16.11.05 שיעור - 6 סטלה מטירני רוזנבאום נגיפי גורמי סרטן ראו שיש נגיפים שכאשר הם מדביקים תאים, הם יכולים לגרום לשינוי דרסטי בהתנהגותם: (אנו מדברים על תאים מותמרים, in vitro והוא אינו בהכרח דומה לתא מותמר שמוצאים בגידול בתוך חיה. בד"כ לנגיפים במעבדה טווח חיים קצר) שינוי מורפולוגי בד"כ גדול יותר שינוי ביוכימי שוני בסוגי החומרים שמסונתזים בתוך התא שינוי בדרישות הגידול של התאים בד"כ הדרישות קטנות יותר, כלומר התא יכול לספק בעצמו את חומרי הגידול שלו. פנוטיפ מותמר: איבוד תכונה עיכוב ע"י מגע -כשהתאים גדלים בתרבית יש להם תכונה מאוד בולטת, שכשהמשטח מתמלא בתאים כך שהם נוגעים זה בזה, הם מפסיקים להתרבות איבוד ע"י מגע. כאשר תא מותמר הוא מאבד את היכולת הזו וממשיך להתרבות. גידול במצע חצי מוצק תאים נורמלים גדלים בד"כ בנוזל, ואינם יכולים להתרבות על מצע מוצק. תא מותמר כן יכול לגדול על מצע מוצק, ואפילו במצע חצי מוצק (ג'ל), ולהתפתח למושבות דרישות פחותות לפקטורי גידול שלבים במחזור התא: G1 סינתזת דנ"א S שלב המתנה G2 חלוקה-מיטוזה- M התא נתון להרבה השפעות של פקטורים מבפנים ומבחוץ, ומקבל סיגנלים האם להפסיק להתרבות, להמשיך וכו'. התא המותמר לא מקבל את הסיגנלים הללו, והוא מתרבה ללא הגבלה. בשקף ניתן לראות עיכוב ע"י מגע בתאים נורמלים, ואיבוד התכונה הזו בתאים מותמרים, כך שהתאים גדלים אחד ע"ג השני. קריטריונים אלו מהווים דרך לאפיין תא מותמר. נגיפים גורמי סרטן יכולים לגרום לתאים לעבור את השינויים עליהם דיברנו, ואלו שינויים החיוניים לשלבים הרבה יותר מתקדמים כדי להתפתח לגידול בתא.In vivo נגיפים אלו מחולקים ל- 2 קב' נגיפי רנ"א נגיפי דנ"א סוגי הנגיפים נגיפי דנ"א : נגיפי רנ"א נגיפי hepadna נגיפי הרטרו נגיפי פוליומה (פוליומה + SV40 ( פפילומה אדנווירוסים הרפס 1
אבעבועות שחורות בטבלה שבשקף מובאות התכונות של הוירוסים הללו. ניתן לראות נגיפים קטנים מאוד וגדולים מאוד (כמו ההרפס). נגיפי הפוליומה ונגיפי ה- SV40 שייכים לאותה משפחה (משפ' פוליומה). נגיף ה- SV40 קטן, פשוט, ללא מעטפת, עשוי רק מדנ"א וקפסיד (חלבונים שעוטפים את החומר הגנטי) מצוי באופן טבעי בקופים, יכול לגרום להתמרה לאו דווקא בקוף, המאכסן הטבעי שלו. צורתו: גיאומטרית- icosahedral, הקפסיד מחולק ליח' חוזרות הנקראות קפסומרים, ולהם סימטריה מאוד יחודית. בחלקיק הויראלי (מה שיכול לגרום להדבקה) יש מולקולה אחת של דנ"א דו גדילית מעגלית. משקל המולקולרי של הדנ"א הוא 3.5 מיליון דלטון (5000 בסיסים). ניתן למצאו את הדנ"א ב- 3 צורות שונות: Supercoiling הצורה הנפוצה בויריון ובתא