2.1 Εισαγωγή. Ένζυμα. κεφάλαιο

κεφάλαιο Ένζυμα 2 2.1 Εισαγωγή Τα ένζυμα είναι πρωτεϊνικά μόρια που αποτελούνται από μία ή περισσότερες πολυπεπτιδικές αλύσους, στις οποίες η αλληλουχία των αμινοξέων καθορίζεται γενετικά, όπως άλλωστε όλων των πρωτεϊνών. Η πλειοψηφία των χημικών αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα σε έναν οργανισμό καταλύεται από ένζυμα και μόνο ένα μικρό ποσοστό αντιδράσεων, που σχετίζονται με την ωρίμαση των μορίων RNA, είναι αυτοκαταλυόμενες ή καταλύονται από άλλα μόρια RNA που εκδηλώνουν καταλυτική δράση. Ως καταλύτης, με την κλασική έννοια του όρου, ορίζεται κάθε ένωση που επηρεάζει την ταχύτητα διεξαγωγής μίας χημικής αντίδρασης, χωρίς να εμφανίζεται στα τελικά προϊόντα της. Ο καταλύτης παραμένει αμετάβλητος στη μάζα μέχρις ότου ολοκληρωθεί η αντίδραση. Οι καταλύτες που παράγονται και χρησιμοποιούνται από τους ζώντες οργανισμούς είναι οργανικής φύσης και ονομάζονται ένζυμα. Τα ένζυμα καταλύουν μόνο εκείνες τις αντιδράσεις που είναι θερμοδυναμικά δυνατές (αυτές που συνοδεύονται από μείωση της 155

κεφάλαιο 2 ελεύθερης ενέργειας). Αυξάνουν κατά πολύ (10 9-10 12 φορές) την ταχύτητα μίας αντίδρασης, κάνοντας ορατές τις χημικές μεταβολές ενός συστήματος σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα. Τα ένζυμα, ως βιοκαταλύτες, μειώνουν την ενέργεια ενεργοποίησης που απαιτείται για την έναρξη μίας αντίδρασης (σχήμα 2.1) και παρέχουν τη δυνατότητα σε αντιδράσεις που καταλύουν να πραγματοποιηθούν γρήγορα σε ήπιες συνθήκες θερμοκρασίας και πίεσης που επικρατούν στα κύτταρα. Οι αντιδράσεις που καταλύονται από ένζυμα θεωρητικά είναι αντιστρεπτές και πρέπει να φτάνουν σε μία ισορροπία. Στα ζώντα κύτταρα, στα οποία οι αντιδράσεις είναι κατά κύριο λόγο μη κατευθυνόμενες, τα προϊόντα της αντίδρασης απομακρύνονται και ως εκ τούτου δε φτάνουν σε κατάσταση ισορροπίας. Αυτό που επιτυγχάνεται είναι μία σταθερή κατάσταση στην οποία οι συγκεντρώσεις των αντιδρωσών ενώσεων παραμένουν σχετικά σταθερές. Οι αντιδράσεις αυτές επιταχύνονται, όταν υπάρχει ανάγκη (ζήτηση) ή επιβραδύνονται, όταν τα προϊόντα δε χρησιμοποιούνται αρκετά γρήγορα, ώστε να εξασφαλίζεται η σταθερή κατάσταση που αναφέρθηκε προηγουμένως. Τα ένζυμα λοιπόν επιταχύνουν ή επιβραδύνουν τις αντιδράσεις κατά τρόπον ώστε η σταθερή κατάσταση να μην τροποποιείται σημαντικά. Κάθε ζων κύτταρο περιέχει εκατοντάδες ενζύμων και μπορεί να λειτουργεί αποτελεσματικά μόνο αν η δράση των ενζύμων του συντονίζεται κατάλληλα. Είναι σημαντικό να γνωρίζει κανείς ότι τα ένζυμα εντός του κυττάρου υπάρχουν σε ξεχωριστά μέρη αυτού και όχι τυχαία κατανεμημένα. Για παράδειγμα, τα ένζυμα του πρώτου σταδίου οξείδωσης της γλυκόζης (διαδικασία γλυκόλυσης) βρίσκονται στο κυτόπλασμα, ενώ εκείνα που εμπλέκονται κατά τον σχηματισμό του ακέτυλο-coa από το πυροσταφυλικό και τη μετέπειτα οξείδωσή του μέσω του κύκλου του Krebs περιορίζονται στα μιτοχόνδρια. Σήμερα παράγεται σχετικά εύκολα μεγάλος αριθμός ενζύμων, που χαρακτηρίζεται από χαμηλό κόστος και μοριακή σταθερότητα. Αυτό επιτυγχάνεται με την ανάπτυξη κατάλληλων τεχνικών: α) καλλιέργειας μικροοργανισμών με τροποποιημένο (ανασυνδυασμένο) DNA, οπότε παράγονται μεγάλες ποσότητες ενζύμων σε χαμηλό κόστος και β) χημικής ή μηχανικής ακινητοποίησης των ενζύμων πάνω σε αδρανή υλικά, γεγονός που επιτρέπει τη σταθεροποίηση του μορίου τους, ώστε η καταλυτική τους ικανότητα να παραμένει υψηλή για μεγάλο χρονικό διάστημα και να είναι δυνατή η επαναχρησιμοποίησή τους (δεσμευμένα ένζυμα). 156

