Οξειδωτικού τύπου βλάβη στο DNA και Σωματικές Μεταλλάξεις στη Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια

Ειδικά Άρθρα για το Άσθμα Οξειδωτικού τύπου βλάβη στο DNA και Σωματικές Μεταλλάξεις στη Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια Ελένη Γ. Τζωρτζάκη, Ειρήνη Νεοφύτου, Νικόλαος Μ. Σιαφάκας Πνευμονολογική Κλινική, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ηρακλείου, Κρήτη & Εργαστήριο Μοριακής και Κυτταρικής Πνευμονολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Κρήτης Λέξεις- Κλειδιά: - οξειδωτικό στρες - βλάβη του DNA - επιδιόρθωση του DNA - επίκτητες σωματικές μεταλλάξεις - παθογένεια της ΧΑΠ Αλληλογραφία: Ελένη Τζωρτζάκη, MD, PhD, FCCP Επίκουρη Καθηγήτρια Πνευμονολογίας Πνευμονολογική Κλινική, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ηρακλείου & Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Κρήτης, 71110, Κρήτη, Ελλάδα Tηλ.: 2810 392 433, Fax: 2810 542 650 E-mail: tzortzaki@med.uoc.gr Οξειδωτικό στρες και οξειδωτικές βλάβες στο DNA στη Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) Οι ζωντανοί οργανισμοί εκτίθενται συνεχώς σε οξειδωτικό στρες, το οποίο δημιουργείται ως αποτέλεσμα των φυσιολογικών βιοχημικών αντιδράσεων του μεταβολισμού αλλά και διάφορων εξωτερικών παραγόντων που συνδέονται με τον τρόπο ζωής και το περιβάλλον, όπως ο καπνός του τσιγάρου και η ατμοσφαιρική ρύπανση 1. Ειδικότερα, ο πνεύμονας εκτίθεται συνεχώς σε ένα περιβάλλον με υψηλή περιεκτικότητα οξυγόνου, εξωγενείς ρύπους και τοξικές ουσίες που εισέρχονται στον οργανισμό κατά την εισπνοή. Λαμβάνοντας υπόψη την μεγάλη επιφάνεια και την παροχή αίματος, ο πνεύμονας είναι ιδιαίτερα ευπαθής σε βλάβες που μπορεί να προκληθούν από το οξειδωτικό στρες 1-3. Το οξειδωτικό στρες έχει σημαντικές επιπτώσεις στη φυσιολογία του πνεύμονα. Αυτές περιλαμβάνουν την οξειδωτική απενεργοποίηση των αντιπροτεασών και της επιφανειοδραστικής ουσίας, την υπερέκκριση βλέννης, την υπεροξείδωση των λιπιδίων της μεμβράνης των κυττάρων, την δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων, τον τραυματισμό του κυψελιδικού επιθηλίου, την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας, την απορύθμιση της απόπτωσης και τέλος την βλάβη του κυτταρικού DNA (Εικόνα 1) 1,4. Το οξειδωτικό στρες και η χρόνια φλεγμονή αποτελούν σημαντικά σημεία στην παθογένεια της ΧΑΠ 5,6. Το οξειδωτικό στρες στη ΧΑΠ είναι αποτέλεσμα αυξημένης έκθεσης σε εισπνεόμενες τοξικές ουσίες (π.χ. κάπνισμα), αλλά και αυξημένης παραγωγής ενεργών ριζών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species) που προέρχονται από τα διάφορα κύτταρα των αεραγωγών (φλεγμονώδη, ανοσοποιητικού, επιθηλιακά) 5,6. Το κάπνισμα, ο μεγαλύτερος αιτιολογικός παράγοντας στην παθογένεια της ΧΑΠ, απελευθερώνει από μόνο του χιλιάδες οξειδωτικά, ελεύθερες ρίζες και χημικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των ριζών υδροξυλίου (-ΟΗ) και του υπεροξειδίου του υδρογόνου (H2O2). Επιπλέον, μπορεί και στρατολογεί, κύτταρα του ανοσοποιητικού και φλεγμονώδη κύτταρα στους πνεύμονες, τα οποία επιδεινώνουν περαιτέρω την οξειδωτική/αντιοξειδωτική ανισορροπία 2,3,7. Υπό κανονικές συνθήκες, ο οργανισμός αντιμετωπίζει το οξειδωτικό στρες με πολλαπλά αντιοξειδωτικά συστήματα και μηχανισμούς επιδιόρθωσης