המודבק. Relaxed -Linear צורה נדירה במאכסן הטבעי שלו (הקוף) בד"כ אינו גורם למחלה. ישנן עדויות למציאת חלקים דומים לקב' הנגיפים הזו במחלות. התגלה כאשר התחילו להכין תרכיבי חיסון כנגד הפוליו. את החיסון הכינו ע"י הדבקת נגיפי הפוליו בקופים. בחלק מהתרכיבים הללו נכנס נגיף טבעי של התאים והוא ה- SV40. כשחקרו אותו מצאו בנגיף הפשוט הזה הרבה עקרונות של תאים איאוקריוטים. אינטראקציות נגיף-תא: infection Abrotive -הנגיף מדביק את התא, אך מהר מאוד נמהל ועובר דגרדציה. infection -Acute הנגיף חודר לתא, וגורם להרס של התא. infection Chronic -תמיד יש רמה מסויימת של נגיף בתא, שגם גורם לנזק. infection Latent הנגיף נמצא בתא אך לא גורם לנזק, עד שהוא מתפרץ בתנאים מסויימים (כגון בסטרס) Transformation גורם לחלוקה מסיבית של התאים נגיף ה- SV40 באופן טבעי, גורם להדבקה ליטית. בהמשך נלמד איך הוא גורם להתמרה. כאשר הוא מדביק את התא, הדנ"א שלו מגיע לגרעין מהר מאוד, ושם מתחיל תהליך השיעתוק והרפליקציה, כך שבסוף מתקבלים וירונים שלמים הפורצים החוצה ומתחילים במחזור חדש. כאשר מדביקים תאי קוף בנגיף זה רואים שתוך 10 דק' ישנה הצטברות של הרנ"א הויראלי, מיד אח"כ מצטברים חלבונים. החלבון הכמעט יחיד שנוצר מייד הוא T. antigen לאחר מכן ישנה התרבות של הדנ"א הויראלי, ורק אח"כ מצטבר רנ"א חדש (הרנ"א המאוחר), והוא מתורגם לחלבונים של הקפסיד. כלומר יש 2 קב', הקב' המוקדמת והקב' המאוחרת המופרדות ע"י יצירת הדנ"א. לאחר יומיים כבר ניתן לראות יצירה של חלקיקים ויראלים שלמים. מה שמתבטא במעבדה ע"י פלאק. שיעתוק של הנגיף והגנים המתבטאים מוקדם: הדנ"א הוא בערך 3.5* 6 10 קילו דלטון. כאשר הפיקו רנ"א של התא המודבק והריצו אותו בגרדיאנטים של גלוקוז ובדקו את גודל הסגמנטים ראן שגודל הרנ"א הוא 19s, מה שאומר 8.5* 5 10 קילו דלטון (רק רבע מהדנ"א משועתק לרנ"א). את סיבי הדנ"א של הנגיף חתכו באנזימי רסטריקציה וביצעו היברידיזציה בין הדנ"א לרנ"א וראו שהרנ"א עושה היברידיזציה עם חצי סיב דנ"א. 2
כשערכו תרגום לרנ"א ראו שנוצרו 2 חלבונים בגדלים שונים על אף שציפו לחלבון אחד. כדי למצוא את הרנ"א המקודד של החלבונים הללו השתמשו ב- nuclease. S1 S1 nuclease יכול לקצץ דנ"א חד סיבי. כאשר מפעילים S1 על ההיבריד דנ"א-רנ"א הוא יחתוך רק אם יהיה לופ ברנ"א-דנ"א. מסמנים את הדנ"א, ועורכים היברידיזציה עם הרנ"א המקודד ל- 2 החלבונים כך שהוא לא מתאים באופן מושלם לדנ"א. הלופ שנוצר יוסר באמצעות ה- S1. לאחר שהריצו בג'ל נראו 3 בנדים, כלומר 3 פרגמנטים: 1900. 