοιό μεταφέρεται στην οδοντωτή έλικα, από εκεί στην CA3 περιοχή και τελικά καταλήγει στην CA1 περιοχή. Από εκεί μέσω του υποθέματος του ιπποκάμπου επιστρέφει στον ενδορινικό φλοιό. Τέλος, είσοδος πληροφοριών μπορεί να γίνει απευθείας σε κάθε περιοχή, ενώ έξοδος πληροφοριών γίνεται από την CA1 περιοχή και το υπόθεμα. Εικ. 9 Διασυνδέσεις του ιπποκάμπου (Joe Z. Tsien, et al 2000). 15

1.5 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ Μνήμη-Μάθηση Η διαδικασία της μνήμης (συγκράτησης εμπειριών) γίνεται σε τρία στάδια: κωδικοποίηση, αποθήκευση, ανάκληση. Κατά την κωδικοποίηση οι πληροφορίες που εισέρχονται στη μνήμη πρέπει να κωδικοποιηθούν με τέτοιο τρόπο ώστε το μνημονικό σύστημα να μπορεί να τις αποδέχεται και να τις χρησιμοποιεί (νοητικές αναπαραστάσεις των φυσικών ερεθισμάτων). Το στάδιο αυτό συμβαίνει στο φλοιό του εγκεφάλου. Στο στάδιο της αποθήκευσης γίνεται η διατήρηση των πληροφοριών για μεγάλο χρονικό διάστημα (Τέγος Σ., Νευρογένεση 2002-2003). Οι πληροφορίες φτάνουν στον εγκέφαλο, επεξεργάζονται και κωδικοποιούνται σε μια αποθήκη βραχύχρονης μνήμης. Η αποθήκη αυτή έχει περιορισμένη χωρητικότητα και όταν δεν γίνεται επανάληψη, η μνήμη αυτή διατηρείται μόνο μερικά λεπτά. Αργότερα οι πληροφορίες μετασχηματίζονται μέσα σε μια μεγαλύτερης διάρκειας μακρόχρονη αποθήκη («θεωρεία των δύο λειτουργιών») (Atkinson and Siffrin, 1968). Τέλος, κατά το στάδιο της ανάκλησης, ανασύρονται οι πληροφορίες που είναι αποθηκευμένες στη μνήμη και επαναφέρονται στη συνείδηση (Βοσνιάδου Σ., 2001). Η μνήμη μακράς διάρκειας χωρίζεται σε Έκδηλη (explicit) και Άδηλη (implicit) (Tulving and Markowitsch, 1998) ή σε declarative και non declarative ( Cohen and Eichenbaum, 1993). Η έκδηλη μνήμη, παρέχει πληροφορίες για το περιβάλλον και τον ^ zio, ενώ με την άδηλη μνήμη αποκτούμε κινητικές ή αντιληπτικές ικανότητες που ωστόσο είναι απρόσιτες στη συνείδηση. Η έκδηλη μνήμη υποδιαιρείται περαιτέρω σε μνήμη που αφορά αυτοβιογραφικά γεγονότα ή επεισοδιακή μνήμη (Episodic) και σε μνήμη που αφορά τεκμηριωμένη γνώση ή σημασιολογική μνήμη (Semantic) (Tulving and Markowitsch, 1998). Η μνήμη που αφορά αυτοβιογραφικά γεγονότα είναι το μοναδικό είδος μνήμης που τη στιγμή της ανάκλησης είναι προσανατολισμένη προς το παρελθόν (Eldridge et al., 2000). Στη σημασιολογική μνήμη κυριαρχεί η γενικευμένη γνώση του κόσμου για τα πράγματα, η τεκμηριωμένη γνώση (Tulving and Markowitsch, 1998). Η πιο γνωστή και ευρέως αποδεκτή λειτουργία του ιπποκάμπου σχετίζεται με τη μνήμη και κατά συνέπεια τη μάθηση. Είναι πλέον γνωστό ότι βλάβη σε περιοχές του ιπποκάμπειου σχηματισμού σχετίζονται με την ανάπτυξη αμνησιακού συνδρόμου που χαρακτηρίζεται από ολική ή σχεδόν ολική πρόδρομη αμνησία, δηλαδή αδυναμία ανάπτυξης μνήμης για γεγονότα που τοποθετούνται χρονικά μετά το συμβάν που 16

προκάλεσε τη βλάβη. Συχνά όμως η πρόδρομη αμνησία συνοδεύεται και από παλίνδρομη αμνησία δηλαδή απώλεια μνήμης για γεγονότα που συνέβησαν πριν την πρόκληση βλάβης. Μάλιστα, μνήμες που αφορούν γεγονότα που χρονικά κατατάσσονται πλησιέστερα με τη στιγμή της βλάβης επηρεάζονται σε μεγαλύτερο βαθμό (Anagnostaras et al., 2001). Αρχικά η συμμετοχή που αποδόθηκε στον ιππόκαμπο όσον αφορά την δημιουργία γεγονότων μνήμης εντοπίστηκε στη δυνατότητα εδραίωσης της μνήμης. Θεωρήθηκε ότι ο ιππόκαμπος λειτουργεί ως ένας παροδικός χώρος αποθήκευσης της μακρόχρονης μνήμης προτού αυτή αποθηκευτεί μόνιμα σε κάποια άλλη περιοχή του εγκεφαλικού φλοιού. Για παράδειγμα αισθητικές πληροφορίες απαραίτητες για την αναγνώριση κάποιου προσώπου μεταφέρονται στον ιππόκαμπο όπου υφίστανται επεξεργασία για χρονικό διάστημα ημερών ή εβδομάδων και εν συνεχεία μεταφέρονται, ενδεχομένως, στην περιοχή του οπτικού φλοιού που σχετίζεται με την αναγνώριση προσώπων. Εναλλακτικά, θεωρήθηκε ότι η λειτουργία του ιπποκάμπου μπορεί να είναι πιο απλουστευμένη χρησιμεύοντας όχι για την επεξεργασία της μακρόχρονης μνήμης αλλά σαν ένας χώρος προσωρινής αποθήκευσης γενικευμένων πληροφοριών προτού την μεταφορά τους προς αποθήκευση σε κάποιο άλλο τμήμα του εγκεφάλου (Principals of Neural Science, 1992). Θεωρείται πλέον ότι ο ιππόκαμπος συμμετέχει και στο σχηματισμό της μνήμης που σχετίζεται με αυτοβιογραφικά γεγονότα, βλάβες στον ιπποκάμπειο σχηματισμό έχουν ως αποτέλεσμα την απώλεια της έκδηλης μνήμης. Ο ιππόκαμπος δηλαδή θεωρείται η δομή η οποία είναι υπεύθυνη για τη συνειδητή μάθηση, αλλά δε σχετίζεται με την άδηλη μνήμη (Kandel et al.,1997). Ωστόσο, η συμμετοχή του ιπποκάμπου στη λειτουργία της μνήμης δεν περιορίζεται πλέον μόνο στα ανωτέρω αναφερθέντα στοιχεία. Η απόπειρα θεραπείας της επιληψίας με αμφοτερόπλευρη αφαίρεση του ιπποκάμπου στον άνθρωπο (Scoville and Milner, 1957), είχε ως αποτέλεσμα σημαντική διαταραχή της μνημονικής λειτουργίας: οι παλιές μνήμες παρέμειναν ενώ οι πρόσφατες παραστάσεις διατηρούνταν μόνο για λίγα λεπτά. Παρομοίως, σε μελέτες που έγιναν σε ασθενείς με βλάβες στον ιπποκάμπειο σχηματισμό, δεν παρατηρούνταν προβλήματα όταν η ανάκληση της μνήμης γινόταν με μικρή καθυστέρηση από την καταγραφή της, ενώ, όταν η ανάκληση της μνήμης γινόταν με μεγάλη καθυστέρηση από το χρόνο της καταγραφής της, εμφανίζονταν απώλεια μνήμης, όπως και αδυναμία προσανατολισμού στο χώρο (Milner, 1965). Σε σχετικές μελέτες που έγιναν σε αρουραίους παρατηρήθηκε πως τραυματισμός του ιπποκάμπου είχε σαν αποτέλεσμα απώλεια της χωριακής μνήμης, με ταυτόχρονη 17

μείωση του αριθμού των νευρώνων και παρουσία ευρημάτων τα οποία παρέπεμπαν σε σκλήρυνση του ιπποκάμπου (K ^oski et al., 2002). Stress Ο ιππόκαμπος είναι μια σημαντική περιοχή του εγκεφάλου για τη ρύθμιση του stress. Συμμετέχει στη ρύθμιση του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος στη νευροτοξική δράση των αυξημένων επιπέδων των γλυκοκορτοκοειδών μετά από επαναλαμβανόμενα γεγονότα που προκαλούν stress (Sapolski, 2000). Μάλιστα, μετά από έρευνες σε πειραματόζωα βρέθηκε ότι έκθεση σε στρεσογόνες καταστάσεις είχε ως αποτέλεσμα την πρόκληση καταστροφών σε νευρώνες του ιπποκάμπου (Sapolski, 1996). Προκλινικές μελέτες έδειξαν ότι τα ιδιαίτερα αυξημένα επίπεδα του stress ή έκθεση του ιπποκάμπου σε γλυκοκορτικοειδή μπορούν να προκαλέσουν βλάβες στον ιππόκαμπο δεδομένου του μεγάλου αριθμού υποδοχέων κορτικοστεροειδών σε αυτόν (Sapolsky, 2000). Έρευνες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι κάτω από συνθήκες stress προέκυπταν δομικές αλλαγές σε νευρώνες του ιπποκάμπου. Αναδιάρθωση των νευρώνων (Wooley et al., 1990), ατροφία του κορυφαίου δενδρίτη (Magarinos et al.,1996), δομικές αλλαγές των συναπτικών απολήξεων (Magarinos et al., 1997), ή και καταστροφή νευρώνων (Mizoguchi, 1992). Σχιζοφρένεια Ένας μεγάλος αριθμός μελετών όπου χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές ερευνητικές προσεγγίσεις συγκλίνουν στο συμπέρασμα ότι ο ιππόκαμπος διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της σχιζοφρένειας. Μελέτες μαγνητικής τοπογραφίας (MRI) κατέδειξαν ελάττωση του μεγέθους (Wright et al., 2000) και αλλαγές στο σχήμα (Csernasky, 2002) του ιπποκάμπου. Μάλιστα, ελαττωμένος όγκος ιπποκάμπου παρατηρήθηκε και σε πρόδρομες περιπτώσεις αλλά και σε ασθενείς σε αρχικό στάδιο εμφάνισης σχιζοφρένειας δείχνοντας ότι η εμπλοκή του ιπποκάμπου δεν είναι δευτερεύουσας σημασίας στην εξέλιξη της νόσου (Joyal et al., 2002). 18