2.2 Ταξινόμηση Ενζύμων Η δράση των ενζύμων είναι μία εξειδικευμένη διαδικασία τόσο ως προς το είδος της αντίδρασης όσο και ως προς το είδος του υποστρώματος. Με βάση την ιδιότητα αυτή τα ένζυμα ταξινομούνται σε έξι κύριες ομάδες, κάθε μία από τις οποίες περιλαμβάνει έναν αριθμό ενζύμων (πίνακας 2.1). Πίνακας 2.1 Ταξινόμηση ενζύμων Ομάδα Οξειδοαναγωγάσες ή οξειδορεδουκτάσες ή οξειδοαναγωγικά ένζυμα Τρανσφεράσες Περιλαμβανόμενα ένζυμα Αφυδρογονάσες Οξειδάσες Υπεροξειδάσες Καταλάσες Οξυγονάσες ή διοξυγονάσες Υδροξυλάσες ή μονοοξυγονάσες Τρανσαλδολάσες και τρανσκετολάσες Ακετυλο-, Γλυκοζυλο- και Φωσφορυλο- Τρανσφεράσες Κινάσες Φωσφορομουτάσες Υδρολάσες ή υδρολυτικά ένζυμα Εστεράσες Γλυκοζιδάσες Πεπτιδάσες Φωσφατάσες Ριβονουκλεάσες Αμιδάσες Απαμινάσες Θειολάσες Φωσφορολιπάσες Λυάσες Αλδολάσες Υδρολυάσες Αποϋδρολυάσες Συνθετάσες Λυάσες Ισομεράσες Συνθετάσες Ρακεμάσες Ισομεράσες Μερικές από τις μουτάσες Συνθετάση της γλουταμίνης Συνθετάση του ακέτυλο-coa 157

κεφάλαιο 2 Οι οξειδοαναγωγάσες ή οξειδορεδουκτάσες καταλύουν αντιδράσεις μεταφοράς υδρογόνου, οξυγόνου ή ηλεκτρονίων από ένα υπόστρωμα δότη ηλεκτρονίων σε ένα άλλο υπόστρωμα που είναι ο δέκτης. Τα ένζυμα αυτά για να δράσουν απαιτούν την παρουσία ενός ή περισσότερων συμπαραγόντων (μέταλλο, συνένζυμο ή προσθετική ομάδα), οι οποίοι συμπεριφέρονται ως ενδιάμεσοι και μεταβατικοί δέκτες ηλεκτρονίων. Παράδειγμα, η οξείδωση του γαλακτικού σε πυροσταφυλικό παρουσία του ενζύμου της αφυδρογονάσης του γαλακτικού. Στην αντίδραση αυτή μετακινούνται από την αλκοολική ομάδα δύο ηλεκτρόνια και δύο άτομα υδρογόνου, αφήνοντας μία κετόνη και μεταφέρονται για να σχηματίσουν το NADH(+H + ). Στην ομάδα αυτή περιλαμβάνονται οι αφυδρογονάσες, οξειδάσες, υπεροξειδάσες, καταλάσες, οξυγονάσες και υδροξυλάσες. Οι τρανσφεράσες είναι μία μεγάλη ομάδα ενζύμων που καταλύουν έναν επίσης μεγάλο αριθμό αντιδράσεων του ενδιάμεσου μεταβολισμού, όπου μεταφέρεται μία χημική ομάδα (π.χ. ακετυλο-, αμινο- και φωσφορο-) από ένα μόριο σε ένα άλλο και στις οποίες είναι απαραίτητη η συμμετοχή ενός συμπαράγοντα μεταφοράς. Παράδειγμα, ο σχηματισμός του κιτρικού από οξαλοξικό κατά την απελευθέρωση ενέργειας στον οργανισμό, όπου λαμβάνει χώρα προσθήκη μίας ακετυλο ομάδας παρουσία της συνθετάσης του κιτρικού. Στην ομάδα αυτή περιλαμβάνονται οι τρανσαλδολάσες και τρανσκετολάσες, ακετυλο-, γλυκόζυλο- φωσφορυλο-τρανσφεράσες, κινάσες και φωσφομουτάσες. Οι υδρολάσες καταλύουν αντιδράσεις υδρολυτικής διάσπασης ενός δεσμού με την προσθήκη των ιόντων του νερού στα φορτία του υποστρώματος που ελευθερώνονται. Στις αντιδράσεις αυτές, που είναι εύκολα αντιστρεπτές, το μόριο του νερού είναι το δεύτερο υπόστρωμα που υφίσταται και αυτό διάσπαση. Τυπικά παραδείγματα αποτελούν οι υδρολάσες των λιπών και των πρωτεϊνών, οι οποίες είναι απαραίτητες για την κανονική λειτουργία του οργανισμού. Έτσι, ένα λίπος διασπάται σε γλυκερίδια (ακυλογλυκερόλες) και λιπαρά οξέα υπό την επίδραση μίας λιπάσης. Ομοίως οι πεπτιδάσες διασπούν τις πρωτεΐνες κατόπιν υδρόλυσης των πεπτιδικών δεσμών. Στην ομάδα αυτή περιλαμβάνονται οι εστεράσες, γλυκοζιδάσες, πεπτιδάσες, φωσφατάσες, θειολάσες, φωσφορολιπάσες, αμιδάσες, απαμινάσες, και ριβονουκλεάσες. Μερικά από τα σωματικά ένζυμα που περιλαμβάνονται στις υποομάδες αυτές είναι οι λιπάσες, κυτταρινάσες, πηκτινάσες, αμυλάσες, πεπτιδάσες, πρωτεάσες κ.ά. 158