630, 330, גילו כי לכל אחד מהחלבונים יש חלק משותף (1900), ולכל אחד מהחלבונים מצורף מקטע אחר (360 או 330). כך מצאו ש- 2 החלבונים מקודדים ע"י 2 חלקים משותפים של רנ"א (1900bp) ועוד חלק נוסף שונה בכל אחד מהחלבונים (אחד 330bp- והשני.(660bp מה שהתברר שישנו ספלייסינג. מהרנ"א הקטן נוצר:,large T antiigen ומהרנ"א הגדול.small t antigen איך זה יתכן? ברנ"א הגדול ישנו.stop kodon ברנ"א הקטן יש איזור של deletion שעולה על ה- stop kodon כך שהוא מדלג עליו, וכך נוצר חלבון גדול יותר. החלק ה- N טרמינלי משותף ל- 2 החלבונים. רוב החלבון שאנו רואים בתא מורכב מה- T,large ואלו 2 החלבונים היחידים המקודדים ע"י הנגיף שרואים בתא המודבק. ניתן ללמוד מהנגיף הנ"ל על הרכב הפרומוטור. ב- SV40 ניתן למצוא 3 אלמנטים מרכזיים: box -TATA רצפים של,TA מצויים במקום מאוד ספציפי נוקאוטיד 30- מנק' התחלת הטרנסקריפציה stream).(up אם משנים את המרחק בין רצפים אלו לנק' התחלת הטרנסקריפציה, משתנה נק' התחלת השיעתוק. elements : Up stream regulatory 3 חזרות של 21 בסיסים- רצפים חוזרים העשירים ב-,GC חיוני לכל מע' טרנסקריפציה 2 חזרות של 72 בסיסים- שם ממוקם האינהנסר. המיקום המדוייק והכיווניות של האינהנסר אינה משנה את יעילות הטרנסקריפציה. ל- 3 האלמנטים ישנם 3 חלבונים שעובדים בטראנס שנקשרים אליהם: ל- box TATA נקשר TATA box factor לחזרות של ה- 21 בסיסים נקשר sp1 פקטור שיעתוק. ולאינהנסר נקשרים יותר מחלבון אחד. חלבונים אלו הם חלבוני המאכסן. הדנ"א הויראלי כשמסתכלים בתוך התא המודבק, רואים סדרה של צורות משונות של דנ"א: "אזניים של פיל"- כתוצאה מכך שהסופר קוייל נפתח ותוך כדי שהוא נפתח הדנ"א עובר רפליקציה באיזור הפתוח. צורה נוספת היא צורת הטטה. האם הרפליקציה מתחילה בנק' אחת או באופן אקראי בכל מיני מקומות? חותכים את הדנ"א באיזור מסויים ברצף כך שנוצר דנ"א לינארי, ואז מסתכלים במיקרוסקופ אלקטרוני. במיקרוסקופ מבחינים בבועה שנפתחת. הסיקו שהתחלת הרפליקציה נעשית במקום אחד משום שהתקבלה בועה אחת. עוד ראו שהרפליקציה היא דו כיוונית, כי אם היא היתה חד כיוונית היינו רואים שהמרחק מנק' ההכפלה מתקצר והמרחק השני מתארך. מה שראו בפועל הוא ששני המרחקים מתקצרים ביחד. 3
ההכפלה מצד אחד נעשית באופן לינארי, ובצד השני ע"י מקטעי אוקזאקי. שיעתוק הרנ"א המאוחר לשיעתוק זה פרומוטר משלו, הוא הרבה פחות מאופיין משל הרנ"א המוקדם. הוא כמעט חופף את הפרומטר המוקדם. נמצא 30 בסיסים מה- origin. מאותו טרנסקריפט ישנם 3 חלבונים כאשר הגנים המוקדמים מקודדים ע"י חצי מסיב אחד, והגנים המאוחרים מקודדים מהסיב השני, כלומר ישנה הפרדה בין