УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Милица Пантелић ДИНАМИКА РАЗГРАДЊЕ ФУНГИЦИДА ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА У САЛАТИ Нови Сад, 2016.
УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Кандидат Милица Пантелић Ментор Проф. др Сања Лазић ДИНАМИКА РАЗГРАДЊЕ ФУНГИЦИДА ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА У САЛАТИ Мaстер рад Нови Сад, 2016.
КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ МАСТЕР РАДА др Сања Лазић, редовни професор Научна област: Фитофармација Пољопривредни факултет, Нови Сад -ментор- др Вера Стојшин, редовни професор Научна област: Фитопатологија Пољопривредни факултет, Нови Сад -председник комисије- др Славица Вуковић, доцент Научна област: Фитофармација Пољопривредни факултет, Нови Сад -члан комисије-
Захваљујем се свом ментору, проф. др Сањи Лазић, на избору теме и корисним саветима и сугестијама приликом реализације рада. Такође, захваљујем се и осталим члановима комисије, доц. др Славици Вуковић и проф. др Вери Стојшин, на сарадњи, стручној помоћи и саветима као и садржајним сугестијама при коначном формулисању рада. Велику захвалност дугујем др Драгани Шуњки, чија су сутручност, знање и безрезервна подршка умногоме допринели квалитету овога рада. Посебну захвалност дугујем својим колегама на незаборавним студентским данима, пријатељима, породици и Немањи, за љубав, стрпљење, разумевање и подршку током свих ових година. На крају, овај рад посвећујем најдражем, Р.И. The more I live, the more I learn. The more I learn, the more I realize, the less I know. Michel Legrand
САДРЖАЈ РЕЗИМЕ... 1 SUMMARY... 3 1. УВОД... 4 2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ... 7 2.1. ПОРЕКЛО, ЗНАЧАЈ И КЛАСИФИКАЦИЈА САЛАТЕ... 7 2.2. МИКОЗЕ САЛАТЕ... 10 2.2.1. Сива трулеж... 10 2.2.2. Бела трулеж... 14 2.3. ДЕГРАДАЦИЈА ПЕСТИЦИДА У БИЉКАМА... 18 2.3.1. Абиотски процеси... 18 2.3.2. Биотски процеси... 20 2.4. ПЕРЗИСТЕНТНОСТ ПЕСТИЦИДА У БИЉКАМА... 21 2.5. ОСТАЦИ ПЕСТИЦИДА И ЗАКОНСКА РЕГУЛАТИВА О ОСТАЦИМА ПЕСТИЦИДА... 22 2.6. AНИЛИНОПИРИМИДИНИ... 25 2.6.1. Ципродинил... 26 2.7. ФЕНИЛПИРОЛИ... 29 2.7.1. Флудиоксонил... 30 2.8. ОДРЕЂИВАЊЕ ОСТАТАКА ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА... 33 3. ЗАДАТАК И ЦИЉ РАДА... 36 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ... 37 4.1. БИЉНИ МАТЕРИЈАЛ... 37 4.2. ПОЉСКИ ОГЛЕД... 38 4.3. ПРИПРЕМА УЗОРАКА ЗА АНАЛИЗУ... 38 4.4. ХЕМИКАЛИЈЕ... 39
4.5. АПАРАТУРА... 39 4.6. ПРИПРЕМА РАСТВОРА... 39 4.7. HPLC-DAD АНАЛИЗА... 40 4.8. ДЕФИНИСАЊЕ ХРОМАТОГРАФСКИХ УСЛОВА... 41 4.9. ПРОВЕРА ПРИНОСА ЕКСТРАКЦИЈЕ ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА ИЗ САЛАТЕ QuEChERS МЕТОДОМ... 42 5. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА... 45 5.1 ОДРЕЂИВАЊЕ ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА ПРИМЕНОМ HPLC/DAD... 45 5.2 ПАРАМЕТРИ ВАЛИДАЦИЈЕ... 49 5.2.1. Линеарност одзива детектора... 49 5.2.2. Лимит детекције (LOD) и лимит квантификације (LOQ)... 52 5.2.3. Прецизност... 52 5.2.4 Тачност одређивања ципродинила и флудиоксонила у узорцима салате.. 54 5.3. МАТРИКС ЕФЕКАТ... 55 5.4. ОСТАЦИ ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА У САЛАТИ... 57 5.5. ПОЛУ-ВЕК РАЗГРАДЊЕ ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА У САЛАТИ... 60 6. ЗАКЉУЧАК... 62 7. ЛИТЕРАТУРА... 64
РЕЗИМЕ У циљу праћења деградације ципродинила и флудиоксонила у салати у периоду од примене препарата до истека каренце, извршен је третман препаратом на бази ових активних материја у препорученој дози. Оглед је постављен у пољу салате на локалитету Прово. Салата је узоркована девет пута 2 сата након примене препарата, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 15 дана. Екстракција ципродинила и флудиоксонила из салате изведена је QuEChERS методом. За одређивање ципродинила и флудиоксонила коришћена је течна хроматографија са DAD детектором (Аgilent 1100, United States) и Agilent Zorbax Eclipse C18 колоном (унутрашњи пречник 50 mm x 4.6 mm, величина честица 1.8 μm). Као мобилна фаза употребљени су ацетонитрил и 0.5% раствор CH 3 COOH (60/40), са протоком 0,9 ml/min, температуром колоне 25 o C и ињектованом запремином 10 μl, док је као одговарајућа таласна дужина усвојена вредност од 254 nm. Валидација методе је у потпуности спроведена у складу са захтевима стандарда SANCO/1257/2013 (EU Commission Health and Consumer Protection Directorate-General, 2013). Просечне вредности приноса екстракције ципродинила и фудиоксонила из салате проверене на три нивоа обогаћења (0.1-40 mg/kg) износиле су 87,10 ± 1,12% за ципродинил и 85,97 ± 2,42 за флудиоксонил, респективно. Прецизност мерења размотрена провером поновљивости одређивања ципродинила и флудиоксонила изражена је релативном стандардном девијацијом (RSD) са вредностима мањом од 1.29% за ципродинил, односно 0,073% за флудиоксонил. У опсегу масених концентрација ципродинила и флудиосконила од 0,1 до 20 μg/ml постигнута је добра линеарност одзива детектора са коефицијентом варијације од 0,994%. Лимити детекције и квантификације за одређивање ципродинила и флудиоксонила у салати приказаном методом износе 0,02 mg/kg и 0,05 mg/kg, респективно. Током испитиваног периода концентрација ципродинила у салати се смањивала од 2,34 mg/kg непосредно након примене фунгицида до 0,16 mg/kg по истеку каренце од 14 дана, док су респективне 1
вредности за флудиоксонил износиле 1,44 и 0,36 mg/kg. Анализом је утврђено да је садржај ципродинила и флудиоксонила у узорцима салате након истека периода каренце био испод максимално дозвољене количине за ове активне материје, прописане Правилником Републике Србије и Европске Уније. Деградација остатака ципродинила и флудиоксонила је приказана по моделу реакције првог реда. Под овим условима, DT 50 ципродинила и флудиоксонила у салати износио је 3,3 и 8,66 дана, респективно. Кључне речи: Ципродинил; Флудиоксонил; Салата; Деградација; Остаци. 2
SUMMARY Degradation of cyprodinil and fludioxonil in lettuce samples was evaluated at several intervals from the product application until the end of the pre-harvest interval. A field of lettuce located at Provo village was used in this study. Cyprodinil and fludioxonile were applied according to the manufacturer s recommendation for protecting lettuce from its important pests: grey mold and white mold. Lettuce samples were collected at nine intervals: 2 hours after cyprodinil and fludioxonil application and 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 15 days after application. The extraction of cyprodinil and fludioxonile from lettuce samples was performed using a QuEChERS-based method. Determination was carried out using an HPLC-UV diode array detection system (Agilent 1100, United States) with an Agilent Zorbax Eclipse C18 column (50 mm 4.6 mm internal diameter, 1.8 μm particle size). The method was subjected to a thorough validation procedure. The recovery data were obtained by spiking blank lettuce samples at three concentration levels (0.1-40 mg/kg), yielding 87,10 ± 1,12% average recovery for cyprodinil and 85,97 ± 2,42 for fludioxonil, respectively. Precision values expressed as relative standard deviation (RSD) were below 1,29% for cyprodinil and 0,073% for fludioxonil, for the intraday precision. Cyprodinil and fludioxonil showed linear calibrations from 0.1 to 20 μg/ml with correlation coefficient (R 2 ) of 0.994%. The limit of detection and limit of quantification were found to be 0,02 mg/kg and 0,05 mg/kg, respectively. The validated method was applied in the analysis of cyprodinil and fludioxonil in lettuce samples. During the study period, the concentration of cyprodinil decreased from 2,34 mg/kg to 0.16 mg/kg, and concentartion of fludioxonil decreased from 1,44 mg/kg to 0.36 mg/kg. The contents of cyprodinil and fludioxonil in lettuce samples at the end of the pre-harvest interval were below the maximum permissible level specified by the Serbian and EU MRLs. The degradation of cyprodinil and fludioxonil residues was simulated by a first-order model DT 50 was 3,3 days for cyprodinil and 8,66 days for fludioxonil, respectively. Keywords: Cyprodinil; Fludioxonil; Lettuce; Degradation; Residues; 3
