ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ# ΕΝΩΣΗ#ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ# Υπουργείο Παιδείας και Θρησκευμάτων, Πολιτισμού και Αθλητισμού Ε.#Π.#Ανταγωνιστικότητα#και#Επιχειρηματικότητα#(ΕΠΑΝ#ΙΙ),#ΠΕΠ#Μακεδονίας# #Θράκης,#ΠΕΠ#Κρήτης#και#Νήσων#Αιγαίου,#ΠΕΠ# Θεσσαλίας# #Στερεάς#Ελλάδας# #Ηπείρου,#ΠΕΠ#Αττικής ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΣ ΒΟΗΘΟΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ELECTRONIC MOLECULAR DIAGNOSTICS ASSISTANT ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π1.2 Διαδικασίες Αξιολόγησης, Διασφάλισης Ποιότητας, Επικύρωσης και Επαλήθευσης Αποτελεσμάτων και Επιτευγμάτων Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: DYNACOMP A.E. (4) Ημερομηνία: 10/02/2014 Ιστορικό Εγγράφου Έκδοση Ημερομηνία Κατάσταση 0.1 15/11/2013 Προσχέδιο 1.0 15/12/2013 1 η έκδοση Τελική 10/02/2014 Τελικό Προετοιμασία - Ονομ./Επώνυμο, (#Φορέα) - Ν. Αχιλλεόπουλος, (4) Γ. Ποταμιάς, (3) Γ. Πατρινός, (1) Ν. Αχιλλεόπουλος, (4) Γ. Πατρινός, (1) Ν. Αχιλλεόπουλος, (4) Γ. Πατρινός, (1) * Κ: Κοινοπραξία έργου, EE: ΕΥΔΕ- ΕΤΑΚ, Δ: Δημόσιο έγγραφο (ελεύθερο, π.χ., Web- Site έργου) Διανομή* K K EE
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στον τομέα της φαρμακογονιδιωματικής και της εξατομικευμένης ιατρικής, έχει καταστεί προφανές ότι τα πληροφοριακά συστήματα και οι εφαρμογές των βάσεων δεδομένων που παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την εμφάνιση και τις συνέπειες των γενετικών παραλλαγών που εμπλέκονται στην φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική, την αποτελεσματικότητα και την τοξικότητα των φαρμάκων, θα γίνουν αναπόσπαστο εργαλείο για τους ερευνητές της βιοϊατρικής και θα επηρεάσει τη κλινική πρακτική. Σε αυτό το παραδοτέο, παρουσιάζουμε τις διαδικασίες αξιολόγησης που θεσπίστηκαν, ώστε να διασφαλιστεί η ποιότητα και εν συνεχεία, η επικύρωση και επαλήθευση των αποτελεσμάτων/ επιτευγμάτων του έργου. EXECUTIVE SUMMARY In the area of pharmacogenomics and personalized medicine, it has become evident that information systems and database applications providing important information on the occurrence and consequences of gene variants involved in pharmacokinetics, pharmacodynamics, drug efficacy and drug toxicity, will become an integral tool for researchers and medical practitioners alike. In this deliverable, we first proceed with the assessment procedures adopted to ensure the quality and then the validation and verification of results/ achievements of the project. ΕΠΑΝ ΙΙ- ΣΠ- - emodia 1 /5 Παραδοτέο Π1.2
ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. Εισαγωγικά Στοιχεία... 3 2. Φάση 1: Έρευνα και Ανάπτυξη... 4 3. Φάση 2: Οι Τεχνολογίες και Υπηρεσίες του Έργου... 5 Αναφορές... 5 ΕΠΑΝ ΙΙ- ΣΠ- - emodia 2 /5 Παραδοτέο Π1.2