הבסיסים. חלבון : T antigen נחוץ לרפליקציה של הדנ"א ע"י קישור לאתר ה- ori של הרפליקציה נחוץ להפעלה של הגנים המאוחרים נקשר לפרומוטר של הרנ"א המאוחר. עושה רגולציה לעצמו, נקשר לנק' התחלת השעתוק של הרנ"א המוקדם, ואז מפסיק להשתעתק. הקפסיד מורכב ראשון, ורק כשהקפסיד מוכן מולקולת הדנ"א נכנסת פנימה. הרכבת הקפסיד נעשית בגרעין, וכשהוא יוצא החוצה, הוא מתמלא בדנ"א ויוצא אל מחוץ לתא. מערכת ההתמרה vitro In מערכת מאוד נדירה. כאשר הויריון נכנס, הדנ"א נכנס לגרעין, אך במקום לבצע רפליקציה, הדנ"א עובר אינטגרציה לדנ"א הגנומי, ובעצם כל החלק המאוחר לא קורה. כלומר: יש לנו רק את יצירת הרנ"א המוקדם. אין יצירה של חלקיקי וירוס-וירונים. במעבדה, תופעה זו בד"כ מתרחשת בתאים של מכרסמים (עכברים) ולא בתאי קוף. האם האינטגרציה נעשית בצורה מכוונת הן מבחינת הוירוס והן מבחינת התא? בודקים זאת ע"י חיתוכים באנזימי רסטריקציה. חותכים את הדנ"א שעבר אינטגרציה, ומקבלים 2 חלקים, מריצים אותו בגל, עושים,southern blot ובודקים כמה פרגמנטים קיבלנו. אם הנגיף נכנס במקום מסויים בגנום, אז ע"י חיתוך אנזימתי מסויים נקבל תמיד את אותם חלקים. לא קיבלנו זאת בפועל, לא כאשר חתכנו את הדנ"א הויראלי ולא כשחתכנו את הדנ"א הגנומי, ולכן מסיקים שאין ספציפיות בשבירה של הדנ"א לא מבחינת התא ולא מבחינת הוירוס. האם יש חלק מסויים בגנום שחייב להיות שם כי הוא חיוני להתמרה? החלק שצריך להיות שלם הוא ה- antigen T. השבירה של הדנ"א יכולה להיות בכל מקום, אם היא התרחשה בתוך החלק שמקודד ל- antigen T לא נקבל התמרה. כאשר לוקחים מוטנטים רגישי טמפ' ניתן לקבוע שה- antigen T נחוץ לתחילת הטרנספורמציה ולהמשכה. הנגיף הפוליומה עצמו הוא נגיף של מכרסמים, הוא כמעט זהה ל- SV40, אך יש לו חלבון שלישי:,Middle t ובעצם כל אשר אמרנו על ה- large T בנגיף SV40 (פרומוטרים,שיעתוק, יכולת התמרה) נכון לגבי ה-.Middle t 20.11.05 שיעור 7 Middle t,large T החלבון העיקרי והנחקר ביותר. בעל 708 חומצות אמינו בעל איזורים של מיקום לגרעין בעל איזור היקשרות לדנ"א בעל איזורי היקשרות לחלבונים תאיים (p53) אתרי פוספורילציה בקצה N ו- C טרמינלי. בעל איזורים וריאבילים-איזורים המשתנים בין זנים שונים של,SV40 ובינו לבין נגיפים אחרים ) c.(terminus 4
