ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ IN VITRO ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΘΡΑΥΣΜΑΤΟΓΟΝΟΥ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΓΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΟΥ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟΥ ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗ ΣΤΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ HL-60 Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης στη Βιολογική Τεχνολογία Χονδρού Βασιλική Βιολόγος ΠΑΤΡΑ Φεβρουάριος 2013

Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Στεφάνου Γεωργία Καθηγήτρια, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Πανεπιστήμιο Πατρών Εξεταστική Επιτροπή Αλαχιώτης Σταμάτης Ομότιμος Καθηγητής, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Πανεπιστήμιο Πατρών Δημόπουλος Νικόλαος Καθηγητής, Τομέας Γενετικής Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Πανεπιστήμιο Πατρών Στεφάνου Γεωργία Καθηγήτρια, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Πανεπιστήμιο Πατρών 1

2

Περιεχόμενα Πρόλογος...9 Περίληψη 13 Summary.15 Εισαγωγή 17 1. Καρκίνος.19 1.1 Γενικά..19 1.2 Τι είναι ο καρκίνος; 19 1.3 Βασικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων..20 1.4 Αιτίες που προκαλούν καρκίνο..24 1.4.1 Ενδογενείς παράγοντες 24 1.4.1.1 Κληρονομικότητα.24 1.4.1.2 Μη φυσιολογικά επίπεδα ορμονών στην κυκλοφορία του αίματος.24 1.4.1.3 Ανοσοποιητικό σύστημα..25 1.4.2 Εξωγενείς παράγοντες.25 1.4.2.1 Κάπνισμα..25 1.4.2.2 Αλκοόλ.26 1.4.2.3 Διατροφή..26 1.4.2.4 Παχυσαρκία..26 1.4.2.5 Παθογόνοι Μικροοργανισμοί...27 1.4.2.6 Ακτινοβολία.27 1.4.2.7 Βιομηχανικά Προϊόντα.27 1.4.2.8 Μόλυνση του περιβάλλοντος...27 1.5 Αντιμετώπιση του καρκίνου..29 2. Φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία...30 2.1 Αλκυλιωτικοί παράγοντες.30 2.2 Αντιμεταβολίτες..30 2.3 Αναστολείς της μίτωσης 31 2.3.1 Αναστολείς που δεσμεύονται στην τουμπουλίνη 31 2.3.2 Αναστολείς των τοποϊσομερασών...31 2.4 Αντικαρκινικά αντιβιοτικά 32 3. Ανθρακυκλίνες-Δοξορουβικίνη.32 3

3.1 Γενικά..32 3.2 Χημική δομή και ιδιότητες 33 3.3 Κλινική χρήση...34 3.4 Παρενέργειες...35 3.5 Μηχανισμοί δράσης 36 3.5.1 Αναστολή σύνθεσης του DNA 36 3.5.2 Δημιουργία συμπλόκων και χιαστί δεσμών με το DNA.36 3.5.3 Αναστολή της τοποϊσομεράσης ΙΙ...38 3.5.4 Δημιουργία ελεύθερων ριζών..39 3.5.4.1 Μηχανισμός παραγωγής ελεύθερων ριζών μέσω οξειδοαναγωγής.39 3.5.4.2 Μηχανισμός παραγωγής ελεύθερων ριζών μέσω δημιουργίας συμπλόκων με ιόντα σιδήρου..40 3.6 Πρόσδεση σε κυτταρικές μεμβράνες 42 3.7 Επαγωγή της απόπτωσης...42 4. Απόπτωση...43 4.1 Γενικά..43 4.2 Μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης 44 4.3 Μονοπάτια επαγωγής της απόπτωσης..45 4.3.1 Εξωγενές μονοπάτι απόπτωσης/οδός εξαρτώμενη από υποδοχείς θανάτου...45 4.3.2 Ενδογενές μονοπάτι απόπτωσης/οδός μη εξαρτώμενη από υποδοχείς θανάτου 46 4.4 Κασπάσες 49 5. Βλάβες του DNA.52 5.1 Δίκλωνα Ρήγματα..52 5.2 Μονόκλωνα ρήγματα.53 5.3 Απουρινικές/απυριμιδινικές θέσεις...53 5.4 Χιαστί δεσμοί..54 5.5 Οξείδωση των βάσεων του DNA...55 6. Μέθοδος ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης (Single Cell Gel Electrophoresis /SCGE)/comet assay.57 6.1 Γενικά..57 6.2 Αρχή της μεθόδου...59 6.3 Διαφορετικές μορφές της μεθόδου comet assay..59 6.4 Εφαρμογές...62 4

6.5 Πλεονεκτήματα...63 6.6 Μειονεκτήματα...63 7. Μικροπυρήνες.64 7.1 Γενικά..64 7.2 Μέθοδος Αναστολής της Κυτταροκίνησης (CBMN/Cytokinesis Block Micronucleus Assay)..67 7.2.1 Πλεονεκτήματα της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης...67 7.2.2 Μειονεκτήματα της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης...70 Σκοπός Εργασίας 71 Υλικά και μέθοδοι..75 1. Κυτταρικές καλλιέργειες.77 1.1. Γενικά.77 1.2 Συνθήκες καλλιέργειας κυτταρικών σειρών..77 1.2.1 Πλήρες Θρεπτικό μέσο...77 1.2.2 ph 78 1.2.3 Θερμοκρασία...79 1.2.4 Άσηπτο περιβάλλον.79 1.3 Κυτταρική σειρά HL-60 80 1.3.1 Απόψυξη κυττάρων.81 1.3.2 Ανακαλλιέργεια κυττάρων..82 1.3.3 Κατάψυξη κυττάρων..83 2. Χημική ένωση.84 3. Έλεγχος της βιωσιμότητας των κυττάρων με τη μέθοδο trypan blue dye exclusion..85 4. Μελέτη της θραυσματογόνου δράσης της δοξορουβικίνης 87 4.1 Ηλεκτροφόρηση μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης (Single Cell Gel Elecrophoresis/Comet Assay) 87 4.2 Τροποποιημένη ηλεκτροφόρηση μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης κάτω από αλκαλικές συνθήκες σε συνδυασμό με τη χρήση ενζύμων επιδιόρθωσης..92 4.3 Μικροσκοπική παρατήρηση.94 4.4 Επεξεργασία των αποτελεσμάτων 95 5. Μελέτη συχνότητας μικροπυρήνων, αποπτωτικών κυττάρων και κυτταροτοξικότητας...97 5

5.1 Μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis Block Micronucleus assay CBMN)..97 5.2 Καλλιέργειες κυττάρων HL-60 98 5.3 Μονιμοποίηση των κυττάρων..99 5.4 Χρώση Giemsa/ May-Grϋnwald.100 5.5 Κριτήρια αναγνώρισης διπύρηνων κυττάρων...101 5.6 Κριτήρια αναγνώρισης των μικροπυρήνων...101 5.7 Κριτήρια διάκρισης μεταξύ αποπτωτικών και νεκρών κυττάρων.102 5.8 Δείκτης πολλαπλασιασμού των κυττάρων CBPI και κυτταροτοξικότητα...103 6. Μελέτη της έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην επαγωγή της απόπτωσης 104 6.1 Προετοιμασία των δειγμάτων.104 6.1.1 Λύση των κυττάρων..104 6.1.2 Ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών με την ευαίσθητη μέθοδο Bradford.107 6.1.3 Καταβύθιση πρωτεϊνών με 100% TCA 109 6.2. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) 109 6.3 Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western 113 6.4 Ανοσοαποτύπωση.115 6.5 Αποδέσμευση των αντισωμάτων και επαναχρησιμοποίηση της μεμβράνης PVDF.118 6.6 Προσδιορισμός του μοριακού βάρους των υπό εξέταση πρωτεϊνών...119 6.7 Επεξεργασία των αποτελεσμάτων...121 Αποτελέσματα...123 1. Μελέτη της θραυσματογόνου δράσης της δοξορουβικίνης..125 1.1 Μέθοδος ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης σε αλκαλικές και ουδέτερες συνθήκες...125 2. Μελέτη του μηχανισμού με τον οποίο η δοξορουβικίνη προκαλεί θραύση του DNA...146 2.1 Γενικά 146 2.2 Τροποποιημένη ηλεκτροφόρηση μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης κάτω από αλκαλικές συνθήκες σε συνδυασμό με τη χρήση επιδιορθωτικών ενζύμων..147 6

3. Μελέτη συχνότητας μικροπυρήνων, αποπτωτικών κυττάρων και κυτταροτοξικότητα..159 3.1 Γενικά 159 3.2 Μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis Block Micronucleus assay CBMN) 159 4. Μελέτη της έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην επαγωγή της απόπτωσης 165 Παράρτημα εικόνων.167 Συζήτηση...181 Συμπεράσματα..195 Βιβλιογραφία 197 7

