1

Μηλογαλακτική Ζύµωση Ως µηλογαλακτική ζύµωση θεωρείται η µετατροπή του L-µηλικού οξέος προς L- γαλακτικό οξύ και διοξείδιο του άνθρακα µε την επίδραση µικροοργανισµών. Κατά συνέπεια, το αποτέλεσµα της µηλογαλακτικής ζύµωσης είναι η µείωση της ολικής οξύτητας των κρασιών, αφού ένα δικαρβονικό οξύ (µηλικό) µετατρέπεται σε µονοκαρβονικό (γαλακτικό). Κατά τη µηλογαλακτική ζύµωση παράγεται αποκλειστικά L-γαλακτικό οξύ. Το D-γαλακτικό οξύ παράγεται από τη γλυκόζη. + CO 2 Σχ.22. Η µηλογαλακτική ζύµωση. Η βιοχηµική αντίδραση της µηλογαλακτικής ζύµωσης έχει µεγάλη σηµασία από τεχνολογική σκοπιά για γλεύκη µε υψηλή οξύτητα, τα οποία παράγονται συνήθως σε περιοχές µε ψυχρό κλίµα. 2

Τα γαλακτικά βακτήρια που προκαλούν τη µηλογαλακτική ζύµωση είναι κόκκοι και βάκιλοι των γενών Leuconostoc (ετεροζυµωτικοί κόκκοι), Pediococcus (οµοζυµωτικοί κόκκοι) και Lactobacillus (όµο- και ετεροζυµωτικοί βάκιλοι). Αυτό δεν σηµαίνει βέβαια ότι όλα τα στελέχη των παραπάνω βακτηρίων κάνουν µηλογαλακτική ζύµωση. Τα γαλακτικά βακτήρια στο µικροσκόπιο παρουσιάζουν διάφορα σχήµατα και διαστάσεις, που αποτελούν χαρακτηριστικό γνώρισµα για το καθένα. Σχ.23. Μορφολογία γαλακτικών βακτηρίων. Α. Leuconostoc oenos. B. Lactobacillus casei. C. Lactobacillus brevis. D. Pediococcus cerevisiae. 3

Η σηµασία της µηλογαλακτικής ζύµωσης Η µηλογαλακτική ζύµωση επιδιώκεται για 3 κυρίως λόγους: 1. Μείωση της οξύτητας σε κρασιά που προκύπτουν από γλεύκη µε υψηλή οξύτητα. 2. Βελτίωση του αρώµατος των κρασιών. 3. Σταθεροποίηση των κρασιών από βακτηριολογική προσβολή µετά την εµφιάλωση. Αν και η µηλογαλακτική ζύµωση µειώνει την οξύτητα στους οίνους, πολλοί οινολόγοι προτιµούν άλλες µεθόδους, επειδή η µηλογαλακτική ζύµωση δεν επιτυγχάνεται εύκολα σε κρασιά µε µεγάλη οξύτητα. Άλλοι τρόποι µείωσης της οξύτητας είναι η κατεργασία µε ανθρακικό ασβέστιο οπότε έχουµε καθίζηση τρυγικού και µηλικού οξέος, χρήση ζυµών του είδους Schizosaccharomyces pombe που παράλληλα µε την αλκοολική ζύµωση µεταβολίζουν και το µηλικό οξύ µετατρέποντάς το είτε σε γαλακτικό οξύ, είτε σε αιθανόλη, κλπ. 4