אומנם הנגיפים היו ידועים בעיקר בקופים ובמכרסמים, התברר כי גם בבני אדם נמצאו זנים דומים. הם נמצאו בחולי השתלת כליות החשופים כתוצאה מטיפול אימונורפרסיבי להתפרצות וירוסים וחיידקים שעוכבו קודם לכן בגוף ע"י המע' האימונית. אחד מהזנים שפרצו הוא ה- BKV זן דומה נמצא בגידולים במוח-.JCV ע"י השוואת הרצף של הזנים השונים, החוקרים הסיקו על זן חדש שהוא אינו.SV40 כאשר מזריקים במקומות שונים בכמויות שונות למכרסמים SV40 ניתן לגרום לגידולים שונים במקומות שונים. בגידולים של בני אדם ניתן לזהות רצפים דומים לרצפים של T antigen ב- SV40. כאשר עורכים PCR ל- sv40 ולזנים בבני אדם, ניתן לראות רצפים זהים ורצפים שונים. מההבדלים הללו ניתן להסיק שאלו זנים שונים לגמרי מה- SV40. בנגיפים שבודדו ממושתלי כליה מצאו אינהנסר 72bp אחד בעוד שב- SV40 ישנם שניים. חשוב לציין שהנגיפים עם רצפים זהים ל- SV40 נמצאו בבני אדם, אך לא הוכח כי הם אלו הגורמים לגידולים. נגיפי ההרפס קב' גדולה הן במס' המינים, והם מבחינת גודל הנגיף. נפוצים בטבע, ניתן למצוא אותם בכל בע"ח (קופים, בקר, צפרדעים, בני אדם...) יכולים לגרום לסוגים שונים של זיהומים: זיהום חריף-אקוטי (זיהום בשפתיים) o -שיכולה לגרום למוות). זיהומים חמורים יותר אנספליטיס (דלקת במוח o זנים שיכולים לגרום לפגמים מולדים o ישנם זנים שיכולים לגרום לגידולים סרטניים. o בבני אדם מוכרים 2 זנים אקוטים: HSV1 ו-.HSV2 VZV גורם לאבעבועות ילדים CMV גורם לכאב גרון קל, ויכול לגרום לפגמים מולדים באישה בהיריון, EBV מעורבים בגדולים סרטניים מאפיינים: הגורמים העיקריים בדלקות במע' המין הדבקה של עובר יכולה לגרום למומים בעלי מנגנון מעניין, אחרי הדבקה ראשונית שבד"כ גורמת לתופעה פתלוגית, הנגיף יכול להישאר בצורה לטנטית עד שהוא עובר ראקטיבציה ושוב הוא יכול לגרום לתופעה פתלוגית. הדנ"א שלהם הוא 144kb דנ"א גדול מאוד (הרבה גנים) בעלי ממברנה נוסף על הקפסיד. מבנה: דנ"א, קפסיד, ובין הקפסיד לממברנה ישנם חלבונים הנקראים: tegument (לא ברור תפקידם). על הממברנה ישנם גליקופרוטאינים שדרכם ההרפס עובר ספיחה לתא המודבק. מה שמייחד את נגיפי ההרפס כקב' הוא המבנה שלהם. בעלי מולק' אחת דנ"א דו גדילית לינארית ההבדל בין הזנים שונים נקבע ע"י המאכסן שלהם, והתכונות הביולוגיות שלהם. מבנה הגנום שלהם אופייני, מחולק ל- 2 איזורים: איזור ארוך וקצר ברצפים מאוד מיוחדים (S,(unic,L unic ובניהם (בקצוות) ישנם רצפים חוזרים. 5
דוגמאות מובאות בשקף HSV- חלק אדום-רצפים חוזרים, השאר הם איזורים יחודיים כפי שכתוב תהליך ההדבקה: ספיחה של הוירון לתא, הממברנה עוברת איחוי. בציטופלסמה מתרחשת הפשטה, הדנ"א נכנס לגרעין, שם מתרחשים שיעתוק ורפליקציה. (השיעתוק נעשה ע"י רנ"א פולימראז תאי). בסוף התהליך ישנו הרס של התאים. ישנו חלבון בויריון שנכנס לתוך הגרעין והוא נקרא אלפא,TIF והוא מאפשר את השיעתוק של הגנים הראשונים early) :(immidiae