ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΟΡΓΑΝΟΜΕΤΑΛΛΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΣΕ Υ ΑΤΙΝΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΕΙΩΝ ΜΕΤΑΛΛΟΥΡΓΩΝ Εργαστήριο Επιστήµης και Τεχνολογίας Προστασίας του Περιβάλλοντος στην Μεταλλουργία και Τεχνολογία Υλικών Τοµέας Μεταλλουργίας και Τεχνολογίας Υλικών Ηρώων Πολυτεχνείου 9, Ζωγράφου 157 80 Τηλέφωνα: (210)-7722172, (210)-7722271 Telefax: (01)-7722173- (01) 7722218 e-mail : tsezos@metal.ntua.gr ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΒΑΣΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ «ΘΑΛΗΣ» ΤΕΛΙΚΗ ΕΚΘΕΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΟΡΓΑΝΟΜΕΤΑΛΛΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΣΕ Υ ΑΤΙΝΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΡΙΟΣ ΤΣΕΖΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΜΠ ΕΡΕΥΝΗΤΡΙΑ ΡΟΖΑ ΒΙ ΑΛΗ ΥΠΟΨΗΦΙΑ Ι ΑΚΤΩΡ ΕΜΠ

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ...2 2. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΜΕΣΩΝ ΜΕ ΜΕΤΑΛΛΑ...6 2.1 ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΜΕΣΑ...6 2.1.1 ΙΣΧΥΡΑ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΜΕΣΑ...6 2.1.2 ΜΕΤΡΙΑ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΜΕΣΑ (ΧΟΥΜΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ)...10 2.2 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ...15 2.2.1 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΧΟΥΜΙΚΟΥ. ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΗΛΗΣ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΥΓΡΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥ...16 2.2.2 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΈΝΤΡΩΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΙΑΛΥΤΟΥ ΜΕΤΑΛΛΟΥ ΜΕ ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ ΗΛΕΚΤΡΟ ΙΑ...19 2.3 ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ - ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ...21 2.3.1 EDTA NTA...21 2.3.2 ΧΟΥΜΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ...22 2.3.2.1 ΠΡΟΤΥΠΟ ΧΟΥΜΙΚΟ ΟΞΥ (IHSS Humic acid)...23 2.3.2.2 ΧΟΥΜΙΚΟ ΟΞΥ ALDRICH...27 2.3.2.3 ΠΡΟΤΥΠΟ ΦΟΥΛΒΙΚΟ ΟΞΥ (IHSS Fulvic acid)...29 2.3.2.4 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟ ΜΕΛΕΤΗ ΧΟΥΜΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ...31 3. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΧΟΥΜΙΚΟΥ ΜΕΤΑΛΛΟΥ ΜΕ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ...33 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...36 5. ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ...38 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...39 1

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Για την ορθή και οµαλή διεξαγωγή του παρόντος έργου, αρχικά συγκεντρώθηκε η σχετική βιβλιογραφία προκειµένου να αποσαφηνιστούν οι µηχανισµοί αλληλεπίδρασης των οργανοµεταλλικών συµπλόκων σε υδάτινο περιβάλλον, η οποία επικεντρώθηκε στη συλλογή άρθρων και βιβλίων σχετικά µε: Χηµεία οργανοµεταλλικών συµπλόκων. Συµπεριφορά µετάλλων και βιοδιαθεσιµότητά τους σε υδατικά συστήµατα. Αναλυτικές µεθόδους και τεχνικές προσδιορισµού οργανοµεταλλικών συµπλόκων. Η σχετική βιβλιογραφία εµπλουτίστηκε µε τις πιο πρόσφατες αναφορές και έγινε κριτική αξιολόγηση της διεθνούς εµπειρίας µε σκοπό την επιλογή των µετάλλων που έχουν ιδιαίτερο περιβαλλοντικό και βιοµηχανικό ενδιαφέρον, όπως επίσης και την επιλογή της διαλυτής οργανικής ύλης, η οποία δύναται να οδηγήσει στην συµπλοκοποίηση των µετάλλων, και κατά συνέπεια στην διαφοροποίηση της συµπεριφοράς τους στα υδατικά συστήµατα. Έτσι, έγινε αρχικά επιλογή 5 µετάλλων (Cr, Mn, Cd, Cu, Zn), των οποίων κρίνεται αναγκαία η λεπτοµερέστερη µελέτη της συµπεριφοράς τους παρουσία οργανικών συµπλοκοποιητικών µέσων, τα οποία έχουν ταξινοµηθεί στις παρακάτω κατηγορίες: 1. Ισχυρά συµπλοκοποιητικά µέσα (EDTA, NTA κ.α.) 2. Μέτρια συµπλοκοποιητικά µέσα (χουµικά, φουλβικά οξέα κ.α.) 3. Ασθενή συµπλοκοποιητικά µέσα (οργανικά οξέα κ.α.) Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία, οι παράµετροι που καθορίζουν το σχηµατισµό και τη συµπεριφορά των οργανοµεταλλικών συµπλόκων µεταξύ ισχυρών συµπλοκοποιητικών µέσων (EDTA, NTA) και µετάλλων, έχουν εκτενέστατα µελετηθεί (1,2,3,4). Επίσης η µελέτη της επίδρασης των ασθενών συπλοκοποιητικών µέσων (οργανικά οξέα κ.α.) στην κινητικότητα και βιοδιαθεσιµότητα των µετάλλων δεν κρίνεται αναγκαία καθώς σχηµατίζουν ασθενείς και ασταθείς δεσµούς. Από την άλλη, η κατανόηση της συµπεριφοράς των ήπιων συµπλοκοποιητικών µέσων (χουµικές ενώσεις) βρίσκεται σε πρώιµο στάδιο εξαιτίας της φύσης τους, του τρόπου αποµόνωσης τους και των συµβατικών µεθόδων προσδιορισµού τους. Για τους παραπάνω λόγους, το παρόν έργο στράφηκε προς την µελέτη των συµπλόκων που 2

σχηµατίζονται υπό την παρουσία χουµικών/φουλβικών οξέων µε µέταλλα, σε υδάτινο περιβάλλον. Η κατανόηση της µοριακή δοµής και των τρόπων δέσµευσης των µετάλλων από τις χουµικές ενώσεις αποτελεί προϋπόθεση και εργαλείο µελέτης των µηχανισµών αλληλεπίδρασης των σχηµατιζόµενων συµπλόκων χουµικών ενώσεων µετάλλων µε την µικροβιακή βιοµάζα. Για τον λόγο αυτό στο παρόν έργο έγινε προσπάθεια µίας συστηµατικής πειραµατικής προσέγγισης του τρόπου δέσµευσης των µετάλλων από χουµικές ενώσεις. Στα φυσικά νερά, οι χουµικές/φουλβικές ενώσεις (HS/FS) αποτελούν το µεγαλύτερο µέρος της διαλελυµένης οργανικής ύλης και η συγκέντρωσή τους εξαρτάται από το είδος και την προέλευση του νερού, και ποικίλει από 0.1 έως 115 mg/l. Οι χουµικές ενώσεις δεν έχουν οµοιογενή χηµική δοµή, ενώ η χηµική τους σύσταση εξαρτάται από την προέλευσή τους. Εξαιτίας των υδρόφοβων και πολυλειτουργικών οµάδων που περιέχουν στο µόριό τους, µπορούν να αλληλεπιδρούν µε οργανική ύλη (π.χ. PCB, PHA) καθώς και µε ανόργανους ρυπαντές (π.χ. βαρέα µέταλλα) και να επιδρούν στην διαµόρφωση της συµπεριφοράς τους και στην «τελική τύχη» τους στα υδάτινα συστήµατα. Για τους παραπάνω λόγους µια λεπτοµερής γνώση των αλληλεπιδράσεων των χουµικών ενώσεων µε µέταλλα αποτελεί ένα εργαλείο πρόγνωσης της τοξικότητας, της αφοµοίωσης και της βιοδιαθεσιµότητας των βαρέων µετάλλων στο προς ανάλυση σύστηµα (5). Ο ποσοτικός προσδιορισµός και η εκτίµηση του ποσοστού συµπλοκοποίησης του µετάλλου σε αραιά διαλύµατα χουµικών και φουλβικών οξέων ήταν το πρώτο στάδιο προσέγγισης των στόχων του παρόντος έργου. Αυτό σηµαίνει, ότι η επιλογή της αναλυτικής µεθόδου έπαιξε πρωτεύοντα ρόλο στην εξέλιξη του παρόντος έργου. Για τον παραπάνω λόγο, έγινε προσπάθεια κατά τη χρονική περίοδο Ιανουαρίου 2003 Ιουνίου 2003 να αναπτυχθεί κατάλληλη αναλυτική µέθοδος προσδιορισµού του συµπλοκοποιηµένου µετάλλου. Σύµφωνα µε την υπάρχουσα βιβλιογραφία, για τη µελέτη των σχηµατιζόµενων συµπλόκων (Me-EDTA, Me-NTA, Me-Χουµικό), έχει αναπτυχθεί µια πληθώρα αναλυτικών µεθόδων (ανοδική βολταµετρία ASV (6,7), τεχνικές φθορισµού (8), χρήση 3