1. УВОД Производња хране, уз перманентни захтев за што вишим приносима, представља императив савремене пољопривредне производње. Према званичним подацима FАО-a, уколико се не би користили пестициди само у току једне године, биљне болести и штетни инсекти и корови смањили би светску производњу хране за 25-30%, а губици ускладиштених намирница повећали би се за још 10-15% (Вуковић и сар., 2013). Међутим, примену пестицида често прати ризик од непожељних последица за животну средину, јер све већи број података говори да се трагови пестицида могу наћи свуда. Они могу контаминирати површинске и подземне воде; могу испољити штетне ефекте на гајеним биљкама, корисним организмима у земљишту, корисним артроподама, ситним сисарима и птицама; могу се наћи као остаци у храни и могу проузроковати појаву резистентности биолошких агенаса (Радивојевић и сар., 2007). Ако изузмемо професионално ангажована лица, као што су пољопривредни произвођачи, они који раде у производњи средстава за заштиту биља или у научним и стручним институцијама чије је подручје деловања везано за ову врсту производа, становништво пестицидима најчешће може бити изложено преко хране. То је због тога што мале количине ових материја могу заостати у плодовима или усевима после њихове бербе, односно жетве (Секулић, 2010). Салата је данас често гајено поврће, у многим земљама гаји се током читаве године, комбинујући производњу на отвореном пољу и у заштићеном простору. Значај у исхрани проистиче због богато минерално-витаминског састава и освежавајућег дејства (Ђуровка, 2008). 4
Производњу салате ремети већи број, углавном гљивичних обољења. По значају и учесталости појављивања, најважнији патоген салате у нашим агроеколошким условима је Botrytis cinerea, проузроковач сиве трулежи. Међутим, у годинама повољним за развој, велике губитке наноси и пламењача, чији је проузроковач Bremia lactuce. Осим тога, треба поменути и болест која се редовно јавља код гајења салате у заштићеном простору сива трулеж, чији је проузроковач Sclerotinia sclerotiorum. Салата је биљка кратког вегетационог периода, што додатно отежава избор и динамику примене фунгицида, због неопходности поштовања каренци за примењене препарате. Појава резистентних изолата Botrytis cinerea према фунгицидима који се користе за сузбијање овог патогена представља велики проблем. Када се овој проблематици додају и све оштрији критеријуми по питању остатака пестицида у храни, као и чињеница да се свеж лист директно користи у исхрани, и то углавном непосредно након бербе, није тешко закључити да је хемијској заштити салате неопходно прилазити са много пажње (Стевић и сар., 2014). Ципродинил се користи као фолијарни фунгицид. Сузбија широк спектар патогена, као што су: Tapesia yallundae и T. acuformis, Erysiphe spp., Pyrenophora teres, Rhynchosporium secalis, Botrytis spp., Alternaria spp., Venturia spp., и Monilinia spp. Флудиоксонил се користи као фунгицид за третирање семена, за контролу Fusarium spp., Microdochium, Rhizoctonia, Tilletia, Pyrenophora и Septoria у усевима житарица и осталих усева. Као фолијарни фунгицид, користи се за контролу Botrytis, Monilinia, Sclerotinia и Alternaria, у виновој лози, коштичавом воћу, поврћу и украсним биљкама (MacBean, 2012). Ишчезавање/деградација различитих пестицидних једињења након њихове примене зависи од различитих фактора, укључујући биљну врсту, хемијску формулацију и начин примене, климатске услове, физичке феномене (углавном волатизацију) и фотодеградацију, где сунчева светлост игра истакнуту улогу (Abd Al-Rahman et al., 2012). У циљу праћења деградације ципродинила и флудиоксонила у салати и одређивања полу-времена разградње, препарат на бази ципродинила и 5
флудиоксонила је примењен у салати против Botrytis cinerea и Sclerotinia sclerotiorum. Извршена је оптимизација методе одређивања њихових остатака у салати, дефинисањем параметара екстракције и пречишћавања, као и основних валидационих параметара у складу са захтевима стандарда SANCO/1257/2013. 6
2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 2.1. ПОРЕКЛО, ЗНАЧАЈ И КЛАСИФИКАЦИЈА САЛАТЕ Салата (Lactuca sativa L.), једногодишња биљка, припада фамилији Аsteraceae и веома је важно лиснато поврће које се конзумира свеже као салата или у комбинацији са другим врстама свежег поврћа (Aćamović - Đoković et al., 2011). Салата је култура прохладне и влажне климе, пореклом из области Средозменог мора. Сматра се да потиче од дивље врсте Lactuca scariola, која је и данас раширена као коров у Средњој Азији и Европи (Ђуровка, 2009). Данас је салата често гајено поврће, у многим земљама гаји се током читаве године, комбинујући производњу на отвореном пољу и у заштићеном простору. Салата је усев који се широко узгаја на свим континентима, посебно у умереним и суптропским регионима. Данас, светска производња салате износи више од 22 милиона тона на око милион хектара. Око две трећине укупне производне области је у Азији, са Кином за коју се рачуна да производи око половине светске производње салате. САД производи око једну петину салате у свету (Mou, 2009). У Европи се гаји на око 144.000 ha (23 t/ha), највише у Италији, Шпанији и Турској. Код нас се званично (статистички) салата не води посебно, а процена је да се производи на око 2-2.500 ha (Ђуровка, 2008). Значај у исхрани проистиче због богатог минерално витаминског састава и освежавајућег дејства. Од минералних материја салата је богата калијумом (до 51%), калцијумом (до 15%), фосфором (до 11%), магнезијумом (до 10%) али је значајан и садржај гвожђа, мангана, молибдена, цинка. Ране сорте садрже више витамина Ц и протеина, а мање угљених хидрата. Хемијски састав салате варира од услова 7
успевања али увек има малу енергетску вредност што уз богатство биолошки важним материјама чини салату битном у рационалној исхрани. Табела 1. Хемијски састав главичасте салате (Лазић и сар., 2001) Садржај % на свежу материју сува сирови масти угљени целулоза минералне материја протеини хидрати материје 4,6-11,6 0,6-2,9 0,3-0,6 0,1-2,3 0,6-0,9 0,8-1,3 Садржај витамина (mg/kg свеже материје) Ц Б 1 Б 2 бета каротена К 4,9-90,0 0,25-2,0 0,25-1,24 2,7-16,0 2,0 Салата у неповољним климатским условима и при обилном ђубрењу азотом накупља знатне количине NO 3 и NO 2 посебно у лисним дршкама и нерватури листа (Ђуровка, 2008). Према класификацији поврћа на основу садржаја нитрата у свежој материји, салата се сврстава у групу поврћа са највећим садржајем нитрата (преко 2500 mg NO 3 kg -1 свеже масе), заједно са цвеклом, целером, ротквицом, спанаћем и др. Светска здравствена организација је изнела податак да је максимално дозвољени дневни унос нитрата у организму људи 5 mg, а нитрита 0,2 mg по килограму телесне масе, без последица по здравље. У људском организму се нитрати везују са хемоглобин при чему настаје метхемоглобин који омета везивање и пренос кисеоника. Када се више од 70% хемоглобина оксидише у метхемоглобин, наступа смрт (Продановић и сар., 2012). Гајена салата обухвата пет варијетета: - лисната (Lactuca sativa subsp. secalina syn var. foliosa, var. acephala, var. crispa), која образује лисну розету и веома брзо цвета, - салата за резање (Lactuca sativa var. acephala), образује крупну розету, а листови су различите величине, облика и боје и релативно споро долази до цветања, 8
- главичаста (Lactuca sativa var. capitata), која образује главицу различите величине, збијености, облика, боје и различите брзине цветања, - салата марула (Lactuca sativa var. angustana syn. var. asparagina) има задебљало стабло са издуженим уским листовима. Код нас се највише гаји главичаста салата (Лазић и сар., 2001). Слика 1. Lactuca sativa var. capitata главичаста салата Извор: http://www.prota4u.org/protav8.asp?g=pe&p=lactuca+sativa+l. 9