Η µηλογαλακτική ζύµωση µεταβάλλει το άρωµα του κρασιού. Η παρουσία του µηλικού οξέος στους οίνους προσδίδει γεύση και οσµή πράσινων ανώριµων φρούτων, ένα είδος στυφάδας και µια ανεπιθύµητη τραχύτητα.τα χαρακτηριστικά αυτά αποτελούν ένα σοβαρό µειονέκτηµα στην ποιότητα των «λεπτών» ερυθρών οίνων. Αντίθετα, το γαλακτικό οξύ είναι λιγότερο «επιθετικό» µετατρέποντας τους οίνους πιο απαλούς και σαρκώδεις, οι οποίοι εµφανίζονται στο στόµα παχείς, χαρακτηριστικά που συνθέτουν την ποιότητα ενός καλού κρασιού. Η µηλογαλακτική ζύµωση θα πρέπει να λαµβάνει χώρα πριν τις κατεργασίες διαύγασης και σταθεροποίησης και πριν το κρασί αποθηκευθεί ή εµφιαλωθεί, καθώς η διεξαγωγή της στο µπουκάλι δηµιουργεί υποστάθµη αλλάζοντας την όψη του προϊόντος. Η εξέλιξη της µηλογαλακτικής ζύµωσης εξαρτάται σηµαντικά από τον πολλαπλασιασµό των γαλακτικών βακτηρίων. Η ανάπτυξη του βακτηριακού πλυθησµού παρουσιάζει 2 διαδοχικούς κύκλους: - Ο πρώτος αρχίζει από τις πρώτες στιγµές οινοποίησης και συµβαδίζει µε την ανάπτυξη των ζυµών. Ο σχηµατισµός όµως της αλκοόλης συντελεί στην παρεµπόδιση του πολλαπλασιασµού των βακτηρίων από µερικές ηµέρες µέχρι µερικές εβδοµάδες (λανθάνουσα φάση), κατά τη διάρκεια της οποίας τα βακτήρια προσαρµόζονται στις νέες συνθήκες. 5

- Μετά την πάροδο της λανθάνουσας φάσης ξαναρχίζει ο πολλαπλασιασµός των βακτηρίων και εποµένως και ο δεύτερος κύκλος ανάπτυξής τους και όταν ο αριθµός τους φτάσει σ ένα ορισµένο µέγεθος (10 6 /ml), τότε αρχίζει η πραγµατοποίηση της µηλογαλακτικής ζύµωσης. Σχ.24. Εξέλιξη της µηλογαλακτικής ζύµωσης. FML: µηλογαλακτική ζύµωση 6

Η ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων εξαρτάται από: - Τον χρόνο παραµονής του οίνου µε τα στέµφυλα. Πρώιµος αποχωρισµός του οίνου από τα στέµφυλα έχει ως αποτέλεσµα τη µειωµένη συγκέντρωση γαλακτικών βακτηρίων και κατά συνέπεια την καθυστερηµένη εκδήλωση µηλογαλακτικής ζύµωσης. - Την αλκοόλη. Γενικά τα γαλακτικά βακτήρια του οίνου είναι ανθεκτικά στην αλκοόλη. Όχι όµως και αυτά που βρίσκονται στα σταφύλια. Παρόλο την ανθεκτικότητά τους, η αλκοόλη ασκεί δυσµενή επίδραση στην ανάπτυξή τους, η οποία εξαρτάται βεβαίως από το είδος και το στέλεχος του βακτηρίου. Κατά κανόνα οι βάκιλοι φαίνονται πιο ανθεκτικοί σε σχέση µε τους κόκκους. - Το SO 2. Τα γαλακτικά βακτήρια είναι ευαίσθητα στο θειώδες και µάλιστα περισσότερο από τις ζύµες. Συγκέντρωση 20mg/L θειώδους επιβραδύνει τη µηλογαλακτική ζύµωση, ενώ 100mg/L έχει ως αποτέλεσµα τον τερµατισµό της. - Τα θρεπτικά συστατικά. Ορισµένα αµινοξέα, βιταµίνες και ανόργανα άλατα είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων. - Τον ανταγωνισµό ζυµών-βακτηρίων. Υπάρχουν στελέχη ζυµών που παρεµποδίζουν την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων µε αποτέλεσµα την καθυστερηµένη έναρξή της. 7