1. Εισαγωγικά Στοιχεία To 2000, στο έγκριτο περιοδικό Science παρουσιάστηκε το ενδεχόμενο ενός συστήματος υγείας, στα πλαίσια του οποίου η γενετική πληροφορία του κάθε πολίτη καταγράφεται με ασφάλεια και εχεμύθεια, λίγο μετά τη γέννησή του. Ο όρος «γενετική πληροφορία» αφορά την παρουσία ή απουσία συγκεκριμένων γονιδιακών παραλλαγών που σχετίζονται με την προδιάθεση στην ασθένεια ή/και την απόκριση σε φάρμακα. Η εν λόγω γενετική πληροφορία δε θα είναι στατική, αλλά θα εμπλουτίζεται κατά τη διάρκεια της ζωής του πολίτη, παρέχοντας τη δυνατότητα επιλογών, ευνοϊκών για την υγεία και την ποιότητα ζωής του ατόμου [1]. Το εν λόγω ανάγνωσμα αποτέλεσε τη βάση για τη σύλληψη και το σχεδιασμό του παρόντος ερευνητικού έργου. Είναι αλήθεια πως μια δεκαετία μετά την ολοκλήρωση του Προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος - Human Genome Project, θα αναμένετο η Ιατρική γενετική να είναι σήμερα μια κοινή κλινική πρακτική. Εντούτοις, καθίσταται σαφές πως η διαθέσιμη γενετική γνώση δεν έχει ακόμη μεταφραστεί σε ικανοποιητικό βαθμό σε κλινικά χρήσιμη πληροφορία. Σημαντικό εμπόδιο αποτελεί, επίσης, η επονομαζόμενη «γονιδιωματική υπερφόρτωση» του Παγκόσμιου Ιστού, με την πληθώρα των ιστοσελίδων και των βάσεων δεδομένων με βιολογικά δεδομένα. Είναι, ωστόσο, οξύμωρο πως για την απάντηση ενός συγκεκριμένου βιολογικού ερωτήματος, οι εμπλεκόμενοι ερευνητές ή/ και κλινικοί κατακλύζονται από την πληθώρα των διαθέσιμων πηγών πληροφοριών και γνώσεων σε βαθμό που η ίδια η απάντηση να παραμένει ασαφής. Παραμένει, λοιπόν, ακόμη αναπάντητη η πρόκληση για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη ολοκληρωμένων διαδικτυακών πληροφοριακών συστημάτων, τα οποία: (i) να διασυνδέουν μεγάλους όγκους και πηγές φαρμακογονιδιωματικών πληροφοριών (π.χ. φαρμακογονιδιωματικές συσχέτισης γονότυπου- φαινότυπου) σε μια ενιαία διαδικτυακή πύλη και (ii) να εξασφαλίζουν την ευέλικτη και άμεση ενημέρωση των σχετικών βάσεων δεδομένων με νέα ευρήματα από τη φαρμακογονιδιωματική έρευνα [2]. Το παρόν έργο αποτελεί συνισταμένη πειραμάτων γονοτύπισης, τεχνολογικής έρευνας, συστημάτων ολοκλήρωσης μεγάλης κλίμακας, δοκιμών και δραστηριοτήτων διάδοσης/ αξιοποίησης σε μια σύνθετη αλληλεπίδραση. Ως εκ τούτου, τηρείται μια σαφή και καλά δομημένη στρατηγική, η οποία περιλαμβάνει τις διαδικασίες αξιολόγησης, προκειμένου να διασφαλιστεί η ποιότητα και η επικύρωση/ επαλήθευση των αποτελεσμάτων του έργου, σε αντιστοιχία με τις φάσεις του. ΕΠΑΝ ΙΙ- ΣΠ- - emodia 3 /5 Παραδοτέο Π1.2