2.2. МИКОЗЕ САЛАТЕ 2.2.1. Сива трулеж Телеморф: Botryotinia fuckeliana Анаморф: Botrytis cinerea Распрострањеност и штетност. Сива трулеж је распрострањено обољење многих гајених биљака широм света. Најзначајније штете причињава у умереним и влажним поднебљима. Сива трулеж проузрокује значајне штете, како на биљкама у пољу, тако и у производњи у затвореном простору, а такође и током транспорта и складиштења производа. Губици на бројним домаћинима могу достићи и 50% (Балаж и сар., 2009). Домаћини и специјализација патогена. Botryotinia fuckeliana је полифагни паразит, који напада преко 200 биљних врста, међу којима се налазе гајене биљке у ратартсву, повртарству и воћарству, као и украсне биљне врсте. У нашим условима главни домаћини међу ратарско-повртарским биљкама су сунцокрет, лук и салата, а може се појавити и на купусњачама, парадајзу, паприци, краставцу, пасуљу, грашку и лану (Балаж и сар., 2010). Симптоми. Botrytis cinerea изазива широк спектар различитих симптома на бројним деловима биљака, па их је врло тешко генерализовати. На цветовима, у зависности од временских услова, симптоми варирају од ситних некроза до типичне влажне трулежи и пропадања. Влажна трулеж, деструкција и пропадање епидермалног и паренхимског ткива, које убрзо бива прекривено масом конидиофора и конидија патогена, представља основни симптом обољења листова, цветова и сочних плодова. На плодовима са дебелом покожицом, као што је киви, трулеж се уочава тек након пресецања или гуљења плода. Код краставца, пасуља, јагоде и јабуке инфекција обично почиње продирањем патогена у још увек 10
причвршћене делове цвета који се суше, а затим се обољење, у виду трулежи шири на тек формиране плодове. На парадајзу у стакленицима и пластеницима најчешће се запажа трулеж стабла око рана насталих заламањем заперака, док се трулеж плодова, праћена обилном спорулацијом патогена, јавља углавном после бербе. На купини и малини патоген изазива трулеж плодова у току вегетације, транспорта и складиштења. Инфекција семена забележена је код више од 50 врста биљака као што су лан, сунцокрет и зелена салата, а преношење патогена семеном може да изазове потпуно пропадање усева леблебије (Тановић и сар., 2011). Слика 2. Botrytis cinerea трулеж и пропадање листова салате Извор: Тановић и сар., 2011 Особине патогена, епидемиологија и екологија. Гљива формира бесполни конидијски стадијум B. cinerea и, веома ретко, полни савршени стадијум B. fuckeliana. Формира добро развијену, септирану маслинастомрку мицелију и дуге, тамне, разгранате, у виду грозда, конидиофоре. Конидиофоре се завршавају увећаном вршном ћелијом, на којој се образује већи број једноћелијских, пепељастосивих, лимунастих или овалних конидија на кратким стеригмама. У повољним условима гљива формира црне дискоидне склероције, уроњене у супстрат. B. cinerea може образовати и микроконидије, тзв. фијалоспоре. Њихова 11
улога је да врше сперматизацију склероција, што доводи до формирања апотеција (Маширевић и Јаснић, 2006). На склероцијама паразит формира пехарасте апотеције на којима се налазе аскуси са по 8 једноћелијских безбојних елипсоидних аскоспора. Паразит се одржава мицелијом и склероцијама у зараженим биљним остацима, земљишту и семену. После дозревања, односно презимљавања, склероције клијају у мицелију, на којој се формира конидијски стадијум гљиве. Улога апотеција са аскусима и аскоспорама у епидемиологији ове гљиве није довољно проучена (Балаж и сар., 2010). Животни циклус почиње појавом конидијског стадијума на површини домаћина. Конидије Botrytis cinerea су свеприсутне у ваздуху и могу се преносити ветром на велике удаљености пре инфекције следећег домаћина. Следећи причвршћивање, конидије клијају на површини домаћина под влажним условима срединe и стварају клицину цев која се развија на апресоријуму и пенетрира површину домаћина. Ћелије одумиру и гљива образује примарну лезију, у којој се могу јавити некроза и одбрамбени одговори домаћина. Под оптималним условима, инфективни циклус може бити завршен за 3-4 дана, зависно од типа нападнутог ткива домаћина (van Kan., 2005). Слика 3. Животни циклус Botrytis cinerea Извор: Agrios, 2005 12
Инфекције овом полифагном гљивом настају нарочито у гајењу парадајза, паприке, краставца, салате и других врста биљака у заштићеном простору. Због повећања влажности ваздуха, нижих температура, мање осветљености током зиме и обично повећаног ђубрења азотом биљке постају осетљивије према B. cinerea. У таквим условима, гљива продире најчешће у биљку кроз оштећена места (ожиљци настали током бербе плодова, закидањем заперака код парадајза, на месту отпалих котиледона, убода инсеката итд.) или преко осушених круничних листића цвета. Гљива често продире у биљке и преко цветова, захватајући прво осушене круничне листиће, а затим се шири преко плодника цвета (Балаж и сар., 2009). Мере заштите. Хемијско сузбијање представља најважнији начин заштите усева и засада од Botrytis cinerea. Поуздане методе прогнозе појаве болести у засадима за сада не постоје, па се заштита заснива на превентивном третирању надземних делова биљке у најосетљивијим фенофазма (Leroux et al., 2002). Фолијарна примена фунгицида, у парадајзу на бази хлороталонила, ципродинила + флудиоксонила, просимидона, затим у паприци, на бази боскалида + пираклостробина, а у салати просимидона, може да смањи штете од ове болести. Приликом примене фунгицида, мора се водити рачуна о каренци, посебно код салате. Испитивања ефикасности биопрепарата на бази суперпаразитних микроорганизама Trichoderma harzianum и Streptomyces griseoviridis против проузроковача сиве трулежи указују на могућност шире примене биолошких мера заштите, којима би се избегао или смањио ризик од остатака пестицида у храни (Балаж и сар., 2009). 13
2.2.2. Бела трулеж Проузроковач: Sclerotinia sclerotiorum Распрострањеност и штетност. Sclerotinia sclerotiorum је врста која је распрострањена по целом свету, проузрокујући обољења у подручјима тропске, медитеранске и субтропске климе. Ова паразитна гљива се често веома интезивно јавља на повртарским и украсним биљкама у затвореном простору, где може проузроковати значајне штете. У погодним условима за развој болести, штете на великом броју гајених биљака, како у производњи у пољу, тако и у стакленичкој и пластеничкој производњи могу износити и до 100%. Заражене биљке веома често се суше и пропадају, не доносећи плод (Балаж и сар., 2009). Домаћини и специјализација патогена. Паразит (Sclerotinia sclerotiorum) напада 361 биљну врсту, које су сврстане у 225 родова и 64 фамилије. Нарочито су угрожени сунцокрет, соја, уљана репица, пасуљ, боранија, легуминозе, поврће, корови и др (Маширевић и Дедић, 2006). Симптоми. С обзиром на широк спектар домаћина Sclerotinia sclerotiorum, не постоје јединствени симптоми за све биљне врсте заражене овом гљивом. На листовима се обично јављају воденасте пеге које се брзо шире и премештају петељком петељком на доле, у стабло. На стаблима појединих заражених биљака прво се развијају мрке пеге, док је код других домаћина иницијална назнака појава воденастих лезија на стаблу. Лезије се обично развијају у некротично ткиво, које затим формира белу, паперјасту мицелију, што представља најјаснији симптом на биљкама зараженим Sclerotinia sclerotiorum. У почетном развоју пега, биљке могу изгледати као да нису заражене. Међутим, како гљива напредује у главно стабло јавља се типично увенуће (Bolton et al., 2006). У каснијој фази развоја обољења у зараженом биљном ткиву или на његовој површини се формирају лако уочљиве, црне склероције паразита (Балаж и сар., 2010). Склероције играју главну улогу у животном циклусу патогена с обзиром да оне производе инокулум и представљају примарне, дуготрајне структуре за преживљавање (Willetts and Wong, 1980), остајући виталне више од 8 година у земљишту (Adams and Ayers, 1979). 14
Представљају скупину хифа са спољашњим, црним омотачем од неколико густих ћелија које садрже меланин, једињење за које се верује да игра важну улогу у заштити од штетних услова и микробиолошке разградње многих гљива (Bell and Wheeler, 1986; Henson et al., 1999) и, у неким случајевима, функцију вирулентности. Белу трулеж салате проузрокују две врсте гљива, Sclerotinia sclerotiorum и Sclerotinia minor. Болест се редовно јавља код гајења салате у заштићеном простору. Зараза салате се, по правилу, прво јавља на кореновомм врату биљака, када зараћено ткиво поприма меку конзистенцију. Зараза се шири са кореновог врата на лишће главице, која такође почиње да трули и на крају у потпуности пропада. На оболелим деловима, при влажним условима, формира се беличаста мицелија, а касније црнкаста телашца склероције гљиве. Заражене главице се лако одвајају од корен (Балаж и сар., 2009). Слика 4. Трулеж основе стабла (лево) салате и приказ склероција и мицелије Sclerotinia sclerotiorum на салати (десно и доле) Извор: http://www.insectimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=1571737 15