Οι λυάσες καταλύουν αντιδράσεις απομάκρυνσης μίας χημικής ομάδας (H 2 O, NH 4+, CO 2, κ.ά.) από ένα υπόστρωμα με την παράλληλη εμφάνιση ενός διπλού δεσμού ή την προσθήκη μίας χημικής ομάδας στο διπλό δεσμό του υποστρώματος. Παράδειγμα, η αποκαρβοξυλάση του πυροσταφυλικού που καταλύει τη μετατροπή του 2-οξο-οξέος σε μία αλδεΰδη με απομάκρυνση CO 2. Στην ομάδα αυτή περιλαμβάνονται οι αλδολάσες, υδρολυάσες, αποϋδρολυάσες, συνθετάσες και λυάσες. Οι ισομεράσες είναι ένζυμα που καταλύουν αντιδράσεις ενδομοριακών ανακατατάξεων των υποστρωμάτων τους. Στην ομάδα αυτή περιλαμβάνονται οι ρακεμάσες, ισομεράσες και μερικές από τις μουτάσες. Οι συνθετάσες (ή λιγάσες) καταλύουν αντιδράσεις δημιουργίας δεσμών μεταξύ ατόμων C, C και Ο, C και Ν. Ως πηγή ενέργειας χρησιμοποιούν την ATP ή άλλα τριφωσφορικά νουκλεοτίδια. Χαρακτηριστικό παράδειγμα η παραγωγή του ακετυλο-coa από οξικό οξύ παρουσία συνθετάσης του ακετυλο-coa κατά το σχήμα: οξικό οξύ + συνένζυμο-α ακετυλο-coa + Η 2 +ΑΜP +PP 2.3 Συμπαράγοντες Τα ένζυμα, όπως ήδη αναφέρθηκε, κατά κανόνα αποτελούνται από σύνθετες, υψηλού μοριακού βάρους πρωτεΐνες. Υπάρχουν όμως και εξαιρέσεις. Μερικές πρωτεΐνες έχουν τη δυνατότητα να λειτουργούν ως καταλύτες (αυτοκαταλύτες), αν και οι περισσότερες χρειάζονται τη βοήθεια κάποιων «μικροουσιών» για να επιταχύνουν τη δράση τους. Τέτοιες μικροουσίες συνδέονται με την πρωτεΐνη και ονομάζονται συμπαράγοντες. Με τον γενικό όρο λοιπόν «συμπαράγοντες» αναφέρονται τα χαμηλού μοριακού βάρους οργανικά μόρια και τα μεταλλικά ιόντα που είναι απολύτως απαραίτητα για την εκδήλωση της καταλυτικής δράσης ορισμένων ενζύμων. Στους συμπαράγοντες περιλαμβάνονται τα συνένζυμα, τα μεταλλικά ιόντα και οι προσθετικές ομάδες. Τα συνένζυμα είναι σχετικά λίγα σε αριθμό, αλλά καθένα από αυτά συνδέεται με έναν αριθμό διαφορετικών ενζύμων και ως εκ τούτου εμπλέκονται σε ένα μεγάλο αριθμό αντιδράσεων. Τα πιο σημαντικά από αυτά είναι το NAD + (νικοτιναμιδο-αδένινο-δινουκλεοτίδιο), το ΤΡΡ (πυροφωσφορική θειαμίνη), η φωσφορική πυριδοξάλη και το FMN (φλάβινο-μονο-νουκλεοτίδιο). 159