8

Πρόλογος Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, στο πλαίσιο του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών του Τμήματος Βιολογίας με Ειδίκευση στη Βιολογική Τεχνολογία. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα Καθηγήτρια κα Στεφάνου Γεωργία για τη συνεχή καθοδήγηση και τις πολύτιμες συμβουλές της καθ όλη τη διάρκεια παραμονής μου στο εργαστήριο, που πηγάζουν από μακροχρόνια έρευνα και μελέτη της ιδίας. Την ευχαριστώ επίσης για τις εποικοδομητικές συζητήσεις και πάντοτε εύστοχες υποδείξεις της κατά τη συγγραφή της παρούσας εργασίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον Καθηγητή κ. Δημόπουλο Νικόλαο για το ενδιαφέρον, τις προτάσεις και τις ουσιαστικές παρατηρήσεις του, όλο αυτό το χρονικό διάστημα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω και τους δύο για την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν, δίνοντας μου την ευκαιρία να πραγματοποιήσω τη διατριβή μου στο Εργαστήριο Γενετικής και να ασχοληθώ με ένα τόσο ενδιαφέρον θέμα. Ευχαριστίες οφείλω στον Ομότιμο Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας κ. Αλαχιώτη Σταμάτη για τη συμμετοχή του στην εξεταστική επιτροπή και την εποικοδομητική κριτική του κειμένου μου. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στην Alakhras Raghda και την Ζαχαράκη Πολυξένη για το χρόνο που αφιέρωσαν στην επίλυση των αποριών μου κατά το ξεκίνημά μου. Επιπλέον, ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον υποψήφιο Διδάκτορα Ζησιμόπουλο Δημήτριο και στη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Τριπολιτσιώτη Δήμητρα, για τη βοήθεια που μου προσέφεραν καθώς και για το γεγονός ότι μοιράστηκαν μαζί μου τις γνώσεις τους. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τους προπτυχιακούς φοιτητές Ταβιανάτου Αναστασία και Αγγελή Νικόλαο για την άριστη συνεργασία που είχαμε, το ευχάριστο κλίμα που επικρατούσε τις ώρες που περνούσαμε μαζί, καθώς και για την κατανόηση που επέδειξαν και την ηθική συμπαράσταση καθ όλη τη διάρκεια παραμονής τους στο εργαστήριο. Ευχαριστώ θερμά την Ταβανιάτου Αναστασία η οποία συνέβαλε με το δικό της τρόπο στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. Επίσης, ευχαριστώ τον προπτυχιακό φοιτητή Θανόπουλο Βασίλη για την καλή συνεργασία που είχαμε. 9

Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στους γονείς μου και τον αδερφό μου, οι οποίοι εμπιστεύονται τις επιλογές μου και στηρίζουν κάθε μου προσπάθεια. Η μέχρι τώρα πορεία μου οφείλεται στη δική τους αμέριστη αγάπη, κατανόηση και στήριξη. 10

Περίληψη Summary 11

12

Περίληψη Η αντικαρκινική ένωση δοξορουβικίνη χρησιμοποιείται ευρέως είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα, στην αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού, των ωοθηκών, του πνεύμονα αλλά και σε περιπτώσεις οξείας λευχαιμίας και σαρκωμάτων. Σε προηγούμενη έρευνα που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο μας, σε λεμφοκύτταρα ανθρώπου αλλά και στην κυτταρική σειρά ποντικού C 2C12, βρέθηκε ότι επάγει το σχηματισμό μικροπυρήνων ως αποτέλεσμα κυρίως χρωμοσωματικής θραύσης. Στην παρούσα εργασία, διερευνήθηκε περαιτέρω η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού καθώς και η ικανότητά της να επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης σε λευχαιμικά κύτταρα ανθρώπου HL-60. Η μελέτη του κερματισμού του DNA λόγω της δράσης της δοξορουβικίνης πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης (SCGE) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Εκτιμήθηκαν οι παράμετροι tail length, % DNA in tail, tail moment, και olive tail moment που αποκαλύπτουν θραύση του DNA. Επιπρόσθετα, η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού αναλύθηκε μέσω δημιουργίας κλάσεων με ελάχιστη έως μέγιστη βλάβη. O μηχανισμός με τον οποίο προκαλεί θραύση του DNA διερευνήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης κάτω από αλκαλικές συνθήκες σε συνδυασμό με τη χρήση των επιδιορθωτικών ενζύμων Fpg και hoog1. Μετέπειτα, εξετάστηκε η ικανότητα της δοξορουβικίνης να επάγει την απόπτωση. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN). Επίσης, με τη μέθοδο CBMN πραγματοποιήθηκε μελέτη του φαινομένου της χρωμοσωματικής θραύσης. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίον η υπό εξέταση χημική ένωση επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης, αναλύθηκε η ικανότητά της να τροποποιεί την έκφραση της κασπάσης-3, μιας πρωτεΐνης που παίζει σημαντικό ρόλο στον καταρράκτη των μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος ανοσοαποτύπωσης της παραπάνω πρωτεΐνης (Western blot). Με βάση τα ευρήματά μας, η δοξορουβικίνη παρουσιάζει θραυσματογόνο δράση, όπως φάνηκε από την αύξηση της εξόδου του DNA από τους πυρήνες των κυττάρων μετά από ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες. Η δημιουργία των ρηγμάτων είναι 13

ισχυρότερη σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού σχετίζεται με την οξείδωση των βάσεων του DNA, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ασταθών σε αλκαλικές συνθήκες θέσεων (alkali labile sites). Επίσης, προκαλεί οριακή αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν, ενώ δε φαίνεται να επάγει τη δημιουργία των μικροπυρήνων στις υψηλότερες συγκεντρώσεις. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με την ιδιότητά της να προκαλεί μεγαλύτερη συχνότητα ρηγμάτων του DNA στις μικρές συγκεντρώσεις. Επιπρόσθετα, επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης. Η επαγωγή αυτή είναι ισχυρότερη σε υψηλές συγκεντρώσεις και δικαιολογεί τις μειωμένες συχνότητες ρηγμάτων και μικροπυρήνων στις συγκεντρώσεις αυτές. Η κασπάση 3 συμμετέχει στην επαγόμενη από τη δοξορουβικίνη απόπτωση όπως φάνηκε από την αύξηση της έκφρασης της κασπάσης 3, μετά από ανάλυση κατά western, σε κυτταρικές καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία δοξορουβικίνης. 14

Summary The anticancer drug doxorubicin is widely used, either alone or in combination with other anticancer drugs, in the treatment of solid tumours of the breast, lung, ovary, as well as in acute leukemia and sarcomas. Previous research in our laboratory showed that doxorubicin is able to induce micronucleus generation, in human lymphocytes and mouse cell line C2C12, mainly due to chromosome breakage. In the present study we investigated the clastogenic activity of doxorubicin as well as its ability to induce apoptosis. Ηuman leukemic cells HL-60 were chosen as the cell system to proceed our research. The clastogenic activity of doxorubicin was investigated by alkaline Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE assay-comet assay). Four parameters were analyzed, tail length, % DNA in tail, tail moment, and olive tail moment, which reveal DNA breakage. Additionally the capacity of doxorubicin to induce DNA fragmentation was analyzed by stratifying the cells into five classes with various degrees of DNA damage, from undamaged DNA to severely damaged DNA. The mechanism by which doxorubicin exerts its clastogenic activity was studied by enzyme linked comet assay. We used Fpg and hoog1 DNA glycosylases. The ability of doxorubicin to induce apoptosis was studied by Cytokinesis-block Micronucleus assay. Also, the CBMN assay was used to assess the micronucleation on HL-60 due to the action of doxorubicin. To further elucidate the mechanism by which doxorubicin induce apoptosis we examined the ability of this compound to alter the expression of caspase 3, that plays a key role in the cascade of molecular events of programmed cell death. This analysis was performed by Western blot. Our findings indicate that doxorubicin exerts clastogenic activity as it provokes DNA migration from the nucleus after SCG electrophoresis in alkaline conditions. The generation of breaks on DNA strands seems to be more potent at low concentrations. The ability of doxorubicin to induce fragmentation of genetic material is correlated with the oxidation of DNA bases resulting in the formation of alkali labile sites. Furthermore, it induces marginal increase in the frequency of micronuclei at lower concentrations, while it doesn t seem to induce micronucleation at higher concentrations. This finding is in accordance with the ability of doxorubicin to generate higher frequency of DNA breaks at low concentrations. Additionally, doxorubicin induces apoptosis. This induction is more potent at higher concentrations and is consistent with the reduced frequency of breaks and micronucleus generation at these concentrations. Activation of apoptosis due to doxorubicin treatment seems to be mediated by caspase 3. 15