Alzheimer Δεδομένης της συμμετοχής του ιπποκάμπου στις λειτουργίες της μνήμης και μάθησης η επίδραση της νόσου του Alzheimer στον δομή αυτή του στεφανιαίου συστήματος είναι σημαντική. Η περιοχή της οδοντωτής έλικας του ιπποκάμπου είναι από τις πρώτες που επηρεάζονται από αυτή την ασθένεια αφού παρατηρείται σχηματισμός ενός μεγάλου αριθμού νευροϊνιδιακών μορφωμάτων που καθιστούν τα νευρικά κύτταρα δυσλειτουργικά (Hyman et al., 1986). Επιπλέον, σε ιστό ασθενών με Alzheimer, βρέθηκε ελάττωση κατά 21% του αριθμού των συνάψεων στην μοριώδη στοιβάδα της οδοντωτής έλικας σε σχέση με τμήματα ιστού από άτομα που δεν είχαν εμφανίσει την ασθένεια (Scheff et al., 1993). 1.6 ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΡΑΧΙΑΙΟΥ-ΚΟΙΛΙΑΚΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ Διάφορες μελέτες έχουν γίνει κατά τον επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου και όσο αφορά στη λειτουργία του έχουν περιγραφεί τα παρακάτω τρία μοντέλα (Small et al., 2002). Σύμφωνα με το πρώτο ο ιππόκαμπος αποτελείται από έναν αριθμό παράλληλων και λειτουργικά ανεξάρτητων εγκάρσιων κυκλωμάτων όπου δεν συμπεριλαμβάνεται η σύνδεση μεταξύ των στιβάδων και έτσι ο επιμήκης άξονας δε θεωρείται ως κύκλωμα. Στο δεύτερο μοντέλο ολόκληρος ο ιππόκαμπος αποτελεί ένα απλό εγκάρσιο κύκλωμα ανεξάρτητα από το σημείο εισόδου της πληροφορίας αφού αυτή θα μεταδοθεί ακολούθως κατά τον επιμήκη του άξονα. Στο τρίτο μοντέλο το οποίο θεωρείται και το πιο αποδεκτό σήμερα, ο ιππόκαμπος αποτελείται από διαδοχικές λειτουργικά περιοχές οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους. Κατά μήκος του διαφραγματικού-κροταφικού επιπέδου του ιππόκαμπου το ενδογενές πρότυπο σύνδεσης παραμένει το ίδιο όμως οι απαγωγές και οι προσαγωγές συνδέσεις από και προς τον ιππόκαμπο μεταβάλλονται. Αυτό υποδηλώνει ότι το διαφραγματικό (ραχιαίο) και το κροταφικό (κοιλιακό) τμήμα του ιππόκαμπου μπορεί να είναι υπεύθυνα για διαφορετικές λειτουργίες. Σε ανατομικό επίπεδο: Διαφορές στη συνδεσμολογία Έρευνες σχετικά με την τοπογραφική οργάνωση των συνδέσεων μεταξύ του ενδορινικού φλοιού και της οδοντωτής έλικας κατέδειξαν ότι ο πλευρικός ενδορινικός 19

φλοιός νευρώνει το ραχιαίο τμήμα της οδοντωτής έλικας, ο ενδιάμεσος ενδορινικός φλοιός νευρώνει το παρακείμενο τμήμα της οδοντωτής έλικας και τέλος ο διάμεσος ενδορινικός φλοιός το κοιλιακό τμήμα της οδοντωτής έλικας. Σημειώνεται ότι κάθε μια από τις προαναφερθείσες περιοχές του ιπποκάμπου δέχονται διαμέσου του περιρινικού και μεταρινικού φλοιού ξεχωριστές ομάδες προσαγωγών νευρικών ινών από διάφορες φλοιώδεις και υποφλοιώδεις περιοχές. Πληροφορίες προερχόμενες από τον αισθητικό φλοιό διοχετεύονται κυρίως στον πλευρικό και ενδιάμεσο ενδορινικό φλοιό (Dolorfo and Amaral, 1998). Μόνο οσφρητικές πληροφορίες φαίνεται να κατανέμονται εξίσου και στις τρεις περιοχές του ενδορινικού φλοιού (Kosel et al., 1981). Η τοπογραφική οργάνωση που προαναφέρθηκε ισχύει και για τις απαγωγές νευρικές ίνες. Νευράξονες που εκβάλλουν από την κοιλιακή και ραχιαία CA1 περιοχή του ιπποκάμπου, καθώς και από το υπόθεμα, καταλήγουν στην διάμεση και πλευρική περιοχή του ενδορινικού φλοιού, αντίστοιχα (Van Groen and Wyss, 1990). Από το σημείο αυτό διαμέσου του περιρινικού φλοιού η πληροφορία καταλήγει σε περιοχές του αισθητικού φλοιού από όπου και ξεκίνησε (Insausti, 1997). Επιπλέον, τοπογραφική διάταξη ακολουθούν και οι συνδέσεις του ιπποκάμπου με υποφλοιώδεις περιοχές. Η ραχιαία, ενδιάμεση και κοιλιακή περιοχή του ιπποκάμπου προβάλλουν σε διαφορετικές υποπεριοχές του πλευρικού διαφράγματος. Κάθε μια από αυτές τις υποπεριοχές νευρώνουν διαφορετικές περιοχές του υποθαλάμου (Risold and Swanson, 1997). Αντίστοιχη τοπογραφική διάταξη ισχύει και για τις συνδέσεις μεταξύ του ενδορινικού φλοιού και του αμυγδαλοειδούς σώματος. Η πλευρική περιοχή του αμυγδαλοειδούς σώματος συνδέεται αμφίδρομα με την πλευρική περιοχή του ενδορινικού φλοιού, ενώ περιοχές της αμυγδαλής που συνδέονται στενότερα με περιοχές του υποθαλάμου και οσφρητικές περιοχές (φλοιώδης, διάμεσος και κεντρικός πυρήνας του αμυγδαλοειδούς σώματος) νευρώνουν τον διάμεσο ενδορινικό φλοιό. Τέλος, θα πρέπει να αναφερθεί ότι υπάρχει και άμεση σύνδεση της αμυγδαλής με τον κοιλιακό ιππόκαμπο (Van Groen and Wyss, 1990). Όσον αφορά το τοπικό κύκλωμα του ιπποκάμπου έχει αναφερθεί ότι η σύσταση των ενδονευρώνων του ραχιαίου ιπποκάμπου διαφέρει από αυτή του κοιλιακού. Η επίπτωση της διαφορετικότητας αυτής στην ηλεκτροφυσιολογική συμπεριφορά και διεγερσιμότητα των δύο περιοχών του ιπποκάμπου δεν έχει μέχρι στιγμής αξιολογηθεί (Nomura et al., 1997). 20

Διαφορές στην νευρωνική διαμόρφωση Οι παραπάνω πληροφορίες δείχνουν ότι το ραχιαίο και το κοιλιακό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού διαφέρουν ως προς τις εισόδους και τις εξόδους τους. Επιπλέον, διαφορές υπάρχουν και στην νευρωνική διαμόρφωση των δικτύων μέσα στον διαφραγματικό και τον κροταφικό ιππόκαμπο οι οποίες υποστηρίζονται και από ηλεκτροφυσιολογικά ευρήματα. Για παράδειγμα, ηλεκτροφυσιολογική μελέτη στη CA1 περιοχή του εγκεφάλου πειραματοζώων που είχαν υποστεί γενικευμένη ισχαιμία κατέδειξε τον κοιλιακό ιππόκαμπο περισσότερο ανθεκτικό στις προκαλούμενες κυτταρικές αλλαγές (Ashton et al., 1986). Τα δυναμικά πεδίου στην κοιλιακή, αλλά όχι στη ραχιαία CA1 περιοχή εκδηλώνουν συνήθως πολλαπλές πληθυσμιακές αιχμές (multiple population spikes) (Gilbert et al., 1985) και ο ουδός για επιληπτικές εκπολώσεις είναι χαμηλότερος στο κοιλιακό τμήμα απ ότι στο ραχιαίο της CA1 περιοχής (Racine et al., 1977). Επιπρόσθετα, σε in vitro έρευνα τομών ιπποκάμπου στις οποίες η αναστολή είχε αρθεί, βρέθηκε ότι ο κοιλιακός ιππόκαμπος εμφανίζει αυξημένη ευαισθησία στην ανάπτυξη επιληπτοειδών εκφορτίσεων σε σχέση με τον ραχιαίο (Borck et al., 1999). Προς την ίδια κατεύθυνση τείνουν και τα ευρήματα μελέτης σε πειραματόζωα που υποβλήθηκαν σε ηλεκτρικό ερεθισμό νευρώνων. Με βάση κλίμακα μέτρησης της έντασης των προκαλούμενων κρίσεων βρέθηκε ότι ο ηλεκτρικός ερεθισμός της κοιλιακής περιοχής του ιπποκάμπου προκαλεί σημαντικά περισσότερο έντονες κρίσεις απ ότι ο ραχιαίος ιππόκαμπος (Becker et al., 1997). Επιπλέον, μετά από διέγερση των παράπλευρων ινών του Schaffer και ενδοκυττάρια καταγραφή από πυραμιδικούς νευρώνες της CA1 περιοχής, ο ραχιαίος ιππόκαμπος βρέθηκε να παρουσιάζει μεγαλύτερα επίπεδα μετασυναπτικής αναστολής σε σχέση με τον κοιλιακό (Papatheodoropoulsos et al., 2002). Τέλος, μετά την εφαρμογή κατάλληλου πρωτοκόλλου για την πρόκληση μετασυναπτικής ενδυνάμωσης στην CA1 περιοχή του ιπποκάμπου, ο βαθμός της μετασυναπτικής ενδυνάμωσης βρέθηκε αυξημένος στον ραχιαίο ιππόκαμπο (Papatheodoropoulos and Kostopoulos, 2000, Maruki et al., 2001). Συνεπώς, τα νευρωνικά δίκτυα στον ραχιαίο και τον κοιλιακό ιππόκαμπο φαίνεται να διαφέρουν αρκετά, υποδηλώνοντας ότι τα τμήματα αυτά δεν χρησιμοποιούν απαραίτητα τις ίδιες διαδικασίες στην κωδικοποίηση της εισερχόμενης πληροφορίας. 21