אלפא גנים גנים לחלבונים רגולטורים הדרושים לשיעתוק של הגנים הבאים :(early) ביתא גנים חלבונים רגולטורים ודנ"א פולימראז הדרוש לרפליקציה של הדנ"א הויראלי. כעת תתרחש רפליקציה של הדנ"א הויאלי, ולבסוף ישועתקו ה- genes :late הגמא גנים שהם חלבונים הדרושים למבנה של הנגיף, בעיקר הגלוקופרוטאינים הדרושים לספיחת הנגיף. לסיכום השיעתוק: השיעתוק הוא ב- 3 שלבים הגנים עוברים שיעתוק מ- 2 הסיבים של הדנ"א. השיעתוק אינו לפי סדר מיקום הגנים בדנ"א. יכולות להתקבל 4 קומבינציות של הדנ"א שעבר רפליקציה. קומבינציות שהן תוצאה של חיבור שונה בין החלק הקטן (US) והחלק הארוך (UL) מבחינת הכיווניות שלהם. בכל ויריון יש מולק' דנ"א אחת עם אחת הקומבינציות. ישנם 3 נק' התחלת הרפליקציה: אחת היא בתוך החלק ה- UL שניים ב- US קרוב לחלקים החוזרים. הדנ"א הנכנס לגרעין נסגר למעגל בעקבות רצפים זהים בכיוון ההפוך ends).(sticy אנדונוקלאז גורם ל- nick ופותח סיב אחד (ה- nick נגרם בד"כ באחת מ- 3 נק' הרפליקציה). הקצה ה-' 5 משתחרר החוצה, וכך נוצרים 2 סיבים חד גדיליים הקצה שהשתחרר והמשלים לו (הקצה ה-' 3 ). הרפליקציה מתרחשת על שני הסיבים הללו. על הסיב עם הקצה '5 נוצרים מקטעי אוקזאקי, ובסיס '3 הסינתזה רציפה. בסוף התהליך יתקבלו 2 מקטעים: רצף לינארי המורכב מסיב חדש וישן, ורצף מעגלי המורכב מסיב חדש וישן. ישנו אנזים שיחתוך את הדנ"א המעגלי כך שיתקבל סיב לינארי. לאחר הרפליקציה כאמור מתרחש השעתוק לגנים בקב' השלישית. חלבונים אלו הם חלבונים מבניים, חלקם גליקופרוטאינים נודדים לממברנה של התא, כך שהקפסיד יכול לצאת מהגרעין, להגיע לממברנה של התא בעקבות הכרה עם חלבונים נגיפיים על גביה, לעבור איחוי איתה ולצאת החוצה. הנגיף נודד לממברנה ע"ג וסיקולה (בסרט, מסומנת במעגל הלבן החיצוני), ויוצא עם הממברנה של התא. בעת חדירת הנגיף לתא המאכסן הוא משבש את המטבוליזם שלו, ולכן הוא מת בסוף התהליך. הדבקה לטנטית סוגים של הדבקה כזו: זיהום ראשוני ללא סיפטומים,HIV) HPV -פפילומה), ולאחר זמן מה הוירוס עובר ריאקטבציה ומתקבלים סימפטומי המחלה. ההדבקה הראשונית כן סימפטומלית,HSV1),(HSV2 לאחר מכן הסימנים הקליניים נעלמים, מבריאים, הוירוס שוב עובר ריאקטיבציה, ומקבלים סימפטומים זהים זיהום ראשוני גורם לתופעה הקלינית (אבעבועות רוח), מבריאים, הנגיף נשאר בגוף, עובר ריאקטיבציה אך מקבלים סימפטומים שונים (שלבקת חוגרת). 6