16

Εισαγωγή 17

18

1. Καρκίνος 1.1 Γενικά Ο καρκίνος συνεχίζει να αποτελεί παγκόσμια μάστιγα παρά την τεράστια πρόοδο που έχει σημειωθεί στον τομέα της έρευνας τις τελευταίες δεκαετίες. Αποτελεί την δεύτερη πιο κοινή αιτία θανάτου μετά τα καρδιαγγειακά νοσήματα. Μέχρι το 2020, ο παγκόσμιος πληθυσμός αναμένεται να αυξηθεί σε 7,5 δισεκατομμύρια. Από αυτό τον αριθμό θα διαγνωστούν περίπου 15 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις καρκίνου και 12 εκατομμύρια ασθενείς θα πεθάνουν. Τα πρώτα «ίχνη» του εντοπίζονται σε απολιθωμένα οστά και μούμιες της αρχαίας Αιγύπτου. Στην ιατρική, το πρώτο χειρόγραφο που αναφέρεται στον καρκίνο βρέθηκε επίσης στην Αίγυπτο. Ονομάζεται πάπυρος Edwin Smith και χρονολογείται το 3000 π. Χ. Ο συγγραφέας του περιγράφει 8 περιπτώσεις καρκίνου του μαστού οι οποίες αντιμετωπίστηκαν με καυτηριασμό και καταλήγει: «πρόκειται για μια σοβαρή ασθένεια για την οποία δεν υπάρχει θεραπεία» (Hajdu, 2011). 1.2 Τι είναι ο καρκίνος; Ο καρκίνος μπορεί να οριστεί ως μια ασθένεια στην οποία μια ομάδα κυττάρων πολλαπλασιάζεται ανεξέλεγκτα αγνοώντας τους «κανόνες» της κυτταρικής διαίρεσης, στους οποίους υπόκεινται φυσιολογικά τα κύτταρα (Hejmadi, 2010). Αλλαγές στο γονιδίωμα των κυττάρων που συνήθως οφείλονται σε μεταλλάξεις είτε κληρονομήσιμες είτε επαγόμενες από περιβαλλοντικούς παράγοντες, έχουν ως αποτέλεσμα την παραγωγή πρωτεϊνών που διαταράσσουν τη λεπτή ισορροπία μεταξύ της κυτταρικής διαίρεσης και της κυτταρικής αδράνειας (Hejmadi, 2010). Πολλοί ερευνητές υποστηρίζουν ότι δεν αρκεί μια μόνο αλλαγή για τη μετατροπή ενός κυττάρου σε καρκινικό. Απαιτούνται περίπου 4 με 7 αλλαγές προκειμένου ένα φυσιολογικό κύτταρο να εξελιχθεί σε κακοήθη όγκο και συνήθως μεσολαβούν πολλά χρόνια μεταξύ της αρχικής αλλαγής και της εμφάνισης του καρκίνου. Το 1971, ο Alfred Knudson διατύπωσε τη διάσημη υπόθεση των δύο γενετικών αλλαγών (two hits hypothesis) συγκρίνοντας επιδημιολογικά δεδομένα που αφορούσαν κληρονομήσιμες και σποραδικές μορφές του ρετινοβλαστώματος. Σύμφωνα με την υπόθεση αυτή, υπάρχει μια αρχική μετάλλαξη ενός αλληλομόρφου γονιδίου στα γεννητικά κύτταρα οικογενειών με κληρονομική προδιάθεση για καρκίνο, η οποία κληρονομείται ενώ αργότερα μια δεύτερη μετάλλαξη του άλλου 19

αλληλομόρφου συμβαίνει στα σωματικά κύτταρα οδηγώντας στην ανάπτυξη του καρκίνου. Στην περίπτωση του μη οικογενούς ρετινοβλαστώματος, η πρώτη μετάλλαξη πραγματοποιείται σε ένα ήδη διαφοροποιημένο κύτταρο του αμφιβληστροειδούς. Αυτό το κύτταρο εμφανίζει μια δεύτερη μετάλλαξη αργότερα κατά την παιδική ηλικία πυροδοτώντας την ανάπτυξη του καρκίνου. Αυτό εξηγεί γιατί οι σποραδικές μορφές ρετινοβλαστώματος τείνουν να εμφανίζονται αργότερα από τις κληρονομήσιμες. Η ταυτοποίηση του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος (RB) το 1987, επιβεβαίωσε πλήρως την υπόθεση του Knudson (Barlow-Stewart, 2012). Εικόνα 1.2.1: Υπόθεση δύο γενετικών αλλαγών (two hits hypothesis) του Knudson (Προσαρμογή από http://www.fccc.edu/research/areas/advisors/knudson/twohit.html). 20

1.3 Βασικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων Υπάρχουν περισσότεροι από 100 διαφορετικοί τύποι καρκίνου και υπότυποι καρκινικών όγκων εμφανίζονται σε συγκεκριμένα όργανα (Hanahan and Weinberg, 2000). Παρόλα αυτά τα καρκινικά κύτταρα μοιράζονται όλα ή κάποια από τα παρακάτω χαρακτηριστικά: «Αθανασία»/ Απεριόριστη διάρκεια ζωής Τα φυσιολογικά κύτταρα έχουν περιορισμένη διάρκεια ζωής. Αυτό οφείλεται στη συνεχή βράχυνση των άκρων των χρωμοσωμάτων (τελομερών) σε κάθε κύκλο αντιγραφής του DNA. Η βράχυνση των χρωμοσωμάτων συνεχίζεται μέχρι ενός σημείου πέραν του οποίου ενεργοποιείται ο μηχανισμός προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα διατηρούν το μήκος των τελομερικών περιοχών τους λίγο μεγαλύτερο από ένα κρίσιμο σημείο ενεργοποιώντας ένα ένζυμο που λέγεται τελομεράση. Το 85-90% των καρκινικών κυττάρων έχει πλήρη ενεργότητα τελομεράσης, γεγονός που τους επιτρέπει να διαιρούνται επ αόριστον. Αντίθετα, στα φυσιολογικά κύτταρα η τελομεράση χάνει την ενεργότητα της με το χρόνο, περιορίζοντας έτσι τον αριθμό των διαιρέσεων που μπορεί να υποστεί το κύτταρο (Μαρμάρας-Λαμπροπούλου, 2005; Hanahan and Weinberg, 2000; Hejmadi, 2010). Επάρκεια μηνυμάτων επαγωγής της κυτταρικής διαίρεσης Τα φυσιολογικά κύτταρα χρειάζονται εξωκυττάρια αυξητικά σήματα (grown signals) προκειμένου να διαιρεθούν. Αυτά τα σήματα (π.χ. διαλυτοί αυξητικοί παράγοντες, πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης, μόρια αλληλεπίδρασης μεταξύ των κυττάρων) δεσμεύονται σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση μιας σειράς ενδοκυττάριων μορίων και τελικά την έκφραση των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τα πρωτοογογονίδια κωδικοποιούν πολλές από τις πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε αυτό το μονοπάτι μεταγωγής μηνυμάτων για κυτταρική διαίρεση. Μεταλλάξεις στην κωδική ή τη ρυθμιστική περιοχή ενός πρωτο-ογογονιδίου, χρωμοσωματικές αναδιατάξεις που οδηγούν σε μετατόπιση μέρους ή ολόκληρου του πρωτοογκογονιδίου σε διαφορετική θέση του χρωμοσώματος, αύξηση του αριθμού των αντιγράφων του ή ενσωμάτωση του γενετικού υλικού ενός ιού κοντά ή μέσα στο πρωτο-ογκογονίδιο μπορεί να οδηγήσουν σε μετατροπή του σε ογκογονίδιο. Τα ογκογονίδια χαρακτηρίζονται από υπερπαραγωγή των πρωτεϊνών που 21