Η µηλογαλακτική ζύµωση είναι προτιµότερο να γίνεται κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύµωσης ή αµέσως µετά το τέλος της. Μετά το τέλος της µηλογαλακτικής ζύµωσης, η καλή οινοποιητική πρακτική απαιτεί περαιτέρω κατεργασίες αν και είναι πολύ δύσκολο να έχουµε επανάληψη της µηλογαλακτικής ζύµωσης. Οι κατεργασίες αυτές περιλαµβάνουν την προσθήκη θειώδους, αποθήκευση σε χαµηλές θερµοκρασίες και διόρθωση της οξύτητας αν χρειάζεται. Αν το κρασί υποστεί αποστειρωτική διήθηση, τότε η προσθήκη του θειώδους είναι περιττή. Οίνοι που παλαιώνονται πριν από την εµφιάλωση υπόκεινται σχεδόν πάντα σε µηλογαλακτική ζύµωση. Αν ακολουθήσουν οι κατάλληλες κατεργασίες, τότε οι οίνοι αυτοί µπορούν µε ασφάλεια να εµφιαλωθούν χωρίς να διατρέχουν κίνδυνο προσβολής από µηλογαλακτικά βακτήρια στο µπουκάλι. Το ίδιο ισχύει και σε παλαιωµένα κρασιά τα οποία δεν έχουν υποστεί µηλογαλακτική ζύµωση. Σε νέα κρασιά, είναι ευθύνη του οινολόγου αν θα προκαλέσει µηλογαλακτική ζύµωση για να αποφύγει την δηµιουργία ιζήµατος στο µπουκάλι ή θα προχωρήσει σε κατεργασίες µε στόχο την παρεµπόδιση εµφάνισής της. Ο έλεγχος για το εάν έχει πραγµατοποιηθεί µηλογαλακτική ζύµωση ή όχι, στηρίζεται στον ποσοτικό προσδιορισµό του µηλικού οξέος και όχι του γαλακτικού οξέος, καθώς το τελευταίο είναι δυνατόν να παραχθεί και από προσβολή γαλακτικών βακτηρίων. Πολύ µικρές συγκεντρώσεις µηλικού οξέος ή πλήρης απουσία του αποτελούν σαφείς ενδείξεις για πραγµατοποίηση µηλογαλακτικής ζύµωσης. 8

Γαλακτική Ζύµωση Η ασθένεια της γαλακτικής ζύµωσης εκδηλώνεται µε µια δυσάρεστη οσµή και γλυκόξινη γεύση, που οφείλεται στην ταυτόχρονη παρουσία υψηλών ποσοτήτων αζύµωτου σακχάρου και οξικού οξέος. Όταν η αλκοολική ζύµωση διακοπεί για µεγάλο χρονικό διάστηµα (π.χ. λόγω ανόδου της θερµοκρασίας στη δεξαµενή), τα σάκχαρα µπορεί να προσβληθούν από τα γαλακτικά βακτήρια και να παραχθεί γαλακτικό οξύ, οξικό οξύ, µαννιτόλη, CO 2, ανάλογα µε τα γαλακτικά βακτήρια. Σχ.25. Μηχανισµός οµογαλακτικής ζύµωσης. Τα γαλακτικά βακτήρια διακρίνονται σε 2 κατηγορίες: τα οµοζυµωτικά ή οµογαλακτικά και τα ετεροζυµωτικά ή ετερογαλακτικά. Τα οµοζυµωτικά γαλακτικά βακτήρια µετατρέπουν τα σάκχαρα σχεδόν αποκλειστικά σε γαλακτικό οξύ. 9

Κατά την ετερογαλακτική ζύµωση η γλυκόζη µετατρέπεται εκτός από γαλακτικό οξύ σε αιθανόλη, οξικό οξύ, CO 2, γλυκερόλη, κλπ, ενώ η φρουκτόζη σε µαννιτόλη (µαννιτική ζύµωση). Σχ.26. Μηχανισµός ετερογαλακτικής ζύµωσης. 10