Διαφορές σε ανώτερες γνωστικές λειτουργίες: Οι δυο πόλοι του ιπποκάμπου έχει δειχθεί ότι εκτός από τις συνδέσεις διαφέρουν και σε ανώτερες γνωστικές λειτουργίες όπως η μνήμη η μάθηση. Στους επίμυες έχει δειχθεί ότι ο ραχιαίος ιππόκαμπος παίζει σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες της χωρικής μάθησης (Moser and Moser, 1998), ενώ ο κοιλιακός στην αντίληψη της εσωτερικής κατάστασης του ζώου και τις συναισθηματικές διεργασίες όπως φόβος και άγχος (Hock and Bunsey, 1998). Ζώα τα οποία παρουσίαζαν βλάβες στον ραχιαίο ιππόκαμπο εμφάνιζαν διαταραχές κατά την δοκιμασία του λαβυρίνθου, ενώ όταν οι βλάβες γινόταν στον κοιλιακό ιππόκαμπο δεν υπήρχε διαταραχή στη μάθηση (Hughes, 1965: Sinnomon, 1978). Επίσης σε φυλογενετικές μελέτες έχει δειχθεί ότι τα είδη που χρειάζεται να έχουν μεγάλη ικανότητα χωρικής μνήμης (π.χ πτηνά) έχουν περισσότερο ανεπτυγμένο τον ραχαίο ιππόκαμπο (Clayton, 1995). Στον άνθρωπο έχει παρατηρηθεί ότι ο πρόσθιος ιππόκαμπος είναι μεγαλύτερος σε σχέση με τον οπίσθιο ιππόκαμπο σε αυτοκινητιστές του Λονδίνου με το ποσοστό αύξησης να μεγαλώνει ανάλογα με τα έτη που ασκούσαν αυτό το επάγγελμα (Maguire et al., 2000). Επιπροσθέτως, ο κοιλιακός ιππόκαμπος, βάσει της διαφορετικής του συνδεσμολογίας και ιδιαίτερα με την περιοχή του αμυγδαλοειδούς πυρήνα, θεωρείται υπεύθυνος για την ανάπτυξη μνήμης αποστροφής όπως προκύπτει από συμπεριφορικές μελέτες όπως πειράματα παθητικής αποφυγής (passive avoidance response) (Lorenzini et al., 1997). Επιπλέον, ο κοιλιακός ιππόκαμπος λόγω των συνδέσεων του με περιοχές του υποθαλάμου, ενέχεται στην ρύθμιση του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων που ενεργοποιείται από διάφορα περιβαλλοντικά ερεθίσματα (Moser and Moser., 1998). Έρευνες σε πρωτεύοντα ενισχύουν την χρησιμότητα του οπίσθιου (ραχιαίου) ιπποκάμπου στην επεξεργασία πληροφοριών σχετικά με το χώρο, ενώ αποδίδουν στον πρόσθιο (κοιλιακό) συμμετοχή στον καθορισμό ή την απομνημόνευση κινήσεων στο χώρο (Colombo et al., 1998). 22

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: y-αμινοβουτυρικο ΟΞΥ (GABA) ΚΑΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΟΥ 2.1 GABA Η ισορροπία μεταξύ διέγερσης και αναστολής στο ώριμο νευρικό σύστημα διατηρείται, από τη μια μεριά, χάρη στον διεγερτικό νευροδιαβιβαστή L- γλουταμικό οξύ, ο οποίος δρα σε AMPA, NMDA, kainate και μεταβοτροπικούς γλουταμινικούς υποδοχείς. Ενώ από την αντίθετη μεριά, η ισορροπία διατηρείται χάρη στον ανασταλτικό νευροδιαβιβαστή γ-αμινοβουτυρικό οξύ ή GABA, το οποίο δρα σε GABAa, GABAb και GABAC υποδοχείς (Tretter and Moss, 2008). To GABA είναι ο κύριος ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) των θηλαστικών. Είναι ένα αλειφατικό αμινοξύ και εντοπίζεται περίπου στο 40% όλων των κεντρικών νευρικών συνάψεων (Sieghart, 1989). Μαζί με τη γλυκίνη ευθύνεται για την πλειονότητα της ανασταλτικής νευροδιαβίβασης του ΚΝΣ. Όπως προαναφέρθηκε, σε όλες τις στιβάδες του ιπποκάμπου υπάρχουν ανασταλτικοί νευρώνες, οι ενδονευρώνες, που εκλύουν GABA. Αυτοί αποτελούν το 10-20% των νευρώνων του ιπποκάμπου (Svoboda et al, 1999). Το GABA συντίθεται στον εγκέφαλο από το γλουταμινικό οξύ με αποκαρβοξυλίωση, με τη βοήθεια της δράσης του ενζύμου αποκαρβοξυλάση του γλουταμινικού οξέος (γ-amino-decarboxylase, GAD). Η GAD είναι ένα κυτταροπλασματικό ένζυμο το οποίο εντοπίζεται στους νευρώνες και για τη λειτουργία του είναι απαραίτητο το συνένζυμο φωσφορική πυριδοξάλη (Arregui and Barer, 1980). Με τον τρόπο αυτό ο κύριος διεγερτικός νευροδιαβιβαστής (γλουταμικό) μετατρέπεται στον κύριο ανασταλτικό νευροδιαβαστή του ΚΝΣ (Εικ.10). 23

Εικ. 10 Σύνθεση του GABA από γλουταμινικό οξύ, με τη δράση του ένζυμου GAD. (http://herkules.oulu.fi/isbn9514267672/html/i43346.html) Το GABA απελευθερώνεται στη συναπτική σχισμή και ασκεί τη δράση του συνδεόμενο με υποδοχείς που βρίσκονται είτε στην προσυναπτική είτε στην μετασυναπτική κυτταρική μεμβράνη, προκαλώντας ανασταλτικά μετασυναπτικά δυναμικά, ενώ στη συνέχεια απομακρύνεται με ένα ειδικό σύστημα επαναπρόσληψης που εξαρτάται από τα ιόντα Na+, την θερμοκρασία καθώς και την κατανάλωση ενέργειας. Πράγματι, μελέτες έχουν δείξει ότι το GABA επαναπροσλαμβάνεται τόσο από τους νευρώνες όσο και από τα κύτταρα της γλοίας (Schousboe and Waagepetersen 2006). 2.2 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ GABA Οι υποδοχείς GABA χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: GABAa, GABAb, και GABAC. Οι GABAa και GABAC ανήκουν στην κατηγορία των ιοντοτρόπων υποδοχέων, δηλαδή στους υποδοχείς που είναι οι ίδιοι τους δίαυλοι ιόντων. Οι ιοντοτρόποι υποδοχείς με τη σύνδεση του νευροδιαβιβαστή επιτρέπουν τη μεταφορά φορτισμένων ιόντων διαμέσου διαύλου που σχηματίζεται από το σύμπλεγμα του υποδοχέα (Principles of Medicinal Chemistry, 1995). Οι υποδοχείς GABAb ανήκουν 24

στην κατηγορία των μεταβοτρόπων υποδοχέων. Είναι συζευγμένοι με διαύλους ιόντων ασβεστίου ή καλίου μέσω συγκεκριμένων G-πρωτεϊνών και ενεργοποιούν συστήματα δευτέρων αγγελιοφόρων μηνυμάτων μέσα στο νευρώνα (Bormann, 1988: Bowery et al., 1990) (Εικ. 11). Εικ. 11 GABAεργική σύναψη ('http://www.pharma.uzh.ch/research/neuropharmacolosv/researchareas/sisnaltransduction/intr oduction.html) Οι GABAa υποδοχείς αποτελούν χημειοελεγχόμενους διαύλους ιόντων χλωρίου (Bormann, 1988: Sivilotti and Nistri, 1991) και ανήκουν στην υπεροικογένεια των ιοντικών διαύλων στην οποία επίσης ανήκει ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης (Boulter et al., 1987). Ενεργοποιούνται από το GABA και τους αγωνιστές μουσκιμόλη, προγκαμπίνη, και ισογκουβακίνη, ενώ αναστέλλονται από τους ανταγωνιστές μπικουκουλίνη, γκαμπαζίνη και (+)-βυδραστίνη (Wermuth and Bizhre, 1987). Είναι πενταμερή συμπλέγματα διαμεμβρανικών υπομονάδων διατεταγμένα σε σχήμα δακτυλιδιού, στο μέσο του οποίου δημιουργείται ένας πόρος. Υπάρχουν 19 διαφορετικά γονίδια υπομονάδων και επιπλέον κάποια από αυτά υφίστανται τη διαδικασία εναλλακτικού ματίσματος κωδικοποιώντας έτσι για περισσότερες της μιας υπομονάδας. Παρά την πληθώρα των υπομονάδων όμως, περιορισμένος συνδυασμός αυτών, πιστεύεται ότι εκφράζεται in 25