Особине патогена, епидемиологија и екологија. Висок репродуктивни потенцијал заједно са способношћу за дугорочно преживљавање чине склероције централном компонентом у епидемиологији болести Sclerotinia sclerotiorum. Склероције могу клијати карпогенично или мицелиогенично, зависно од услова спољашње средине, па као резултат тога постоје две засебне категорије болести. Склероције које клијају мицелиогенично производе хифе које директно могу напасти биљна ткива. Склероције које клијају карпогенично производе апотеције и потом аскоспоре које заражавају надземне делове биљака домаћина. Хифе се састоје од хијалина, септиране су, разгранате и вишеједарне, са мицелијом беле до жутомрке боје. Бесполне споре се не образују. Међутим, микроконидије се формирају на хифама или хименијуму апотеција. Ипак, оне не клијају и њихова улога у биологији гљиве и даље је непозната. Већина болести узрокованих овим патогеном инициране су аскоспорама. Апотеције или плодоносна тела Sclerotinia sclerotiorum која образују аскоспоре, формирана су карпогеничним клијањем склероције на или у близини површине земљишта, под оређеним условима спољашње средине. Фактори спољашње средине који условљавају карпогенично клијање укључују температуру земљишта и влагу, а такође и температуру на којој се образују склероције (Bolton et al., 2006). Оптимална температура за развој гљиве је између 18 и 25ºC, а релативна влажност 60-80%. Најповољније температуре за образовање апотеција се крећу између 11 и 15ºC, док испод 5 и изнад 30ºC престаје развој ових органа. За остварење инфекције надземних делова биљака путем аскоспора, потребан је дужи влажан период (Балаж и сар., 2010). Мере заштите. И поред бројних досадашњих истраживања, још нису нађене ефикасне мере заштите од беле трулежи. Примена низа превентивних мера омогућује смањење интензитета заразе на толерантну меру. Дезинфекција земљишта је једна од најзначајнијих мера. Употреба здравог семена и његова дезинфекција могу смањити заразу. Иоако нема отпорних сорти, односно хибрида поврћа према проузроковачима беле трулежи, ипак, међу генотиповима постоје разлике у степену осетљивости (Балаж и сар., 2009). Могу се применити и биолошке мере сузбијања, применом разних антагонистичких микроорганизама, углавном гљива, које паразитирају склероције, 16
односно спречавају клијање. Међу овим гљивама наводе се Coniothirium minutus, Gliocladium canetulatum, G. roseum, Trichoderma harzianum, T. lignorum, T. viridae и Penicillium sp. Данас се комерцијално користи препарат KONI на бази гљиве C. minutus (Маширевић и Јаснић, 2006). Последњих година, све већа пажња се посвећује примени фунгицида у сузбијању проузроковача ове болести. Дезинфекцијом семена је могуће смањити заразу младих биљака. Фолијарна примена системичних фунгицида у циљу заштите плода и стабла, због тешкоћа у техници апликације, често не обезбеђује задовољавајуће ефекте. Против беле трулежи, код нас је регистрован фунгицид на бази просимидона за примену у салати, док код осталих биљака нема регистрованих препарата (Балаж и сар., 2009). Слика 5. Животни циклус Sclerotinia sclerotiorum Извор: http://www.sclerotia.org/lifecycle/ 17
2.3. ДЕГРАДАЦИЈА ПЕСТИЦИДА У БИЉКАМА Након примене у пољу, пестициди доспевају у разне сегменте животне средине: подземне и површинске воде, земљиште, биљке и атмосферу (Bedos et al., 2002). У контакту sa биљком пестицид је подложан ишчезавању и разградњи. Разликујемо абиотске и биотске процесе којима долази до смањења резидуа пестицида (Шовљански и Лазић, 2007). 2.3.1. Абиотски процеси Испаравање је сложен термин који обухвата евапорацију пестицида са биљне површине, као и транспирацију као унутрашњи процес у биљци где се пестицид губи преко водене паре коју биљке излучују преко стома на листу. Међутим, испаравање пестицида са површине биљака зависи од специфичног притиска паре саме супстанце, а на њу утичу и параметри животне средине као што су дневне осцилације температуре и соларног зрачења. У поређењу са испаравањем са земљишта, пестициди испаравају знатно брже са биљака, углавном зависећи од различитих афинитета супстанце да се везује за површину биљака и земљишта. Повећањем влажности ваздуха повећава се афинитет адсорпције, чиме се смањује испаравање (Fantke et al., 2013). Фоторазградња обухвата процес где молекуларна екситација апсорпцијом енергије сунчеве светлости разултира органским реакцијама као што су хидроксилација и декарбоксилација (директна фотолиза) и процес где реактиван кисеоник оксидише функционалне групе пестицида (индиректна фотолиза). Фотодеградација зависи пре свега од метеоролошких услова (интензитет зрачења, ефекти засењивања) на површини биљака, афинитету према формулацији пестицида, као и површинском воштаном саставу кутикуле, пошто се капљице пестицида на бази уља растварају у епикутикуларном воскастом слоју и на тај начин су заштићене од фотодеградације. Стога, велике лисне површине прекривене 18
воштаним слојем представљају идеално место за акумулацију хидрофобних пестицида (Fantke et al., 2013). Постоји неколико фактора који контролишу фотолизу на површини биљке: Фактори животне средине сматра се да бројни фактори као што су метеоролошки услови, тип формулације, карактеристике пестицидног средства и афинитет биљне површине према формулацији, одређују количину пестицида везаних за површину као и земљишни покривач и дебљину надстрешнице биљака. Услови осветљености спектрално зрачење сунчеве светлости на биљној површини је најважније за разумевање ефеката фотолизе. С обзиром да прозорско стакло које се употребљава у уобичајеним стакленицима апсорбује значајну количину светлости у UV-B региону (280-320 nm), овај ефекат филтрирања вероватно смањује преклапање између спектара соларне емисије и блиског UV-апсорпционог спектра многих пестицида. Ефекат формулације формулација пестицида се састоји од активне супстанце, носача попут глине, сурфактаната као оквашивача и агената ширења, неевапорирајућих вискозних стикера, хумектаната и агената пенетрације као што су биљна уља. Ова адитивна средства поседују хидрофобне и хидрофилне делове у молекулу чиме обезбеђују веома сложен медијум за фотолизу пестицида. Анатомија листа листови су покривени заштитном кутикулом која има улогу смањења губитка воде и у заштити биљке од инфекције различитим патогенима. Кутикула је сложене структуре, састављена од пектинског слоја који везује кутин до зидова епидермалних ћелија и слоја епикутикуларног воска на спољашњој страни. Када су стоме отворене молекули гаса могу се ширити унутар и изван и реаговати са великом хидрофилном површином мезофилних ћелија прекривених водом. Већина пестицида су хидрофобни молекули и стога велика 19
површина листова прекривена липидима (кутикула) представља идеално место за акумулацију пестицида. Хемија воска Фотоиндуковане реакције (Katagi, 2004). 2.3.2. Биотски процеси Процеси који се одигравају у биљци, првенствено изазвани метаболизмом, и образовањем, у коначном исходу, нетоксичних производа. Производе метаболичке измене, разградње, називамо метаболити. Карактер и брзина метаболизма је различита, зависи од пестицида, биљке и спољне средине. Пестицид је окарактерисан хемијском структуром, физичко-хемијским својствима као што су испарљивост, растворљивост у води и органским растварачима, односно у липидима и мастима сличним материјама, површински напон. Од значаја је облик формулације, облик и начин примене, иницијална концентрација, величина честица, присуство или одсуство других пестицида и непестицидних супстанци, те њихове интеракције. Биљка карактерише је врста, често и сорта, фенофаза, хабитус, анатомскоморфолошке карактеристике, физиолошка, биохемијска и генетска својства, која утичу на распоред (дистрибуцију) пестицида и њихов метаболизам у биљкама. Тако облик биљке може бити усправан, положен, раширен; облик листова широк, узан, велики, ситни, влакнасти; положај и збијеност листова хоризонталан, висећи, усправан; површина листа длакава, воштана и тд. Од спољних чинилаца најзначајнији су температура, сунчево и UV светло и влага (Шовљански и Лазић, 2007). 20