εκλεκτικών ηλεκτροδίων ISE (9) κ.α.). Στο παρόν ερευνητικό έργο αναπτύχθηκε µια νέα αναλυτική µέθοδος, η οποία στηρίζεται στη χρήση υγρής χρωµατογραφίας (HPLC) µε ανιχνευτή UV και παρουσιάζει σηµαντικά πλεονεκτήµατα έναντι των παραπάνω συµβατικών µεθόδων. Αρχικά, επιλέχθηκε σαν συµπλοκοποιητικό µέσο το EDTA, το οποίο αποτελεί ένα ισχυρό συµπλοκοποιητικό µέσο και του οποίου οι ιδιότητες έχουν εκτενέστατα µελετηθεί. Μελετήθηκαν τα σύµπλοκα Cu µε EDTA. Έτσι, αναπτύχθηκε στο εργαστήριο µας, κατάλληλη αναλυτική µέθοδος, η οποία στηρίζεται στη χρήση υγρής χρωµατογραφίας (HPLC) µε ανιχνευτή UV (4). Αναλυτικότερα, για τον προσδιορισµό των σχηµατιζόµενων συµπλόκων EDTA-Cu έγινε χρήση υγρής χρωµατογραφίας, στην οποία ο διαχωρισµός του συµπλόκου επιτεύχθηκε µε χρήση µιας κατάλληλα επεξεργασµένης ιοντοεναλλακτικής στήλης C18 και στη συνέχεια ο προσδιορισµός του µε χρήση ανιχνευτή υπεριώδους (UV) στα 254 nm. Σύµφωνα µε τα πειραµατικά αποτελέσµατα, ο προσδιορισµός των σχηµατιζόµενων συµπλόκων EDTA-Cu επιτεύχθηκε, χωρίς ιδιαίτερες παρεµβολές από άλλες ουσίες που τυχόν υπήρχαν στα προς εξέταση δείγµατα. Τέλος, να σηµειωθεί πως η επιλεγµένη µέθοδος µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον προσδιορισµό συµπλόκων και άλλων µετάλλων µε EDTA, καθώς και µετάλλων µε άλλα συνθετικά συµπλοκοποιητικά µέσα (π.χ. NTA, DTPA κ.τ.λ.). Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε σειρά πειραµάτων για την επαλήθευση της επιλεγµένης αναλυτικής µεθόδου στο προσδιορισµό των σχηµατιζόµενων συµπλόκων χουµικών οξέων Cu και Zn. Από την πορεία των πειραµάτων διαπιστώθηκε πως η επιλεγµένη µέθοδος δεν είναι κατάλληλη για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισµό των συµπλόκων χουµικών µετάλλων εξαιτίας της πολυπλοκότητας των µορίων και του µεγάλου µοριακού βάρους των χουµικών, το οποίο προκαλεί προβλήµατα στην οµαλή λειτουργία του συστήµατος. Έτσι, έγινε προσπάθεια Στο πρώτο στάδιο της µελέτης των χουµικών οξέων επιλέχθηκε νατριούχο άλας χουµικών (Na-HA), το οποίο διατίθεται στο εµπόριο από την Aldrich. 4

τροποποίησης της µεθόδου για να επιτύχουµε ποσοτικό προσδιορισµό των ενώσεων προς ταυτοποίηση. Για τον λόγο αυτό, επιλέχθηκε µια νέα στήλη σύµφωνα µε τις βιβλιογραφικές αναφορές (10,11,12), η οποία στηρίζεται σε διεργασίες αποκλεισµού µεγέθους (size exclusion column) και στη συνέχεια προσαρµόστηκε στο σύστηµα της υγρής χρωµατογραφίας (LC). Αναλυτικότερα, ο ποσοτικός προσδιορισµός του ελεύθερου χουµικού οξέος και του σχηµατιζόµενου συµπλόκου χουµικού-µετάλλων επιτεύχθηκε µε χρήση στήλης αποκλεισµού µεγέθους (size exclusion column) και ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) στα 254 nm. Οι στήλες αυτές χρησιµοποιούνται κλασσικά για τον προσδιορισµό µεγαλοµοριακών ενώσεων. Η χρήση υγρής χρωµατογραφίας µε στήλη αποκλεισµού µεγέθους αποτελεί µία άριστη µέθοδο διαχωρισµού της διαλελυµένης οργανικής ύλης (DOM) σε υδατικά διαλύµατα χωρίς να απαιτείται προεπεξεργασία των δειγµάτων και συγχρόνως παρέχει την δυνατότητα µελέτης της κατανοµής του µοριακού βάρους της διαλελυµένης οργανικής ύλης και των χουµικών ενώσεων. Τέλος, τα σηµαντικότερα επιτεύγµατα του παρόντος έργου µπορούν να συνοψιστούν στα εξής: Συγκέντρωση και αξιολόγηση της σηµαντικότερης και πιο πρόσφατης βιβλιογραφίας σχετικά µε τις ιδιότητες και τους µηχανισµούς γένεσης των συµπλόκων χουµικών ενώσεων µετάλλων. Ανάπτυξη πρωτότυπης αναλυτικής µεθόδου για τον προσδιορισµό του ελεύθερου χουµικού και του σχηµατιζόµενου συµπλόκου χουµικού µετάλλου. Μελέτη της κινητικής συµπλοκοποίησης των µετάλλων Cu και Zn µε πρότυπες χουµικές ενώσεις, οι οποίες αποµονώθηκαν µετά από κατάλληλη επεξεργασία από τη ιεθνή Κοινότητα Χουµικών Ενώσεων (IHSS). Προκαταρκτική πειραµατική διερεύνηση της δυνατότητας παρακολούθησης των αλληλεπιδράσεων συµπλόκων χουµικού µετάλλου µε ανενεργή και ενεργή µικροβιακή βιοµάζα. Εντοπισµός προβληµάτων για την πειραµατική παρακολούθηση των αλληλεπιδράσεων αυτών. 5

2. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΜΕΣΩΝ ΜΕ ΜΕΤΑΛΛΑ 2.1 ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΜΕΣΑ Οι οργανικές ενώσεις, των οποίων µελετήθηκε η επίδραση τους σε µέταλλα, επιλέχθηκαν από δύο κύριες οµάδες, τα ισχυρά συµπλοκοποιητικά µέσα (EDTA NTA) και τα µέτρια συµπλοκοποιητικά µέσα (χουµικές ενώσεις). Η µελέτη της επίδραση των ασθενών συπλοκοποιητικών µέσων (οργανικά οξέα κ.α.) στην κινητικότητα και βιοδιαθεσιµότητα των µετάλλων δεν κρίνεται αναγκαία καθώς σχηµατίζουν ασθενείς και ασταθείς δεσµούς. 2.1.1 ΙΣΧΥΡΑ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΜΕΣΑ Στην περίπτωση των ισχυρών συµπλοκοποιητικών µέσων επιλέχθηκε να µελετηθεί η περίπτωση του αιθυλοδιαµινοτετραοξικού (EDTA) και του νιτριλοτριοξεικού οξέος (NTA), τα οποία βρίσκονται σε µεγάλες συγκεντρώσεις στις εκροές των βοθρολυµάτων (30 150 µg/l και 300 1500 µg/l, αντίστοιχα), καθώς αποτελούν κύριο συστατικό απορρυπαντικών και δύναται να επηρεάσουν σε µεγάλο βαθµό την κινητικότητα και την τελική τύχη των µετάλλων (13). Το EDTA (εικόνα 1) αποτελεί ένα συνθετικό συµπλοκοποιητικό µέσο, το οποίο χρησιµοποιείται ευρέως σε βιοµηχανικές, φαρµακευτικές και γεωργικές εφαρµογές. Εξαιτίας της χαµηλής του βιοαποικοδόµησηµότητας είναι παρόν σε σχετικά µεγάλες συγκεντρώσεις τόσο σε λύµατα, όσο και σε υπόγεια νερά. Το EDTA σχηµατίζει σταθερά σύµπλοκα µε βαρέα µέταλλα, µε αποτέλεσµα σε πολλές περιπτώσεις να θεωρείται υπεύθυνο για τυχόν αναδιαλυτοποίηση ροφηµένων ή καταβυθισµένων µετάλλων. Εικόνα 1. Σχηµατική παράσταση της µοριακής δοµής του EDTA. 6

Το EDTA έχει τη δυνατότητα να συµπλοκοποιεί µεταλλικά ιόντα µε αναλογία 1:1 (εικόνα 2). Στην περίπτωση που έχει χάσει τα υδρογόνα των καρβοξυλοµάδων που περιέχει (έντονα αλκαλικό περιβάλλον) δεσµεύει το µεταλλικό ιόν σύµφωνα µε την παρακάτω χηµική εξίσωση. Οι µορφές του EDTA σε συνάρτηση µε το ph του διαλύµατος φαίνονται στο σχήµα 1. M +n + Y -4 MY n-4 K f = (MY n-4 )/(M +n )(Y -4 ) όπου, Y -4 : το µόριο του EDTA πλήρως απαλλαγµένο από τα υδρογόνα των καρβοξυλοµάδων M +n : το µεταλλικό ιόν σθένους n+ MY n-4 : το σχηµατιζόµενο σύµπλοκο K f : η σταθερά ισορροπίας η σχηµατισµού του συµπλόκου. Σχήµα 1. ιάγραµµα κατανοµής µορφών EDTA σε συνάρτηση µε το ph του διαλύµατος. 7

Εικόνα 2. Σχηµατική παράσταση της δοµής των σχηµατιζόµενων συµπλόκων µεταξύ ΝΤΑ/EDTA και δισθενών µετάλλων( Me = Me 2+ ). Η σταθερά ισορροπίας για τα περισσότερα µέταλλα, κυρίως στην περίπτωση των µεταβατικών, παρουσιάζει µεγάλες τιµές. Το NTA (εικόνα 3) αποτελεί ένα ξενοβιοτικό συµπλοκοποιητικό µέσο το οποίο εξαιτίας της ικανότητας του να συµπλοκοποιεί µέταλλα, χρησιµοποιείται ευρέως στη βιοµηχανία απορρυπαντικών και σε γεωργικές εφαρµογές. Η ιδιότητα του να συµπλοκοποιεί µέταλλα σε συνδυασµό µε την εύκολη βιοαποικοδόµησή του από µικροοργανισµούς έχει καταστήσει το NTA επικίνδυνο για το περιβάλλον καθώς µπορεί να δηµιουργήσει διαλυτά βιοδιαθέσιµα σύµπλοκα NTA µετάλλου. Για τον παραπάνω λόγω η συµπεριφορά του έχει εκτενέστατα µελετηθεί (13, 14). Εικόνα 3. Σχηµατική παράσταση της µοριακής δοµής του NTA. 8