vivo. Η πιο συχνά εκφραζόμενη ισομορφή των GABAA υποδοχέων στον ανθρώπινο εγκέφαλο αποτελείται από 2α, 2β και 1γ υπομονάδες (Εικ. 11). Εικ. 11 Σχηματική αναπαρασταση υπομονάδων GABAA υποδοχέα και θεσεις πρόσδεσηςστόχοι σημαντικών φαρμάκων σε αυτόν. (http://www.niaaa.nih.sov/resources/graphicsgallery/neuroscience/pases/saba receptor.aspx) Οι GABAA υποδοχείς θεωρούνται πολύ σημαντικοί υποδοχείς διότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της διεγερσιμότητας του εγκεφάλου και πολλά σημαντικά φάρμακα όπως οι βενζοδιαζεπίνες, τα βαρβιτουρικά, τα νευροστεροειδή, η αιθανόλη, αλλά και κάποια αντιεπιληπτικά και γενικά πτητικά αναισθητικά αλληλεπιδρούν με αυτούς τους υποδοχείς (http://en.wikipedia.org/wiki/gaba A receptor). Η δέσμευση του GABA στον GABAA υποδοχέα έχει ως αποτέλεσμα τη διάνοιξή του διαύλου του και την είσοδο ιόντων χλωρίου καθώς η συγκέντρωσή τους είναι υψηλότερη στο εξωκυττάριο χώρο. Ενώ η χημική κλίση των ιόντων χλωρίου είναι προς το εσωτερικό του κυττάρου, η ηλεκτρική κλίση είναι αντίθετη, λόγω της αρνητικής φόρτισης στην ενδοκυττάρια πλευρά της κυτταροπλασματικής μεμβράνης του κυττάρου. Όταν δεσμευτεί το GABA στους GABAA υποδοχείς, το δυναμικό ηρεμίας των νευρώνων διαταράσσεται λόγω του ιοντικού ρεύματος χλωρίου προς το εσωτερικό του κυττάρου, κάτι που οφείλεται στην υπεροχή της χημικής έναντι της ηλεκτρικής κλίσης του ιόντος, με αποτέλεσμα να δημιουργείται υπερπόλωση στον νευρώνα και μείωση της διεγερσιμότητάς του. 26

Ο GABAa υποδοχέας απευαισθητοποιείται όταν το GABA παραμείνει για μεγάλο χρονικό διάστημα προσδεμένο. Σε υψηλές συγκεντρώσεις του GABA η απευαισθητοποίηση συμβαίνει πιο γρήγορα σε σύγκριση με χαμηλότερες συγκεντρώσεις (Sieghart, 1995). Οι υποδοχείς GABAC είναι και αυτοί πενταμερή συμπλέγματα υπομονάδων γύρω από έναν κεντρικό πόρο. Συνδέονται με κανάλι ιόντων χλωρίου και ενεργοποιούνται από το GABA (Εικ.12) και άλλα βασικά δομικά ανάλογά του όπως το cis-4-αμινοκροτονικό οξύ (CACA), το οποίο δεν αναγνωρίζεται ούτε από τους GABAA ούτε από τους GABAB υποδοχείς, ενώ η δράση τους αναστέλλεται από το τετραυδροπυριδινο-4-μεθυλοφωσφονικό οξύ (ΤΡΜΡΑ) (Bormann and Feigenspan, 1995: Ragozzino et al., 1996). Οι GABAc υποδοχείς διακρίνονται από τους GABAa και GABAb λόγω του ότι δεν είναι ευαίσθητοι στην μπικουκουλίνη και στη μπακλοφένη (Feigenspan et al., 1993: Qian and Dowling, 1993: Wisden et al., 1996) και η λειτουργία τους δεν επηρεάζεται από τις βενζοδιαζεπίνες και τα βαρβιτουρικά. Εντοπίζονται κυρίως στον αμφιβληστροειδή χιτώνα του ματιού και συνίστανται από ρ-υπομονάδες. Η αγωγιμότητα του διαύλου των GABAC υποδοχέων για το χλώριο είναι μικρότερη και εμφανίζουν πιο αργή και παρατεταμένη απάντηση στη σύνδεση του GABA σε σύγκριση με τους GABAA υποδοχείς. (http://en.wikipedia.org/wiki/gabacreceptor) Εικ. 12 Δομή GABACυποδοχέα και υπομονάδων του. (http://webvision.med.utah.edu/book/part-v-phototransduction-in-rods-and-cones/sabacreceptors-in-the-vertebrate-retina/) Οι GABAB (μεταβολοτρόποι) υποδοχείς με τη μεσολάβηση G πρωτεϊνών και συστημάτων δεύτερων αγγελιοφόρων (μονοπάτι αδενυλικής κυκλάσης και φωσφολιπάσης Α2), ανοίγουν διαύλους καλίου, από όπου θετικά φορτισμένα ιόντα καλίου εξέρχονται από το κύτταρο, οδηγώντας το δυναμικό της μεμβράνης πιο κοντά 27

στο ισοδύναμο δυναμικό για το κάλιο, με αποτέλεσμα την υπερπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης. Οι GABAb υποδοχείς ελαττώνοντας την δραστηριότητα της αδενυλικής κυκλάσης, μειώνουν την αγωγιμότητα της κυτταρικής μεμβράνης στο ασβέστιο (Bormann, 1988: Bowery, 1993: Mott and Lewis, 1994). Επιπλέον, ενεργοποιούνται από το GABA και τον αγωνιστή μπακλοφένη ενώ η δράση τους αναστέλλεται από την σακλοφένη, και τη φακλοφένη (Seabrook et al., 1990). Υπάρχουν δύο υπότυποι των GABAB υποδοχέων, οι GABAB1 και οι GABAB2 (Bettler et al., 2004). Οι υπότυποι του GABAb υποδοχέα περιλαμβάνουν μια μεγάλη αμινοτελική περιοχή εξωκυτταρικά, παρόμοια με τις βακτηριακές πρωτεΐνες δέσμευσης αμινοξέων (O'Hara et al., 1993). Επιπλέον, έχουν 7 διαμεμβρανικά τμήματα και ένα ενδοκυτταρικό καρβοξυ-τελικό άκρο, το οποίο παίζει κρίσιμο ρόλο στο διμερισμό (Εικ. 13). Στην ίδια κατηγορία υποδοχέων ανήκουν και οι μεταβολοτρόποι υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος με τους οποίους οι GABAb υποδοχείς παρουσιάζουν 20% ομοιότητα, ενώ είναι κατά 45% παρόμοιοι (Couve et al., 2000). Εικ. 13 Δομή GABAb υποδοχέα και υπομονάδων του. (http://www.pharma. uzh. ch/research/neuropharmacolosv/researchareas/sisnaltransduction/intr oduction.html) 28

Σε αντίθεση με τους GABAa υποδοχείς, οι οποίοι διενεργούν τη γρήγορη φάση της αναστολής (Macdonald and Olsen, 1994), οι GABAb υποδοχείς ασκούν την αργή φάση της αναστολής και δεν επηρεάζεται από ανταγωνιστές του GABAa υποδοχέα (Hill and Bowery 1981; Mott and Lewis 1994). Οι GABAb υποδοχείς όταν ενεργοποιηθούν προκαλούν υπερπόλωση στον μετασυναπτικό νευρώνα καθώς και αναστολή της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή από την προσυναπτική απόληξη. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ΘΑΒΑεργική νευροβιαβίβαση στον ιππόκαμπο μπορεί να τροποποιηθεί από πολλούς παράγοντες μεταξύ των οποίων και τη χορήγηση οπιοειδών. Πράγματι, ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες υποδεικνύουν ότι η in vitro χορήγηση οπιοειδούς αναστέλλει την απελευθέρωση γ-αμινοβουτυρικού οξέος από τους ενδονευρώνες του ιπποκάμπου (Cohen et al., 1992: Madison et al., 1988: Nicoll et al., 1980). Άμεση συνέπεια αποτελεί η άρση της αναστολής που προκαλούν οι ενδονευρώνες στα πυραμιδικά κύτταρα του ιππόκαμπου με τελικό αποτέλεσμα την αυξημένη δραστηριότητα των πυραμιδικών νευρώνων (Svoboda et al., 1999). 29

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΟΠΙΟΕΙΛΗ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ 3.1 ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Όπιο ονομάζεται ο αποξηραμένος γαλακτώδης χυμός που προέρχεται από την κάψα του σπόρου ενός είδους παπαρούνας που ονομάζεται Papaver Somniferum (Μήκων η Υπνοφόρος) (Εικ. 14). Είναι ένα από τα αρχαιότερα φάρμακα που χρησιμοποίησε ο άνθρωπος, η καλλιέργειά του ξεκινά από την Νεολιθική εποχή. Οι Σουμέριοι, οι Ασσύριοι, οι Αιγύπτιοι, οι Έλληνες, οι Ρωμαίοι και οι Άραβες έκαναν εκτενή χρήση του οπίου που την εποχή εκείνη ήταν το πιο διαδεδομένο παυσίπονο, επιτρέποντας ακόμη την περάτωση μικρών εγχειρήσεων (http://en.wikipedia.org/wiki/opium). Εικ. 14 Το φυτό Papaver Somniferum (Μήκων η Υπνοφόρος) Το όπιο περιέχει 25 αλκαλοειδή από τα οποία τα σημαντικότερα είναι: μορφίνη, κωδεΐνη, παπαβερίνη και θηβαΐνη, τα οποία είναι τα φυσικά οπιοειδή. Οι οπιοειδείς ουσίες χωρίζονται σε τρείς μεγάλες κατηγορίες (Πίνακας 1): > Τα φυσικά αλκαλοειδή του οπίου (μορφίνη, κωδείνη, παπαβερίνη και θηβαίνη) > Τα ημισυνθετικά παράγωγα, τα οποία προκύπτουν από μικρές χημικές μεταβολές του βασικού χημικού τύπου της μορφίνης (ηρωίνη, υδρομορφίνη, οξυκωδόνη) 30