100 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 1ο, Τόμος 25ος, Ιανουάριος - Μάρτιος 2012 εικονα 1. Ποικίλοι παράγοντες ευθύνονται για βλάβες στα νουκλεϊνικά οξέα (DNA), όπως οι υπεριώδεις ακτίνες, η ιοντίζουσα ακτινοβολία, ο καπνός του τσιγάρου, τα υποπροϊόντα του κυτταρικού μεταβολισμού, ή τα λάθη κατά την αντιγραφή του DNA. Υπό κανονικές συνθήκες, ο οργανισμός αντιμετωπίζει το οξειδωτικό στρες με πολλαπλούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς και συστήματα αποκατάστασης των λαθών των νουκλεϊνικών οξέων. Ωστόσο, όταν το οξειδωτικό στρες υπερνικά την αντιοξειδωτική ικανότητα του οργανισμού, τα παθολογικά κύτταρα απομακρύνονται με τον μηχανισμό της απόπτωσης. και αντικατάστασης των κατεστραμμένων κυττάρων, των νουκλεϊνικών οξέων, των πρωτεϊνών και των λιπιδίων 1,7-8. Η κατανομή της οξειδωτικής βλάβης στο γονιδίωμα εξαρτάται από την ευαισθησία των ακολουθιών των βάσεων, κατά την οξειδωτική επίθεση, αλλά και την κατά-προτίμηση στόχευση των διαδικασιών αποκατάστασης. Ολοένα και περισσότερες ενδείξεις δείχνουν ότι η οξειδωτική βλάβη στο μη-κωδικοποιό DNA, όπως και στα τελομερή, στις μικροδορυφικές ακολουθίες του DNA, στους εκκινητές και στα σημεία της μεθυλίωσης, μπορεί τελικά να έχουν σημαντικές βιολογικές συνέπειες, δεδομένου ότι ο οργανισμός δίνει χαμηλή προτεραιότητα επιδιόρθωσης των βλαβών σε αυτές τις περιοχές, αφού δεν κωδικοποιούν για συγκεκριμένες εντολές 7-9. Σωματικές Μεταλλάξεις και Μικροδορυφορικό DNA Υπάρχουν δύο κύριες κατηγορίες γενετικών μεταλλάξεων: οι de Novo (νέες) και οι σωματικές μεταλλάξεις 10. Οι μεταλλάξεις που εμφανίζονται μόνο σε γαμέτες ή που συμβαίνουν αμέσως μετά τη γονιμοποίηση ονομάζονται de Novo μεταλλάξεις (νέες). Εάν μια μετάλλαξη συμβεί σε σωματικά κύτταρα, η μεταλλαγή περιορίζεται στον οργανισμό στον οποίο συνέβει και δεν περνάει στις μελλοντικές γενιές. Αυτό το είδος του γενετικού λάθους αποκαλείται «αποκτηθείσα» ή σωματική μετάλλαξη, και εμφανίζεται κάποια στιγμή στο DNA μεμονωμένων κυττάρων κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόμου. Οι σωματικές μεταλλάξεις μπορεί να προκαλούνται από εξωτερικούς, περιβαλλοντικούς παράγοντες (υπεριώδη ακτινοβολία, καρκινογόνα, ρύποι/τοξικές ουσίες, καπνό του τσιγάρου) ή μπορεί να συμβούν εάν γίνει ένα λάθος κατά τη διάρκεια του διπλασιασμού ή στα αντίγραφα του DNA κατά την κυτταρική διαίρεση 10. Το οξειδωτικό στρες που έχει κεντρική σημασία στην παθογένεια των χρόνιων φλεγμονωδών παθήσεων των πνευμόνων, όπως η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, μπορεί να βλάψει άμεσα το DNA των κυττάρων του πνεύμονα και ιδίως τη σύνθεση των βάσεων των επαναλαμβανόμενων αλληλουχίων του Μικροδορυφορικού DNA, ειδικά όταν συνδυάζεται και με ανεπάρκεια του συστήματος επιδιόρθωσης των λαθών του DNA (Mismatch Repair -MMR) 8-10. Οι μικροδορυφόροι του DNA είναι μοναδικοί για κάθε άτομο και ταυτόσημοι σε κύτταρα από διαφορετικούς ιστούς του ίδιου ατόμου 11-13. Οι μικροδορυφόροι είναι διάσπαρτοι σε όλο το γονιδίωμα και συνήθως εντοπίζονται