κωδικοποιούν ή από υπερβολική αύξηση της ενεργότητάς τους με αποτέλεσμα τα φυσιολογικά κύτταρα να αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα και ανεξάρτητα από το μικροπεριβάλλον τους και να μετατρέπονται σε καρκινικά. Τα ογκογονίδια συμπεριφέρονται ως επικρατή γονίδια (Hanahan and Weinberg, 2000; Hejmadi, 2010). Μη απόκριση σε μηνύματα καταστολής της κυτταρικής διαίρεσης Προκειμένου να διατηρηθεί η ομοιόσταση ενός ιστού, τα κύτταρα εκτός από μηνύματα για κυτταρική διαίρεση δέχονται και μηνύματα τα οποία λειτουργούν ως φρένο για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμποδίζουν την διαίρεση των κυττάρων. Τα προϊόντα αυτών των γονιδίων εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα. Μεταλλάξεις στα ογκοκατασταλτικά γονίδια οδηγούν σε απενεργοποίηση των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν με αποτέλεσμα τα κύτταρα να αγνοούν τα εξωκυττάρια μηνύματα καταστολής και να συνεχίζουν να διαιρούνται. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια συμπεριφέρονται ως υποτελή γονίδια (Hanahan and Weinberg, 2000; Hejmadi, 2010). Αποφυγή της απόπτωσης Η δημιουργία όγκων μπορεί να ερευνηθεί όχι μόνο από τη σκοπιά του συνεχούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού αλλά και από τη σκοπιά του μειωμένου κυτταρικού θανάτου. Τα κύτταρα συνεχώς ελέγχουν την εσωτερική τους κατάσταση δηλαδή τα επίπεδα οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών, την ακεραιότητα του γενετικού υλικού και την ισορροπία των μονοπατιών που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Αν αυτός ο έλεγχος αποκαλύψει βλάβη ή δυσλειτουργία, ενεργοποιούνται μηχανισμοί που καθορίζουν αν η ανάπτυξη του κυττάρου θα «παγώσει» και θα ενεργοποιηθούν μηχανισμοί επιδιόρθωσης ή εναλλακτικά αν η βλάβη είναι εκτεταμένη ενεργοποιούν το μονοπάτι προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωση). Υπάρχουν αρκετά στοιχεία που υποδηλώνουν ότι η αποφυγή της απόπτωσης είναι ένα κύριο χαρακτηριστικό αν όχι όλων των περισσοτέρων μορφών καρκίνου. Τα καρκινικά κύτταρα αποφεύγουν την απόπτωση με πολλούς τρόπους. Ο πιο κοινός τρόπος περιλαμβάνει μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53. Η πρωτεΐνη p53 λειτουργεί κυρίως ως ανιχνευτής βλαβών στο DNA και ενεργοποιεί είτε μηχανισμούς επιδιόρθωσης είτε το μονοπάτι απόπτωσης ως απόκριση στη βλάβη. 22

Επίσης, ενδοκυττάρια μηνύματα όπως υποξία ή υπερέκφραση ογκογόνων πρωτεϊνών ενεργοποιούν πρωτεΐνες οι οποίες εμπλέκονται στην απόπτωση και σχετίζονται με την p53. Η απενεργοποίηση της λειτουργίας της p53 έχει παρατηρηθεί σε ποσοστό μεγαλύτερο από το 50% των καρκίνων στον άνθρωπο (Hejmadi, 2010). Αγγειογένεση Όπως τα φυσιολογικά κύτταρα έτσι και τα καρκινικά χρειάζονται οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά για να επιβιώσουν και να αναπτυχθούν. Όμως, καθώς ο όγκος μεγαλώνει, τα φυσιολογικά αιμοφόρα αγγεία δεν επαρκούν για να τροφοδοτήσουν τα κύτταρα που βρίσκονται στο κέντρο του. Για το λόγο αυτό τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Σε αρκετούς όγκους έχει παρατηρηθεί υπερέκφραση των αυξητικών παραγόντων VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) και/ή FGF (Fibroblast Grown Factor). Σε άλλες περιπτώσεις έχει παρατηρηθεί μειωμένη έκφραση ενδογενών αναστολέων όπως η θρομβοσπονδίνη-1 ή η β-ιντερφερόνη. Σε μερικούς όγκους μπορεί να συμβούν και οι δύο αλλαγές. Και στις δύο περιπτώσεις πάντως διαταράσσεται η ισορροπία μεταξύ των επαγωγέων και των αναστολέων της αγγειογένεσης με αποτέλεσμα το σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων (Hanahan and Weinberg, 2000). Μετάσταση Ορισμένα καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να αποσπώνται από την αρχική καρκινική μάζα και με την κυκλοφορία του αίματος και της λέμφου να μεταφέρονται σε άλλους ιστούς και όργανα. Εκεί συνεχίζουν την ανεξέλεγκτη διαίρεσή τους με αποτέλεσμα τη δημιουργία νέων όγκων (Hejmadi, 2010). Οι όγκοι που έχουν την ικανότητα μετάστασης ονομάζονται κακοήθεις. Αντίθετα οι όγκοι που δεν έχουν την ικανότητα να διεισδύουν σε γειτονικούς ιστούς και να εξαπλώνονται σε διαφορετικά σημεία του σώματος ονομάζονται καλοήθεις. Συνήθως οι καλοήθεις όγκοι δεν αποτελούν απειλή. Υπάρχουν όμως και περιπτώσεις που μπορεί να αποκτήσουν χαρακτηριστικά κακοήθους όγκου. Με τον όρο καρκίνος αναφερόμαστε στους κακοήθεις όγκους. Οι κακοήθεις όγκοι αποτελούν την αιτία θανάτου στο 90% των καρκινοπαθών (Hanahan and Weinberg, 2000). 23

1.4 Αιτίες που προκαλούν καρκίνο Ο καρκίνος οφείλεται τόσο σε ενδογενείς όσο και σε εξωγενείς παράγοντες. Οι παράγοντες αυτοί δρουν είτε μαζί είτε διαδοχικά. 1.4.1 Ενδογενείς παράγοντες Υπάρχουν ενδογενείς παράγοντες που καθιστούν ορισμένα άτομα πιο επιρρεπή στην εμφάνιση καρκίνου από ότι κάποια άλλα. 1.4.1.1 Κληρονομικότητα Το 1900 οι επιστήμονες ανακάλυψαν ότι οι μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2 σχετίζονται με τον καρκίνο του μαστού και είναι κληρονομικές. Από τότε έχουν βρεθεί κι άλλα γονίδια που σχετίζονται με οικογενείς μορφές καρκίνου όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου, του νεφρού, των ωοθηκών, του θυρεοειδούς, του παγκρέατος και του δέρματος. Ωστόσο οι οικογενείς μορφές καρκίνου δεν είναι τόσο συχνές. Μόνο το 5-10% των καρκίνων οφείλονται σε κληρονομικές μεταλλάξεις γονιδίων (Anand et al., 2008). 1.4.1.2 Μη φυσιολογικά επίπεδα ορμονών στην κυκλοφορία του αίματος Υπάρχουν ορμόνες που παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση αφού προωθούν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Εμπλέκονται κυρίως σε καρκίνους που σχετίζονται με το φύλο όπως ο καρκίνος του μαστού, των ωοθηκών, του προστάτη και των όρχεων. Τα επίπεδα των ορμονών στην κυκλοφορία του αίματος ενός ατόμου καθορίζονται κυρίως γενετικά κι αυτό εξηγεί εν μέρει την παρουσία ορισμένων μορφών καρκίνου σε οικογένειες που δεν φαίνεται να φέρουν μεταλλαγμένα γονίδια που σχετίζονται με τις συγκεκριμένες μορφές. Για παράδειγμα, οι κόρες γυναικών με καρκίνο του μαστού έχουν αισθητά υψηλότερα επίπεδα οιστρογόνων και προγεστερόνης σε σύγκριση με τις κόρες υγιών γυναικών. Τα υψηλότερα επίπεδα ορμονών ίσως εξηγούν γιατί οι γυναίκες αυτές έχουν περισσότερες πιθανότητες να εμφανίσουν καρκίνο του μαστού ακόμα κι απουσία μεταλλαγμένων γονιδίων (http://en.wikipedia.org/wiki/cancer). 24