ההרפס סימלפקס הדבקה ראשונית בתאי אפיתל, ישנו ליזיס של תאים הופעת הסימפטומים ע"ג השפה, לאחר מכן הוירוס עובר לגנגליון דרך נויירונים, ושם נשאר בצורה לטנטית -ישנו שיעתוק של גן ה- LAT שאינו מתורגם לחלבון. מסיבה מסויימת ישנה ריאקטיבציה של הגנום הויראלי, הדנ"א מגיע לתאי אפיתל, ישנה יצירה של וירונים, ושוב הופעת סימפטומים זהים. הויריון יכול להמשיך בנויירון למע' העצבים (במקום לתאי אפיתל) ולגרום לזיהום במוח (אנספליטיס) שיכול להוביל למוות - Epstein Barr Virus - EBV הדבקה ראשונית בד"כ בלימפוציטים, אך האיכסון הלטנטי שלו הוא בתאי האפיתל 23.11.05 שיעור 8 בהמשך להרפס 3 אניטראקציות: אנטראקציה ליטית מתבטאת בזיהום אקוטי אינטראקציה לטנטית התמרה ישנם מס' זנים של נגיפי הרפס פוטנצייאלים להתמרה גם של התא in vitro וגם.in vivo כלומר, ישנם מס' סוגים של גידולים סרטניים שכנראה קשורים בזיהומים של נגיפים מסויימים. אנו יודעים שישנם בע"ח שמבחינה טבעית יכולים לפתח גידולים סרטניים, ומהגידולים הללו ניתן לבודד וירוס שאם נחדיר אותו לבע"ח בריא הוא יכול לגרום לגידול סרטני. מודלים של בע"ח שנמצאו בהם זנים של הרפס שיכולים לגרום לסרטן: צפרדע ישנם זנים של צפרדעים שיכולים לפתח באופן טבעי קרצינומה של הכליות. כשמבודדים את התאים האפיתליאלים הנגועים ניתן למצוא שם את נגיף ההרפס. מה שהתברר שהנגיף המצוי בתאי אפיתל של הכליה יכול להתרבות רק בחורף, כלומר הדנ"א פולימראז של ההרפס רגיש לטמפ', ועובד יותר טוב בתנאים קרים. לכן רואים התפתחות של גידולים בעיקר בחורף. קופים בקופים יש הרבה וירוסים שמתרבים. ישנם שני זנים של נגיפי הרפס: samiri ו- ateles שבאופן טבעי ניתן למצוא אותם ב- 2 זנים של קופים, samiri בקוף "שנאי", ו- ateles בקוף "עכביש". שם הם מתרבים, ואין התפתחות של גידול, אך אם הם יוחדרו לזן אחר של קוף, הנגיף מתחיל להתרבות וליצור וירונים בתאי אפיתל של הכליות, ולאחר כמה שבועות יש התפתחות של לימפומה (ב- cell T), כלומר יש זן אחד שיכול להדביק באותו בע"ח 2 סוגי תאים: תאי אפיתל (הדבקה ליטית), ותאי T לימפוציטים (הדבקה טומרגנית הגורמת ללימפומה) עופות נגיף ההרפס הנקרא: marek s וגם הוא מדביק תאי אפיתל על בסיס הנוצות (על העור). הנגיף יכול לגרום גם לגידול בבלוטות הלימפה, ולגרום למוות ב- 70% מהעופות המודבקים. (היווה בעיה גדולה בחקלאות). כלומר, מדביק גם תאי אפיתל, וגם לימפוצטים מסוג T. מע' הוירוס בעופות היתה המערכת הראשונה שהיה אפשר למנוע (חלקית לפחות) בה את ההתפתחות הסרטנית ע"י חיסון. בשנות ה- 70 המאוחרות לקחו נגיף הרפס דומה מתרנגולות הודו שאינו גורם לתופעות אלו, פיתחו חיסון כנגדו, והזריקו אותו לעופות הללו. התוצאות הראו כי היתה ירידה משמעותית בפיתוח גידולים סרטניים באותם עופות. 7