Γλυκεροπυροσταφιλική Ζύµωση Κατά την αλκοολική ζύµωση ο αποδέκτης του Η στην τελική φάση είναι το µόριο της ακεταλδεΰδης που στην αρχή της ζύµωσης λείπει από το περιβάλλον. Εποµένως η οξείδωση του NADH 2 προς αναγέννηση του NAD+ δεν είναι δυνατόν να πραγµατοποιηθεί από την ακεταλδεΰδη και γίνεται από την Ρ-διϋδροξυακετόνη που αναγόµενη δίνει γλυκερόλη. Σχ.27. Η γλυκεροπυροσταφυλική ζύµωση. 11

Η ακεταλδεΰδη που δηµιουργείται στην συγκεκριµένη περίπτωση δεν ανάγεται σε αλκοόλη επειδή το NADH 2 χρησιµοποιήθηκε για την αναγωγή της Ρ- διϋδροξυακετόνης σε γλυκερόλη. Παρουσιάζεται δηλαδή το φαινόµενο να σχηµατίζεται ένα µόριο γλυκερόλης και ένα µόριο πυροσταφυλικού οξέος που δεν µετατρέπεται σε αιθανόλη. Υπάρχει εποµένως ένας ανταγωνισµός µεταξύ ακεταλδεΰδης και Ρ- διϋδροξυακετόνης για την αναγωγή τους. Αρχικά, που δεν υπάρχει αρκετή ακεταλδεΰδη υπερισχύει η αναγωγή της Ρ-διϋδροξυακετόνης διϋδροξυακετόνης. Στη συνέχεια όµως, καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση της ακεταλδεΰδης και όταν έχουµε πλέον εξίσωση των δυο συγκεντρώσεων επικρατεί η αναγωγή της ακεταλδεΰδης προς αιθανόλη καθώς είναι θερµοδυναµικά ευκολότερη. Η γλυκεροπυροσταφυλική ζύµωση γίνεται σε µικρό ποσοστό ( 8%) ακόµα και όταν έχει υπερισχύσει η αλκοολική ζύµωση. Η παρουσία του θειώδους κατά τη ζύµωση ευνοεί τον σχηµατισµό γλυκερίνης καθώς ενώνεται και δεσµεύει την ακεταλδεΰδη. 12

Γαλακτική Ζύµωση της Γλυκερόλης Τα κύρια προϊόντα της γαλακτικής ζύµωσης της γλυκερόλης είναι το γαλακτικό οξύ, το οξικό οξύ και η ακρολεΐνη. Η τελευταία ενώνεται στους οίνους µε ταννίνες και άλλες φαινολικές ενώσεις και δίνει πικρή γεύση (ασθένεια της πίκρανσης). Η γαλακτική ζύµωση της γλυκερόλης αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισµα λίγων µόνο στελεχών που ανήκουν ωστόσο σε περισσότερα γένη γαλακτικών βακτηρίων και όχι µόνο σε ένα γένος. Ο µηχανισµός της δεν είναι απόλυτα γνωστός. Σχ.28. Μηχανισµός γαλακτικής ζύµωσης της γλυκερόλης. 13

Βιοχηµικές Μετατροπές του Κιτρικού Οξέος Ορισµένα γαλακτικά βακτήρια µεταβολίζουν και το κιτρικό οξύ (κυρίως κατά τη διάρκεια της µηλογαλακτικής ζύµωσης). Σχ.29. Βιοχηµικές µετατροπές του κιτρικού οξέος από τα γαλακτικά βακτήρια. 14

Βιοχηµικές Μετατροπές του Τρυγικού Οξέος Ορισµένα γαλακτικά βακτήρια µεταβολίζουν το τρυγικό οξύ (ασθένεια της εκτροπίασης). Σχ.30. Βιοχηµικές µετατροπές του τρυγικού οξέος από τα γαλακτικά βακτήρια. 15

Οξική Ζύµωση Προκαλείται από αρνητικούς κατά Gram αερόβιους µικροοργανισµούς, γνωστά ως οξικά βακτήρια, τα οποία οξειδώνουν την αλκοόλη του κρασιού σε οξικό οξύ. αλδεϋδική αφυδρογονάση Σχ.31. Οξείδωση της αιθανόλης σε οξικό οξύ από τα οξικά βακτήρια. 16