> Τα συνθετικά παράγωγα του οπίου (μεθαδόνη, προποξυφαίνη, μεπεριδίνη, πενταζοκίνη) Τα οπιοειδή φάρμακα χρησιμοποιούνται ως αναλγητικά για την αντιμετώπιση του οξέος και χρόνιου πόνου και αποτελούν μέρος της περιεγχειρητικής αγωγής. ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΟΠΙΟΕΙΑΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΦΥΣΙΚΑ ΟΠΙΟΕΙΑΗ ΗΜΙΣΥΝΘΕ ΤΙΚΑ ΟΠΙΟΕΙΑΗ ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΟΠΙΟΕΙΑΗ ΟΠΙΟΕΙΑΕΙΣ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ ΟΠΙΟ ΜΟΡΦΙΝΗ ΚΩΔΕΪΝΗ ΠΑΠΑΒΕΡΙΝΗ ΘΗΒΑΪΝΗ ΗΡΩΙΝΗ ΔΕΣΟΜΟΡΦΙΝΗ ΥΔΡΟΜΟΡΦΙΝΗ ΔΙΥΔΡΟΜΟΡΦΙΝΗ ΔΙΥΔΡΟΚΩΔΕΪΝΗ ΟΞΥΚΩΔΟΝΗ ΠΕΘΙΔΙΝΗ ΜΕΘΑΔΟΝΗ ΔΕΞΤΡΟΜΟΡΑΜΙΔΗ ΔΙΠΙΠΑΝΟΝΗ ΔΕΞΤΡΟΠΡΟΠΟΞΥΦΑΙΝΗ ΝΑΛΟΡΦΙΝΗ ΛΕΒΑΛΟΡΦΙΝΗ ΝΑΛΟΞΟΝΗ ΝΑΛΤΡΕΞΟΝΗ ΚΥΚΛΑΖΟΚΙΝΗ ΒΟΥΠΡΕΝΟΡΦΙΝΗ 1997) Πίνακας 1. Οπιοειδείς Ουσίες (Φαρμακολογικές Δράσεις Εξαρτησιογόνων Ουσιών, Ασπροδίνη, Υπάρχουν τρία είδη ενδογενών οπιοειδικών πεπτιδίων, αυτά προέρχονται από τα πρόδρομα μόρια της προοπιομελανοκορτινης (β-ενδορφίνες), της προεγκεφαλίνης (εγκεφαλίνες) και της προδυνορφίνης (δυνορφίνες και νεοενδορφίνες) (Cesselin, 1995). Δρουν είτε ως βραχείας δράσης νευρομεταβιβαστές είτε ως μακράς δράσης νευροορμόνες με αλληλεπικαλυπτόμενες δράσεις και έχουν αγωνιστική δράση στους οπιοειδείς υποδοχείς του νευρικού συστήματος. Παράγονται σε μεγαλύτερες ποσότητες σε καταστάσεις στρες ή πόνου, ενώ η χρόνια εξωγενής χορήγηση οπιοειδών ουσιών αντικαθιστά τα ενδογενή οπιοειδή και ελαττώνει τα επίπεδά τους. 31

Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση στερητικών συμπτωμάτων σε περίπτωση απότομης διακοπής των εξωγενών οπιοειδών (Φαρμακολογικές Δράσεις Εξαρτησιογόνων Ουσιών, Ασπροδίνη, 1997). Οι οπιοειδικοί υποδοχείς είναι οι στόχοι όπου δρουν τα οπιοειδή φάρμακα (με πιο γνωστούς εκπροσώπους τη μορφίνη, την πεθιδίνη και τη φεντανύλη), αλλά και τα ενδογενή οπιοειδικά πεπτίδια. Τρεις κύριες κατηγορίες, και ένας μικρότερης σημασίας, οπιοειδικών υποδοχέων έχουν ταυτοποιηθεί: οι μ-, οι κ-, οι δ-οπιοειδικοί υποδοχείς και ο OPRL1 (opioid receptor-like 1), (ή αντίστοιχα MOR, KOR, DOR και NOR), (Εικ. 15, 16). Οι παραπάνω υποδοχείς με μελέτες δέσμευσης εκλεκτικών ραδιοαναλόγων διακρίνονται περαιτέρω στους υπότυπους: μ1- και μ2-, δ1- και δ2-, κ1-4- και ORL1(Cesselin, 1995: Mollereau et al., 1994). Έχουν βρεθεί τρία μόνο γονίδια οπιοειδικών υποδοχέων, επομένως οι υπότυποι προέρχονται είτε από εναλλακτικό μάτισμα του mrna ή από διμερισμό των πρωτεϊνών του υποδοχέα (Cesselin, 1995). photo-riacllv* Εικ. 15 Τρισδιάστατη δομή ORL 1 υποδοχέα (http://www.jbc. org/content/2 75/38/29268.full) Εικ. 16 μ-, κ- και δ-οπιοειδικοί υποδοχείς Τα οπιοειδή πεπτίδια και οι οπιοειδικοί υποδοχείς διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στον έλεγχο συμπεριφορών ουσιαστικών για την επιβίωση του οργανισμού, όπως είναι η απάντηση σε επώδυνα ερεθίσματα και στρεσσογόνους παράγοντες. Το οπιοειδικό σύστημα επιπλέον ελέγχει αυτόνομες λειτουργίες, όπως είναι η αναπνοή, η θερμορύθμιση, η κινητικότητα του γαστρεντερικού σωλήνα, η ανοσολογική απάντηση. Επομένως, δεν είναι παράδοξο ότι τα οπιοειδή φάρμακα έχουν πολλαπλές επιδράσεις στον ανθρώπινο οργανισμό. Αυτές περιλαμβάνουν αναλγησία, ευφορία ή δυσφορία, καταστολή του αναπνευστικού, μύση, δυσκοιλιότητα, και αλλαγές στη 32

λειτουργία του ενδοκρινικού και ανοσοποιητικού συστήματος (Πίνακας 2) (Cesselin, 1995). ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ μ κ δ Η ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΤΟΥΣ ΠΡΟΚΑΛΕΙ Αναλγησία Καταστολή αναπνοής Ευφορία Εξάρτηση (σωματική) Αναλγησία Ηρεμία Μύση Αναλγησία Καταστολή αναπνοής ΑΓΩ ΝΙΣΤΕΣ Ενδορφίνες Μορφίνη Συνθετικά οπιοειδή Δυνορφίνες Εγκεφαλίνες Α Ν ΤΑ ΓΩ Ν ΙΣΤΕΣ Ναλοξόνη Ναλοξόνη Ναλοξόνη Πίνακας 2. Αγωνιστές/Ανταγωνιστές οπιοειδικών υποδοχέων Οι οπιοειδικοί υποδοχείς ανήκουν στους μεταβοτρόπους υποδοχείς και είναι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες (guanine-nucleotide binding regulator protein). Υπάρχουν 4 οικογένειες G-πρωτεινών (Gs, Gi, GQ, G12) αποτελούμενες από διαφορετικούς τύπους α, β και γ υπομονάδων. Οι οπιοειδείς υποδοχείς ενεργοποιούν την Gi οικογένεια πρωτεϊνών. Μετά την πρόσδεση του συνδέτη στον υποδοχέα ενεργοποιείται η G-πρωτεΐνη, η α υπομονάδα δεσμεύει το GTP και αφήνει το σύμπλεγμα συνδέτη-υποδοχέα, αλλά και την υπομονάδα βγ. Στη συνέχεια η α υπομονάδα διεγείρει τους επενεργητές και υδρολύει το GTP για να γίνει η αναγέννηση του κύκλου. Οι οπιοειδικοί υποδοχείς μπορούν να βρεθούν είτε προσυναπτικά είτε μετασυναπτικά. Μετασυναπτικά η ενεργοποίηση των G-πρωτεϊνών προκαλεί αναστολή της αδενυλικής κυκλάσης, με αποτέλεσμα την ελάττωση των επιπέδων του κυκλικού AMP. Προσυναπτικά η ενεργοποίηση των οπιοειδικών υποδοχέων προκαλεί διαμέσου της βγ υπομονάδας των G πρωτεϊνών το άνοιγμα διαύλων καλίου και το κλείσιμο διαύλων ασβεστίου (N and P/Q τύπου δίαυλοι Ca++). Η αύξηση της αγωγιμότητας για το κάλιο και η μείωση για το ασβέστιο οδηγεί σε μείωση της διεγερσιμότητας της κυτταρικής μεμβράνης με αποτέλεσμα την μειωμένη 33

απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών, όπως η ουσία P και το γλουταμικό οξύ, από τις απολήξεις των νευρώνων, ενώ η ενεργοποίηση μετασυναπτικών υποδοχέων προκαλεί υπερπόλωση της μεμβράνης του μετασυναπτικού νευρώνα (Besse et al., 1990). Η διέγερση των G-πρωτεϊνών έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C (PLC), η οποία με τη σειρά της στρατολογεί την 1,4,5 τριφωσφορική-ινοσιτόλη (IP3) και την διάκυλο-γλυκερόλη (DAG) οδηγώντας στην απελευθέρωση ασβεστίου στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC), αντίστοιχα (Εικ.17). Εικ. 17 Μεταγωγή σήματος του οπιοειδικού υποδοχέα (http://medscience. us/kc6. html) Ένας αριθμός δεύτερων αγγελιοφόρων έχει συσχετιστεί με την ενεργοποίηση των οπιοειδικών υποδοχέων με τη μεσολάβηση της βγ υπομονάδας των G πρωτεϊνών. Αυτοί περιλαμβάνουν την κινάση των υποδοχέων που σχετίζονται με τις G πρωτεΐνες (G protein receptor kinase-grk), τη δυναμίνη 1 (dynamin 1) και τη MAP κινάση (MAPK, mitogen-activated protein kinase), και την ERK (extracellular signal regulated kinase), (Cesselin, 1995). Μετά από συνεχή διέγερση του υποδοχέα λαμβάνει χώρα φωσφορυλίωση στο καρβοξυτελικό του άκρο. Η φωσφορυλίωση μπορεί να γίνει από την PKC, την ασβέστιο-καλμοδουλίνη εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση, τη GRK ή και τη MAPK. Η φωσφορυλίωση συμβάλλει στη λειτουργική απευαισθητοποίηση του υποδοχέα εμποδίζοντας την αλληλεπίδραση αυτού με τις G πρωτεΐνες. Η φωσφορυλίωση αποτελεί επιπλέον έναυσμα για την ενδοκυττάρωση του 34