Слика 6. Шематски приказ интеракција биљка-животна средина са процесима који директно доприносе усвајању пестицида или транспорту у биљкама (празне стрелице) и процесе који директно доприносе ишчезавању пестицида из биљака (попуњене стрелице) (Fantke, 2013). 2.4. ПЕРЗИСТЕНТНОСТ ПЕСТИЦИДА У БИЉКАМА Перзистентност је способност задржавања пестицида у биљци (води или земљишту). Пестициди се класификују према перзистентности, односно брзини разградње, на основу биолошког полувека разградње RL 50 (residue life 50%) времена које треба да протекне да би се иницијална количина, на или у биљци разградила за 50%. Изражава се у данима. Биолошки полувек зависи од гајене културе, иницијалне концентрације, начина примене, климатских чинилаца итд. Снижење садржаја пестицида у биљним ткивима условљено је њиховом способности да материје стране за биљку учини безопасним. Ово се дешава прерасподелом пестицида у органим биљке у процесу њеног раста, излучивањем из биљке са парама воде у процесу транспирације, а такође ексудацијом путем корена у земљиште (Шовљански и Лазић, 2007). 21
Табела 2. Класификација пестицида према брзини разградње и перзистентности у биљкама (Шовљански и Лазић, 2007). Перзистентност Биолошки полувек, RL 50 дани Кратко перзистентни 1,0-3,6 Умерено перзистентни 3,6-6,75 Средње перзистентни 6,75-10,6 Перзистентни 10,6-15,0 Најперзистентнији Преко 15,0 2.5. ОСТАЦИ ПЕСТИЦИДА И ЗАКОНСКА РЕГУЛАТИВА О ОСТАЦИМА ПЕСТИЦИДА Познато је да ће се у одређеном временском року, после примене пестицида на биљци задржати већа или мања количина средства, зависно од природе хемијског средства, начина облика и броја примена, састава и облика формулације, величине капи спреја, климатских и метеоролошких услова, врсте биљке, времена третирања, влажности и типа земљишта и др. Количина пестицидног спреја која је иницијално присутна на биљној површини и која се задржава у/на њој (не мења се квантитативно и квалитативно под утицајем атмосфералија), назива се депозит. Од овог депозита, убрзо након образовања, извесна количина се отресе са биљке, док се други део депозита смањује услед испаравања. Део који се задржава на површини биљке који је подвргнут метеоролошким утицајима и процесима који изазивају измене, комплексације, изомеризације, разградње и др., као и миграције, назива се резидуа-остатак. Резидуе представљају активну супстанцу, изомере и метаболите (производ метаболичке разградње) и налазе се на/у пољопривредној култури, животним намирницама, дечијој храни, 22
сточној храни и др. Остаци пестицида изражавају се у mg/kg свеже материје (Шовљански и Лазић, 2007). С обзиром да је људска безбедност најзначајнији фактор у производњи хране, превазилазећи чак и очигледан значај економских фактора, основани су међународни системи правне контроле са циљем спречавања доспевања остатака контаминираних производа у људску исхрану. Стога, важан аспект безбедности хране јесте контрола остатака пестицида у храни (Pico et al., 2006). Цео регулаторни и контролни систем је постављен тако да количине остатака пестицида које се могу наћи у храни морају бити нешкодљиве за људе и животиње и истовремено најниже могуће, што опет мора бити у директној вези са најнижим количинама пестицида које се примењују да би се остварио потребан ниво заштите гајених биљака, дозвољеним максималним бројем понављања ових третмана у току једне сезоне, као и крајњим роковима употребе у сезони (Секулић, 2010). Да би се осигурала безбедност хране за потрошаче и да би се заштитило здравље истих, треба тежити мониторингу остатака пестицида у прехрамбеним производима. Стога, дозвољени нивои остатака пестицида у намирницама су законски регулисани постављањем максимално дозвољених количина остатака (МДК) који ограничавају врсте и количине пестицида које могу легално бити присутне у храни, што је одређено различитим регулаторним телима који минимизирају изложеност потрошача штетном или непотребном уношењу пестицида. Поред тога максимално дозвољене количине остатака помажу да се осигура правилна употреба пестицида кроз овлашћења и регистрације (количине примене и каренце) и дозвољава слободан промет производа третираних пестицидима (Bakirci et al., 2014). Максимално дозвољене количине (МДК) остатака пестицида се дефинишу као највише дозвољене концентрације пестицидних остатака у или на храни, утврђених на основу принципа добре пољопривредне праксе (GAP-Good Agricultural Practice) да би се осигурало најмање могуће излагање потрошача пестицидима (European Food Safety Authority, 2011). Прописане вредности МДК успостављају се тако што се врши процена краткорочне и дугорочне изложености остацима пестицида путем хране која може бити третирана пестицидима, и поређењем тако успостављених вредности са експериментално дериватизованим вредностима 23
прихватљивог дневног уноса (ADI, од engl. Acceptable Daily Intake) и акутне референтне дозе (ARfD). Наша регулаторна тела су, у протеклом периоду, прихватала МДК вредности које је препоручивала Светска здравствена организација (UN/WHO) или су преузимала вредности прописане у земљама Европске уније. У Европској унији се од 2008. године примењује нова Уредба (396/2005), која прописује јединствену листу МДК вредности која важи за све земље чланице. Данас се прописане вредности МДК код нас формирају у односу на јединствену ЕУ листу. У нашој земљи, од 2014. године, на снази је Правилник о максимално дозвољеним количинама остатака средстава за заштиту биља у храни и храни за животиње и о храни и храни за животиње за коју се утврђују максимално дозвољене количине остатака средстава за заштиту биља (Сл.гласник РС, број 29/14). Да би третиране биљке, односно производи, били потпуно безбедни за потрошаче, мора да прође одређени број дана од примене препарата до жетве или бербе каренца. То је период у којем се примењено средство потпуно разгради или се разгради испод МДК. Ако дозу повећамо изнад препоручене, повећамо број примена, скратимо време између две примене, или на било који начин не поштујемо препоруке произвођача пестицида (што се налази као упутство на етикети), тада каренца не обезбеђује да ће заостали пестицид бити испод МДК. Ако дакле повећамо дозу, тада морамо да продужимо каренцу, ако при препорученој дози не поштујемо време чекања, у време бербе или жетве имаћемо количине пестицида изнад МДК. Ако продужимо време чекања, остаци пестицида биће још нижи (Шовљански и Лазић, 2007). 24
2.6. AНИЛИНОПИРИМИДИНИ Анилинопиримидини су релативно нова класа фунгицида широког спектра деловања са протективним и системичним деловањем против неколико биљних патогена који припадају класама Ascomycetes и Deuteromycetes. Уведени су као ботритициди у различите европске државе средином 1990-их година, али су такође коришћени против многих других патогена попут Venturia inaequalis, Venturia pyrina, Monilinia spp., Septoria pyricola, Pseudocercosporella herpotrichoides и Blumeria graminis (Heye et al., 1994). Фунгициди који припадају класи анилинопиримидина су ципродинил, мепанипирим и пириметанил. Они показују сличну биолошку активност у контроли широког спектра патогена у/на воћу, виновој лози, житарицама и ратарским културама. Ова три једињења садрже заједничку анилино-пиримидинску прстенасту структуру са различитим субституентима у пиримидинском прстену (Roberts and Hutson, 1999). Pyrimethanil Mepanipyrim Cyprodinil Слика 7. Хемијска структура анилинопиримидина Извор: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0261219400000727 Механизам деловања укључује инхибицију биосинтезе метионина и секреције хидролитичких ензима. Анилинопиримидини не показују укрштену резистентност са другим хемијским групама фунгицида. Обимaн мониторинг у пољу показао је високу ефикасност фунгицида из групе анилинопиримидина током низа година и ниједан случај практичне резистентности у свим циљним патогенимa 25