Όµοια µε το EDTA, η δέσµευση µεταλλικών ιόντων από το ΝΤΑ µπορεί να περιγραφεί από την παρακάτω απλουστευµένη χηµική εξίσωση, ενώ η δοµή του συµπλόκου φαίνεται στην εικόνα 2. Στο σχήµα 2 φαίνονται οι µορφές του NTA σε συνάρτηση µε το ph του διαλύµατος. όπου, M +n + Y -3 MY n-3 K f = (MY n-3 )/(M +n )(Y -3 ) Y -3 : το µόριο του ΝΤΑ πλήρως απαλλαγµένο από τα υδρογόνα των καρβοξυλοµάδων M +n : το µεταλλικό ιόν σθένους n+ MY n-3 : το σχηµατιζόµενο σύµπλοκο K f : η σταθερά ισορροπίας η σχηµατισµού του συµπλόκου. Σχήµα 2. ιάγραµµα κατανοµής µορφών NTA σε συνάρτηση µε το ph του διαλύµατος 9

2.1.2 ΜΕΤΡΙΑ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΜΕΣΑ (ΧΟΥΜΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ) Οι χουµικές ενώσεις αποτελούν ένα ασυνήθιστα περίπλοκο, άµορφο µίγµα, το οποίο αποτελείται από εξαιρετικά ετερογενή, χηµικά ενεργά αλλά συγχρόνως ανθεκτικά µόρια, και το οποίο παράγεται κατά τις δευτερογενείς αντιδράσεις σύνθεσης, µεταξύ των προϊόντων αποσύνθεση της βιολογικής ύλης. Έχουν προταθεί αρκετοί µηχανισµοί για να εξηγήσουν την προέλευση και το σχηµατισµό των χουµικών ενώσεων, οι οποίοι παριστάνονται στην εικόνα 4 (21). Σύµφωνα µε την θεωρία της λιγνίνης, οι χουµικές ενώσεις προέρχονται από µετασχηµατισµούς της λιγνίνης κατά την προσβολή της από µικροοργανισµούς (διαδροµή 4, εικόνα 4). Η τροποποιηµένη λιγνίνη υφίσταται περαιτέρω µετασχηµατισµό µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό χουµικού οξέος αρχικά, και στη συνέχεια φουλβικού οξέος. Η διαδροµή 1 της εικόνας 4, η οποία δεν θεωρείται σηµαντική, υποθέτει ότι οι χουµικές ενώσεις προέρχονται από σάκχαρα. Εικόνα 4. Μηχανισµοί σχηµατισµού χουµικών ενώσεων. Η σύγχρονη θεωρία σχετικά µε τη γένεση των χουµικών ενώσεων είναι η θεωρία των πολυφαινολών (διαδροµή 2 και 3, εικόνα 4), (εικόνα 5). Στην διαδροµή 3 (εικόνα 4), η λιγνίνη αποτελεί κύριο συστατικό στο σχηµατισµό των χουµικών ενώσεων, αλλά οι φαινολικές αλδεΰδες και τα οξέα τα οποία προέρχονται από την λιγνίνη κατά την 10

προσβολή της από µικροοργανισµούς, µετατρέπονται σε κινόνες µε την βοήθεια κατάλληλων ενζύµων, ο οποίες στη συνέχεια πολυµερίζονται παρουσία ή απουσία αζωτούχων ενώσεων µε σκοπό το σχηµατισµό χουµικών ενώσεων. Η διαδροµή 2 (εικόνα 4), είναι ανάλογη της διαδροµής 3, µε τη διαφορά ότι στην περίπτωση αυτή οι πολυφαινόλες προέρχονται από άλλες πηγές άνθρακα, διαφορετικές της λιγνίνης (π.χ. κυτταρίνη) και στη συνέχεια οξειδώνονται παρουσία ενζύµων προς κινόνες και στη συνέχεια σε χουµικές ενώσεις. Εικόνα 5. Σχηµατική αναπαράσταση της θεωρίας των πολυφαινολών κατά τον σχηµατισµό των χουµικών ενώσεων. Αν και η θεωρία των πολυφαινολών είναι η δηµοφιλέστερη, για να εξηγηθούν πλήρως οι µηχανισµοί σχηµατισµού των χουµικών ενώσεων απαιτούνται και οι 4 διαδροµές, ανάλογα µε τις συνθήκες του περιβάλλοντος στο οποίο σχηµατίζονται οι χουµικές ενώσεις. Οι χουµικές ενώσεις είναι ένα από τα περισσότερο διαδεδοµένα φυσικά προϊόντα στην επιφάνεια της γης. Το µεγαλύτερο κλάσµα του οργανικού άνθρακα στη ξηρά 11

αποτελείται από χουµικές ενώσεις (>70%), ενώ στα φυσικά ύδατα το κλάσµα των χουµικών ανέρχεται στο 90% του διαλελυµένου οργανικού άνθρακα (DOM). Η περιβαλλοντική σηµασία των χουµικών ενώσεων είναι ουσιώδης. Η ύπαρξη τους επηρεάζει σε µεγάλο βαθµό την τύχη των ρυπαντών που απορρίπτονται στο περιβάλλον εξαιτίας της συµπλοκοποιητικής δράσης τους. Οι αντιδράσεις µεταξύ των χουµικών ενώσεων και των µετάλλων είναι ιδιαίτερα περίπλοκες και εξαρτώνται από το µέταλλο, τη φύση της χουµικής ένωσης και το ph του διαλύµατος. Υπάρχουν δυο πιθανά αποτελέσµατα της συµπλοκοποιητικής δράσης των χουµικών στα µέταλλα, µε διαφορετικές περιβαλλοντικές επιπτώσεις στην κινητικότητα και τη βιοδιαθεσιµότητα των µετάλλων: (i) ο σχηµατισµός διαλυτών συµπλόκων χουµικού- µετάλλου, τα οποία είναι δυνατό να προκαλέσουν ρύπανση των υπόγειων υδάτων, και (ii) ο σχηµατισµός αδιάλυτων συµπλόκων χουµικού-µετάλλου, µε αποτέλεσµα τη µείωση της βιοδιαθεσιµότητας και εποµένως της τοξικής δράσης των µετάλλων στο περιβάλλον. Η σειρά δέσµευσης των µετάλλων στις χουµικές ενώσεις σύµφωνα µε τους Gamble και Schnitzer (22) φαίνεται παρακάτω. Cu > Ni > Co > Pb = Ca > Zn > Mn > Mg Η διαδεδοµένη ύπαρξή τους στο περιβάλλον σε συνδυασµό µε την ικανότητά τους να παρέχουν πολλαπλές θέσεις αντίδρασης, καθιστούν τις χουµικές ενώσεις υπεύθυνες για ένα µεγάλο αριθµό διαδικασιών που λαµβάνουν µέρος στο περιβάλλον, όπως η αποσάθρωση των ορυκτών, η βιοδιαθεσιµότητα των θρεπτικών, η κινητικότητα των ρύπων, η σταθερότητα των κολλοειδών και ο κύκλος του άνθρακα και του αζώτου. Μέχρι σήµερα έχει γίνει µεγάλη προσπάθεια να δοθεί ένας σαφής ορισµός και να κατηγοριοποιηθούν οι χουµικές ενώσεις παρά την πολυπλοκότητα και την ετερογενή φύσης τους. Έτσι έχουν προταθεί διάφοροι τρόποι κλασµατοποίησής τους µε βάση το µοριακό τους βάρος (18), τη µέθοδο αποµόνωσής τους (19) και τη διαλυτότητά τους (17). Οι χουµικές ενώσεις µε βάση τη διαλυτότητά τους σε όξινα / αλκαλικά διαλύµατα, µπορούν να χωριστούν στα παρακάτω χουµικά κλάσµατα, τα οποία φαίνονται στον πίνακα 1. 12

Πίνακας 1. Κατηγοριοποίηση χουµικών ενώσεων µε βάση τη διαλυτότητά τους. Κλάσµα Αλκαλικό διάλυµα Όξινο διάλυµα Φουλβικό Οξύ ιαλυτό ιαλυτό Χουµικό οξύ ιαλυτό Αδιάλυτο Χουµίνη Αδιάλυτο Αδιάλυτο Αν και έχουν δοθεί σηµαντικές πληροφορίες όσο αφορά τη δοµή των χουµικών µε χρήση µεθόδων ηλεκτρονικής µικροσκοπίας, µαγνητικού πυρηνικού συντονισµού (nuclear magnetic resonance, NMR) και φασµατοσκοπίας υπερύθρου (infrared spectroscopy), η συµπεριφορά τους δεν έχει εντελώς κατανοηθεί εξαιτίας των παρακάτω λόγων: απουσία µοναδικής δοµής των χουµικών ενώσεων, απουσία µοναδικής µεθόδου αποµόνωσης και εξαγωγής τους, απουσία κατάλληλης µοναδικής αναλυτικής µεθόδου για τον προσδιορισµό των χουµικών ενώσεων. Οι υπάρχουσες πληροφορίες από τη µελέτη των χουµικών ενώσεων σε συνδυασµό µε τους γνωστούς περιορισµούς που σχετίζονται µε τη δοµή των µορίων, έχει καταστήσει δυνατή την εύρεση µόνο πιθανού µοντέλου δοµής του χουµικού / φουλβικού οξέος (εικόνα 6). Εικόνα 6. Πιθανή δοµή φουλβικού οξέος όπως έχει προταθεί από τους Schnitzer και Kahn (15). Η δραστικότητα των χουµικών εξαρτάται από τη µακροµοριακή δοµή και τις λειτουργικές οµάδες που περιέχουν. Ανεξάρτητα από τη διαδικασία αποµόνωσης των 13