1.4.1.3 Ανοσοποιητικό σύστημα Το ανοσοποιητικό σύστημα καταστέλλει την καρκινογένεση με τρεις διαφορετικούς τρόπους: α) προστατεύει από ϊικές μολύνσεις, β) καταστρέφει τους παθογόνους μικροοργανισμούς βοηθώντας στην απομάκρυνση της φλεγμονής αφού η παρατεταμένη παρουσία ενός φλεγμονώδους μικροπεριβάλλοντος διευκολύνει την καρκινογένεση και γ) εξουδετερώνει τα καρκινικά κύτταρα καθώς συχνά εκφράζουν στην κυτταρική τους επιφάνεια είτε μόρια τα οποία δεσμεύονται σε υποδοχείς κυττάρων της μη ειδικής άμυνας είτε αντιγόνα που αναγνωρίζονται από υποδοχείς των λεμφοκυττάρων (ειδική άμυνα). Εξασθένιση ή καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος μπορεί να οδηγήσει σε καρκινογένεση (Dunn et al., 2006; Schreiber et al., 2011). Επίσης, πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να προωθήσει την επικράτηση εναλλακτικών μορφών καρκινικών κυττάρων (ασκεί συνεχή επιλογική πίεση σε γενετικά ασταθή καρκινικά κύτταρα/immune selection) τα οποία τελικά ξεφεύγουν από τη δράση του μέσω ποικίλλων μηχανισμών. Επομένως, το ανοσοποιητικό σύστημα όχι μόνο καταστέλλει την καρκινογένεση αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να την προωθήσει (Dunn et al., 2004; Dunn et al., 2006). 1.4.2 Εξωγενείς παράγοντες Ένας παράγοντας θεωρείται καρκινογόνος όταν υπάρχει συνεχής συσχέτιση μεταξύ της έκθεσης σε αυτόν και της εμφάνισης μιας συγκεκριμένης μορφής καρκίνου. Υπάρχουν αρκετοί περιβαλλοντικοί παράγοντες που είναι καρκινογόνοι. Κάποιοι από αυτούς αναλύονται παρακάτω. 1.4.2.1 Κάπνισμα Ο καπνός του τσιγάρου αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης τουλάχιστον 14 διαφορετικών μορφών καρκίνου. Έρευνες έχουν δείξει ότι ευθύνεται για το 25-30% των θανάτων από καρκίνο και για το 87% των θανάτων από καρκίνο του πνεύμονα. Συγκριτικά με τους μη καπνιστές, οι άντρες καπνιστές εμφανίζουν 23 φορές και οι 25

γυναίκες καπνίστριες 17 φορές περισσότερες πιθανότητες εμφάνισης καρκίνου του πνεύμονα (Anand et al., 2008). 1.4.2.2 Αλκοόλ Η πρώτη αναφορά για τη σχέση μεταξύ της κατανάλωσης αλκοόλ και αυξημένου κινδύνου εμφάνισης καρκίνου του οισοφάγου δημοσιεύτηκε το 1910. Μεταγενέστερες έρευνες έχουν αποκαλύψει ότι η χρόνια κατανάλωση αλκοόλ είναι ένας παράγοντας κινδύνου για την εμφάνιση καρκίνου της στοματικής κοιλότητας, της αναπνευστικής οδού, του φάρυγγα, του λάρυγγα και του οισοφάγου, όπως επίσης και για την εμφάνιση καρκίνου του ήπατος, του παγκρέατος και του μαστού (Anand et al., 2008). 1.4.2.3 Διατροφή Το 1981, οι Doll και Peto ανακάλυψαν ότι το 30-35% των θανάτων από καρκίνο στις ΗΠΑ σχετιζόταν με τη διατροφή. Ο βαθμός στον οποίο η κακή διατροφή συμβάλλει στην θάνατο από καρκίνο ποικίλλει ανάλογα με τη μορφή του. Οι περισσότερες καρκινογόνες ενώσεις που εισέρχονται στο στομάχι μας, όπως οι νιτροσαμίνες, οι διοξίνες και τα παρασιτοκτόνα προέρχονται από το φαγητό μας αυτό καθεαυτό, από πρόσθετα που μπορεί να περιέχει ή από τον τρόπο μαγειρέματος. Επίσης, η έλλειψη φρούτων και λαχανικών από τη διατροφή μας και η υπερβολική κατανάλωση κόκκινου κρέατος αυξάνει την πιθανότητα εμφάνισης αρκετών τύπων καρκίνου, όπως ο καρκίνος της γαστρεντερικής οδού, του προστάτη, του μαστού, της κύστης, του παγκρέατος και της στοματικής κοιλότητας (Anand et al., 2008). 1.4.2.4 Παχυσαρκία Σύμφωνα με έρευνες Αμερικανικής Εταιρίας κατά του καρκίνου, η παχυσαρκία συνδέεται με αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας από καρκίνο του μαστού (σε γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση), του ενδομητρίου, των νεφρών, του οισοφάγου, του παγκρέατος, του προστάτη, της χοληδόχου κύστης και του ήπατος. Στις Ηνωμένες Πολιτείες το 14% των θανάτων από καρκίνο στους άνδρες και το 20% στις γυναίκες αποδίδεται στην παχυσαρκία (Anand et al., 2008). 26

1.4.2.5 Παθογόνοι Μικροοργανισμοί Αρκετοί DNA ιοί όπως επίσης και ρετροϊοί αποτελούν ογκογόνους παράγοντες. Επίσης, παράσιτα όπως το Opisthorchis viverrini ή το Schistosoma haematobium και βακτήρια όπως το Helicobacter pylori μπορεί να εμπλέκονται στην καρκινογένεση (Anand et al., 2008). 1.4.2.6 Ακτινοβολία Πάνω από το 10% των περιπτώσεων καρκίνου οφείλονται σε διάφορες μορφές ακτινοβολίας. Μεταξύ αυτών συγκαταλέγονται η λευχαιμία, το λέμφωμα, ο καρκίνος του δέρματος, του θυρεοειδούς, του μαστού και του πνεύμονα. Η εισπνοή του ραδονίου και των προϊόντων διάσπασης του είτε στο σπίτι είτε στο χώρο εργασίας (ορυχεία) αποτελεί την πιο κοινή πηγή έκθεσης σε ιονίζουσα ακτινοβολία. Επίσης, οι ακτίνες Χ που χρησιμοποιούνται για διαγνωστικούς και θεραπευτικούς σκοπούς μπορεί να προκαλέσουν καρκινογένεση. Η πιο κοινή πηγή μη ιονίζουσας ακτινοβολίας είναι η υπεριώδης ακτινοβολία του ήλιου. Συνδέεται με αρκετές μορφές καρκίνου του δέρματος και κυρίως με τον πιο θανατηφόρο αυτών, το μελάνωμα (Anand et al., 2008). 1.4.2.7 Βιομηχανικά Προϊόντα Πολλά βιομηχανικά προϊόντα είναι καρκινογόνα. Μεταξύ αυτών συγκαταλέγονται η βενζόλη, η ανιλίνη, ο αμίαντος, οργανικοί διαλύτες, εντομοκτόνα, ζιζανιοκτόνα, παρασιτοκτόνα κ.α. Άτομα που έρχονται σε συχνή επαφή με τις ουσίες αυτές στο χώρο εργασίας τους παρουσιάζουν αυξημένη συχνότητα εμφάνισης ορισμένων μορφών καρκίνου (Μαρμάρας-Λαμπροπούλου, 2005). 1.4.2.8 Μόλυνση του περιβάλλοντος Η μόλυνση του περιβάλλοντος (αέρας, νερό, έδαφος) σε πολλές περιπτώσεις σχετίζεται με την καρκινογένεση. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν η μόλυνση του αέρα με κυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες (PAHs) κυρίως στις πόλεις, η οποία αυξάνει τον κίνδυνο θανάτου από καρκίνο του πνεύμονα καθώς 27

επίσης και η παρουσία χλωρίου και νιτρικού άλατος στο πόσιμο νερό που αυξάνουν τον κίνδυνο εμφάνισης λευχαιμίας, λεμφώματος και καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Anand et al., 2008). Ωστόσο, η επίδραση των περιβαλλοντικών παραγόντων δεν είναι ανεξάρτητη από τα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο. Αντιθέτως είναι γνωστό ότι επηρεάζουν άμεσα ή έμμεσα γονίδια τα οποία εμπλέκονται στην καρκινογένεση. Εικόνα 1.4.1: Ο ρόλος των γονιδίων και του περιβάλλοντος στην εμφάνιση του καρκίνου. Α. Ποσοστιαία συνεισφορά των γενετικών και των περιβαλλοντικών παραγόντων στον καρκίνο. Β. Κίνδυνος εμφάνισης διαφόρων οικογενών μορφών καρκίνου. Γ. Ποσοστιαία συνεισφορά κάθε περιβαλλοντικού παράγοντα στην εμφάνιση καρκίνου (Προσαρμογή από Anand et al., 2008). 28