εκτός, αλλά και μερικές φορές εντός, των κωδικών αλληλουχιών. Διπλασιάζονται πιστά στα υγιή κύτταρα διασφαλίζοντας ότι οι κωδικές αλληλουχίες παραμένουν εντός του κατάλληλου πλαισίου ανάγνωσης 11-13. Προσθήκη ή απαλειφή ενός ή περισσότερων μονάδων επανάληψης (βάσεων) μπορούν να προκαλέσουν μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στα παρακείμενα (downstream) γονίδια. Το μικροδορυφορικό DNA έχει χρησιμεύσει ως άριστος πολυμορφικός δείκτης στην χαρτογράφηση του γονιδιώματος πολλών οργανισμών, συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπου 11-13. Το σύστημα επιδιόρθωσης των λαθών του DNA (MMR), είναι πολύ σημαντικό για τη διατήρηση της σταθερότητας των μικροδορυφόρων. Είναι σχεδιασμένο να διορθώνει αναντιστοιχίες μίας βάσης και μικρές λούπες εισαγωγής/διαγραφής που μπορεί να εμφανισθούν κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA 14,15. Το οξειδωτικό στρες όμως είναι ικανό να απενεργοποιήσει τον παραπάνω μηχανισμό οδηγώντας σε Αστάθεια των αλληλουχιών του μικροδορυφορικού DNA με τις ανάλογες συνέπειες. Η ανεύρεση Αστάθειας του Μικροδορυφορικού DNA (MSI) σε δείγματα ιστών αποτελεί αξιόπιστο μέσο για τη μελέτη των σωματικών μεταλλάξεων. Αυτό επιτυγχάνεται με τη χρήση κατάλληλων μικροδορυφορικών δεικτών που στοχεύουν συγκεκριμένους χρωμοσωμικούς τόπους

ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 1ο, Τόμος 25ος, Ιανουάριος - Μάρτιος 2012 101 κοντά ή μέσα σε γονίδια που είναι γνωστό ή πιθανόν εμπλέκονται στην παθογένεια διαφόρων νοσημάτων 11-13. Αστάθεια του Μικροδορυφορικού DNA στη Χ.Α.Π. Οι πρώτες μελέτες που αποκάλυψαν σωματικές μεταλλάξεις του τύπου της Aστάθειας του Mικροδορυφορικού DNA (Microsatellite DNA Instability), σε καλοήθεις παθήσεις του πνεύμονα ήταν στην Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) 16-17 και αργότερα στο Βρογχικό Άσθμα 18. Ωστόσο, σε μια συγκριτική μελέτη μεταξύ της ΧΑΠ και του Άσθματος σε επίπεδο μικροδορυφορικού DNA, οι ασθενείς με ΧΑΠ έδειξαν υψηλότερη συχνότητα σωματικών μεταλλάξεων σε σύγκριση με το Άσθμα 19. Στην ίδια μελέτη αναδείχτηκαν ειδικοί μικροδορυφορικοί τόποι για τη ΧΑΠ, δίπλα σε γονίδια που σχετίζονται με την παθογένεση της νόσου (π.χ. Surfactant Α, περφορίνη, CD8, TNF) 19. Στη συνέχεια εκτιμήθηκε η σχέση μεταξύ των παροξύνσεων της ΧΑΠ και την γενετική αστάθεια. Ο «φαινότυπος των συχνών παροξύνσεων» παρουσίασε και τα υψηλότερα ποσοστά σωματικών μεταλλάξεων 20. Μια πιθανή εξήγηση που δόθηκε ήταν ότι οι συχνές παροξύνσεις της ΧΑΠ οι οποίες συνήθως χαρακτηρίζονται από επίμονη φλεγμονή και αυξημένο οξειδωτικό φορτίο θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε μεγαλύτερη βλάβη του DNA, του οξειδωτικού τύπου, συγκριτικά με την σταθερή ΧΑΠ 20. Ένα άλλο σημαντικό ερώτημα αποτελούσε η αναζήτηση του συγκεκριμένου κυτταρικού υπο-πληθυσμού που παρουσιάζει ευπάθεια σε σωματικές μεταλλάξεις. Η δική μας υπόθεση στόχευε τα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα [lung epitheliar barrier cells (LEBCs)], δεδομένου ότι αποτελούν την πρώτη γραμμή άμυνας του αναπνευστικού συστήματος στο εχθρικό πολλές φορές περιβάλλον 21. Πολυάριθμα στοιχεία δείχνουν ότι