D: амино-киселине и синтеза протеина Милица Пантелић није откривен под комерцијалним условима, укључујући Botrytis и Venturia. Међутим, у условима принуђене селекције, потенцијални ризик од резистентности ових патогена може бити испољен у пољским и лабараторијским испитивањима (Krieger 2001). Табела 3. FRAC Cоde листа: фунгициди разврстани према механизму деловања (FRAC, 2015). МОА Циљно место и код Назив групе Хемијска група Уобичајен назив Коментари FRAC код D1: Синтеза метионина (предложено) АPфунгициди (Аnylino- Pirmidini) Анилинопиримидини Ципродини Мепанипири м Пириметанил Резистентност позната за Botrytis и Venturia, спорадично у Oculimacula. 9 Средњи ризик. 2.6.1. Ципродинил Ципродинил је фунгицид из групе анилинипиримидина који је развијен и уведен од стране Novartis Crop Production AG и први пут пласиран на тржиште 1994. године (Liu et al., 2011). Инхибитор је биосинтезе метионина и секреције хидролитичких ензима гљива. Системични је фунгицид, усваја се од стране биљке након фолијарне примене и транспортује ткивима и акропетално ксилемом. Инхибира продирање и развој мицелије гљива и унутар листа и на самој површини. Користи се као фолијарни фунгицид у житарицама, виновој лози, јабучастом воћу, коштичавом воћу, јагодама, поврћу, ратарским усевима и украсним биљкама и као фунгицид за третирање семена јечма. Сузбија широк спектар патогена, као што су: Tapesia yallundae и T. acuformis, Erysiphe spp., Pyrenophora teres, Rhynchosporium secalis, Botrytis spp., Alternaria spp., Venturia spp., и Monilinia spp., у количинама од 150-1500 g/ha, зависно од усева, патогена и методе апликације (MacBean, 2012). 26
Табела 4. Физичко-хемијске особине ципродинила (Roberts and Hutson, 1999) Назив Хемијски назив (IUPAC) Ципродинил N-4-Cyclopropyl-6-methylpyrimidin-2-yl)aniline Регистарски број 121552-61-2 Молекулска формула C 14 H 15 N 3 Молекулска тежина 225.3 Хемијска структура Растворљивост у води 20 mg l -1 (ph 5), 13 mg l -1 (ph 7), 15 mg l -1 (ph 9) 25 o C К ос 1400 Водени притисак 5.1 x 10-4 Pa (25 o C) Log K ow 4 (ph 5-9) pk a 4.4 Токсиколошке особине токсиколошка истраживања су показала да ципродинил има ниску акутну токсичност [орална/дермална летална доза (LD 50 ) за пацове > 2000 mg/kg ] и не иритира очи и кожу. Сет тестова мутагености показао је да ципродинил нема мутагени потанцијал. У пацовима и зечевима производ није тератоген и нема штетан ефекат на репродукцију или фертилност након излагања две генерације (Heye et al., 1994). Доза без уочљивог ефекта (NOEL) за пацове је 3 mg/kg телесне масе дневно (2 године), за мишеве 196 mg/kg телесне масе дневно (1,5 година), за псе 65 mg/kg телесне масе дневно (1 година). Прихватљиви дневни унос (АDI) је 0,03 mg/kg. Припада III групи отрова (WHO); III, IV групи отрова (EPA). Екотоксиколошке особине: Птице LD 50 за дивље патке >500, белоглаве препелице >2000 mg/kg. LС 50 (8 дана) за дивље патке и белоглаве препелице >5200 mg/kg. 27
Рибе LС 50 (96 h) за калифорнијску пастрмку 2,41 mg/l, плавошкргу сунчаницу 2,17 mg/l. Дафније ЕС 50 (48 h) 0,033 mg/l. Алге Е b C 50 (72 h) за Selenastrum capricornutum 5,21 mg/l. Друге акватичне врсте ЕС 50 за Lemna gibba 7,71; Gammarus sp. 1,8; Ostracoda 1,1; Simocephalus vetulus 0,15; Tamnocephalus 0,12 mg/l. Пчеле LD 50 (48 h, орално и контактно) >100 µg/пчели. Глисте LС 50 (14 дана) за Eisenia foetida 192 mg/kg (MacBean., 2012). Meтаболички путеви хидроксилација на метил групи и фенил- и пиримидин- групама прстена је примарни метаболички пут ципродинила. Цепање анилино-пиримидинске везе је мање заступљен метаболички пут. Хемијска разградња ципродинил је стабилан на хидролитичку разградњу у ph 5-9 пуферским растворима на 25 o C са DT 50 >1 године. Ципродинил се брзо разграђује у води када је изложен UV светлу (DT 50 14 дана). Разградња у земљишту ципродинил је разграђен у земљишту са DT 50 вредностима од 20-60 дана и неекстрактабилне резидуе биле су главне радиоактивне компоненте које су детектоване у биљкама. Метаболизам у биљкама хидроксилација је примарна метаболичка реакција ципродинила у парадајзу. Хидроксилација се дешава на метил групи, пиримидин и фенил прстену (Roberts and Hutson, 1999). Према правилнику Европске Уније Reg. (EU) No 2015/400 максимално дозвољена количина остатака ципродинила (MRLs) у салати износи 15 mg/kg. У Републици Србији према Правилнику о максимално дозвољеним количинама остатака средстава за заштиту биља у храни и храни за животиње и о храни и храни за животиње за коју се утврђују максимално дозвољене количине остатака средстава за заштиту биља, максимално дозвољене количине остатака (МДК) ципродинила у салати износе 15 mg/kg. 28
2.7. ФЕНИЛПИРОЛИ Једињења са широким спектром биолошке активности, нарочито против трулежи корена и палежи клијанаца које узрокују гљиве из класе Ascomiceta, Basidiomiceta i Deuteromiceta. Првенствено се користе за третман семена житарица за контролу патогена семена (Roberts and Hutson, 1999). Овој класи фунгицида припадају фенпиклонил, који се користи као фунгицид за третман семена и флудиоксонил, који је нашао примену како за третман семена тако и као фунгицид за фолијарну примену против проузроковача сиве трулежи, Botrytis cinerea. Оба синтетичка фунгицида су хемијски повезани са пиролнитрином, секундарним метаболитом бројних Pseudomonas врста, који има улогу у системима биоконтроле, нарочито у контроли сиве трулежи јагода (Gullino et al., 2000). Phenylpyrrole Fenpiclonil Fludioxonil Слика 8. Општа структура фенолпирола и структурне формуле фенпиклонила и флудиоксонила (Pillonel and Meyer, 1997). Показано је да третман семена фенилпиролима значајно повећава садржај полиола, нарочито глицерола, у мицелији гљиве. Даље, показано је да је протеин киназа, која може бити укључена у регулацију биосинтезе глицерола, инхибирана фенилпиролима. Ово имплицира да циљно место фенилпирола лежи у путу преношења осмотских сигнала (Pillonel and Meyer, 1997). Њихов предложени механизам деловања је ометање транспортних процеса (шећера и аминокиселина) у плазматичнoj мембрани (Roberts and Hutson, 1999). 29
E: пренос сигнала Милица Пантелић Табела 5. FRAC Cоde листа: фунгициди разврстани према механизму деловања (FRAC, 2015). МОА Циљно место и код Назив групе Хемијска група Уобичајен назив Коментари FRAC код Е2: МАР/хистидин киназа у преносу осмотских сигнала РPфунгициди (Phenyl- Pyrroles) фенилпироли Фенпиклонил Флудиоксонил Резистентност се јавља спорадично; низак до средњи ризик; потребно управљање резистентношћу 12 2.7.1. Флудиоксонил Флудиоксонил је фунгицид из групе фенилпирола, објављен од стране Ciba- Geigy AG као нови фунгицид за третман семена и фолијарну примену. Први пут је је пуштен у продају 1993. године за третирање семена и 1995. године као фолијарни фунгицид, у Француској. Несистемични је фунгицид са дугим резидуалним деловањем. Усвајање у биљна ткива и куративна својства су генерално ограничени. Инхибира углавном клијање конидија, и, у мањем обиму, клицине цеви и пораст мицелије. Користи се као фунгицид за третирање семена, за контролу Fusarium spp., Microdochium, Rhizoctonia, Tilletia, Pyrenophora и Septoria у усевима житарица и осталих усева, у количини 2,5-10 g/100 kg. Као фолијарни фунгицид, користи се за контролу Botrytis, Monilinia, Sclerotinia и Alternaria, у виновој лози, коштичавом воћу, поврћу и украсним биљкама, у количини 250-500 g/ha; користи се и за третман после бербе на коштичавом воћу, јабучастом воћу, цитрусима и кивију, у количини 30-60 g/ha, против Botrytis, Monilinia и Penicillium (MacBean, 2012). Флудиоксонил је аналог пиролнитрина са субституентима у фенил прстену, који га чине стабилнијим на светлост, што омогућава његову примену као фолијарног фунгицида у борби против Botrytis cinerea и релевантних патогена. Инхибира углавном клијање конидија, и, у мањем обиму, клицине цеви и пораст мицелије. Узрокује морфолошке промене клицине цеви (т.ј. отицање, абнормално гранање и прскање ћелије). Ови ефекти су слични променама узрокованим дикарбоксимидима (Rosslenbroich and Stuebler, 2000). 30
Табела 6. Физичко-хемијске особине флудиоксонила (Roberts and Hutson, 1999) Назив Хемијски назив (IUPAC) Флудиоксонил 3-Cyano-4-(2,2-difluoro-1,3-benzodiokol-4-yl)pyrrole Регистарски број 131341-86-1 Молекулска формула C 12 H 6 F 2 N 2 O 2 Молекулска тежина 248.2 Хемијска структура Растворљивост у води 1.8 mg l -1 у води на 25 o C К ос 12,100-386,000 Водени притисак 3.9 x 10-7 Pa (25 o C) Log K ow 4.12 у дестилованој води Токсиколошке особине: Орална Акутна орална LD 50 за мужјаке пацова 1617, женке пацова 589 mg/kg. Кожа и очи Акутна перкутана LD 50 за пацове >2000 mg/kg. Не иритира кожу и очи (зечеви). Инхалациона LС 50 (4 h) за пацове > 3740 mg/m 3 (aеросола). Доза без уочљивог ефекта NOEL (90 дана и 1 година) за псе 50 ppm (1,67 mg/kg телесне масе дневно); (2 године) за пацове 25 ppm (1,2 mg/kg телесне масе дневно). Прихватљиви дневни унос АDI 0,005 mg/kg телесне масе дневно. Остало У Амес тесту није показао мутагено дејство; није тератоген (зечеви и пацови). Класа токсичности WHO (aктивна супстанца) III; EPA (формулација) III. Екотоксиколошке особине: Птице Акутна орална LD 50 за белоглаву препелицу 1608 mg/kg. LС 50 (6 дана) за белоглаву препелицу > 5317 mg/kg, за дивље патке > 4970 mg/kg хране. Рибе LС 50 (96 h) за плавошкргу сунчаницу 2,13, калифорнијску пастрмку 5,84 mg/l. 31