1.5 Αντιμετώπιση του καρκίνου Με βάση τον τύπο του καρκίνου, τη θέση του και το στάδιο εξέλιξης στο οποίο βρίσκεται υπάρχουν διαφορετικοί τρόποι αντιμετώπισης. Η χειρουργική επέμβαση χρησιμοποιείται για την αφαίρεση συμπαγών όγκων (solid tumors) και είναι αποτελεσματική στην περίπτωση που ο καρκίνος εντοπιστεί σε αρχικά στάδια. Επίσης, χρησιμοποιείται για την αφαίρεση καλοηθών όγκων. Συρρίκνωση ή εξαφάνιση των όγκων μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση ακτίνων Χ ή άλλου είδους ακτίνων υψηλής ενέργειας καθώς και ραδιενεργών υλικών, που κατευθύνονται με όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ακρίβεια στο σημείο που βρίσκεται ο όγκος. Ένας ακόμα τρόπος αντιμετώπισης πολλών μορφών καρκίνου είναι η χημειοθεραπεία. Σε αντίθεση με την ακτινοβολία και τη χειρουργική επέμβαση, οι οποίες θεωρούνται τοπικές θεραπείες αφού δρουν σε συγκεκριμένο σημείο του σώματος, η χημειοθεραπεία διαφέρει αφού κατά κύριο λόγο χρησιμοποιείται ως συστημική θεραπεία. Αυτό σημαίνει ότι τα φάρμακα ταξιδεύουν μέσα στο σώμα για να φτάσουν στα καρκινικά κύτταρα όπου και αν βρίσκονται. Επίσης, φυλετικές ορμόνες ή ενώσεις οι οποίες επηρεάζουν την παραγωγή ή τη δραστηριότητα αυτών χρησιμοποιούνται για να επιβραδύνουν την ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού, του προστάτη και του ενδομητρίου, οι οποίοι χρησιμοποιούν ως αυξητικά σήματα τις ορμόνες που φυσιολογικά υπάρχουν στο σώμα μας (ορμονική θεραπεία). Μια ακόμα μορφή θεραπείας του καρκίνου είναι η ανοσοθεραπεία. Στην ενεργή ανοσοθεραπεία παράγοντες όπως οι ιντερλευκίνη-2, οι ιντερφερόνη-α κι άλλες κυτοκίνες παράγονται στο εργαστήριο και χορηγούνται στους ασθενείς με στόχο να διεγείρουν ή να ενισχύσουν τη φυσική απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος. Αντιθέτως, η παθητική ανοσοθεραπεία δεν βασίζεται στην άμυνα του οργανισμού αλλά χρησιμοποιεί συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος τα οποία παράγονται έξω από το σώμα του ασθενούς. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων τα οποία αναγνωρίζουν αντιγόνα που εκφράζονται στα καρκινικά κύτταρα-στόχους. Τέλος, υπάρχουν θεραπείες που στοχεύουν κατευθείαν στα καρκινικά κύτταρα παρεμβαίνοντας στις διαδικασίες αύξησης, διαίρεσης, εξάπλωσης και θανάτου των καρκινικών κυττάρων (π.χ. χρήση αναστολέων των μηνυμάτων αύξησης, επαγωγέων της απόπτωσης, αναστολέων της αγγειογένεσης και μονοκλωνικών αντισωμάτων τα οποία 29

μεταφέρουν χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή ραδιενεργά υλικά αποκλειστικά στα καρκινικά κύτταρα) (www.cancer.org; www.radiologyinfo.org; www.cancer.gov). 2. Φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία Τα αντικαρκινικά φάρμακα ταξινομούνται σε αυτά που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία, στην ορμονική θεραπεία και την ανοσοθεραπεία. Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία με βάση τη χημική δομή και το μηχανισμό δράσης τους διακρίνονται σε αλκυλιωτικούς παράγοντες, αντιμεταβολίτες, αντιβιοτικά και αναστολείς της μίτωσης (Parnell and Woll, 2003). 2.1 Αλκυλιωτικοί παράγοντες Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες μεταφέρουν αλκυλομάδες στις μεθυλ- ή στις αιθυλομάδες του DNA σχηματίζοντας ενδομοριακούς χιαστί δεσμούς που τροποποιούν τη δομή ή τη λειτουργία του. Η πιο κοινή θέση αλκυλίωσης είναι το Ν-7 της γουανίνης, αν και μπορεί να διαφέρει ανάλογα με την οικογένεια στην οποία ανήκει ο αλκυλιωτικός παράγοντας. Δρουν σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου και χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση πολλών διαφορετικών μορφών καρκίνου μεταξύ των οποίων η λευχαιμία, το λέμφωμα, η νόσος Hodgkin, το πολλαπλό μυέλωμα, το σάρκωμα όπως επίσης και ο καρκίνος του πνεύμονα, του μαστού και των ωοθηκών. Στη θεραπεία του καρκίνου χρησιμοποιούνται οι εξής τύποι αλκυλιωτικών παραγόντων: α) οι υπερίτες του αζώτου, β) οι νιτροζουρίες, γ) τα θειϊκά αλκύλια, δ) οι τριαζίνες, ε) οι αιθυλενιμίνες και στ) παράγοντες της οικογένειας των πλατινών (www.cancer.org.; Espinosa et al., 2003). 2.2 Αντιμεταβολίτες Πρόκειται για κυτταροτοξικούς παράγοντες που δομικά μοιάζουν με τις φυσιολογικές πουρίνες, πυριμιδίνες καθώς επίσης και με βιταμίνες και αμινοξέα. Αναστέλλουν τη δράση ενζύμων που εμπλέκονται στη σύνθεση του DNA ή ενσωματώνονται στο DNA και το RNA με αποτέλεσμα τη δημιουργία ρηγμάτων. Χρησιμοποιούνται στην αντιμετώπιση της λευχαιμίας, του καρκίνου των ωοθηκών, του μαστού καθώς επίσης και σε άλλες μορφές καρκίνου. Μερικά παραδείγματα 30

αντιμεταβολιτών είναι τα εξής: αναστολείς του φολικού οξέος (π.χ. methotrexate), ανταγωνιστές των πυριμιδινών (αντιπυριμιδίνες) (π.χ. 5-fluorouracil, cytarabine) και αναστολείς των πουρινών (αντιπουρίνες) (π.χ. 6-mercaptopurine) (Espinosa et al., 2003; Parnell and Woll, 2003). 2.3 Αναστολείς της μίτωσης Υπάρχουν δύο ειδών αναστολείς της μίτωσης. Αυτοί που δεσμεύονται στην τουμπουλίνη και οι αναστολείς των τοποϊσομερασών. 2.3.1 Αναστολείς που δεσμεύονται στην τουμπουλίνη Η τουμπουλίνη αποτελεί τη βασική υπομονάδα των μικροσωληνίσκων, οι οποίοι συμμετέχουν σε πολλές σημαντικές λειτουργίες του κυττάρου, μεταξύ των οποίων ο σχηματισμός της μιτωτικής ατράκτου κατά μήκος της οποίας μετακινούνται τα χρωμοσώματα κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Οι αναστολείς της τουμπουλίνης είναι κυρίως αλκαλοειδή φυτών και ενώσεις που προέρχονται από φυσικά προϊόντα όπως τα αλκαλοειδή του καλλωπιστικού θάμνου Vinca και οι ταξάνες οι οποίες προέρχονται από ένα είδος ελάτου, τον τάξο. Τα αλκαλοειδή της Vinca προσδένονται σε ειδικές θέσεις της τουμπουλίνης και αναστέλλουν τον πολυμερισμό των διμερών τουμπουλίνης, εμποδίζοντας μικροσωληνίσκων. Οι με ταξάνες αυτό έχουν τον τρόπο διαφορετική τον θέση σχηματισμό των δέσμευσης και σταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους. Αυτή η ασυνήθιστη σταθερότητα εμποδίζει την φυσιολογική αναδιοργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων. Οι εποθιλόνες (epothilones) αποτελούν μια καινούρια ομάδα ουσιών που «σταθεροποιούν» την τουμπουλίνη (Parnell and Woll, 2003). 2.3.2 Αναστολείς των τοποϊσομερασών Οι τοποϊσομεράσες βοηθούν στο διαχωρισμό των δύο αλυσίδων του DNA ώστε να μπορέσει να αντιγραφεί. Η τοποϊσομεράση I κόβει τον ένα μόνο κλώνο του DNA ενώ η τοποϊσομεράση ΙI κόβει και τους δύο κλώνους. Οι αναστολείς των τοποϊσομερασών χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της λευχαιμίας όπως επίσης και του καρκίνου του πνεύμονα, των ωοθηκών, της γαστρεντερικής οδού κι άλλων μορφών καρκίνου. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αναστολέα της τοποϊσομεράσης I είναι τα topotecan και 31