2. Φάση 1: Έρευνα και Ανάπτυξη Σε αυτό το σημείο, τέθηκαν οι προδιαγραφές των απαιτήσεων των χρηστών, περιλαμβάνοντας μια σειρά από ολοκληρωμένα, διεπιστημονικά «καθήκοντα» έρευνας και τεχνολογίας. Πρώτα, προσδιορίστηκαν οι γενετικές/ γονιδιωματικές ερευνητικές μελέτες του έργου και πρωτίστως, η αξιολόγηση, επικύρωση και επαλήθευσή τους. Για το σκοπό αυτό, θα αναπτυχθούν θα επικυρωθούν θα επαληθευτούν και θα εφαρμοστούν μέθοδοι γονοτύπισης προς διασφάλιση της ποιότητας των αποτελεσμάτων σε καθημερινή βάση. Συγκεκριμένα, αποσκοπώντας στην επικύρωση των ευρημάτων κατά τη διερεύνηση της ΔΠΑ, κατόπιν εφαρμογής των μικροσυστοιχιών, θα επιλεχθούν εκείνοι οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs), που θα εμφανίσουν τις πιο ισχυρές συσχετίσεις. Θα επιλεγούν, συνεπώς, εκείνοι οι πολυμορφισμοί που (i) έχουν τιμή p < 10-5, (ii) στη βάση του πιο κοντινού γονιδίου, της σχέσης του με τη ΔΠΑ και τη θέση του SNP σε αυτό το γονίδιο (προτεραιότητα δόθηκε στους ιντρονικούς και εξωνικούς πολυμορφισμούς) και τέλος, (iii) απορρίπτοντας τους πολυμορφισμούς σε ανισορροπία σύνδεσης (D =1, r 2 >0,98). Για εκείνους τους πολυμορφισμούς που θα ικανοποιήσουν τα παραπάνω κριτήρια θα εφαρμοστεί άμεση γονοτύπιση στα ίδια αρχικά δείγματα. Στην περίπτωση της ΑΜΣ, η επικύρωση θα επιτευχθεί με το σχεδιασμό και την εφαρμογή ποικίλων τύπων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, αλλά και αλληλούχισης κατά Sanger. Σε καθε περίπτωση, κάθε γονίδιο/ βιοδείκτης θα μελετηθεί ξεχωριστά, με την ανάπτυξη της βέλτιστης για αυτό(ν) μεθοδολογίας. Το πρώτο αναλυτικό βήμα αφορά τον σχεδιασμό των εκκινητών. Ο σχεδιασμός των εκκινητών θα γίνει με τη βοήθεια μιας σειράς υπολογιστικών προγραμμάτων. Αρχικά, θα εντοπιστεί η ακριβής θέση των υπό μελέτη παραλλαγών μέσω της βάσης δεδομένων Ensembl (http://www.ensembl.org/), όπου δίδεται και μέρος της αλληλουχίας που περιβάλλει τον εκάστοτε πολυμορφισμό. Ο σχεδιασμός των εκκινητών θα γίνει έτσι, ώστε το προϊόν της PCR να περικλείει τον πολυμορφισμό περίπου στο κέντρο του. Σε αυτό το σημείο, θα γίνει χρήση του προγράμματος Primer3 (v. 0.4.0) (Koressaar and Remm 2007) (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Επίσης, μέσω του Primer3 θα ελεγχθούν οι βασικές παράμετροι, όπως η θερμοκρασία τήξης (Tm) των εκκινητών και η ποσοστιαία σύστασή τους σε βάσεις γουανίνης και κυτοσίνης (GC content). Ο κάθε εκκινητής θα ελεγχθεί περαιτέρω ως προς το αν εμφανίζει συμπληρωματικότητα, είτε με τον εαυτό του (self- complementarity) ή με τον έτερο εκκινητή, μέσω του προγράμματος DNAMAN ή εναλλακτικά του DINAMELT two- state melting (hybridization), το οποίο εντοπίζεται στον σύνδεσμο (http://mfold.rna.albany.edu/?q=dinamelt/two- state- melting). Θα διερευνηθεί, ακόμη, η ειδικότητα των εκκινητών ως προς το ανθρώπινο γονιδίωμα. Για το λόγο αυτό, θα χρησιμοποιηθεί ο αλγόριθμος BLAST (Basic Local Alignment Tool) του Ensembl. Τέλος, με τη βοήθεια του DINAMELT two- state melting (folding) θα καταλήξουμε στις δευτεροταγείς δομές του προϊόντος στον ακριβή σύνδεσμο (http://mfold.rna.albany.edu/?q=dinamelt/two- state- folding). Στον τελευταίο έλεγχο, ανασταλτικός παράγοντας της επιλογής των εκκινητών αποτελεί η δημιουργία βρόγχου στην περιοχή των εκκινητών, ενώ προτιμώνται τιμές διαφοράς στην ελεύθερη ενέργεια του Gibbs (ΔG) μεταξύ - 1 και +1. Ανάλογα, λοιπόν, με το υπό μελέτη γονίδιο/βιοδείκτη, θα αναπτυχθεί, θα ΕΠΑΝ ΙΙ- ΣΠ- - emodia 4 /5 Παραδοτέο Π1.2