οι εισπνεόμενες τοξικές ουσίες από το κάπνισμα του τσιγάρου καθώς και η αυξημένη παραγωγή ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS) από τα διάφορα φλεγμονώδη κύτταρα των αεραγωγών στη ΧΑΠ βλάπτει σοβαρά το επιθήλιο του πνεύμονα 2-3. Χρησιμοποιήσαμε ανοσο-μαγνητικό διαχωρισμό και κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα προκλητών πτυέλων και βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BAL), ασθενών με ΧΑΠ και «υγιών» καπνιστών, προκειμένου να διαχωρίσουμε τα επιθηλιακά κύτταρα από τα λευκοκύτταρα. Στην συνέχεια οι υπο-πληθυσμοί αναλύθηκαν ξεχωριστά για ανίχνευση αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA. Η μελέτη μας ήταν η πρώτη που διαχώρισε κυτταρικούς υπο-πληθυσμούς πτυέλων και BAL, σε ασθενείς με ΧΑΠ και καπνιστές, επιβεβαιώνοντας ότι οι σωματικές αλλοιώσεις στο DNA εμφανίζονταν αποκλειστικά στα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα (LEBCs) των ασθενών με ΧΑΠ. Τα αποτελέσματα αυτά υποστήριξαν την αρχική μας υπόθεση ότι η εμμένουσα φλεγμονή και το αυξημένο οξειδωτικό στρες στη ΧΑΠ είναι ικανά να βλάψουν τόσο πολύ τα κύτταρα του αναπνευστικού επιθηλίου ώστε να προκληθεί οξειδωτική βλάβη στο DNA με επακόλουθο τις σωματικές μεταλλάξεις 21. Μια υπόθεση για την έναρξη της Χρόνιας Αποφρακτικής Πνευμονοπάθειας Με βάση τις παραπάνω μελέτες προτείναμε ένα νέο μοντέλο (Εικόνα 2) για την έναρξη της ΧΑΠ, που συνδέει την οξειδωτική βλάβη στο DNA των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα (LEBCs) με την ανοσολογική απάντηση του οργανισμού 22. Αρχικά, το κάπνισμα βλάπτει τα κύτταρα του αναπνευστικού επιθηλίου, μέσω συνεχούς και επίμονου οξειδωτικού στρες το οποίο οδηγεί σε οξειδωτικού τύπου βλάβη του DNA τους 2-4,9, αλλά και καταστολή του μηχανισμού επιδιόρθωσης των λαθών του DNA, με τελικό αποτέλεσμα τις σωματικές μεταλλάξεις 9,21. Τα μεταλλαγμένα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα ενεργοποιούν έμμεσα και πολώνουν τα δενδριτικά κύτταρα (DC), εκπέμποντας σήματα κινδύνου 22. Επιπλέον, ο καπνός του τσιγάρου βλάπτει από μόνος του, τα δενδριτικά κύτταρα τροποποιώντας περαιτέρω την ανοσολογική τους αντίδραση 23. Στο «μοντέλο κινδύνου», τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, όπως είναι τα δενδριτικά, μπορεί να ενεργοποιηθούν και από «ενδογενή» σήματα κινδύνου που παράγονται π.χ. από τα αλλοιωμένα/μεταλλαγμένα πνευμονικά κύτταρα, μετά από έκθεση σε παθογόνους παράγοντες, τοξίνες, μηχανικές βλάβες, οξειδωτικό στρες και καπνό τσιγάρου 24,25. Στην περίπτωση της ΧΑΠ, τα πολωμένα δενδριτικά κύτταρα παρουσιάζουν στο λεμφικό ιστό τα «ενδογενή» σήματα συναγερμού, από τα αλλοιωμένα επιθηλιακά κύτταρα. Ο λεμφικός ιστός αντιδρά όπως και στην περίπτωση κάθε «εισβολέα», εκτρέποντας την ανοσολογική απάντηση προς τον πολλαπλασιασμό των CD8 + κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων προκειμένου να τον εξουδετερώσει 22,25,26. Τα CD8 + Τ-κύτταρα μεταναστεύουν στα σημεία της αρχικής προσβολής και, με την απελευθέρωση περφορίνης και γρανζυμών, επιτίθενται στα αλλοιωμένα επιθηλιακά κύτταρα ενεργοποιώντας το μονοπάτι της απόπτωσης και απομάκρυνσης τους 22,25,26.