irinotecan ενώ αναστολέα της τοποϊσομεράσης II οι ενώσεις etoposide και teniposide (www.cancer.org.; Espinosa et al., 2003). 2.4 Αντικαρκινικά αντιβιοτικά Τα αντιβιοτικά που χορηγούνται για την αντιμετώπιση του καρκίνου δρουν μέσω ποικίλλων μηχανισμών όπως η δημιουργία χιαστί δεσμών στο DNA και η αναστολή των τοποϊσομερασών. Για παράδειγμα οι ανθρακυκλίνες ενσωματώνονται μεταξύ των ζευγών βάσεων του DNA και του RNA, αναστέλλουν την DNA και την RNA πολυμεράση, επάγουν τη δημιουργία ελεύθερων ριζών και τροποποιούν τη λειτουργία της κυτταρικής μεμβράνης. Άλλα χαρακτηριστικά παραδείγματα αντικαρκινικών αντιβιοτικών αποτελούν η μπλεομυκίνη (bleomycin) και η δακτινομυκίνη (dactinomycin) (Parnell and Woll, 2003). Υπάρχουν βέβαια και φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία αλλά δεν ανήκουν σε καμία από τις προαναφερθείσες κατηγορίες αφού δρουν με τελείως διαφορετικό μηχανισμό όπως το ένζυμο L-ασπαραγινάση και ο αναστολέας του πρωτεασώματος bortezomib (www.cancer.org). 3. Ανθρακυκλίνες-Δοξορουβικίνη 3.1 Γενικά Αν και οι ανθρακυκλίνες ήταν γνωστές για τις αντιβακτηριακές τους ιδιότητες από το 1939, η αντικαρκινική τους δράση έγινε γνωστή τη δεκαετία του 1960. Πηγή προέλευσής τους αποτελούν διάφορα είδη στρεπτομύκητα. Από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες ανθρακυκλίνες είναι η δαουνορουβικίνη και η δοξορουβικίνη (Rabbani et al., 2004; Mukhtar et al., 2012). Η πρώτη αναφορά στις αντικαρκινικές ιδιότητες της δαουνορουβικίνης χρονολογείται το 1963 όταν βρέθηκε να έχει θετική δράση ενάντια σε όγκους ποντικών. Ανακαλύφθηκε σχεδόν παράλληλα από δυο ερευνητικές ομάδες, μια στο Μιλάνο και μια στο Παρίσι. Το όνομα δαουνορουβικίνη προήλθε από το συνδυασμό της ονομασίας δαουνομυκίνη που δόθηκε από τους Ιταλούς ερευνητές και της ονομασίας ρουβιδομυκίνη που δόθηκε από τους Γάλλους ερευνητές. Το δαουνομυκίνη προέρχεται από το Δαουνία, μια πόλη της αρχαίας Ιταλίας από όπου απομονώθηκε το στέλεχος Streptomyces peucetius, το οποίο παρήγαγε την ένωση, ενώ το ρουβιδομυκίνη οφείλεται στο έντονο κόκκινο χρώμα της. Η έρευνα για βιοσυνθετικά παράγωγα με παρόμοια δομή και καλύτερα 32

φαρμακολογικά αποτελέσματα οδήγησε σε ένα 14-υδροξυ παράγωγο αυτής με σημαντική αντικαρκινική δράση σε ποικίλλα προκλινικά συστήματα. Το 1967 άρχισε να χρησιμοποιείται σε κλινικές μελέτες με το όνομα αδριαμυκίνη (λόγω της Αδριατικής θάλασσας) (Muggia, 2001). 3.2 Χημική δομή και ιδιότητες Η δοξορουβικίνη είναι μια αγλυκόνη που αποτελείται από ένα τετρακυκλικό δακτύλιο με παρακείμενες ομάδες κινόνης και υδροκινόνης στους δακτυλίους Γ και Β αντίστοιχα, μια μεθόξυ ομάδα στον άνθρακα 4 του δακτυλίου Δ, και μια μικρή πλευρική αλυσίδα στον άνθρακα 9 με ένα καρβονύλιο στον άνθρακα 13. Ένα σάκχαρο, που ονομάζεται daunosamine, προσδένεται με γλυκοσιδικό δεσμό στον άνθρακα 7 του δακτυλίου Α και αποτελείται από μια 3-amino-2,3,6-trideoxy-Lfucosyl ομάδα (Minotti et al., 2004; Preobrazhenskaya et al., 2006). Πρόκειται για μια κόκκινη κρυσταλλική σκόνη με μοριακό τύπο C27H29NO11 και μοριακό βάρος 579.98 gr/mol. Είναι διαλυτή στο νερό και σε διαλύματα αιθανόλης και μεθανόλης ενώ είναι τελείως αδιάλυτη σε μη πολικούς οργανικούς διαλύτες. Τα διαλύματα αυτής έχουν πορτοκαλοκίτρινο χρώμα σε όξινο ph, πορτοκαλοκόκκινο σε ουδέτερο ph και μπλε-ιώδες σε ph μεγαλύτερο του 9 (Arcamone et al., 1969; Rabbani et al, 2004). Η συστηματική της ονομασία είναι (8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methyltetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1-methoxy7,8,9-10-tetrahydrotetracene-5,12-dione hydrochloride. Κάποια από τα συνώνυμα με τα οποία συναντάται είναι τα εξής: Dox, Adriamycin, Adria και 14- hydroxydaunorubicin. Στο εμπόριο συνήθως κυκλοφορεί ως Adriamycin PFS. Η δοξορουβικίνη και η δαουνορουβικίνη διαφέρουν μόνο στον άνθρακα 14, όπου η δοξορουβικίνη έχει μια επιπλέον υδροξυλομάδα (Sparreboom et al., 2002). 33

Εικόνα 3.2.1: Χημική δομή της δοξορουβικίνης (Monneret, 2001). 3.3 Κλινική χρήση Η δοξορουβικίνη χρησιμοποιείται στη θεραπεία του καρκίνου του στήθους, των πνευμόνων, των ωοθηκών, της ουροδόχου κύστεως, του οστεοσαρκώματος, σε σαρκώματα μαλακών ιστών, σε ποικίλλες κακοήθειες που εμφανίζονται σε παιδιά (νευροβλάστωμα, σάρκωμα Ewing), σε οξείες λευχαιμίες, καθώς και στην αντιμετώπιση της νόσου Hodgkin, του λεμφώματος non-hodgkin και στο πολλαπλό μυέλωμα. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με αντικαρκινικά φάρμακα που ανήκουν σε άλλες ομάδες πέραν των ανθρακυκλινών όπως με αναστολείς της μιτωτικής ατράκτου (ταξάνες, αλκαλοειδή της Vinca), φάρμακα που έχουν ως βάση την πλατίνα (cisplatin και carboplatin), νουκλεοτιδικά ανάλογα (cytarabine και 5-fluorouracil), αλκυλιωτικούς παράγοντες (cyclophosphamide) και αντιφολικές ενώσεις (παρεμποδίζουν τη δράση των φολικών οξέων π.χ. τετραϋδροφολικό οξύ σημαντικό για τη σύνθεση των βάσεων DNA) (Sparreboom et al., 2002). Χορηγείται συνήθως ενδοφλεβίως καθώς η χορήγηση από το στόμα δεν είναι αποτελεσματική, κυρίως λόγω της τοπικής γαστρεντερικής τοξικότητας και της σχετικά χαμηλής και μεταβλητής βιοδιαθεσιμότητας (περίπου 5%). Επιπλέον, οι ανθρακυκλίνες διασπώνται στο στομάχι εξαιτίας του χαμηλού ph. Μετά την ενδοφλέβια χορήγηση, προσλαμβάνεται ταχύτατα από ιστούς που είναι εύκολα προσιτοί όπως η καρδιά, το ήπαρ, ο σπλήνας, οι νεφροί και οι πνεύμονες και εξαιτίας της ισχυρής συγγένειας με το πυρηνικό DNA, η συγκράτηση από τους ιστούς 34

είναι υψηλή. Δεν διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και δεν συσσωρεύεται στους εγκεφαλικούς ιστούς (Sparreboom et al., 2002). 3.4 Παρενέργειες Η ναυτία, ο εμετός, ο πυρετός, η διάρροια, η ανορεξία, η πλήρης αλωπεκία, η στοματίτιδα, η καταστολή του μυελού των οστών και η μείωση των λευκοκυττάρων στο αίμα αποτελούν συνήθεις παρενέργειες από τη χορήγηση της δοξορουβικίνης. Από τις πιο σοβαρές συνέπειες της δοξορουβικίνης είναι η καρδιοτοξικότητα. Μια οξεία, παροδική καρδιακή δυσλειτουργία μπορεί να εμφανιστεί στο 10-40% των ασθενών αμέσως μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Πιο σοβαρή είναι η χρόνια καρδιοτοξικότητα, η οποία εμφανίζεται αργότερα, έως και 6 μήνες μετά τη χορήγηση της τελευταίας δόσης δοξορουβικίνης και έχει ως αποτέλεσμα την πρόκληση δριμείας μυοκαρδιοπάθειας οδηγώντας σε συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια. Η χρόνια μυοκαρδιοπάθεια είναι μη αναστρέψιμη και δοσο-εξαρτώμενη (Sparreboom et al., 2002). Ένα ακόμα πρόβλημα που προκύπτει από τη χορήγηση της δοξορουβικίνης είναι η τοπική ιστική νέκρωση λόγω εξαγγείωσης του φαρμάκου στο σημείο που εισάγεται με ένεση (Sparreboom et al., 2002). Τέλος, η εμφάνιση ανθεκτικότητας των καρκινικών κυττάρων σε κυτταροστατικούς παράγοντες μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται και οι ανθρακυκλίνες είναι αρκετά συχνό φαινόμενο. Η ανθεκτικότητα στις ανθρακυκλίνες μπορεί να είναι είτε εγγενής είτε να αποκτηθεί κατά τη διάρκεια επαναλαμβανόμενων γύρων χημειοθεραπείας. Η πρώτη μορφή ανθεκτικότητας εμφανίζεται κυρίως σε συμπαγείς όγκους ενώ η δεύτερη στην αντιμετώπιση της οξείας λευχαιμίας (Sparreboom et al., 2002). 35