κεφάλαιο 2 Στις περιπτώσεις αυτές η πρωτεΐνη, που αναφέρεται ως αποπρωτεΐνη, από καταλυτικής πλευράς είναι μη ενεργός. Όταν συνδέεται με το συνένζυμο σχηματίζει το ενεργό ολοένζυμο. Τα συνένζυμα συμμετέχουν σε αντιδράσεις μεταφοράς ομάδων ή ηλεκτρονίων. Σε μερικές περιπτώσεις το συνένζυμο δεν παραμένει μόνιμα συνδεδεμένο με το αποένζυμο, αλλά απελευθερώνεται, αφού ολοκληρωθεί η αντίδραση. Έτσι η οξειδωμένη μορφή, π.χ., του αδενινο-νουκλεοτιδίου σχηματίζει ισχυρό δεσμό με το αποένζυμο σε συστήματα αφυδρογονάσης. Όταν ολοκληρωθεί η οξείδωση, η ανηγμένη μορφή αποσυνδέεται από το ένζυμο και η οξειδωμένη μορφή αναγεννάται κατόπιν αντίδρασης με άλλους δέκτες ηλεκτρονίων. Σε τέτοιες περιπτώσεις το συνένζυμο δρα περισσότερο ως δεύτερο υπόστρωμα παρά ως αληθές συνένζυμο. Πολλά ένζυμα δρουν με τον έναν ή τον άλλο τρόπο ή και με τους δύο τρόπους που αναφέρθηκαν, ανάλογα με την αντίδραση στην οποία εμπλέκονται κάθε φορά. Περί τα δύο τρίτα των ενζύμων απαιτούν μεταλλικά ιόντα ως συμπαράγοντες για να εκτελέσουν την αποστολή τους και καλούνται μεταλλοένζυμα. Στα ένζυμα αυτά τα μεταλλικά ιόντα είτε συμμετέχουν άμεσα στην κατάλυση, οπότε αποτελούν τμήματα του ενεργού κέντρου, όπως για παράδειγμα στην περίπτωση των ενζύμων μεταφοράς ηλεκτρονίων, οπότε τα μέταλλα υφίστανται αλλαγές στον αριθμό οξείδωσης αυτών είτε ελέγχοντας τη διαμόρφωση του ενζύμου επιτρέπουν το σχηματισμό ή τη διάσπαση του συμπλόκου «ένζυμο-υπόστρωμα». Επίσης το μεταλλικό ιόν μπορεί να είναι συστατικό της προσθετικής ομάδας, όπως για παράδειγμα ο Fe του πορφυρινικού δακτυλίου των κυττοχρωμάτων και το Co στον δακτύλιο της βιταμίνης Β 12. Και στην περίπτωση αυτή το μέταλλο, σε συνεργασία με την προσθετική ομάδα, συμμετέχει άμεσα στην κατάλυση. Παραδείγματα μεταλλικών συμπαραγόντων που σχηματίζουν δεσμούς με πρωτεΐνες είναι αυτοί του Zn (πεπτιδάσες), του Cu (μεγάλος αριθμός οξειδασών), του Fe (φερρεδοξίνες) κ.ά. Οι προσθετικές ομάδες είναι μη πρωτεϊνικά μόρια χαμηλού μοριακού βάρους που συνδέονται με ισχυρούς δεσμούς στο πρωτεϊνικό τμήμα του ενζύμου ή βρίσκονται εγκλωβισμένα στο εσωτερικό του πρωτεϊνικού μορίου και η απομάκρυνσή τους είναι δύσκολη, αν όχι αδύνατη. Παράδειγμα, ο πορφυρινικός δακτύλιος των κυττοχρωμάτων και των καταλασών ή ακόμα στα φλαβινοένζυμα FAD και FMN. Μερικά ένζυμα βρίσκονται σε μη ενεργοποιημένη (αδρανή) μορφή η οποία όμως μετατρέπεται σε ενεργό στην περιοχή και στο χρόνο που απαι- 160