Дафније ЕС 50 (48 h) 30,9 mg/l. Алге Е r C 50 (96 h) за Selenastrum capricornutum 0,0031 mg/l; ЕС 50 за Anabaena flos-aquae 32,5 mg/l. Друге акватичне врсте ЕС 50 (14 дана) за Lemna gibba 0,00243 Пчеле LD 50 (орално) >170 µg/пчели; (контактно) > 194 µg/пчели. Глисте LС 50 (14 дана) за Eisenia foetida 219 mg/kg сувог земљишта (MacBean., 2012). Метаболички путеви флудиоксонил је стабилан на хидролитичку разградњу и разградњу у земљишту. Оксидација и хидратација цијано групе је опажена у и на површини земљишта и вероватно је резултовала од фотолитичке активности до одговарајућих амида и карбоскилних киселина. Обимна разградња се јавља на пирол прстену у биљкама и животињама, укључујући хидроксилацију и оксидацију праћене отварањем прстена. Хемијска разградња стабилан је на хидролитичку разградњу (више од 30 дана на 25 o C) преко рh од 5-9. Разгради се на рh 7 пуферском раствору када се изложи UV светлу, са процењеном DT 50 вредности од 10 дана. Разградња у земљишту - Према наводима EFSA (2007), фотолиза игра главну улогу у начину и динамици разградње флудиоксонила у земљишту. Главни метаболити се образују на светлу, али не и у мраку. Флудиоксонил се користи за фолијарну примену и за третман семена, а изразита улога фотолизе у разградњи флудиоксонила и формирања метаболита резултује у главним разликама у његовој судбини и понашању, када се користи за фолијарно третирање или за третирање семена. У истраживањима у којима је флудиоксонил примењен у облику WP формулације на земљишту или виновој лози, полу-животи су се кретали од 8 43 дана. У истраживањима фотолизе у земљишту, фотодеградација је била бржа, указујући да је флудиоксонил веома ниско перзистентан у земљишту када се директно изложи светлости. Метаболизам у биљкама истраживања биљног метаболизма су спроведена са пшеницом и виновом лозом. Семена пшенице третирана са флудиоксонилом оцењивана су у различитим временским 32
интервалима након сетве. Приближно 80% 14 С-резидуа су заостала у земљишту. Остаци су локализовани у кореновом систему са занемарљивим резидуама у листовима и зрну (Robеrts and Hutson, 1999). Према правилнику Европске Уније Reg. (EU) No 2015/845 максимално дозвољена количина остатака флудиоксонила (MRLs) у салати износи 40 mg/kg. У Републици Србији према Правилнику о максимално дозвољеним количинама остатака средстава за заштиту биља у храни и храни за животиње и о храни и храни за животиње за коју се утврђују максимално дозвољене количине остатака средстава за заштиту биља, максимално дозвољене количине остатака (МДК) флудиоксонила у салати износе 15 mg/kg. 2.8. ОДРЕЂИВАЊЕ ОСТАТАКА ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА Резидуално понашање пестицида у салати од нарочитог је интереса јер јестиви део овог поврћа одговара целој површини третираној пестицидима. Стога, након примене, хемикалије су у потпуности нагомилане на усеву (Cabizza et al., 2007). González-Rodríguez et al. (2008), су испитивали остатке 23 фунгицида и инсектицида у 75 узорака зеленог и лиснатог поврћа (блитва, спанаћ и салата) прикупљених из Ourens-а (југозападна Шпанија) током пролећа 2007. године. У 15 од укупно 75 узорака, остаци пестицида су били изнад максимално дозвољене количине (МДК). Највеће концентрације фунгицида пронађене су у зеленој салати (просимидон 12 mg/kg), а највеће концентрације инсектицида у блитви (циперметрин 6 mg/kg). Више концентрације пестицида у салати у поређењу са блитвом и спанаћом, пронађене су услед тога што је салата осетљива на присуство штеточина и што изискује узастопне третмане пестицидима, а као последица се 33
јављају виши нивои остатака који се толеришу. Мarin et al. (2003) су испитивали деградацију ципродинила и флудиоксонила након примене за контролу болести у салати и грожђу. Гасна хроматографија са азот-фосфорним детектором је коришћена за проучавање деградације ових једињења из биљака у пољским условима и током хлађења. Фунгицид SWITCH (Syngenta, Basel, Switzerland) је коришћен у југоисточној Шпанији за контролу сиве плесни (Botrytis cinerea) у стоном грожђу и беле плесни (Sclerotinia minor и Sclerotinia sclerotiorum) у салати. Двоструко дејство овог производа огледа се у томе што садржи две активне материје из различитих хемијских група, анилинопиримидинске (ципродинил) и фенилпиролске (флудиоксонил). Вредности остатака 21 дан након третмана били су испод МДК вредности (МДК=0,05 mg/kg) утврђених у Шпанији у пољском огледу за оба једињења. Fenoll et al. (2009) су испитивали деградацију три инсектицида (пиримикарб, пирипроксифен и бупрофезин) и три фунгицида (ципродинил, флудиоксонил и тебуконазол) у паприци гајеној у стакленичкој производњи. Гасна хроматографија са азот-фосфорним детектором (GC-NPD) је коришћена за испитивање деградације ових једињења у паприци. С обзиром да су ципродинил и флудиоксонил исте формулације, они су се разматрали заједно у овом истраживању. Након првог третмана, стопа смањења ципродинила била је значајно већа него флудиоксонила, док су након другог третмана полу животи износили 7,31 и 9,77 дана за ципродинил и флудиоксонил, редом. Недељу дана након третмана, ниво остатака ципродинила био је испод МДК (0,5 mg/kg), док је за флудиоксонил (1 mg/kg) био испод МДК непосредно након третмана. У моменту истека каренце, нивои остатака су били испод МДК вредности прописаних у Шпанији. Garau et al. (2002) су испитивали деградацију азоксистробина, пириметанила, ципродинила и флудиоксонила у парадајзу из стакленика. У време истека каренце, осим ципродинила, остаци свих других пестицида су били испод МДК вредности утврђених у Италији. Недељу дана након примене ниво остатака ципродинила је био изнад МДК (0,5 mg/kg), док је за флудиоксонил ниво остатака био испод МДК (1 mg/kg), одмах након примене препарата. Истраживање механизама ишчезавања ових фунгицида показало је да је смањење резидуа флудиоксонила било услед фоторазградње, док су евапорација и кодестилација процеси који су приписани смањењу резидуа ципродинила. 34
Liu et al. (2011) су испитивали разградњу ципродинила у пољским условима и у условима стакленичке производње у Кини. Полу век разградње је износио 14,5 и 12,5 дана у јагодама и земљишту, редом, у пољским условима, односно 5,5 и 6,5 дана, редом, у стакленику. Резултати су указали да су стопе деградације у стакленичким условима биле много брже него у пољским условима, било у јагодама или земљишту. Крајње резидуе у јагодама биле су испод МДК вредности прописаних у ЕУ (5 mg/kg), 7 дана након примене. Melo et al. (2012) су развили нови метод за одређивање 10 пестицида који се примењују у производњи зелене салате (ацетамиприд, азоксистробин, ципродинил, фенексамид, флудиоксонил, фолпет, ипродион, металаксил, пиримикарб и толифлуанид) користећи екстракцију на чврстој фази (SPME) и течну хроматографију (HPLC) са детектором са низом диода (DAD). Детектор са низом диода, иако мање моћан од осталих детектора има ту предност што се лакше савлада и користи, омогућавајући квантификацију ових пестицида испод максимално дозвољених нивоа остатака ових једињења у салати. Метод је омогућио одређивање азоксистробина, ципродинила, фенексамида, флудиоксонила, фолпета, ипродиона и толифлуанида у зеленој салати при концентрацијама између 0,8 и 25,6 mg/kg, односно, испод максималних нивоа остатака дозвољених за ова једињења у салати. Предложена методологија може се користити за скрининг пестицида у узорцима салате или за проучавање деградације ових једињења у периоду након истека каренце. 35