102 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 1ο, Τόμος 25ος, Ιανουάριος - Μάρτιος 2012 εικονα 2. Μια υπόθεση για την έναρξη της ΧΑΠ. Αρχικά, το κάπνισμα, μέσω του αυξημένου οξειδωτικού στρες που προκαλεί, βλάπτει τα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα (LEBCs), και αλλοιώνει το μηχανισμό αυτόματης επιδιόρθωσης των λαθών του DNA οδηγώντας σε σωματικές μεταλλάξεις. Τα μεταλλαγμένα επιθηλιακά κύτταρα LEBCs εκπέμπουν σήματα κινδύνου, δεν αναγνωρίζονται πλέον από τον οργανισμό ως «οικεία» αλλά ως «ξένοι εισβολείς» με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση και την πόλωση των δενδριτικών κύτταρων (DC). Ακολουθεί η παρουσίαση του σήματος στον λεμφικό ιστό ο οποίος απαντά με πολλαπλασιασμό των CD8 + κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκύτταρων τα οποία στοχεύουν στα αλλοιωμένα επιθηλιακά κύτταρα. Όταν τα προσεγγίσουν απελευθερώνουν περφορίνη και γρανζύμες και τα καταστρέφουν. Η αποτυχημένη απομάκρυνση των αποπτωτικών επιθηλιακών κυττάρων (efferocytosis) παρεμποδίζει την λύση της φλεγμονής και βλάπτει την ακεραιότητα του αναπνευστικού επιθηλίου, οδηγώντας στη ΧΑΠ. Όμως στην ΧΑΠ, φαίνεται ότι δεν ακολουθείται το φυσιολογικό μονοπάτι της απόπτωσης - απομάκρυνσης παθολογικών κυττάρων - επαν-επιθηλιοποίησης, όπως άλλωστε έχουν δείξει πολλές μελέτες 27-30. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες σε βιοψίες πνεύμονα, έδειξαν αυξημένη έκφραση του προ-αποπτωτικού p53 στα πνευμονοκύτταρα τύπου ΙΙ (PN II) ασθενών με ΧΑΠ σε σύγκριση με καπνιστές xωρίς ΧΑΠ 30. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης της λεκτίνης SP-A στην ΧΑΠ, η οποία συμμετέχει στον μηχανισμό εκκαθάρισης των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων του πνεύμονα αλλά και στην ρύθμιση της φλεγμονώδους διαδικασίας 31,32. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε μειωμένη αναλογία του SP-A στα θετικά PN ΙΙ σε σχέση με τα συνολικά PN ΙΙ σε ασθενείς με ΧΑΠ σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς ΧΑΠ. Το ποσοστό αυτό σχετίστηκε και με το βαθμό της απόφραξης των αεραγωγών 31. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκαν προηγούμενες μελέτες, όπου είχε διαπιστώσει γενετική αστάθεια στην ΧΑΠ σε μικροδορυφορικό δείκτη παρακείμενο του γονιδίου της SP-A 19,20.

ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 1ο, Τόμος 25ος, Ιανουάριος - Μάρτιος 2012 103 Εν κατακλείδι, η οξειδωτική βλάβη στο DNA και οι σωματικές μεταλλάξεις των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα φαίνεται ότι συμβάλλουν στην μοριακή παθογένεια της ΧΑΠ. Επιπλέον, η ικανότητα ή όχι της επιδιόρθωσης του DNA κατά μήκος του γονιδιώματος, φαίνεται να αποτελεί ακόμα ένα κομμάτι της παθογένειας της ΧΑΠ και ίσως θα μπορούσε να αντικατοπτρίσει εν μέρει την ατομική ευαισθησία των καπνιστών να αναπτύξουν ή όχι τη νόσο. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (Βλέπε αγγλικό κείμενο)