τείται η δράση του ενζύμου. Το τρυψινογόνο, για παράδειγμα, συντίθεται στο πάγκρεας, μεταφέρεται στο λεπτό έντερο και εκεί μετατρέπεται στο ενεργό πεπτικό ένζυμο τρυψίνη. Το είδος αυτό του μηχανισμού εξασφαλίζει σημαντικότατο έλεγχο στην ενζυμική δράση από πλευράς χρόνου και θέσης. Τα μη ενεργοποιημένα αυτά «πρόδρομα» ένζυμα ονομάζονται ζυμογόνα. 2.4 Μηχανισμός Δράσης των Ενζύμων Για να λάβει χώρα μία χημική αντίδραση, τα προς αντίδραση μόρια πρέπει να περάσουν στην ενεργοποιημένη μεταβατική κατάστασή τους απορροφώντας μία ποσότητα ενέργειας που ονομάζεται ενέργεια ενεργοποίησης. Στην αέριο κατάσταση ή σ ένα διάλυμα, η ενέργεια των μορίων μπορεί να αυξηθεί με την παροχή μιας εξωτερικής πηγής ενέργειας (π.χ. θερμότητας), οπότε ενεργοποιούνται περισσότερα μόρια και η αντίδραση επιταχύνεται. Επειδή όμως στον ζωικό οργανισμό δεν μπορεί να αυξηθεί η θερμότητα, επιδιώκεται η μείωση της απαιτούμενης ενέργειας ενεργοποίησης με την παρουσία των ενζύμων, οπότε οι θερμοδυναμικά δυνατές αντιδράσεις του κυττάρου επιταχύνονται στις ήπιες συνθήκες του κυττάρου, ξεπερνώντας το ενεργειακό φράγμα της ενέργειας ενεργοποίησης (σχήμα 2.1). Με τη δράση του ενζύμου σχηματίζεται ένα σύνθετο μόριο (σύμπλοκο) μεταξύ ενζύμου και υποστρώματος ή υποστρωμάτων. Το σύνθετο αυτό μόριο στη συνέχεια διασπάται και παράγεται το προϊόν της αντίδρασης και το αμετάβλητο ένζυμο κατά το σχήμα: Ένζυμο + Υπόστρωμα Ένζυμο + Υπόστρωμα Ένζυμο + Προϊόν Τα σύμπλοκα που αναφέρθηκαν σχηματίζονται μεταξύ υποστρώματος και σχετικά λίγων ενεργών περιοχών της επιφάνειας του ενζύμου. Οι δεσμοί αυτοί μπορεί να είναι: 161

κεφάλαιο 2 Η περιοχή του ενζύμου στην οποία συνδέεται το υπόστρωμα, προκειμένου να υποστεί τροποποίηση, ονομάζεται ενεργό κέντρο ή ενεργός περιοχή. Η ενεργός περιοχή ή τα ενεργά κέντρα είναι πάντα σχετικά μικρά, σε σχέση με το μόριο του ενζύμου, και τρισδιάστατα. Έχουν συνήθως τη μορφή σχισμής που ξεκινά από την περιφέρεια του μορίου του ενζύμου και φτάνει μέχρι την εσωτερική υδρόφοβη περιοχή. Τα ενεργά κέντρα των ενζύμων συνήθως περιβάλλονται από αλύσους αμινοξέων, μερικές από τις οποίες βοηθούν στη συνένωση με το υπόστρωμα, ενώ άλλες συμμετέχουν στην πραγματική καταλυτική διαδικασία. 162

Σχήμα 2.1 Μηχανισμός καταλυτικής δράσης ενζύμου 2.5 Εξειδίκευση των Ενζύμων Η δράση των ενζύμων είναι εξειδικευμένη και ως προς το είδος της αντίδρασης και ως προς το είδος του υποστρώματος. Η εξειδίκευση αυτή μπορεί να είναι απόλυτη, αν η δράση του ενζύμου περιορίζεται σε ένα μόνο υπόστρωμα. Κλασικό παράδειγμα η ουρεάση η οποία καταλύει μόνο τη διάσπαση της ουρίας σε CO 2 και NH 3. Σε πολλές περιπτώσεις το ένζυμο μπορεί να καταλύει περισσότερες της μίας ομάδας υποστρωμάτων, οπότε η εξειδίκευση αυτή είναι σχετική. Μία τέτοιου είδους εξειδίκευση θεωρείται ανώτερης τάξης, όπως στην περίπτωση των πεπτικών ενζύμων της τρυψίνης και της πεψίνης, τα οποία καταλύουν τη διάσπαση των πεπτιδικών δεσμών. Η ανάγκη εξειδίκευσης ενός ενζύμου προκύπτει από την ειδική σύζευξη των ενεργών ομάδων του υποστρώματος με το ενεργό κέντρο του ενζύμου. Εδώ προτείνεται το ομοίωμα κλειδιού κλειδαριάς, σύμφωνα με το οποίο το ένζυμο 163