υποδοχέα σε κυστίδια καλυπτόμενα με κλαθρίνη, η οποία γίνεται με τη μεσολάβηση πρωτεϊνών που καλούνται αρρεστίνες (β-arrestin). Από τη στιγμή που ο υποδοχέας έχει ενδοκυτωθεί, είτε ανακυκλώνεται και επιστρέφει στην επιφάνεια του κυττάρου είτε οδηγείται προς πρωτεόλυση στο σύμπλεγμα ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος (μέσω ουβικουϊτινιλύωσης) (http://medscience.us/kc6.html). Στον ιππόκαμπο οπιοειδικοί υποδοχείς υπάρχουν σχεδόν αποκλειστικά στους GABAεργικούς ενδονευρώνες (Drake et al., 1999). Οι ενδονευρώνες αναστέλλουν τους πυραμιδικούς νευρώνες του ιππόκαμπου σχηματίζοντας ανασταλτικές GABAεργικές συνάψεις σε διαφορετικά τμήματα της μετασυναπτικής μεμβράνης. Κάποιοι από αυτούς σχηματίζουν ανασταλτικές συνάψεις στα σώματα των πυραμιδικών νευρώνων ή στο αρχικό τμήμα του νευράξονα, ενώ άλλοι συνάπτονται στους δενδρίτες των πυραμιδικών νευρώνων (Svoboda et al., 1999). Στον ιππόκαμπο απαντώνται οπιοειδικοί υποδοχείς και των τριών τύπων μ-, δ- και κ- (Drake et al., 1999: Commons et al., 1998). Η ενεργοποίηση των υποδοχέων αυτών έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της δραστηριότητας των ενδονευρώνων, με συνέπεια την άρση της αναστολής που αυτοί επιφέρουν στους πυραμιδικούς νευρώνες του ιππόκαμπου (διπλή αναστολή). Το τελικό αποτέλεσμα της ενεργοποίησης των οπιοειδικών υποδοχέων στον ιππόκαμπο είναι, επομένως, η αύξηση της δραστηριότητας των πυραμιδικών νευρώνων (Svoboda et al., 1999). 32 ΦΕΝΤΑΝΥΛΗ Η φεντανύλη είναι ένα ισχυρό συνθετικό οπιοειδές αναλγητικό με ταχεία έναρξη και βραχεία διάρκεια δράσης. Πρόκειται για έναν ισχυρό αγωνιστή των μ- οπιοειδών υποδοχέων και είναι περίπου 100 φορές πιο ισχυρό από τη μορφίνη (100 μικρογραμμάρια φεντανύλης περίπου ισοδυναμούν με 10 mg μορφίνης και 75 mg πεθιδίνης). Ιστορικά έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του παροξυσμικού πόνου και χρησιμοποιείται συνήθως σε προ-εγχειρητικές διαδικασίες ως παυσίπονο, όπως επίσης και ως αναισθητικό σε συνδυασμό με βενζοδιαζεπίνες. Μεταβολίζεται στο ήπαρ και εκκρίνεται από τα νεφρά. Η φεντανύλη δεν δρα αποκλειστικά στους μ υποδοχείς, αλλά και στους δ και κ υποδοχείς, αν και η δέσμευση της στους μ είναι 100 φορές πιο ισχυρή από ότι στους δ και κ υποδοχείς (Εικ. 18). (http://en.wikipedia.org/wiki/fentanyl) 35

Στο Εργαστήριο Φαρμακολογίας της Ιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, έχει μελετηθεί η επίδραση της in vivo χορήγησης φεντανύλης στη ανοσοδραστικότητα του γ-αμινοβουτυρικού οξέος σε νευρώνες της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου. Συμπερασματικά παρατηρήθηκε ότι, η οξεία in vivo χορήγηση φεντανύλης προκαλεί, 24 ώρες αργότερα, ελάττωση της νευρωνικής διαβίβασης γ- αμινοβουτυρικού οξέος.. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την αύξηση της διεγερσιμότητας του ιπποκάμπου μετά από χορήγηση φεντανύλης και παρέχουν πληροφορίες όσον αφορά πιθανούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στα αρχικά στάδια ανάπτυξης αντοχής στα οπιοειδή (Kouvaras et al., 2008). Εικ. 18 2D και 3D δομή της φεντανύλης (http://en.wikipedia.org/wiki/file:fentanvl-2dskeletal.pns) 36

ΣΚΟΠΟΣ Δεδομένου του ότι στη βιβλιογραφία υπάρχουν ελάχιστες μελέτες σχετικά με την οξεία επίδραση των οπιοειδών στον ιππόκαμπο, ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της φεντανύλης στους νευρώνες GABA του ιπποκάμπου επίμυος, τόσο στη ραχιαία όσο και στην κοιλιακή μοίρα. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική μελέτη με τη χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι του GABA, οι οποία είχε ως στόχο: 1. τη σύγκριση μεταξύ ραχιαίας και κοιλιακής μοίρας του ιπποκάμπου όσον αφορά τον αριθμό των GABAεργικών νευρώνων και 2. την μελέτη της ενδεχόμενης δράσης της φεντανύλης στον αριθμό των GABAεργικών νευρώνων. Η σύγκριση αυτή στοχεύει στην κατανόηση των διαφορετικών ρόλων που διαδραματίζουν οι δύο μοίρες του ιπποκάμπου τόσο σε φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. 37

ΕΙΑΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Για τα πειράματα της παρούσας εργασίας χρησιμοποιήθηκαν ενήλικες επίμυες Wistar, αρσενικού γένους και βάρους 250-300 γρ. Τα ζώα τοποθετούνταν σε κλουβιά ανά 3-4, σε σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας, είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό και ο κύκλος ημέρας-νύχτας (περιοδικός φωτισμός) ήταν 12 ώρες. Οι συνθήκες διαβίωσης και χειρισμού των πειραματόζωων ήταν σύμφωνες με τον Ελληνικό Νόμο (Π.Δ. 160/91). Χορήγηση Φεντανύλης - Πειραματικές ομάδες Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν τυχαία σε 2 ομάδες. Από αυτές η μία ομάδα αποτέλεσε την ομάδα ελέγχου, ενώ στη δεύτερη χορηγήθηκαν υποδορίως και ανά 15 20 λεπτά, τέσσερις δόσεις φεντανύλης των 80μg/kg (συνολική δόση φεντανύλης: 320μg/kg). Οι επίμυες θανατώθηκαν 24 ώρες μετά την τελευταία ένεση φεντανύλης. Για την αποφυγή του θανάτου των πειραματόζωων, λόγω καταστολής της αναπνοής από τη χορήγηση του οπιοειδούς, υπήρξε συνεχής παρακολούθηση του ζώου για χρονικό διάστημα έως και δύο ώρες μετά την χορήγηση της τελευταίας δόσης του φαρμάκου. Παρασκευή τομών Απομόνωση του ιπποκάμπου και προετοιμασία των τομών-μονιμοποίηση. Τα πειραματόζωα τοποθετήθηκαν σε ειδικό θάλαμο και μετά την αναισθητοποίησή τους με αιθέρα, αποκεφαλίσθηκαν σε ειδική λαιμητόμο. Στη συνέχεια το κρανίο διανοίχθηκε και αφαιρέθηκε με χρήση ειδικών εργαλείων, αποκαλύπτοντας τον εγκέφαλο του ζώου. Καθ όλη τη διαδικασία ο εγκέφαλος διαβρέχονταν και τελικά τοποθετήθηκε σε κρύο τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΤΕΝΥ) σύστασης (σε mm): 124 NaCl; 4 KCl; 2 MgSO4; 2 CaCl; 1.25 NaH2PO4; 26 NaHCO3; 10 γλυκόζη σε ph 7.4, με συνεχή οξυγόνωση με μείγμα αερίου σύστασης 95% Ο2-5% CO2. Μετά την απομάκρυνση της παρεγκεφαλίδας διαχωριζόταν τα δύο ημισφαίρια με τομή κατά μήκος της μεσαίας σχισμής. Ο ιππόκαμπος κάθε 38

ημισφαιρίου αποχωριζόταν από τις παρακείμενες δομές (φλοιός, θάλαμος) με προσεκτικούς χειρισμούς και τοποθετούνταν στην έδρα μικροτόμου (Mcllwain tissue chopper). Κατόπιν, λαμβάνονταν τομές πάχους 500 μm εγκάρσιες στον επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου, τόσο από τη ραχιαία όσο και από την κοιλιακή του μοίρα (εικ. 19). Κάθε τομή μεταφέρονταν με τη χρήση πινέλου σε ειδικό δοχείο το οποίο περιείχε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΤΕΝΥ). Η όλη διαδικασία διαρκούσε για σύντομο χρονικό διάστημα (περίπου πέντε λεπτών) προκειμένου να διασφαλισθεί η βιωσιμότητα του ιστού. Μετά από επώαση μιας ώρας, οι τομές τοποθετούνταν σε δοχείο που περιείχε μονιμοποιητικό διάλυμα παραφορμαλδεΰδης (4% PFA) σε 0,1Μ PB (0,1M ΝαΗ2Ρθ4/0,1Μ K2HPO4) ph=7,4 και κατόπιν διατηρούνταν στο ψυγείο έως 24 ώρες. Η μονιμοποίηση σταματά την αυτόλυση του ιστού και διαφυλάσσει τη δομική σταθερότητα των κυττάρων (κυτοαρχιτεκτονική) καθόλα τα βήματα επεξεργασίας του ιστού. Γ Δ Εικ.19 (Α) Σχηματική παράσταση της θέσης του ιππόκαμπου στον εγκέφαλο αρουραίου και του τρόπου διαχωρισμού του σε εγκάρσιες τομές (Β). Τα DH (dorsal hippocampus) και VH (ventral hippocampus) αντιστοιχούν στον ραχιαίο και τον κοιλιακό πόλο του ιππόκαμπου αντίστοιχα. (Γ): Απεικόνιση του βασικού κυκλώματος και των στιβάδων, όπως οργανώνονται σε μία εγκάρσια τομή ιππόκαμπου (Γ): Σχηματική παράσταση των γωνιών τομής του ιππόκαμπου στους δύο πόλους του (Διδακτορική διατριβή Θ.Πετρίδης, Πάτρα 2008). 39