επικυρωθεί και θα εφαρμοστεί (i) η διαδικασία PCR- ARMS (Polymerase Chain Reaction Amplification Refractory Mutation System), (ii) η διαδικασία PCR- RFLP (Polymerase Chai Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism) και τέλος, (iii) η αλληλούχιση κατά Sanger. 3. Φάση 2: Οι Τεχνολογίες και Υπηρεσίες του Έργου Έτερο «καθήκον» αποτελεί η αξιολόγηση και διασφάλιση της ποιότητας των τεχνολογιών και υπηρεσιών του έργου, καθώς και η επικύρωση των επιτευγμάτων, ώστε να υποστηριχτούν οι σκοποί και συνεπώς, το όραμα του έργου. Πρόκειται για τεχνολογίες γενετικών βάσεων δεδομένων και πρόσβασης/ διανομής της πληροφορίας, καθώς και κλινικές και γενωμικές οντολογίες και ονοματολογίες που θα ομαλοποιήσουν την υπάρχουσα ετερογένεια στις καταχωρήσεις των κλινικο- γενωμικών δεδομένων. Τέλος, πρόκειται για χειρισμούς εξόρυξης δεδομένων προκειμένου να εξυπηρετηθούν οι ερωτήσεις ανακάλυψης της γνώσης. Με την επιτυχή ολοκλήρωση των πρότερων συνιστωσών, το έργο θα έχει φθάσει στο στάδιο, όπου θα είναι δυνατή η υλοποίηση της ολοκληρωμένης πλατφόρμας του έργου και η εγκατάστασή της στο περιβάλλον του χρήστη. Η ολοκλήρωση του συστήματος και η δοκιμή του συνεπάγεται την οικοδόμηση, την εγκατάσταση και την περαιτέρω δοκιμή ενός κατάλληλου «πάρκου» εξυπηρετητή υποδομών με τις κατάλληλες συνδέσεις επικοινωνίας προς εκείνες τις θέσεις και τους χρήστες που απαιτούνται για τη διαλειτουργικότητα των υπηρεσιών. Η αρχιτεκτονική του συστήματος θα πρέπει να περιλαμβάνει τα κατάλληλα μέτρα για την εμπιστοσύνη και την ασφάλεια των δεδομένων, όπως αυτές προσδιορίζονται και από τις ανάγκες της κοινωνίας. Σε αυτό το σημείο θα πραγματοποιηθούν, επίσης, ερωτήσεις εξόρυξης της βιοιατρικής βιβλιογραφίας, ώστε να υποστηριχθούν, να επαληθευτούν και να ενισχυθούν τα αποτελέσματα του έργου με τα υπάρχοντα δημοσιευμένα στοιχεία. Η αξιολόγηση της πρωτότυπης κλινικο- γονιδιωματικής υποδομής και της απορρέουσας πλατφόρμας θα λάβει χώρα με τον έλεγχο των πρωτοτύπων από τους χρήστες. Η αξιολόγηση του συνόλου του έργου και των επιτευγμάτων του, σε σχέση με τους στόχους του έργου, θα πραγματοποιηθεί από κοινού με όλους τους εταίρους και θα ενταχθεί τεκμηριωμένη στην τελική έκθεση του έργου. Αναφορές [1] Sander C. 2000. Genomic medicine and the future of health care. Science 287: 1977 [2] Thorisson GA, Muilu J, Brookes AJ. 2009. Genotype- phenotype databases: challenges and solutions for the post- genomic era. Nat. Rev. Genet. 10(1): 9 ΕΠΑΝ ΙΙ- ΣΠ- - emodia 5 /5 Παραδοτέο Π1.2