κεφάλαιο 2 είναι μία πολύπλοκη κλειδαριά στην οποία μπορεί να ταιριάζει ένα μόνο κλειδί (το υπόστρωμα) συγκεκριμένου σχήματος και μεγέθους (σχήμα 2.2). Σχήμα 2.2 Σχηματική παράσταση σύνδεσης ενζύμου-υποστρώματος (ομοίωμα κλειδιού-κλειδαριάς) Επειδή όμως όλες οι περιπτώσεις δράσης των ενζύμων δεν εξηγούνται με το προαναφερθέν σχήμα, έχει διατυπωθεί και η άποψη ότι η κατάλληλη διαμόρφωση του ενζύμου για να δεχτεί το υπόστρωμα δεν προϋπάρχει, αλλά προκαλείται από τη σύνδεση του υποστρώματος σε συγκεκριμένη περιοχή του πρωτεϊνικού μορίου (σχήμα 2.3). Και στις δύο περιπτώσεις γίνεται αποδεκτό ότι το ένζυμο για να δράσει ως καταλύτης, θα πρέπει να συνδεθεί με το υπόστρωμα. Για να γίνει αυτό θα πρέπει στο ενζυμικό μόριο να υπάρχει μία περιοχή, η διαμόρφωση της οποίας είναι συμπληρωματική της διαμόρφωσης ολόκληρου του μορίου ή τμήματος του υποστρώματος. Σχήμα 2.3 Σχηματική παράσταση προσαρμογής ενζύμου υποστρώματος, προκειμένου να γίνει η σύνδεση 164

2.6 Παράγοντες που Επηρεάζουν την Ενεργότητα των Ενζύμων 2.6.1 Συγκέντρωση υποστρώματος Σ ένα σύστημα όπου το ένζυμο βρίσκεται σε περίσσεια και η συγκέντρωση παραμένει σταθερή, κάθε αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος αυξάνει την ταχύτητα της αντίδρασης. Αυτό συμβαίνει λόγω της αυξημένης χρησιμοποίησης των διαθέσιμων ενεργών κέντρων του ενζύμου. Αν όμως η συγκέντρωση του υποστρώματος συνεχίζει να αυξάνεται, η χρησιμοποίηση των διαθέσιμων ενεργών κέντρων του ενζύμου μεγιστοποιείται και ως εκ τούτου δεν υπάρχουν άλλα περιθώρια αύξησης του ρυθμού διεξαγωγής της αντίδρασης. Στην πραγματικότητα μάλιστα, η συνεχής αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος μπορεί να προκαλέσει μείωση του ρυθμού της αντίδρασης λόγω της ατελούς σύνδεσης μεταξύ ενζύμου και υποστρώματος, που οφείλεται στον ανταγωνισμό των μορίων του πλεονάζοντος υποστρώματος για τα ενεργά κέντρα του ενζύμου. Η επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος στην ταχύτητα μίας αντίδρασης που καταλύεται από ένα ένζυμο συνήθως εκφράζεται με τη σταθερά Km των Michaelis-Menten. Η σταθερά αυτή ορίζεται ως η μοριακή συγκέντρωση του υποστρώματος κατά την οποία το 50% των ενεργών κέντρων του ενζύμου καταλαμβάνεται από το υπόστρωμα και ο ρυθμός της αντίδρασης είναι το ήμισυ του μέγιστου. Πέραν της τιμής Km, η επίδραση της αύξησης της συγκέντρωσης του υποστρώματος στην αντίδραση μειώνεται, καθώς προσεγγίζεται το μέγιστο της συγκέντρωσης. Για συγκεντρώσεις υποστρώματος μικρότερες του Km κάθε αύξηση στη συγκέντρωση προκαλεί αύξηση στο ρυθμό της αντίδρασης. Όταν οι φυσιολογικές συγκεντρώσεις του υποστρώματος είναι πολύ πιο πάνω από το Km του ενζύμου, τότε το υπόστρωμα δεν αποτελεί πλέον τον καθοριστικό παράγοντα στη συγκεκριμένη μεταβολική διαδικασία. Πολλά ένζυμα έχουν τιμές Km που προσεγγίζουν τις φυσιολογικές συγκεντρώσεις. Κάθε αλλαγή στη συγκέντρωση αυτή προκαλεί σημαντικές αλλαγές στον ρυθμό της αντίδρασης που έχουν ιδιαίτερη σημασία στον έλεγχο του μεταβολισμού. 165