χουµικών ενώσεων, το χουµικό και το φουλβικό οξύ παρουσιάζουν κοινά χαρακτηριστικά όπως η ύπαρξη και στις δύο περιπτώσεις ενεργών οµάδων που περιέχουν οξυγόνο ( COOH, φαινολικές και αινολικές υδροξυλοµάδες ΟΗ, κινόνες και ηµι-υδροκινόνες), άζωτο (-RNH 2 ) και θείο (-RSH) (16). Επίσης να σηµειωθεί ότι το φουλβικό οξύ παρουσιάζει µικρότερο µοριακό βάρος, µεγαλύτερη ολική οξύτητα και µεγαλύτερο περιεχόµενο σε καρβοξυλοµάδες (17). Η χηµική συµπεριφορά των χουµικών ενώσεων ελέγχεται κατά κύριο λόγο από δύο ενεργές οµάδες, τις καρβοξυλοµάδες και τις φαινολικές υδροξυλοµάδες. Οι καρβοξυλοµάδες αρχίζουν να χάνουν υδρογονοκατιόντα H + σε ph = 3 και το µόριο αποκτά αρνητικό φορτίο, ενώ σε ph = 9 οι φαινολικές υδροξυλοµάδες αρχίζουν να διίστανται και το µόριο να αποκτά υψηλό αρνητικό φορτίο (17). Έτσι, σε υψηλές τιµές ph, όταν λαµβάνει χώρα αποµάκρυνση υδρονοκατιόντων από τις φαινολικές υδροξυλοµάδες οι χουµικές ενώσεις είναι δυνατό να αλληλεπιδρούν µε µέταλλα µε ηλεκτροστατικές δυνάµεις αλλά παράλληλα να τα συµπλοκοποιούν όπως φαίνεται στην εικόνα 7. Εικόνα 7. Πιθανοί τρόποι αλληλεπίδρασης χουµικών ενώσεων µε µέταλλα (M n+ = µεταλλικό κατιόν µε φορτίο n + ). Η έλλειψη γνώσης σχετικά µε τη δοµή των χουµικών ενώσεων, επιφέρει αδυναµία πρόβλεψης της χηµικής και βιολογικής επίδρασής τους στο περιβάλλον, ενώ η αποσαφήνιση της πολύπλοκης δοµής τους θα δώσει µια νέα ώθηση στη µελέτη και κατανόηση της συµπεριφοράς τους στα φυσικά υδατικά συστήµατα και ειδικότερα στο ρόλο τους σαν φορείς ρυπαντών όπως π.χ. εξετάζονται στα πλαίσια του παρόντος έργου, σαν συµπλοκοποιητές µετάλλων. 14

2.2 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Προκειµένου να επιτύχουµε ποσοτικό προσδιορισµό της αλληλεπίδρασης µετάλλου χουµικού, διερευνήσαµε τη δυνατότητα ανάπτυξης µεθοδολογίας η οποία να επιτρέπει: α) τον προσδιορισµό του ελεύθερου χουµικού, β) τον προσδιορισµό του ελεύθερου µετάλλου, σε κάθε συνθετικό διάλυµα µετάλλου χουµικού το οποίο παρασκευάζεται µε στόχο την παρακολούθηση της «στοιχειοµετρίας» συµπλοκοποίησης. Με τον τρόπο αυτό η µεθοδολογική προσέγγιση αναλύεται σύντοµα παρακάτω: 1) Παρασκευάζονται συνθετικά διαλύµατα γνωστής συγκέντρωσης σε χουµικό και µέταλλο. Ζυγίζεται κατάλληλη ποσότητα χουµικής ένωσης µε σκοπό την παρασκευή διαλύµατος συγκέντρωσης 50 ppm, το οποίο χρησιµοποιείται στη συνέχεια για την προετοιµασία των προς εξέταση δειγµάτων. Παρασκευάζονται διαλύµατα µετάλλων (Cu, Zn) συγκέντρωσης 100 ppm από κατάλληλα επιλεγµένη αµπούλα. Τα παραπάνω διαλύµατα διατηρούνται στο ψυγείο. Παρασκευάζεται διάλυµα χουµικού 5 ppm και στη συνέχεια προστίθεται κατάλληλη ποσότητα διαλύµατος µετάλλου (Cu/Zn) 100 ppm. Η συγκέντρωση των συνθετικών διαλυµάτων, τα οποία πρόκειται να µελετηθούν ως προς τη συµπλοκοποιητική ικανότητα της χουµικής ένωσης, φαίνεται στον πίνακα 2. Πίνακας 2. Συγκέντρωση συνθετικών διαλυµάτων προς µελέτη. α/α Χουµική Ένωση (ppm) Μέταλλο (ppm) 1 5.00 0.00 2 5.00 0.10 3 5.00 0.50 4 5.00 1.00 5 5.00 2.50 6 5.00 5.00 7 5.00 10.00 15

2) Μετά την αποκατάσταση της ισορροπίας στο διάλυµα προσδιορίζονται ποσοτικά: το ελεύθερο χουµικό (υγρός χρωµατογράφος). το ελεύθερο µέταλλο (εκλεκτικό ηλεκτρόδιο). Το ισοζύγιο συµπλοκοποίησης περιγράφεται από τις παρακάτω εξισώσεις. Ολικό Χουµικό = Ελεύθερο Χουµικό + Συµπλοκοποιηµένο Χουµικό (1) Ολικός Χαλκός = Ελεύθερος Χαλκός + Συµπλοκοποιηµένος Χαλκός (2) Από τις εξισώσεις (1) και (2), γνωρίζοντας τις συγκεντρώσεις των συνθετικών διαλυµάτων και προσδιορίζοντας µε την βοήθεια των αναλυτικών µεθόδων το ελεύθερο χουµικό και τον ελεύθερο χαλκό, καθίσταται δυνατός ο προσδιορισµός του συµπλοκοποιηµένου χουµικού/χαλκού. 2.2.1 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΧΟΥΜΙΚΟΥ. ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΗΛΗΣ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΥΓΡΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥ Αρχικά, η δράση διαφόρων συµπλοκοποιητικών µέσων σε µέταλλα, µελετήθηκε µε χρήση ενός συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας, στην οποία ο διαχωρισµός του συµπλόκου επιτεύχθηκε µε κατάλληλα επεξεργασµένη ιοντοεναλλακτικής στήλης C 18 και στη συνέχεια ο προσδιορισµός του µε χρήση ανιχνευτή υπεριώδους (UV) στα 254 nm. Αναλυτικότερα, χρησιµοποιήθηκε µια ιοντοεναλλακτική στήλη, 25cm 4,6mm C 18 (Supelco Discovery), η οποία επεξεργάστηκε κατάλληλα µε σκοπό την αποµάκρυνση των µεταλλικών ιόντων τα οποία δύναται να προκαλέσουν σφάλµα στις µετρήσεις. Η στήλη προσαρµόστηκε στο σύστηµα της υγρής χρωµατογραφίας µε ταυτόχρονη χρήση µιας προστήλης για την προστασία της κυρίως στήλης από επιµολύνσεις και πιθανές φράξεις. Αρχικά, το σύστηµα καθαρίστηκε και σταθεροποιήθηκε πριν χρησιµοποιηθεί για πρώτη φορά µε σκοπό την αποµάκρυνση των µεταλλικών ιόντων. Για τον λόγο, αυτό αντλήθηκε από το σύστηµα διάλυµα 20% νιτρικού οξέος για 30min, απιονισµένου νερού για 3h και στην συνέχεια ακετονιτρίλιου για 1h. 16

Πριν από τη µέτρηση το πληρωτικό υλικό της στήλης επικαλύφθηκε µε cetrimide, προκειµένου να ενισχυθεί η ιοντοεναλλακτική ικανότητα της, µε άντληση διαλύµατος 1mM cetrimide σε µεθανόλη-νερό (30:70) για 10h ροή 0,5 ml/min. Οι αναλυτικές συνθήκες συνοψίζονται στον πίνακα 3. Πίνακας 3. Αναλυτικές συνθήκες µέτρησης. Χρωµατογραφία Ανιχνευτής υπεριώδους (UV) Προστήλη Αναλυτική στήλη Προεπεξεργασία Κινούµενη φάση Ροή Ποσότητα δείγµατος Χρόνος µέτρησης Μήκος κύµατος (λ) Discovery LC-18, 4.0 mm I.D. (Supelco) Discovery LC-18, 25cm 4.6 mm I.D. (Supelco) Παθητικοποίηση συστήµατος (επικάλυψη στήλης µε cetrimide) 6 mm Na 2 SO 4, 1mM HEPES, ρυθµισµένο σε ph 7 µε NH 4 OH 1.5 ml/min 250 µl 30 min 258 nm Μελετήθηκαν τα σχηµατιζόµενα σύµπλοκα EDTA Cu και NTA - Cu. Σύµφωνα µε τα χρωµατογραφήµατα που προέκυψαν, επιτεύχθηκε ποιοτικός προσδιορισµός των σχηµατιζόµενων συµπλόκων, αλλά η επιλεγµένη µέθοδος κρίθηκε ακατάλληλη καθώς εµφάνισε αδυναµία ποσοτικού προσδιορισµού τους, εξαιτίας της αδυναµίας διαχωρισµού της κορυφής του ελεύθερου EDTA/NTA και του σχηµατιζόµενου συµπλόκου. Η παραπάνω αδυναµία της µεθόδου κατέστησε αναγκαία την τροποποίησή της για να καλύψει τις ανάγκες του έργου. Επιλέχθηκε µια νέα στήλη µε διευρυµένες δυνατότητες έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η µελέτη του φαινοµένου της συµπλοκοποίησης των µετάλλων µε ισχυρά συµπλοκοποιητικά µέσα (EDTA NTA), 17