3.5 Μηχανισμοί δράσης Παρά την ευρεία κλινική χρήση των ανθρακυκλινών οι μηχανισμοί μέσω των οποίων εκδηλώνουν την κυτταροστατική και κυτταροτοξική τους δράσης αποτελούν αντικείμενο συζήτησης. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται οι ακόλουθοι: 3.5.1 Αναστολή σύνθεσης του DNA Η δοξορουβικίνη εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων με παθητική διάχυση και από εκεί με τη βοήθεια του πρωτεασώματος 26S μεταφέρεται στον πυρήνα όπου παρεμβάλλεται μεταξύ γειτονικών ζευγών βάσεων της διπλής έλικας του DNA με μη ειδικό τρόπο προκαλώντας τοπική έκπτυξη αυτής. Αυτού του είδους οι μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις του μορίου των ανθρακυκλινών με το DNA μπορεί να αναστείλουν τη δράση της DNA λιγάσης, της ελικάσης καθώς κι άλλων DNA-εξαρτώμενων πρωτεϊνών εμποδίζοντας τις διαδικασίες της αντιγραφής, της μεταγραφής και της μετάφρασης (Sparreboom et al., 2002; Cutts et al., 2003; Minotti et al., 2004). 3.5.2 Δημιουργία συμπλόκων και χιαστί δεσμών με το DNA Οι ανθρακυκλίνες σχηματίζουν ασταθείς ομοιοπολικούς δεσμούς με το DNA. Αυτού του είδους οι ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις οδηγούν είτε στο σχηματισμό λιγότερο σταθερών συμπλόκων DNA-δοξοροβουκίνης είτε περισσότερων σταθερών χιαστί δεσμών με το DNA (Minotti et al., 2004). Η δοξορουβικίνη παρεμβάλλεται με ειδικό τρόπο ανάμεσα στην κυτοσίνη και την αμινομάδα των αλληλουχιών 5 -GCN-3. Για την παρεμβολή απαραίτητη είναι η εξωκυκλική Ν2 αμίνη της γουανίνης και η αμίνη που βρίσκεται στον άνθρακα 3 του σακχάρου daunosamine. Συγκεκριμένα, η δοξορουβικίνη προσδένεται στον άνθρακα με ομοιοπολικό δεσμό (δεσμός N-C-N, με κόκκινο χρώμα) μεταξύ της 3 αμινομάδας της daunosamine και της Ν2 αμίνης της γουανίνης. Η περιοχή daunosamine προεξέχει στη μικρή αύλακα του DNA. Αντίθετα, ο κεντρικός άνθρακας του δεσμού Ν-C-N προέρχεται από τη φορμαλδεϋδη, η οποία αντιδρά με την αμινομάδα της δοξορουβικίνης με αποτέλεσμα το σχηματισμό μιας ενεργούς βάσης Schiff. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι αντιδράσεις παραγωγής ελεύθερων ριζών στις οποίες διαμεσολαβούν ιόντα σιδήρου, έχουν ως αποτέλεσμα και την παραγωγή φορμαλδεϋδης από διάφορες κυτταρικές πηγές άνθρακα όπως τα λιπίδια (Minotti et 36

al., 2004). Επίσης, η φορμαλδεϋδη μπορεί να παραχθεί από οξείδωση της δοξορουβικίνης. Η παρεμβολή της δοξορουβικίνης σε περιοχές πλούσιες σε γουανίνη-κυτοσίνη και η δημιουργία συμπλόκων μπλοκάρει μεταγραφικούς παράγοντες που προσδένονται σε αυτές τις περιοχές. Επιπλέον, η παρουσία μεγάλου αριθμού αυτών των ογκωδών συμπλόκων στο DNA αναμένεται να οδηγήσει σε απόπτωση (και νέκρωση) (Cutts et al., 2005). Τα σύμπλοκα δοξορουβικίνης-dna σταθεροποιούνται περαιτέρω με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ της υδροξυλομάδας του C9 της δοξορουβικίνης και της γουανίνης του δεύτερου κλώνου του DNA με αποτέλεσμα τη δημιουργία χιαστί δεσμών μεταξύ δοξορουβικίνης και DNA (Taatjes et al., 1997; Minotti et al., 2004). Εικόνα 3.5.2.1: Δομή των συμπλόκων DNA-δοξορουβικίνης. Με μπλε χρώμα απεικονίζεται η δοξορουβικίνη, με κόκκινο ο δεσμός N-C-N και με πράσινο οι συμπληρωματικές αλυσίδες του DNA (Cutts et al., 2005). 37

3.5.3 Αναστολή της τοποϊσομεράσης ΙΙ Η ανάγκη ύπαρξης των τοποϊσομερασών προέρχεται από τη δομή διπλής έλικας του DNA. Τα ένζυμα αυτά λύνουν τα τοπολογικά προβλήματα που σχετίζονται με την αντιγραφή του DNA, τη μεταγραφή, τον ανασυνδυασμό καθώς και την αναδιοργάνωση της χρωματίνης χωρίς να μεταβάλλουν τη δομή και την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων. Επιπλέον, διατηρούν σταθερό το επίπεδο υπερελίκωσης του γενετικού υλικού προκειμένου να διευκολύνουν την αλληλεπίδρασή του με πρωτεΐνες αλλά και να εμποδίσουν την υπερβολική υπερελίκωση του η οποία είναι επιβλαβής. Συγκεκριμένα οι τοποϊσομεράσες φέρουν σε πέρας αυτή την αποστολή προκαλώντας παροδικά είτε μονόκλωνα (τοποϊσομεράση Ι) είτε δίκλωνα (τοποϊσομεράση ΙΙ) ρήγματα στο DNA (Champoux, 2001). Οι ανθρακυκλίνες μεταξύ των οποίων και η δοξορουβικίνη σταθεροποιούν μια ενδιάμεση κατάσταση όπου οι δύο κλώνοι του DNA είναι κομμένοι και ομοιοπολικά συνδεδεμένοι με κατάλοιπα τυροσίνης της τοποϊσομεράσης ΙΙ, εμποδίζοντας έτσι την επανένωση των δύο κλώνων. Η δημιουργία και η σταθερότητα του συμπλόκου δοξορουβικίνη-dna-τοποϊσομεράση ΙΙ βασίζεται σε δομικά χαρακτηριστικά της δοξορουβικίνης. Το επίπεδο σύστημα δακτυλίων είναι σημαντικό για την παρεμβολή των ανθρακυκλινών στο DNA, καθώς οι δακτύλιοι Β και Γ συμπλέκονται με γειτονικά ζεύγη βάσεων και ο δακτύλιος Δ διέρχεται από το σημείο παρεμβολής. Αντίθετα, οι περιοχές του μορίου που δεν συμμετέχουν στην παρεμβολή (το σάκχαρο daunosamine και ο δακτύλιος Α) παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και τη σταθεροποίηση του συμπλόκου. Συγκεκριμένα, το σάκχαρο το οποίο εντοπίζεται στη μικρή αύλακα του DNA αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της ικανότητας των ανθρακυκλινών να αναστέλλουν την τοποϊσομεράση ΙΙ. Η βλάβη που προκαλείται στο DNA και οφείλεται σε αναστολή της τοποϊσομεράσης ΙΙ ακολουθείται από διακοπή της κυτταρικής αύξησης στη φάση G1 και G2 του κυτταρικού κύκλου και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Επίσης, έχει αναφερθεί ότι η δοξορουβικίνη αναστέλλει και την τοποϊσομεράση Ι αλλά πρόκειται για ένα βοηθητικό μηχανισμό δράσης (Minotti et al., 2004). 38