κεφάλαιο 2 2.6.2 Συγκέντρωση ενζύμου Σ ένα σύστημα όπου το υπόστρωμα βρίσκεται σε περίσσεια, μία αύξηση στη συγκέντρωση του ενζύμου δίνει μία ευθύγραμμη αύξηση στην ταχύτητα αντίδρασης που οφείλεται στην παροχή πρόσθετων ενεργών κέντρων για το σχηματισμό συμπλόκων ενζύμου-υποστρώματος. Μία πρόσθετη αύξηση της συγκέντρωσης του ενζύμου μπορεί να αποτελέσει εν μέρει τον περιοριστικό παράγοντα, όπως στη διαθεσιμότητα του συνενζύμου, μετατρέποντάς το σε λειτουργικό. Τα ένζυμα, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, σπάνια κορέννυνται με υπόστρωμα. 2.6.3 Παρεμποδιστές Πολλά και ποικίλα υποστρώματα μπορούν να δρουν ως παρεμποδιστές της ενεργότητας των ενζύμων. Αυτοί εντάσσονται σε δύο κύριες κατηγορίες: τους αντιστρεπτούς και τους μη αντιστρεπτούς. Η αντιστρεπτή παρεμπόδιση εμπλέκει μη ομοιοπολικούς δεσμούς του παρεμποδιστή στο ένζυμο. Η ομάδα αυτή διαιρείται σε τρεις υποομάδες: τους ανταγωνιστικούς, τους μη ανταγωνιστικούς και τους αδρανοποιητές παρεμποδιστές. Ένας ανταγωνιστικός παρεμποδιστής προσομοιάζει το υπόστρωμα στη χημική του δομή και συνδυάζεται με το ένζυμο, για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο ενζύμου-παρεμποδιστή. Κάνοντας αυτό όμως ανταγωνίζεται το υπόστρωμα για τα ενεργά κέντρα (ή τις περιοχές) του ενζύμου και ως εκ τούτου παρεμποδίζεται η σύνδεση ενζύμου-υποστρώματος. Αυτό το είδος της παρεμπόδισης μπορεί να αντιστραφεί με την προσθήκη περίσσειας υποστρώματος το οποίο απομακρύνει τον παρεμποδιστή, σχηματίζοντας κανονικά σύμπλοκα ενζύμου-υποστρώματος. Ένα από τα πλέον γνωστά παραδείγματα είναι αυτό των σουλφοναμιδών. Η σύνθεση του φυλλικού οξέος από το p-αμινοβενζοϊκό οξύ (PABA) είναι μία ζωτική μεταβολική διαδικασία στα βακτήρια που ελέγχεται από τις σουλφοναμίδες. Η ομοιότητα μεταξύ PABA και σουλφονιλαμίδης (που παράγεται από τις σουλφοναμίδες) παρεμποδίζει τον σχηματισμό φυλλικού οξέος. Η προσθήκη όμως PABA σε περίσσεια εξουδετερώνει την παρεμπόδιση. Η έκταση της παρεμπόδισης 166

εξαρτάται από τις σχετικές συγκεντρώσεις αληθούς υποστρώματος και παρεμποδιστή. Ένας μη ανταγωνιστικός παρεμποδιστής δεν συνδέεται με την ενεργό περιοχή, αλλά με κάποια άλλη περιοχή της επιφάνειας του ενζύμου, μειώνοντας έτσι τελικά την καταλυτική δράση του ενζύμου. Στην απλούστατη περίπτωση ο παρεμποδιστής συνδέεται άμεσα με τα δύο, ένζυμο και υπόστρωμα, και σχηματίζει τρεις τύπους συμπλόκου: Ένζυμο Υπόστρωμα (ΕΥ) Ένζυμο Παρεμποδιστής (ΕΠ) Ένζυμο Παρεμποδιστής Υπόστρωμα (ΕΠΥ) Ο ρυθμός της αντίδρασης επιβραδύνεται λόγω της απομάκρυνσης του ενζύμου από το σύστημα. Το σύμπλοκο ΕΠ καταλύεται εσωτερικά, ενώ το ΕΠΥ είναι επιρρεπές σε επαναμετατροπή του σε ΕΥ, συμβάλλοντας έτσι εν μέρει στην καταλυτική ενεργότητα. Η μη ανταγωνιστική παρεμπόδιση δεν μπορεί να αντιστραφεί με περίσσεια υποστρώματος, μπορεί όμως με εξαντλητική διάλυση. Στους αδρανοποιητές παρεμποδιστές ο παραμποδιστής συνδέεται με το σύμπλοκο ένζυμο υπόστρωμα και το καθιστά αδρανές. Η μη αντιστρεπτή παρεμπόδιση εμπλέκει διπολικούς δεσμούς στην ενεργό περιοχή και δεν μπορεί να αντιστραφεί με περίσσεια υποστρώματος ή με διάλυση. Η ενεργός περιοχή ωστόσο καταλαμβάνεται και γίνεται καταλυτικά αδρανής. Πολλοί απ αυτούς τους παρεμποδιστές έχουν υψηλή τοξικότητα, όπως για παράδειγμα τα οργανοφωσφορικά δηλητήρια που προσβάλλουν το νευρικό σύστημα. 2.6.4 Αλλοστερικές επιδράσεις Τα αλλοστερικά ή ρυθμιστικά ένζυμα ρυθμίζουν την ταχύτητα ολόκληρων μεταβολικών διαδικασιών. Η ενεργότητά τους επηρεάζεται από μόρια τα οποία συνδέονται με τα ένζυμα, αλλά δε δρουν με τον τρόπο που δρουν οι ανταγωνιστικοί ή οι μη ανταγωνιστικοί παρεμποδιστές. Στο μόριο των ενζύμων αυτών, εκτός από το ενεργό κέντρο, υπάρχουν και ειδικές περιοχές όπου συνδέονται οι αλλοστερικοί τροποποιητές που είναι βιομόρια διαφορετικής συνήθως στερεοχημικής δομής από το υπόστρωμα. Η σύνδεση 167