Αφυδάτωση και διαύγαση Πραγματοποιήθηκε σταδιακή αφυδάτωση του ιστού με διαλύματα αιθανόλης: 50%, 70%, 80%, 95% και 100% (από 1h), ενώ, στο τέλος, το μέσο αφυδάτωσης αντικαταστάθηκε με ξυλόλη η οποία αποτελεί διαλύτη συμβατό με το μέσο έγκλεισης (παραφίνη). Η διαδικασία ολοκληρώθηκε με δύο διαδοχικές επωάσεις των τομών σε υγρή παραφίνη στους 60 C (1h κάθε επώαση). Με αυτόν τον τρόπο οι τομές εμποτίσθηκαν με παραφίνη η οποία προσδίδει δομική σταθερότητα στον ιστό. Οι διαποτισμένοι με παραφίνη ιστοί τοποθετήθηκαν σε ειδικές κασέτες έγκλεισης (εικ.20). Εικ.20 Κασέτες έγκλεισης σε παραφίνη Σκήνωση σε παραφίνη Η διαδικασία της σκήνωσης περιλαμβάνει έγκλειση του ιστού σε στερεή παραφίνη ώστε ο ιστός να κόβεται με ακρίβεια σε λεπτές τομές. Η στερεοποίηση της παραφίνης επιτυγχάνεται με την τοποθέτησή της σε πάγο και από τη διαδικασία αυτή προκύπτουν κύβοι παραφίνης που περιέχουν τον ιστό. Κόψιμο τομών και συλλογή τους Οι κύβοι παραφίνης που προκύπτουν τοποθετούνται σε μικροτόμο (εικ.21). Τομές πάχους 5-7 μm κόβονται με τον μικροτόμο σχηματίζοντας «κορδέλες» διαδοχικών τομών οι οποίες τοποθετούνται σε θερμό υδατόλουτρο. Από εκεί, οι τομές συλλέγονται σε αντικειμενοφόρους πλάκες και διατηρούνται σε κλίβανο επώασης στους 37 C για μια ημέρα τουλάχιστον μέχρι το επόμενο βήμα της διαδικασίας. 40

ElK 21 Μικροτόμος (http://www.biopsies.gr/2010/09/blog-post.html) Μονιμοποίηση ολόκληρου εγκεφάλου Η συγκεκριμένη τεχνική πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στη διπλωματική εργασία της ιατρού Ν. Πίππιδου ( Πιππίδου Ν., Επίδραση οπιοειδών φαρμάκων στην ανοσοϊστοχημική έκφραση του GABA στο ραχιαίο ιππόκαμπο - συγκριτική μελέτη διαφορετικών τεχνικών μονιμοποίησης, Λάρισα 2012). Ανοσοϊστοχημική μελέτη Για τον κυτταρικό εντοπισμό και τη μελέτη της πιθανής δράσης της φεντανύλης στα ενδοκυττάρια επίπεδα του ανασταλτικού νευροδιαβιβαστή GABA πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική μελέτη με χρήση εκλεκτικών αντισωμάτων. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν: Πολυκλωνικό αντίσωμα ανεπτυγμένο σε κουνέλι κατά του GABA σε τελική συγκέντρωση 1/500 (Sigma Γερμανίας, A 2052). 1η μέρα 1. Αποπαραφίνωση σε Ξυλένιο x2x6 λεπτά (1ο Ξυλένιο στους 40ο C). 2. Ενυδάτωση: 100ο x2x5 λεπτά ^ 95ο x5 λεπτά ^ 80ο χ5 λεπτά ^ 70ο χ5 λεπτά ^ 50ο x5 λεπτά. 3. Ξέπλυμα με PBS: x2x5 λεπτά. 41

4. Επώαση σε Κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,01M, ph=6.0 5. Θέρμανση με χρήση μικροκυμάτων σε Κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,01Μ, ph=6.0, 3 λεπτά στα 750W, και μετά 7 λεπτά στα 350W. Παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. 6. Έκπλυση με PBS: 3 x5 λεπτά. 7. Επώαση σε Υπεροξείδιο του Υδρογόνου 2% σε 5% Μεθανόλη. 8. Έκπλυση με PBS: 3x5 λεπτά. 9. Επώαση 10% NGS σε PBS (blocking). 10. Επώαση με το διάλυμα του 1ου αντισώματος (Ab rabbit anti-gaba) σε συγκέντρωση 1:500 (0,5% Triton X σε PBS). 11. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και μετά στους 4ο overnight. 2η μέρα 12. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. 13. Έκπλυση με PBS: 3x5 λεπτά 14. Επώαση με το διάλυμα του 2ου αντισώματος (Ab anti-rabbit Alexa 555) σε συγκέντρωση 1:400 σε PBS x1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 15. Έκπλυση με PBS: 3x5 λεπτά. 16. Έγκλειση σε γλυκερόλη. Μικροσκοπία Για την οπτικοποίηση του ιστού χρησιμοποιήθηκε μικροσκόπιο φθορισμού AxioImager Z1 (Carl Zeiss, Jena, Germany) εξοπλισμένο με φίλτρα κατάλληλου μήκους κύματος και λογισμικό AxioVision software, 4.7.1 και αντικειμενικός φακός Plan-Neofluar 10x. Για την καταγραφή των εικόνων χρησιμοποιήθηκε ασπρόμαυρη κάμερα AxioCam CCD (Carl Zeiss, Jena, Germany). Η ποσοτική ανάλυση των εικόνων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ανάλυσης εικόνας ImageJ. Τρία τυχαία τετράγωνα ίδιων διαστάσεων επιλέχθηκαν σε κάθε μια από τις στοιβάδες και για όλες τις υπό-περιοχές του ιππόκαμπου, όπως φαίνεται και στην εικόνα 22. Σε κάθε ένα τετράγωνο από αυτά έγινε καταμέτρηση των θετικά βαμμένων κυττάρων, τα οποία είτε ήταν πλήρως βαμμένα-γεμισμένα ή στο κέντρο είχαν μαύρο-άβαφο- 42

διακριτό πυρήνα και βαμμένο περικάρυο. Τέλος, έγινε και υπολογισμός των αποφυάδων των νευρώνων σε κάθε μία από τις υποπεριοχές του ιπποκάμπου. Εικόνα 22. Ιππόκαμπος. Οι υποπεριοχές του ιπποκάμπου από τις οποίες λήφθησαν οι φωτογραφίες (Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Ιατρική Σχολή Λάρισας, 2012). Σε κάθε τετράγωνο της εικόνας 23 αντιστοιχεί μία υποπεριοχή του ιπποκάμπου και σε κάθε υποπεριοχή οι αντίστοιχες στοιβάδες, για τις οποίες ξεχωριστά καταμετρήθηκαν οι νευρώνες. Οι περιοχές αυτές αντιστοιχούν: 1. SUB (από έξω προς τα μέσα): Στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων, Πυραμιδική στοιβάδα, Ακτινωτή στιβάδα και Βοθριώδης-Μοριακή στοιβάδα. 2. CA1 (από έξω προς τα μέσα): Στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων, Πυραμιδική στοιβάδα, Ακτινωτή στιβάδα και Βοθριώδης-Μοριακή στοιβάδα 3. CA3 (από έξω προς τα μέσα): Στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων, Πυραμιδική στοιβάδα, Ακτινωτή στιβάδα και Βοθριώδης-Μοριακή στοιβάδα 4. DG (από έξω προς τα μέσα): Μοριώδης στοιβάδα, Κοκκιώδης στοιβάδα, Πολύμορφη στοιβάδα. 43

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 13 πειραματόζωα, από τα οποία τα 10 προχώρησαν έως και το στάδιο της ανοσοϊστοχημείας. Στα 4 (2 πειραματόζωα ελέγχου και 2 με φεντανύλη) πραγματοποιήθηκε η τεχνική μονιμοποίησης τομών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως και στα 8 (4 ελέγχου και 4 με φεντανύλη) εφαρμόστηκε η τεχνική με τη μέθοδο της μονιμοποίησης ολόκληρου του εγκεφάλου του πειραματοζώου (Πιππίδου Ν., Λάρισα 2012). Για τη μελέτη της ενδεχόμενης δράσης της φεντανύλης στα επίπεδα του GABA, καθώς επίσης και για την σύγκριση ραχιαίας και κοιλιακής μοίρας του ιπποκάμπου, στα επίπεδα του GABA πραγματοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές μελέτες τόσο σε ζώα ελέγχου, όσο και σε ζώα στα οποία είχε χορηγηθεί το οπιοειδές φεντανύλη. Εικ. 23 Ανοσοϊστοχημικός εντοπισμός του GABA στη CA1 περιοχή του ιπποκάμπου σε ζώα control και fentanyl, ραχιαία(άο^ώ) και κοιλιακή (ventral) μοίρα με τη μέθοδο μονιμοποίησης τομών (κλίμακα: 100 μω). 44

Εικ. 24 Ανοσοϊστοχημικός εντοπισμός του GABA στη CA3 περιοχή του ιπποκάμπου σε ζώα ελέγχου και «fentanyl», ραχιαία και κοιλιακή μοίρα με τη μέθοδο μονιμοποίησης τομών (κλίμακα: 100 im ). Εικ. 25 Ανοσοϊστοχημικός εντοπισμός του GABA στη DG περιοχή του ιπποκάμπου σε ζώα ελέγχου και «fentanyl», ραχιαία και κοιλιακή μοίρα με τη μέθοδο μονιμοποίησης τομών (κλίμακα: 100 μώ). 45