καθώς και µε ήπια συµπλοκοποιητικά µέσα (χουµικές ενώσεις) των οποίων η φύση καθιστούσε αδύνατο τον προσδιορισµό τους µε µια ιοντοεναλλακτική στήλη. Οι αναλυτικές συνθήκες της νέας µεθόδου συνοψίζονται στον πίνακα 4. Πίνακας 4. Αναλυτικές συνθήκες µέτρησης. Χρωµατογραφία Ανιχνευτής υπεριώδους (UV) Προστήλη Αναλυτική στήλη Κινούµενη φάση Ροή Ποσότητα δείγµατος Χρόνος µέτρησης Μήκος κύµατος (λ) TSKgel G3000PW (TOSOH BIOSEP) 7,5 mm 7,5 cm TSKgel G3000PW (TOSOH BIOSEP) 7,5 mm 30 cm Υπερκάθαρο νερό 0,50 ml/min 100 µl 20 min 254 nm Προσδιορίστηκαν οι αναλυτικές συνθήκες για τον ποσοτικό προσδιορισµό διαλυµάτων χουµικού οξέος. Αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα διαλυµάτων χουµικών ενώσεων φαίνονται στην εικόνα 8. Η παραγόµενη καµπύλη αναφοράς φαίνεται στο σχήµα 3. Εικόνα 8. Αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα διαλυµάτων χουµικών ενώσεων. 18

Area (µv/sec) 1000000,00 900000,00 800000,00 700000,00 600000,00 500000,00 400000,00 300000,00 200000,00 y = 171695x + 2715,4 R 2 = 0,9998 100000,00 0,00 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 Συγκέντρωση Χουµικού οξ. (ppm) Σχήµα 3. Αντιπροσωπευτική καµπύλη αναφοράς πρότυπου χουµικού οξέος από υγρό χρωµατογράφο. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα έδειξαν ότι η αναλυτική µέθοδος ανταποκρίνεται τόσο στον ποιοτικό όσο και στον ποσοτικό προσδιορισµό των ελεύθερων χουµικών ενώσεων. 2.2.2 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΈΝΤΡΩΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΙΑΛΥΤΟΥ ΜΕΤΑΛΛΟΥ ΜΕ ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ ΗΛΕΚΤΡΟ ΙΑ Έγινε χρήση εκλεκτικού ηλεκτροδίου χαλκού (ISE Cu METROHM) το οποίο σε συνδυασµό µε ένα ηλεκτρόδιο αναφοράς, εµβαπτίστηκε στα προς εξέταση δείγµατα και κατέστησε δυνατό τον προσδιορισµό των ελευθέρων ιόντων χαλκού στα προς εξέταση διαλύµατα. Αντιπροσωπευτική καµπύλη αναφοράς φαίνεται στο σχήµα 4. 220,0 210,0 V (mv) 200,0 190,0 y = 27,544x + 198,66 R 2 = 0,9998 180,0-0,40-0,20 0,00 0,20 0,40 0,60 log(cu) Σχήµα 4. Αντιπροσωπευτική καµπύλη αναφοράς ελεύθερων ιόντων χαλκού από εκλεκτικό ηλεκτρόδιο. 19

Τέλος, έγινε χρήση ηλεκτροδίου µέτρησης ph. Σύµφωνα µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα, το ph των προς εξέταση διαλυµάτων επηρεάζει την συµπλοκοποιητική ικανότητα των χουµικών ενώσεων, αλλά η φύση της επιλεγµένης αναλυτικής µεθόδου επιτρέπει τον προσδιορισµό των χουµικών ενώσεων σε ph όµοιο µε του υπερκάθαρου νερού. 20

2.3 ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ - ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ 2.3.1 EDTA NTA Για τη µελέτη της συµπλοκοποιητικής ικανότητας των ισχυρών συµπλοκοποιητικών µέσων NTA και EDTA χρησιµοποιήθηκε συνδυασµός υγρού χρωµατογράφου και εκλεκτικού ηλεκτροδίου χαλκού. Οι αναλυτικές συνθήκες του χρωµατογράφου φαίνονται στον πίνακα 4. Από τα χρωµατογραφήµατα των προς εξέταση δειγµάτων επιτεύχθηκε ποιοτικός προσδιορισµός των σχηµατιζόµενων συµπλόκων, αλλά η επιλεγµένη µέθοδος εµφάνισε αδυναµία ποσοτικού προσδιορισµού τους, εξαιτίας της αδυναµίας διαχωρισµού της κορυφής του ελεύθερου EDTA/NTA και σχηµατιζόµενου συµπλόκου. Η χρήση του εκλεκτικού ηλεκτροδίου χαλκού έδωσε πληροφορίες όσον αφορά την κατανοµή του χαλκού στα προς εξέταση δείγµατα. Στο σχήµα 5 παρουσιάζεται η συσχέτιση µεταξύ ολικού χαλκού και ελεύθερου χαλκού στα διαλύµατα. Όπως φαίνεται από το σχήµα 5, ο προστιθέµενος χαλκός στο διάλυµα συµπλοκοποιείται από το EDTA/NTA πλήρως µε γραµµοµοριακή αναλογία 1:1, ενώ η προσθήκη επιπλέον ποσότητας Cu οδηγεί στην εµφάνιση ελευθέρων ιόντων χαλκού στο διάλυµα. NTA/EDTA : 0,025 mm 0,030 Ελεύθερος Χαλκός (mm) 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 Ολικός Χαλκός (mm) NTA EDTA Σχήµα 5. Κατανοµή Χαλκού στο διάλυµα (NTA/EDTA: 0,025 mm). Τα παραπάνω πειραµατικά αποτελέσµατα επιβεβαίωσαν την εγκυρότητα της αναλυτικής µεθόδου καθώς συµπίπτουν µε τις βιβλιογραφικές αναφορές, οι οποίες σχετίζονται µε την συµπλοκοποιητική δράση των EDTA/NTA (13, 14). 21

2.3.2 ΧΟΥΜΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ Μελετήθηκαν οι παρακάτω χουµικές ενώσεις: 1. Πρότυπο Χουµικό οξύ από τη ιεθνή Κοινότητα Χουµικών Ενώσεων (IHSS). 2. Χουµικό οξύ από την εταιρία Aldrich. 3. Πρότυπο Φουλβικό οξύ από τη ιεθνή Κοινότητα Χουµικών Ενώσεων (IHSS). Στον πίνακα 5 φαίνεται η στοιχειακή σύσταση, οι όξινες ενεργές οµάδες και η κατανοµή του άνθρακα ( 13 C NMR) των πρότυπων χουµικών ενώσεων. Πίνακας 5. Στοιχειακή σύσταση, όξινες ενεργές οµάδες, κατανοµή άνθρακα προτύπων χουµικών ενώσεων. Elemental composition Sample Standard HA Cat. No. H 2 O Ash C H O N S P Suwannee River I 1S101H 10.0 3.10 52.55 4.40 42.53 1.19 0.58 <0.01 Standard FA Suwannee River I 1S101F 8.8 0.46 52.44 4.31 42.20 0.72 0.44 <0.01 Acidic Functional Groups of IHSS Samples Sample Cat. No. Carboxyl Phenolic Q 1 Log K 1 n 1 Q 2 Log K 2 n 2 N RMSE Standard HA Suwannee River 1S101H 9.59 4.24 10.69 4.42 3.79 2.28 9.68 1.11 113 0.0673 Standard FA Suwannee River 1S101F 11.44 2.91 12.00 3.80 3.21 1.48 9.52 1.00 109 0.1053 Solution State 13 C NMR Estimates of Carbon Distribution Sample Cat. No. Carbonyl Carboxyl Aromatic Acetal Heteroaliphatic Aliphatic 220-190 ppm 190-165 ppm 165-110 ppm 110-90 ppm 90-60 ppm 60-0 ppm Standard HA 22

Suwannee River 1S101H 8 19 37 9 7 21 Standard FA Suwannee River 1S101F 7 20 24 5 11 33 Κατά τη διαλυτοποίηση των πρότυπων χουµικών ενώσεων σε υπερκάθαρο νερό µε ph : 5,5 6,5, διαπιστώθηκε µείωση του ph του διαλύµατος εξαιτίας της διάστασης των καρβοξυλοµάδων των χουµικών ενώσεων. Η παραπάνω µείωση του ph σε δύο αντιπροσωπευτικά πειράµατα, φαίνεται στο σχήµα 6. 6,50 ph 6,00 5,50 1-Νοε 11-Νοε 5,00 4,50 0,000 2,000 4,000 6,000 Συγκέντρωση Χουµικού Οξέος (ppm) Σχήµα 6. Μείωση ph κατά την διαλυτοποίηση πρότυπου χουµικού οξέος. 2.3.2.1 ΠΡΟΤΥΠΟ ΧΟΥΜΙΚΟ ΟΞΥ (IHSS Humic acid) Η συµπλοκοποιητική ικανότητα πρότυπων χουµικών ενώσεων, τα οποία αποµονώθηκαν µετά από κατάλληλη επεξεργασία νερού από τον ποταµό Suwannee (Καναδάς) από τη ιεθνή Κοινότητα Χουµικών Ενώσεων (International Humic Substances Society), µελετήθηκε µε χρήση της αναλυτικής µεθόδου της οποίας οι συνθήκες συνοψίζονται στον πίνακα 4. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα έδειξαν ότι η αναλυτική µέθοδος ανταποκρίνεται τόσο στον ποιοτικό όσο και στον ποσοτικό προσδιορισµό του ελεύθερου χουµικού οξέος. Μελετήθηκε η συµπλοκοποιητική ικανότητα των χουµικών ενώσεων στα µέταλλα Cu και Zn. Η επιλογή των συγκεκριµένων µετάλλων στηρίχθηκε στην σειρά δέσµευσης τους από τις χουµικές ενώσεις, όπως αυτή παρουσιάζεται στο κεφάλαιο 2.1.2. Από 23