Ορισµένα οξικά βακτήρια προκαλούν µερική εστεροποίηση του οξικού οξέος µε την αιθυλική αλκοόλη: CH 3 COOH + CH 3 CH 2 OH CH 3 COOCH 2 CH 3 + H 2 O Σχ.32. Σχηµατισµός οξικού αιθυλεστέρα από τα οξικά βακτήρια. Ο οξικός αιθυλεστέρας στα κρασιά έχει διπλή προέλευση: 1. Ένα µέρος προέρχεται από µικροοργανισµούς, κυρίως στους νέους οίνους. 2. Ένα άλλο µέρος προέρχεται από την αντίδραση παλαίωσης µεταξύ αλκοόλης και οξικού οξέος. Ο οξικός αιθυλεστέρας παίζει σηµαντικό ρόλο στη διαµόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των οίνων. Τα οξικά βακτήρια οξειδώνουν και τα σάκχαρα. 17

Στο µικροσκόπιο τα οξικά βακτήρια παρουσιάζονται ως κυλινδρικά ή ελλειψοειδή κύτταρα και βρίσκονται µεµονωµένα ή συνδεδεµένα σε ζεύγη και µικρές αλυσίδες. Περισσότερο συνηθισµένη είναι η σύνδεσή τους ανά 2 σε σχήµα 8. Τα σηµαντικότερα γένη είναι το Gluconobacter και το Acetobacter. Το γένος Acetobacter οξειδώνει περαιτέρω το οξικό οξύ προς CO 2, καθώς διαθέτει πλήρη κύκλο του Krebs, σε αντίθεση µε το γένος Gluconobacter, το οποίο δεν διαθέτει πλήρη κύκλο του Krebs. Σχ.33. Μορφολογία οξικών βακτηρίων. Ως υποχρεωτικά αερόβιοι µικροοργανισµοί, τα οξικά βακτήρια αναπτύσσονται γρήγορα στην επιφάνεια του οίνου και σχηµατίζουν µια γλοιώδη µεµβράνη. 18

Σε οίνους µε περιεκτικότητα αλκοόλης>12-14% 14% (v/v) δεν σχηµατίζεται µεµβράνη, αλλά τα οξικά βακτήρια βρίσκονται διασκορπισµένα σε όλο τον όγκο του οίνου. Παράγοντες ανάπτυξης οξικών βακτηρίων Οξυγόνο. Τα οξικά βακτήρια ως υποχρεωτικά αερόβιοι µικροοργανισµοί απαιτούν την ύπαρξη οξυγόνου για την ανάπτυξή τους. Θερµοκρασία. Η βέλτιστη θερµοκρασία ανάπτυξης των οξικών βακτηρίων είναι 25-30 ο C για το Gluconobacter και 30 ο C για το Acetobacter. Ωστόσο, τα οξικά βακτήρια αναπτύσσονται σε µεγαλύτερο εύρος θερµοκρασιών: 7-41 ο C για τα Gluconobacter και 5-42 ο C για το Acetobacter. Θρεπτικά συστατικά. Το Gluconobacter προτιµά την αιθανόλη και τη γλυκόζη, ενώ το Acetobacter χρησιµοποιεί την αιθανόλη, το γαλακτικό οξύ, τις εξόζες και τη γλυκερόλη. ph. Το βέλτιστο ph για το Gluconobacter είναι 5.5-6.0 και για το Acetobacter 5.4-6.3. Σε ph<3.0 είναι αδύνατη η ανάπτυξή τους, ενώ σε ph:3.2-3.8 3.8 η ανάπτυξή τους είναι ασθενής. SO 2. Είναι ευαίσθητα στο θειώδες. Ποσότητα 30mg/L είναι ικανή να εµποδίσει την ανάπτυξή τους. Αναπτύσσονται όµως στην επιφάνεια του οίνου, όπου το θειώδες οξειδώνεται από τον ατµοσφαιρικό αέρα. 19