3. ЗАДАТАК И ЦИЉ РАДА Задатак рада је валидација методе одређивања остатака фунгицида ципродинила и флудиоксонила у салати, високоперформантном течном хроматографијом (HPLC), дефинисањем параметара екстракције и пречишћавања, као и основних валидационих параметара у складу са захтевима стандарда SANCO/1257/2013. Такође, задатак рада је и постављање огледа на локалитету Прово (општина Владимирци), примена препарата SWITCH 62,5-WG против микоза салате и узорковање салате 2 сата након третирања, након 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 дана и након 15 дана (дан по истеку каренце). Циљ овог рада је да се валидованом методом прати деградација фунгицида ципродинила и флудиоксонила у салати гајеној на отвореном пољу након примене препарата SWITCH 62,5-WG (ципродинил + флудиоксонил 375 g/l + 250 g/l; Syngenta) у препорученој количини. Пратиће се разградња ципродинила и флудиоксонила, 2 сата након третирања, након 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 дана и након 15 дана (дан по истеку каренце) уз утврђивање полу-века разградње. На основу резултата истраживања добиће се увид у постојаност ципродинила и флудиоксонила у салати, након њихове примене. Утврдиће се вредност DT 50 и проверити да ли је постављена каренца за ципродинил и флудиоксонил у Европској Унији примењива и у нашој земљи, с обзиром да препарат није регистрован за примену у салати. 36
4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ 4.1. БИЉНИ МАТЕРИЈАЛ Салата (Lactuca sativa L., сорта Сетер) је расађена на отвореном пољу површине 40 ари, априла 2015. година, на локалитету Прово (општина Владимирци). Међуредно растојање износило је 30 cm, а растојање имеђу биљака 25 cm, чиме је обезбеђен склоп од 11 биљака по метру квадратном. Слика 9. Локалитет Прово, 2015. godine (Извор: Брзаковић, Н.) 37
4.2. ПОЉСКИ ОГЛЕД У циљу заштите од проузроковача сиве трулежи (Botrytis cinerea) и проузроковача беле трулежи (Sclerotinia sclerotiorum), салата је третирана препаратом SWITCH 62,5-WG (ципродинил + флудиоксонил 375 g/l + 250 g/l; Syngenta), у препорученој количини примене од 0,6-0,8 kg/ha, уз утрошак од 400 l воде/ha. Препарат је примењен фолијарно, прскалицом Villager lela 15. Током трајања огледа салата је наводњавана системом вештачког кишења, употребом распрскивача. У Републици Србији препарат SWITCH 62,5-WG није регистрован за ову намену, али је у земљама у окружењу (Република Хрватска) регистрован (Цвјетковић, 2005). Обзиром на ефикасност поменутог препарата у сузбијању горе поменутих обољења, и у нашој земљи произвођачи подлежу његовој све чешћој примени у усеву салате, без обзира што није регистрован за ту намену. Отуда и интересовање за праћење деграције фунгицида ципродинила и флудиоксонила у салати. 4.3. ПРИПРЕМА УЗОРАКА ЗА АНАЛИЗУ Узорковање салате изведено је случајним избором, са више места у оквиру експерименталне парцеле, са циљем обезбеђења репрезентативног узорка. Прво узорковање извршено је по сушењу депозита (нулти дан), након 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 15 дана. Такође, узети су и узорци нетретиране салате, који су коришћени за валидацију методе. Просечни узорци салате транспортовани су до лабораторије, где су припремљени лабораторијски узорци масе 100 грама, који су до момента анализе чувани у режиму дубоког замрзавања. Експериментални део испитивања обављен је у "Лабораторији за биолошка испитивања и пестициде", Департмана за фитомедицину у заштиту животне средине, Пољопривредног факултета у Новом Саду, током јануара 2016. године. 38
4.4. ХЕМИКАЛИЈЕ Ципродинил аналитички стандард 98,5% (Dr Ehrenstorfer, Germany), Флудиоксонил аналитички стандард 99,0% (Dr Ehrenstorfer, Germany), Ацетонитрил, HPLC чистоће (''J.T.Baker'', Darmstadt, Germany), Сирћетна киселина (''J.T.Baker'', Darmstadt, Germany), QuECheRS Extract Pouches, EN Method Cat. No. 5982-0650 QuECheRS Dispersive SPE Kit, Part No. 5982-5356. 4.5. АПАРАТУРА Течни хроматограф Agilent Technologies, 1100 Serie, Колона Zorbax Eclipse XDB-C18 (50 mm 4.6 mm, 1.8 μm), Agilent Technologies, Филтери за мобилну фазу Hewlett Packard, Nylon Filter Membranes 9301-0895; 47 mm, pore size 0.45 µm, Аналитичка вага Shimadzu A 200, USK 1 ултразвучна када, Sonic SR, Gadžin Han, Упаривач Stuart SBH130D/3 Digital Block Heater, Vortex Mixer Scientific Industries Genie 2 Digital SI-A236 Центрифуга Sigma 2/6E 4.6. ПРИПРЕМА РАСТВОРА Основни раствор. На аналитичкој ваги је у нормалном суду од 10 ml одмерено 10 mg аналитичког стандарда ципродинила чистоће 99%. Стандард је растворен у ацетонтрилу и чуван у фрижидеру. Концентрација основног раствора била је 0,99 mg/ml. Исто је поновљено и за флудиоксонил, с тим да је 10,4 mg аналитичког стандарда овог једињења чистоће 98,5% растворено у ацетонитрилу. Концентрација основног раствора била је 1,02 mg/ml. 39
Радни раствор. Разблажењем основног раствора стандарда примењена је серија раствора концентрације 0,1 40 µg/ml. Ове концентрације употребљене су за испитивање приноса екстракције и дефинисања хроматографских услова коришћењем следећих параметара: Линеарност одговора детектора Лимит детекције (LOD) Лимит квантификације (LOQ) Поновљивост Тачност Матрикс ефекат 4.7. HPLC-DAD АНАЛИЗА За одређивање ципродинила и флудиоксонила у салати примењена је течна хроматографија (HPLC) са детектором са низом диода (DAD) (Слика 10). Најбоље одређивање ципродинила и флудиоксонила постигнуто је под условима датим у Табели 7. Слика 10. Течни хроматограф Agilent Tecnologies1100 Series Извор: Оригинал 40
Табела 7. Услови рада HPLC/DAD Мобилна фаза A 0,5% CH 3 COOH B ацетонитрил Однос мобилних фаза 40/60 Температура колоне 25 C Проток кроз колону Таласна дужина DAD 0,9 ml/min 254 nm Ињектована запремина 10 µl 4.8. ДЕФИНИСАЊЕ ХРОМАТОГРАФСКИХ УСЛОВА Валидација методе спроводи се у складу са захтевима стандарда SANCO/1257/2013, који подразумева проверу хроматографских услова испитивањем линеарности одзива детектора, прецизности и тачности методе, као и одређивањем границе детекције и квантификације. Линеарност одзива детектора проверена је ињектовањем раствора стандарда ципродинила и флудиоксонила концентрације 0,1-20 µg/ml. Израчунавањем нагиба праве приказана је линеарност зависности површине пика од концентрације аналита. Лимит детекције (LOD) и лимит квантификације (LOQ) је одређен на основу односа сигнал/шум базне линије (S/N). S/N је одређен мерењем сигнала аналита који се налази у ниској концентрацији и узорка без аналита, при чему је утврђена најнижа концентрација аналита коју је могуће детектовати. За лимит детекције узета је вредност концентрација која даје S/N=3. Лимит квантификације одређен је аналогно одређивању LOD, према S/N=10. 41
Поновљивост је одређена ињектовањем раствора мешавине стандарда ципродинила и флудиоксонила у ацетонитрилу, концентрације 1,0 µg/ml пет пута и проверена израчунавањем релативне стандардне девијације. Тачност је одређена као проценат аналитичког поступка recovery за познату додату количину аналита у нетретиране узорке салате. 4.9. ПРОВЕРА ПРИНОСА ЕКСТРАКЦИЈЕ ЦИПРОДИНИЛА И ФЛУДИОКСОНИЛА ИЗ САЛАТЕ QuEChERS МЕТОДОМ Екстракција ципродинила и флудиоксонила из салате изведена је применом QuEChERS методе. Анализа је спроведена коришћењем нетретиране салате која је до момента анализе чувана у режиму дубоког замрзавања. Нетретирани узорци салате - контрола, претходно су уситњени и хомогенизовани ручним блендером. На ваги је измерено 10 г узорка и пренесено у полипропиленску кивету од 50 ml. Овако припремљеном узорку додата је одговарајућа количина стандарда ципродинила и флудиоксонила запремина од 1 ml раствора - крајња концентрација 0,1; 1; 10; 20 и 40 µg/ml. Киветa је затворена и остављена у фрижидеру преко ноћи. Слика 11. Припрема узорака за анализу Извор: Оригинал 42
Након тога, додато је 9 ml ацетонитрила (укупна запремина ацетонитрила 10 ml), снажно мућкано 1 минут ручно, потом 1 минут на вортексу а затим је додата припремљена пуферска смеша соли (4,0 g магнезијум-сулфата, 1,0 g натријумхлорида, 1,0 g натријум-цитрата-дихидрата и 0,5 g динатријум-цитратасесквихидрата). Одмах је интезивно мућкано по 1 мин ручно и на вортексу. Потом су кивете пренесене у ултразвучно купатило на 10 минута. На крају је центрифугирано 5 мин на 3000 обртаја/мин (Слика 12). Слика 12. Даљи ток екстракције ципродинила и флудиоксонила из салате Извор: Оригинал Након тога уследило је пречишћавање екстракта (Слика 13). Аликвот 6 ml је пренесен у полипропиле нску кивету Додата је пуферска смеша соли 900 mg MgSO 4 и 150 mg PSA Снажно је мућкано 1 min Центрифугирано 5 min на 3000 rpm 43
Слика 13. Поступак пречишћавања екстракта (Извор: Оригинал) Од аликвота је узето 3 ml, пренесено у епрувете и упаравано до крајње запремине од 1 ml. Након тога, екстракт је профилтриран кроз 0,45 µm мембрански филтер, пренесен у виал и анализиран на HPLC/DAD. Слика 14. Припрема за HPLC/DAD анализу (Извор: Оригинал) 44