την σειρά αυτή επιλέχθηκε ένα µέταλλο το οποίο παρουσιάζει µεγάλη τάση συµπλοκοποίησής του από χουµικές ενώσεις (Cu), και ένα µε µικρή (Zn). Η µορφή των χρωµατογραφηµάτων φαίνεται στις εικόνες 9 και 10 όπου είναι εµφανής η κορυφή του ελεύθερου χουµικού οξέος. Εικόνα 9. Χρωµατογράφηµα δείγµατος Χουµικού Zn Εικόνα 10. Χρωµατογράφηµα δείγµατος Χουµικού Cu Από τα χρωµατογραφήµατα των προς εξέταση δειγµάτων υπολογίστηκε η ποσότητα του ελευθέρου χουµικού οξέος και στη συνέχεια η ποσότητα του σχηµατιζόµενου συµπλόκου από την εξίσωση 3. Χουµικό (σύµπλοκοποιηµένο) = Χουµικό (ολικό) Χουµικό (ελεύθερο) (3) 24

Κινητική δέσµευσης µετάλλου από το πρότυπο χουµικό οξύ Τα σχήµατα 7 και 8 παρουσιάζουν τη χρωµατογραφική παρακολούθηση της µείωσης του ελεύθερου χουµικού οξέος σε συνάρτηση µε το προστιθέµενο διαλυτό µέταλλο στο διάλυµα. 12,00 Ελεύθερο Χουµικό Οξύ (ppm) 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 Ολικός Zn (ppm) Σχήµα 7. Επίδραση της συγκέντρωσης του προστιθέµενου Zn στο ελεύθερο χουµικό οξύ. 6,00 Ελεύθερο Χουµικό Οξύ (ppm) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Ολικός Χαλκός (ppm) Σχήµα 8. Επίδραση της συγκέντρωσης του προστιθέµενου Cu στο ελεύθερο χουµικό οξύ. Από τα σχήµατα 7, 8 φαίνεται ότι όταν η αναλογία µαζών ολικό µέταλλο (Cu, Zn) / ολικό χουµικό είναι 1/2, παύει να υπάρχει ανιχνεύσιµη ποσότητα ελεύθερου χουµικού οξέος. 25

Για να ολοκληρωθεί η ποσοτική µελέτη του φαινοµένου, χρησιµοποιήθηκε ένα εκλεκτικό ηλεκτρόδιο χαλκού (ISE Cu METROHM) το οποίο κατέστησε δυνατό τον προσδιορισµό των ελευθέρων ιόντων χαλκού, και στη συνέχεια από την εξίσωση 4 τον υπολογισµό του συµπλοκοποιηµένου χαλκού. Χαλκός (Συµπλοκοποιηµένος) = Χαλκός (Ολικός) Χαλκός (Ελεύθερος) (4) Τα πειραµατικά αποτελέσµατα των προς εξέταση δειγµάτων παρουσιάζονται στο σχήµα 9. Στο σχήµα αυτό δίνονται τρεις καµπύλες: 1) η καµπύλη µείωσης της συγκέντρωσης του ελευθέρου χουµικού οξέος προσδιορισµένη χρωµατογραφικά, 2) η καµπύλη αύξησης της συγκέντρωσης του ελευθέρου χαλκού προσδιορισµένη µε εκλεκτικό ηλεκτρόδιο χαλκού, 3) η καµπύλη αύξησης της συγκέντρωσης του συµπλοκοποιηµένου από το χουµικό χαλκό προσδιορισµένη από την εξίσωση 4. (Ολικό Χουµικό Οξύ: 5ppm) 9,00 8,00 Συγκέντρωση C (ppm) 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 Ελεύθερος Χαλκός Συµπλοκοποιηµένος Χαλκός Ελεύθερο Χουµικό οξύ 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Ολικός Χαλκός (ppm) Σχήµα 9. Κατανοµή Χαλκού (Ολικό χουµικό οξύ: 5ppm). Από το σχήµα 9, φαίνεται ότι η συγκέντρωση τόσο του συµπλοκοποιηµένου όσο και του ελεύθερου χαλκού αυξάνεται καθώς αυξάνεται ο προστιθέµενος χαλκός στο διάλυµα. Το ολικό χουµικό οξύ στο διάλυµα είναι 5 ppm, και όπως µπορεί να διαπιστωθεί από το σχήµα 9, όταν ο προστιθέµενος χαλκός στο διάλυµα υπερβεί τα 26

2,50 ppm παύει να υφίσταται σαν ελεύθερο χουµικό οξύ. Όµως, η αύξηση του συµπλοκοποιηµένου χαλκού πέρα τα 2,50 ppm προστιθέµενου χαλκού, φανερώνει ότι το χουµικό οξύ έχει τη δυνατότητα να συµπλοκοποιεί επιπλέον ποσότητα χαλκού, παρά το γεγονός ότι δεν υπάρχει ελεύθερο χουµικό οξύ στο διάλυµα. Η συµπεριφορά αυτή του χουµικού οξέος οφείλεται στις πολυάριθµες ενεργές συµπλοκοποιητικές οµάδες που περιέχει στο µόριο του. 2.3.2.2 ΧΟΥΜΙΚΟ ΟΞΥ ALDRICH Για τη µελέτη της δράσης του χουµικού οξέος Aldrich, ακολουθήθηκε όµοια µεθοδολογία µε αυτή των πρότυπων χουµικών ενώσεων και η οποία περιγράφεται στη παράγραφο 2.2. Στην εικόνα 11 φαίνονται τα παραγόµενα χρωµατογραφήµατα. Εικόνα 11. Χρωµατογραφήµατα Χουµικού οξέος Aldrich Cu. Από την εικόνα 11 φαίνεται η µείωση του ελευθέρου χουµικού οξέος µε την αύξηση του προστιθέµενου χαλκού στο διάλυµα. Κινητική δέσµευσης µετάλλου από το χουµικό οξύ Aldrich Από τα χρωµατογραφήµατα των προς εξέταση δειγµάτων υπολογίστηκε η ποσότητα του ελευθέρου χουµικού οξέος και στη συνέχεια η ποσότητα του σχηµατιζόµενου 27

συµπλόκου. Το σχήµα 10 παρουσιάζει τη µείωση του ελεύθερου χουµικού οξέος σε συνάρτηση µε το προστιθέµενο διαλυτό χαλκό στο διάλυµα. 6,00 Ελεύθερο Χουµικό Οξύ (ppm) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Ολικός Χαλκός (ppm) Σχήµα 10. Επίδραση της συγκέντρωσης του προστιθέµενου Cu στο ελεύθερο χουµικό οξύ. Από το σχήµα 10 φαίνεται πώς παύει να υπάρχει ελεύθερο χουµικό οξύ όταν η αναλογία µαζών Cu:Χουµικό οξύ είναι 1:2. Στη συνέχεια, µε την ταυτόχρονη χρήση του εκλεκτικού ηλεκτροδίου επιτεύχθηκε η µελέτη της κατανοµής του προστιθέµενου χαλκού στο διάλυµα. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα φαίνονται στο σχήµα 11. (Ολικό Χουµικό: 5ppm) 10,00 9,00 Συγκέντρωση C (ppm) 8,00 7,00 Ελεύθερος Χαλκός 6,00 Συµπλοκοποιηµένος Χαλκός 5,00 Ελεύθερο Χουµικό Οξύ 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Ολικός Χαλκός (ppm) Σχήµα 11. Κατανοµή Χαλκού Μείωση ελευθέρου χουµικού (Ολικό χουµικό οξύ: 5ppm). 28

Από το σχήµα 11, φαίνεται ότι η συγκέντρωση του ελεύθερου χαλκού αυξάνεται, ενώ η συγκέντρωση του συµπλοκοποιηµένου χαλκού παραµένει σταθερή καθώς αυξάνεται ο προστιθέµενος χαλκός στο διάλυµα πέρα τα 2,50 ppm. Το ολικό χουµικό οξύ στο διάλυµα είναι 5 ppm, και όπως µπορεί να διαπιστωθεί από το σχήµα 11, όταν ο προστιθέµενος χαλκός στο διάλυµα υπερβεί τα 2,50 ppm παύει να υφίσταται σαν ελεύθερο χουµικό οξύ και αδυνατεί να συµπλοκοποιήσει επιπλέον ποσότητα χαλκού. 2.3.2.3 ΠΡΟΤΥΠΟ ΦΟΥΛΒΙΚΟ ΟΞΥ (IHSS Fulvic acid) Για τη µελέτη της συµπλοκοποιητικής δράσης πρότυπων φουλβικών ενώσεων (IHSS Fulvic acid), ακολουθήθηκε η αναλυτική µέθοδος που περιγράφηκε στο κεφάλαιο 2.2, δηλαδή η ταυτόχρονη χρήση συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας µε στήλη αποκλεισµού µεγέθους και ανιχνευτή υπεριώδους, και εκλεκτικού ηλεκτροδίου χαλκού. Κινητική δέσµευσης µετάλλου από το πρότυπο φουλβικό οξύ Από τα πειραµατικά αποτελέσµατα προκύπτει η δράση του προστιθέµενου χαλκού στη συγκέντρωση του ελεύθερου φουλβικού οξέος (σχήµα 12). 6,00 Ελεύθερο Φουλβικό οξύ (ppm) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 Ολικός Χαλκός (ppm) Σχήµα 12. Επίδραση της συγκέντρωσης του προστιθέµενου χαλκού στη συγκέντρωση του ελεύθερου φουλβικού οξέος. 29