κεφάλαιο 2 των τροποποιητών στο μόριο ενός ρυθμιστικού ενζύμου προκαλεί αλλαγή της διαμόρφωσής του, με αποτέλεσμα να τροποποιείται θετικά ή αρνητικά η καταλυτική του ικανότητα. Τα αλλοστερικά ένζυμα καταλύουν, κατά κανόνα, την πρώτη αντίδραση μίας μεταβολικής διαδικασίας που οδηγεί στη βιοσύνθεση ενός τελικού μεταβολίτη (π.χ ενός αμινοξέος). Το τελικό προϊόν της μεταβολικής αυτής διαδικασίας, όταν συσσωρεύεται και δεν χρησιμοποιείται από το κύτταρο, λειτουργεί ως αρνητικός τροποποιητής και αναστέλλει ή μειώνει τη δράση του αλλοστερικού ενζύμου. Ο τρόπος αυτός ελέγχου της δράσης των αλλοστερικών ενζύμων ονομάζεται ανάδραση. Παράλληλα όμως διάφοροι άλλοι μεταβολίτες μπορούν να λειτουργήσουν ως θετικοί τροποποιητές. 2.6.5 Περιβαλλοντικοί παράγοντες Η ενεργότητα των ενζύμων μπορεί να επηρεαστεί επιπλέον και από έναν αριθμό παραγόντων, όπως είναι η θερμοκρασία, η οξύτητα και η συγκέντρωση των αλάτων. Οι παράγοντες όμως αυτοί στον ζωικό οργανισμό δε έχουν ιδιαίτερη σημασία. Η θερμοκρασία, πέραν ενός περιορισμένου εύρους, επηρεάζει την ενεργότητα των ενζύμων. Συγκεκριμένα, για κάθε αύξηση της θερμοκρασίας κατά 10 ο C, η ταχύτητα της αντίδρασης περίπου διπλασιάζεται, αλλά μέχρι του βαθμού που δεν αρχίζει η μετουσίωση της πρωτεΐνης του ενζύμου. Μετά τους 50 ο C η αλλαγή της δομής του ενζύμου επιταχύνεται, οπότε χάνονται τα ενεργά κέντρα στην επιφάνεια του ενζύμου και κατά συνέπεια μειώνεται η ενεργότητά του. Κάθε ένζυμο έχει την άριστη θερμοκρασία του, χωρίς να παραγνωρίζεται και η χρονική διάρκεια επίδρασης μίας συγκεκριμένης θερμοκρασίας. Υπάρχουν ένζυμα μικροοργανισμών (προσαρμοσμένων σε ψυχρό περιβάλλον) που δρουν αποτελεσματικά στους 0 ο C και άλλα (μικροοργανισμών προσαρμοσμένων σε θερμό περιβάλλον) που δρουν στους 100 ο C. Τα περισσότερα ένζυμα όμως καταστρέφονται στους 100 ο C. Η συγκέντρωση των Η + (ph) επηρεάζει σημαντικά την αποτελεσματικότητα της δράσης των ενζύμων. Έτσι, πολλά ένζυμα δρουν άριστα σε ph 6-7, που είναι αυτό των κυττάρων. Εξωκυτταρικά ένζυμα μπορούν να έχουν τη μέγιστη δράση τους σε όξινο ή αλκαλικό ph, αλλά το εύρος στο οποίο 168

λειτουργούν είναι 2,5-3,0 μονάδες. Πέραν των ορίων αυτών η ενεργότητα μειώνεται ταχέως. Άλλωστε η υψηλή οξύτητα ή αλκαλικότητα επιφέρει αλλαγές στη δομή των ενζύμων (πρωτεϊνών), και ως εκ τούτου μείωση της ενεργότητας. 169