Εικ. 26 Ανοσοϊστοχημικός εντοπισμός του GABA στη SUB περιοχή του ιπποκάμπου σε ζώα ελέγχου και «fentanyl», ραχιαία και κοιλιακή μοίρα με τη μέθοδο μονιμοποίησης τομών (κλίμακα: 100 μω). Στα διαγράμματα που ακολουθούν, αρχικά γίνεται σύγκριση του αριθμού των κυττάρων που εκλύουν GABA, μεταξύ ραχιαίας και κοιλιακής μοίρας του ιπποκάμπου, σε ζώα ελέγχου. Στη συνέχεια ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία αλλά αυτή τη φορά σε ζώα στα οποία είχε χορηγηθεί φεντανύλη ( fentanyl ). Έπειτα, πραγματοποιήθηκε σύγκριση του αριθμού των κυττάρων που εκλύουν GABA, μεταξύ ζώων ελέγχου και φεντανύλης της ραχιαίας μοίρας και τέλος, ομοίως και για την κοιλιακή μοίρα του ιπποκάμπου. Παρουσιάζονται αποτελέσματα και από τις δύο τεχνικές: Ι.Μέθοδος μονιμοποίησης τομών (fixed slices), 2. Μέθοδος μονιμοποίησης ολόκληρου του εγκεφάλου (perfused brain). 46

r4 Μέθοδος μονιμοποίησης τομών (slices) Ι.Σύγκριση CONTROL dorsal-ventral κάθε περιοχής CA1,CA3,DG,SUB CA1 CONTROL or pyr rad l-m CA1 dorsal mca1 ventral SUB C O N TRO L 0 or pyr rad l-m SUB dorsal SUB ventral Σχήμα 1 Σύγκριση του αριθμού των GABA-εργικών νευρώνων, μεταξύ ραχιαίας και κοιλιακής μοίρας του ιπποκάμπου (περιοχές CA1, CA3, SUB, DG) των ζώων ελέγχου. Στα παραπάνω διαγράμματα παρατηρείται σχετικά μικρότερος αριθμός των GABA-εργικών κυττάρων στην κοιλιακή μοίρα (ventral) του ιπποκάμπου σε σχέση με την ραχιαία (dorsal) σε όλες σχεδόν τις υπό-περιοχές του, καθώς επίσης και στις περισσότερες στοιβάδες. Εξαίρεση αποτελεί στη CA1 περιοχή η στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων (oriens) και η ακτινωτή στοιβάδα στις οποίες παρατηρείται μεγαλύτερος αριθμός κυττάρων. 47

2. Σύγκριση F E N T A N Y L dorsal-ventral κάθε περιοχής C A 1, CA3, D G, SUB Σχήμα 2 Σύγκριση του αριθμού των GABA-εργικών νευρώνων, μεταξύ ραχιαίας και κοιλιακής μοίρας του ιπποκάμπου (περιοχές CA1, CA3, SUB, DG) των ζώων στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη. Τα παραπάνω διαγράμματα παρουσιάζουν αρκετές ομοιότητες με αυτά της προηγούμενης σύγκρισης των ζώων ελέγχου (Σχήμα 1). Παρατηρείται δηλαδή και εδώ μια σχετική μείωση του αριθμού των GABA-εργικών κυττάρων στην κοιλιακή μοίρα (ventral) του ιπποκάμπου σε σχέση με την ραχιαία (dorsal) σε όλες σχεδόν τις υπό-περιοχές του, καθώς επίσης και στις περισσότερες στοιβάδες. Εξαίρεση αποτελεί μόνο η ακτινωτή στοιβάδα, της περιοχής του υποθέματος (SUB), στην οποία παρατηρείται μια μικρή αύξηση του αριθμού των κυττάρων. 48

3. Σύγκριση D O R S A L control-fentanyl κάθε περιοχής C A 1, CA3, D G, SUB CA1 DORSAL CA3DORSAL SUB DORSAL DGDORSAL Σχήμα 3 Σύγκριση του αριθμού των GABA-εργικών νευρώνων, μεταξύ των ζώων ελέγχου και των ζώων στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη (περιοχές CA1, CA3, SUB, DG) της ραχιαίας (dorsal) μοίρας του ιπποκάμπου. Στα παραπάνω διαγράμματα παρατηρείται μια σχετική αύξηση του αριθμού των GABA-εργικών κυττάρων στα ζώα στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη σε σχέση με τα ζώα ελέγχου σε όλες σχεδόν τις υπό-περιοχές του ιπποκάμπου, καθώς επίσης και στις περισσότερες στοιβάδες. Εξαίρεση αποτελεί στη CA1 περιοχή η Βοθριώδης-Μοριακή στοιβάδα (Lacunosum moleculare), στη CA3 περιοχή η πυραμιδική (pyr) και η Βοθριώδης-Μοριακή στοιβάδα (l-m) και στην περιοχή του υποθέματος η στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων (oriens) στις οποίες παρατηρείται μια μικρή μείωση του αριθμού των GABA-εργικών κυττάρων. 49

4. Σύγκριση V E N T R A L control-fentanyl κάθε περιοχής CA1, C A 3, D G, SUB CA1 VENTRAL CA3VENTRAL or pyr rad l-m CA1 control CA1 fentanyl SUB VENTRAL DGVENTRAL or pyr rad l-m SUB control SUB fentanyl Σχήμα 4 Σύγκριση του αριθμού των GABA-εργικών νευρώνων, μεταξύ των ζώων ελέγχου και των ζώων στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη (περιοχές CA1, CA3, SUB, DG) της κοιλιακής (ventral) μοίρας του ιπποκάμπου. Τα παραπάνω διαγράμματα παρουσιάζουν αρκετές ομοιότητες με αυτά της προηγούμενης σύγκρισης της ραχιαίας μοίρας του ιπποκάμπου (Σχήμα 3). Παρατηρείται δηλαδή και εδώ αύξηση του αριθμού των GABA-εργικών κυττάρων στα ζώα στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη σε σχέση με τα ζώα ελέγχου σε όλες σχεδόν τις υπό-περιοχές του ιπποκάμπου, καθώς επίσης και στις περισσότερες στοιβάδες. Εξαίρεση αποτελεί στη CA3 περιοχή η πυραμιδική (pyr) στοιβάδα και στην περιοχή της Οδοντωτής έλικας η κοκκιώδης στοιβάδα (granular) στις οποίες παρατηρείται μείωση του αριθμού των GABA-εργικών κυττάρων. 50

Μέθοδος μονιμοποίησης ολόκληρου εγκεφάλου (perfused brain) Ι.Σύγκριση CONTROL dorsal-ventral κάθε περιοχής CA1,CA3,DG,SUB Σχήμα 5 Σύγκριση του αριθμού των GABA-εργικών νευρώνων, μεταξύ ραχιαίας και κοιλιακής μοίρας του ιπποκάμπου (περιοχές CA1, CA3, SUB, DG) των ζώων ελέγχου. Τα παραπάνω διαγράμματα της μεθόδου μονιμοποίησης ολόκληρου εγκεφάλου παρουσιάζουν μια διαφορετική εικόνα σε σχέση με αυτά που είδαμε προηγουμένως από τη μέθοδο μονιμοποίησης τομών. Αντίθετα δηλαδή στα διαγράμματα αυτά παρατηρείται μεγαλύτερος αριθμός GABA-εργικών κυττάρων στην κοιλιακή μοίρα (ventral) του ιπποκάμπου σε σχέση με την ραχιαία (dorsal) στις περισσότερες υπό-περιοχές του, καθώς επίσης και στις περισσότερες στοιβάδες. Εξαίρεση αποτελούν οι κύριες-βασικές στοιβάδες (πυραμιδική και κοκκιώδης στοιβάδα αντίστοιχα) των περιοχών CA1, υποθέματος (SUB) και οδοντωτής έλικας, στις οποίες παρατηρείται μικρότερος αριθμός κυττάρων. 51

2. Σύγκριση F E N T A N Y L dorsal-ventral κάθε περιοχής C A 1,C A 3,D G,SU B Σχήμα 6 Σύγκριση του αριθμού των GABA-εργικών νευρώνων, μεταξύ ραχιαίας και κοιλιακής μοίρας του ιπποκάμπου (περιοχές CA1, CA3, SUB, DG) των ζώων στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη. Τα παραπάνω διαγράμματα παρουσιάζουν αρκετές ομοιότητες με αυτά της προηγούμενης σύγκρισης των ζώων ελέγχου (Σχήμα 5). Παρατηρείται δηλαδή και εδώ αύξηση του αριθμού των GABA-εργικών κυττάρων στην κοιλιακή μοίρα (ventral) του ιπποκάμπου σε σχέση με την ραχιαία (dorsal) στις περισσότερες υπόπεριοχές του, καθώς επίσης και στις περισσότερες στοιβάδες. Εξαίρεση αποτελούν οι κύριες-βασικές στοιβάδες (πυραμιδική και κοκκιώδης στοιβάδα αντίστοιχα) των περιοχών CA1 και οδοντωτής έλικας, στις οποίες παρατηρείται μείωση του αριθμού των κυττάρων. 52

3. Σύγκριση D O R S A L control-fentanyl κάθε περιοχής C A 1,C A 3,D G,SU B CA1 DORSAL CA3DORSAL J ---------------- A i TrF or pyr rad l-m CA3 control n CA3 fentanyl SUB DORSAL DG DORSAL or pyr rad l-m SUB control DSUBfentanyl Σχήμα 7 Σύγκριση του αριθμού των GABA-εργικών νευρώνων, μεταξύ των ζώων ελέγχου και των ζώων στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη (περιοχές CA1, CA3, SUB, DG) της ραχιαίας (dorsal) μοίρας του ιπποκάμπου. Στα παραπάνω διαγράμματα δεν παρατηρείται σχεδόν καμία αλλαγή, μεταξύ των ζώων ελέγχου και των ζώων στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη. Εξαίρεση αποτελούν μόνο στην περιοχή του υποθέματος η στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων (oriens) και η βοθριώδης-μοριακή στοιβάδα (l-m), στις οποίες παρατηρείται μείωση του αριθμού των GABA-εργικών κυττάρων των ζώων στα οποία έχει χορηγηθεί το οποιοειδές φεντανύλη. 53