Όπως φαίνεται από το σχήµα 12, το πρότυπο φουλβικό οξύ παρουσιάζει την ίδια συµπεριφορά µε το χουµικό οξύ (IHSS και Aldrich) και σε αναλογία µαζών Cu : φουλβικό οξύ 1:2, παύει να υπάρχει ελεύθερο στο διάλυµα. Η ταυτόχρονη χρήση ενός εκλεκτικού ηλεκτροδίου χαλκού (ISE Cu METROHM), κατέστησε δυνατό τον προσδιορισµό των ελευθέρων ιόντων χαλκού, και στη συνέχεια τον υπολογισµό του συµπλοκοποιηµένου χαλκού. Η κατανοµή του χαλκού στο διάλυµα φαίνεται στο σχήµα 13. 7,00 6,00 Συγκέντρωση C (ppm) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 Ελεύθερος Χαλκός Συµπλοκοποιηµένος Χαλκός Ελεύθερο Φουλβικό Οξύ 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Ολικός Χαλκός (ppm) Σχήµα 13. Κατανοµή Χαλκού Μείωση ελευθέρου φουλβικού (Ολικό φουλβικό οξύ: 5ppm). Από το σχήµα 13, φαίνεται ότι η συγκέντρωση τόσο του συµπλοκοποιηµένου όσο και του ελεύθερου χαλκού αυξάνεται καθώς αυξάνεται ο προστιθέµενος χαλκός στο διάλυµα. Το ολικό φουλβικό οξύ στο διάλυµα είναι 5 ppm, και όπως µπορεί να διαπιστωθεί από το σχήµα 13, όταν ο προστιθέµενος χαλκός στο διάλυµα υπερβεί τα 2,50 ppm παύει να υφίσταται σαν ελεύθερο φουλβικό οξύ. Όµως, η αύξηση του συµπλοκοποιηµένου χαλκού πέρα τα 2,50 ppm προστιθέµενου χαλκού, φανερώνει ότι το φουλβικό οξύ έχει την δυνατότητα να συµπλοκοποιεί επιπλέον ποσότητα χαλκού, παρά το γεγονός ότι δεν υπάρχει ελεύθερο φουλβικό οξύ στο διάλυµα. Όµοια µε την περίπτωση του πρότυπου χουµικού οξέος, η συµπεριφορά αυτή του φουλβικού οξέος οφείλεται στις πολυάριθµες ενεργές συµπλοκοποιητικές οµάδες που περιέχει στο µόριο του. 30

2.3.2.4 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟ ΜΕΛΕΤΗ ΧΟΥΜΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Στο σχήµα 14, παρουσιάζεται η µείωση της ελεύθερης χουµικής ένωσης (Humic IHSS, Humic Aldrich και Fulvic IHSS) σε συνάρτηση µε την προστιθέµενη ποσότητα χαλκού στο διάλυµα. Από το σχήµα 14 φαίνεται ότι και οι τρεις µορφές χουµικών ενώσεων παρά τη διαφορετική τους µοριακή δοµή, προέλευση και µέθοδο αποµόνωσης, εµφανίζουν παρόµοια συµπεριφορά. Και στις τρεις περιπτώσεις παύει να υφίσταται ελεύθερη χουµική ένωση στο διάλυµα όταν η αναλογία µαζών χαλκού:χουµική ένωση είναι περίπου 1:2. 6,00 Ελεύθερη Χουµική Ένωση (ppm) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 Humic IHSS Humic Ald Fulvic IHSS 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Ολικός Χαλκός (ppm) Σχήµα 14. Μείωση της ποσότητας της ελεύθερης χουµικής ένωσης σε συνάρτηση µε την ποσότητα του ολικού χαλκού στο διάλυµα. Από το σύνολο των πειραµατικών δεδοµένων φαίνεται ότι η µεθοδολογία που αναπτύχθηκε είναι αξιόπιστη και ακριβής. Στο σχήµα 15 παρουσιάζεται η συγκέντρωση του συµπλοκοποιηµένου χαλκού σε συνάρτηση µε τον ολικό χαλκό που προστέθηκε στο διάλυµα. Κάθε µία καµπύλη του σχήµατος αντιστοιχεί σε µια υπό µελέτη χουµική ένωση. 31

4,00 Συµπλοκοποιηµένος Χαλκός (ppm) 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 Humic IHSS Humic Ald Fulvic IHSS 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Ολικός Χαλκός (ppm) Σχήµα 15. Επίδραση της φύσης της χουµικής ένωσης στην κατανοµή του χαλκού (Συγκέντρωση χουµικής ένωσης: 5 ppm). Από το σχήµα αυτό φαίνεται ότι το φουλβικό οξύ έχει τη µεγαλύτερη συµπλοκοποιητική ικανότητα από τις χουµικές ενώσεις που µελετήθηκαν στο παρόν έργο. Η δράση αυτή του φουλβικού οξέος οφείλεται στο µεγαλύτερο περιεχόµενο σε καρβοξυλοµάδες, οι οποίες στις συνθήκες ph των πειραµάτων διίστανται µε αποτέλεσµα να αλληλεπιδρούν µε τα µέταλλα µε ηλεκτροστατικές δυνάµεις (17). Επίσης από το σχήµα 15 φαίνεται ότι το πρότυπο χουµικό οξύ παρουσιάζει µεγαλύτερη συµπλοκοποιητική ικανότητα από το χουµικό οξύ Aldrich. Η συµπεριφορά αυτή πιθανόν, προέρχεται από τη διαφορετική µοριακή δοµή και τις διαφορετικές ενεργές οµάδες που περιέχουν, καθώς δεν είναι ίδιος ο τρόπος αποµόνωσης και η προέλευσή τους. 32

3. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΧΟΥΜΙΚΟΥ ΜΕΤΑΛΛΟΥ ΜΕ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ Σύµφωνα µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα, µακροµόρια όπως το χουµικό οξύ είναι γνωστό ότι ροφώνται στην επιφάνεια της βιοµάζας και επιδρούν στη µικροβιακή δραστηριότητα. Σύµφωνα µε τους Tranvik και Sieburth (20) έχει διαπιστωθεί ότι η µικροβιακή πυκνότητα πενταπλασιάζεται σε δείγµατα όπου υπάρχουν χουµικές ενώσεις, παρά το γεγονός ότι ο άνθρακας των χουµικών ενώσεων δεν είναι άµεσα βιοδιαθέσιµος. Η αύξηση αυτή είναι δυνατό να προέρχεται από την αύξηση των θρεπτικών καθώς οι χουµικές ενώσεις είναι δυνατό να δρουν σαν µέσο συγκέντρωσης και ανταλλαγής θρεπτικών µε τη βιοµάζα. Στο παρόν έργο έλαβε µέρος µία προκαταρκτική πειραµατική διερεύνηση της δυνατότητας παρακολούθησης της αλληλεπίδρασης των συµπλόκων χουµικού - µετάλλων µε µικροβιακή βιοµάζα. Επιλέχθηκε να εξεταστεί το χουµικό οξύ Aldrich. Χρησιµοποιήθηκε ανενεργή βιοµάζα ψευδοµονάδων (Pseudomonas sp.) και ενεργή βιοµάζα µυκήτων (Sacharomyces Cerevisiae). Το µέταλλο που επιλέχθηκε είναι ο χαλκός διότι έχει εκτενέστατα µελετηθεί στο παρόν έργο. Στην παρούσα µελέτη του φαινοµένου κρίθηκε αναγκαίος ο προσδιορισµός της κατανοµής του χαλκού στο διάλυµα. Ο προστιθέµενος χαλκός στο διάλυµα είναι δυνατό: a) Να ροφηθεί από τη µικροβιακή βιοµάζα. b) Να συµπλοκοποιηθεί από το χουµικό οξύ. c) Να συµπλοκοποιηθεί από τα πιθανά πολυµερή, τα οποία εκκρίνονται από την ενεργή βιοµάζα κατά τις διαδικασίες µεταβολισµού της. d) Να παραµείνει ελεύθερος στο διάλυµα. Η κατανοµή του χαλκού στα προς εξέταση διαλύµατα περιγράφεται από της εξίσωση (1) στην περίπτωση ανενεργής βιοµάζας και την εξίσωση (2) στην περίπτωση ενεργής βιοµάζας. Cu (ολικός) = Cu (ελεύθερος) + Cu (συµπλοκοποιηµένος από το χουµικό) + Cu (ροφηµένος στη βιοµάζα) (1) 33

Cu (ολικός) = Cu (ελεύθερος) + Cu (συµπλοκοποιηµένος από το χουµικό) + Cu (συµπλοκοποιηµένος από εκκρίσεις βιοµάζας) + Cu (ροφηµένος στη βιοµάζα) (2) Για τη µελέτη του φαινοµένου χρησιµοποιήθηκε η αναλυτική µέθοδος που περιγράφεται στο κεφάλαιο 2.2, δηλαδή ο συνδυασµός υγρής χρωµατογραφίας και εκλεκτικού ηλεκτροδίου χαλκού. Παρασκευάστηκαν συνθετικά διαλύµατα χαλκού χουµικού Aldrich βιοµάζας. Οι συγκεντρώσεις των συνθετικών διαλυµάτων φαίνονται στον πίνακα 6. Πίνακας 6. Συγκέντρωση συνθετικών διαλυµάτων µελέτης της αλληλεπίδρασης χουµικού µετάλλων βιοµάζας. α/α Βιοµάζα (ppm) Χουµικό Οξύ (Aldrich) (ppm) Χαλκός (ppm) 1 400 0 0 2 400 5 0,5 3 400 5 1 4 400 5 5 5 400 5 10 Τα διαλύµατα αναδεύονται για 5 ώρες. Στα δείγµατα γίνεται µέτρηση του ελεύθερου χαλκού µε εκλεκτικό ηλεκτρόδιο. Στη συνέχεια µικρή ποσότητα δείγµατος διηθείται από φίλτρο 0,45 µm µε σκοπό την αποµάκρυνση της βιοµάζας και στη συνέχεια οδηγείται στον υγρό χρωµατογράφο µε σκοπό τη µέτρηση του ελεύθερου χουµικού οξέος στο διάλυµα. Στα χρωµατογραφήµατα που προέκυψαν παρουσιάστηκαν παρεµβολές, πιθανότατα προερχόµενες από τη βιοµάζα, στις αναµενόµενες θέσεις εµφάνισης του χουµικού οξέος, µε αποτέλεσµα να δυσχεραίνεται ο ποσοτικός προσδιορισµός του. Αντιπροσωπευτικό χρωµατογράφηµα φαίνεται στην εικόνα 12, από όπου µπορεί να διαπιστωθεί η αδυναµία της µεθόδου κατά το διαχωρισµό της κορυφής του ελεύθερου χουµικού από άλλες παρούσες µακροµοριακές ενώσεις στο προς εξέταση δείγµα. 34

Εικόνα 12. Αντιπροσωπευτικό χρωµατογράφηµα διαλύµατος χουµικού χαλκού παρουσία βιοµάζας. Από τα πειραµατικά αποτελέσµατα, τα οποία προέκυψαν από τη χρήση του εκλεκτικού ηλεκτροδίου, διαπιστώθηκε ότι στις συνθήκες εκτέλεσης των πειραµάτων, όλη η ποσότητα του προστιθέµενου χαλκού είναι δεσµευµένη είτε από το χουµικό οξύ, είτε ροφηµένη στην επιφάνεια της µικροβιακής βιοµάζας. 35

4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα σηµαντικότερα συµπεράσµατα του παρόντος έργου µπορούν να συνοψιστούν στα εξής: 1. Αναπτύχθηκε πρωτότυπη αναλυτική µέθοδος για τον προσδιορισµό του ελεύθερου χουµικού και του σχηµατιζόµενου συµπλόκου χουµικού µετάλλου. Από τα αποτελέσµατα ενός µεγάλου αριθµού πειραµάτων, η αναλυτική µέθοδος κρίθηκε αξιόπιστη και ακριβής. 2. Στην περίπτωση των ισχυρών συµπλοκοποιητικών µέσων EDTA/NTA, επιτεύχθηκε ποιοτικός προσδιορισµός των σχηµατιζόµενων συµπλόκων, αλλά η επιλεγµένη µέθοδος εµφάνισε αδυναµία ποσοτικού προσδιορισµού τους. ήχθηκε πειραµατικά µε χρήση εκλεκτικού ηλεκτροδίου χαλκού, ότι τα EDTA/NTA συµπλοκοποιούν τον προστιθέµενο χαλκό στο διάλυµα µε γραµµοµοριακή αναλογία 1:1 όπως άλλωστε υποδεικνύεται και από σχετικές βιβλιογραφικές αναφορές (13, 14). 3. Μελετήθηκε επιτυχώς η κινητική συµπλοκοποίησης των µετάλλων Cu και Zn µε πρότυπες χουµικές ενώσεις, οι οποίες αποµονώθηκαν µετά από κατάλληλη επεξεργασία από την ιεθνή Κοινότητα Χουµικών Ενώσεων (IHSS). 4. Τα µέτρια συµπλοκοποιητικά µέσα που επιλέχθηκαν να µελετηθούν είναι το πρότυπο χουµικό οξύ, το χουµικό οξύ Adrich και πρότυπο φουλβικό οξύ. Σε αναλογία µαζών Cu/Zn : χουµική ένωση 1:2, τα πειραµατικά αποτελέσµατα έδειξαν την πλήρη κατανάλωση της χουµικής ένωσης για τη δέσµευσης των µετάλλων. 5. Το πρότυπο φουλβικό οξύ εµφανίζει τη µεγαλύτερη συµπλοκοποιητική ικανότητα από τις άλλες χουµικές ενώσεις στις συνθήκες των πειραµάτων. Η ικανότητα αυτή του φουλβικού οξέος οφείλεται στο ότι το φουλβικό οξύ περιέχει µεγαλύτερο αριθµό καρβοξυλοµάδων από τις άλλες χουµικές ενώσεις. Στις συνθήκες των πειραµάτων, οι καρβοξυλοµάδες διίστανται και αλληλεπιδρούν µε τα µέταλλα δεσµεύοντας τα µέσο ηλεκτροστατικών δυνάµεων. 6. Το χουµικό οξύ (Aldrich), εµφανίζει µειωµένη συµπλοκοποιητική ικανότητα. Όταν η αναλογία µάζας Cu : χουµικό οξύ προσεγγίζει το 1:2, παύει να 36

συµπλοκοποιεί τον προστιθέµενο χαλκό, ο οποίος παραµένει µε την µορφή ελεύθερων ιόντων στο διάλυµα. 7. Οι πρότυπες χουµικές ενώσεις (χουµικό και φουλβικό οξύ) έχουν την δυνατότητα να συµπλοκοποιούν και µεγαλύτερη ποσότητα χαλκού πέρα της αναλογίας µαζών 1:2 όπου παύουν να υπάρχουν ελεύθερα µόρια χουµικής ένωσης στο διάλυµα. Αυτό οφείλεται στις πολυάριθµες ενεργές συµπλοκοποιητικές οµάδες που περιέχουν στο µόριο τους. 8. Κατά την προκαταρκτική πειραµατική διερεύνηση της δυνατότητας παρακολούθησης της αλληλεπίδρασης των συµπλόκων χουµικού µετάλλου µε ανενεργή και ενεργή µικροβιακή βιοµάζα, εµφανίζονται παρεµβολές κατά τη µέτρηση του ελεύθερου χουµικού οξέος µε αποτέλεσµα να δυσχεραίνεται ο προσδιορισµός του. 9. Ο προστιθέµενος χαλκός, στα προς εξέταση διαλύµατα µελέτης της αλληλεπίδρασης των σχηµατιζόµενων συµπλόκων µε τη βιοµάζα, κατανέµεται ως εξής: a) Συµπλοκοποιηµένος από το χουµικό οξύ. b) Συµπλοκοποιηµένος από τις µακροµοριακές ενώσεις που εκκρίνονται από την βιοµάζα. c) Ροφηµένος στην επιφάνεια της βιοµάζας. 37

5. ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ Το παρόν έργο αποτελεί την αρχή µιας διεξοδικής µελέτης του φαινοµένου της συµπλοκοποίησης µετάλλων από χουµικές ενώσεις και της αλληλεπίδρασης τους µε µικροβιακή βιοµάζα µε σκοπό την κατανόηση των µηχανισµών που διέπουν το φαινόµενο στα φυσικά νερά. Οι επόµενες ερευνητικές εργασίες θα έχουν σαν στόχο την ανάπτυξη µεθοδολογίας παρακολούθησης των αλληλεπιδράσεων χουµικών ενώσεων µετάλλων µικροβιακής βιοµάζας και ειδικά τον ποσοτικό προσδιορισµό της κατανοµής του µετάλλου µεταξύ των χουµικών ενώσεων, της βιοµάζας και/ή των οργανικών µορίων που οφείλουν την παρουσία τους στο διάλυµα της βιοµάζας. Θα γίνει επίσης προσπάθεια εντοπισµού των θέσεων που διατίθενται από τις χουµικές ενώσεις για δέσµευση µετάλλων µε χρήση εξειδικευµένων φασµατοσκοπικών µεθόδων, προκειµένου να προσδιοριστούν οι συνθήκες κορεσµού των θέσεων αυτών από τα µελετούµενα µέταλλα. Στα πλαίσια του παρόντος έργου, τα πειραµατικά αποτελέσµατα που παρήχθησαν µέχρι τώρα θα αποτελέσουν το υλικό για δύο επιστηµονικές δηµοσιεύσεις, οι οποίες σχετίζονται µε την ανάπτυξη της αναλυτικής µεθόδου προσδιορισµού των χουµικών ενώσεων µε χρήση υγρού χρωµατογράφου, και µε τη µελέτη της δέσµευσης χαλκού από χουµικές ενώσεις. 38

6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. H. Xue, L. Sigg, Zinc speciation in lake waters and its determination by ligand exchange with EDTA and DPASV, Anal. Chim. Acta, (1994) 284 505-515. 2. V. White, C. Knowles, Effect of metal complexation on the bioavailability of NTA to Chelatobacter heintzii ATCC 29600, Arch Microbiol (2000) 173, 373-382. 3. W. Bedsworth, D. Sedlak, Sources and Environmental fate of Strongly Complexed Nickel in Estuarine Waters: The role of EDTA Environ. Sci. Technol. (1999) 33, 926-931. 4. W.W. Bedsworth, D.L. Sedlak,, Determination of metal complexes of ethylenediaminetetraacetate in the presence of organic matter by highperformance liquid chromatography, J. Chrom. A, (2001) 905, 157-162 5. D.O. Hessen, L.J. Tranvik, Aquatic Humic Substances, Ecology and Biogeochemistry, Springer (1998). 6. G. Abbt-Braun, F. H. Frimmel, Von Wasser (1990), 74, 307-324. 7. P. MacCarthy, J.A. Rice, Humic Substances in Soil, Sediment and Water. New York, (1985). 8. H.K. Powell, R.M. Town, Anal. Chim. Acta (1991) 248, 95-102. 9. P. Burba, P.G. Willmer, Fresenius J. Anal. Chem. (1992) 342, 167-171. 10. J. Vogl, K.G. Heumann, Determination of heavy metal complexes with humic substances by HPLC/ICP-MS coupling using on-line isotope dilution technique, Fresenius J. Anal. Chem (1997) 359, 438-441. 11. L. Rottmann, K.G. Heumann, Determination of Heavy Metal Interaction with Dissolved Organic Materials in Natural Aquatic Systems by Coupling a High- Performance Liquid Chromatography System with an Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer, Anal. Chem., (1994) 66, 3709-3715. 12. Y. Chin, G. Alken, E. O Loughlin, Molecular Weight, Polydispersity, and Spectroscopic Properties of Aquatic Humic Substances, Environ. Sci. Technol., (1994) 28, 1853-1858. 13. A. C. Alder, H. Siegrist, W. Gujer, W. Giger, Behaviour of NTA and EDTA in biological wastewater treatment, Water Research, (1990) 24(6), 733-742. 39