מההוכחות הללו, היה קל יותר לשכנע את קהילת המדענים שתופעות דומות מתרחשות גם בבני אדם. ישנם 8 זנים של הרפס באדם, שמתוכם 2 עיקריים כגורמי סרטן פוטנציאלים:.EBV,HHV8 (EBV) Epstein barr virus גורם למחלת הנשיקה מחלה זיהומית לא ממאירה-( IM ).infectoius mononucleosis קשור גם ל- 2 מיני סרטן : o בוקיט לימפומה BL גידול בבלוטות הלימפה. o קרצינומה NPC (מע' העיכול העליונה). מדביק תאי אפיתל ולימפוציטים. הנגיף זוהה לראשונה בגידול בבוקיט לימפומה. היו לו מאפיינים דומים לנגיפי ההרפס המוכרים, הוא אובחן כזן חדש והוא כונה.EBV הנגיף הינו קשה לגידול, והוא נזנח לתקופה מסויימת עד שבמקרה, במעבדה בה גילו את הנגיף, אחת העובדות חלתה במחלת הנשיקה. כשבדקו אותה גילו כי יש לה נוגדנים רבים כנגד הנגיף. כתוצאה מכך החליטו החוקרים לערוך מחקרים נוספים בנושא, והם לקחו דגימות דם מהצוואר של העובדים הצעירים, ושמרו בהקפאה. כשאחד מהם חלה במחלת הנשיקה, לקחו ממנו שוב דגימת דם והשוו בין 2 הדגימות דם, ומצאו כי דגימת הדם לאחר המחלה הכילה נוגדנים כנגד הנגיף. רוב האוכלוסיה מפתחת נוגדנים כנגד הנגיף כבר בגיל צעיר כתוצאה מחשיפה לנגיף. למחלה זו בילדים אין כמעט סימפטומים. המחלה קלינית יותר בגיל מבוגר יותר (לאדם שלא נחשף לנגיף בילדותו), אז מתפתחת מחלת הנשיקה. זאת בגלל שהמע' החיסונית בשלה יותר ויש ייצור ביתר של לימפוציטים. זוהי מחלה אופיינית לגיל הנעורים. המערכת הליטית של הנגיף נעשית בתאי אפיתל של החלק העליון של מע' הנשימה והוא מופרש ברוק, ועל שום כך נקראת המחלה "מחלת הנשיקה". הנוגדנים כנגד הקפסיד של הנגיף (נוגדני (viruse capsid antigen-vca מגנים מפני המחלה. (הנגיף לא חוזר בד"כ אלא אם כן יש ביטוי כרוני, או בעיה במע' האימונית, נכון לגבי כל ההרפסים). המחלות הממאירות כאשר מצאו את הנגיף בגידול בוקיט לימפומה, חשדו שיש לו תפקיד בהתפתחות הגידול. ראו כי בחולים ישנה כמות גדולה מהרגיל של נוגדנים כנגד הנגיף. ברוב המקרים של בוקיט לימפומה בתוך הביופסה, ניתן למצוא את הדנ"א של הנגיף ואנטיגנים שונים של הנגיף, לא בהכרח חלקיקים שלמים של הנגיף (וירונים). בוקיט לימפומה (BL) היא מחלה דיי אנדמית באיזורים מסויימים באפריקה בילדים בני -8 10 באיזורים החופפים למחלת המלריה. ב- 100% של החולים ניתן למצוא רצפי דנ"א של.EBV מחוץ לאפריקה לעומת זאת ישנה פחות נוכחות של EBV בביופסיה. כשהתחילו לחקור את נגיף ה- EBV in vitro ראו שיש לו גם תכונות של וירוס מתמיר. כאשר אנו שמים תאי B לימפוצטים בתרבית הם לא יכולים להתרבות יותר מפעמיים עד שלוש, כלומר לא שורדים הרבה זמן, מזדקנים ומתים. אם נוסיף לתאים אלו,EBV הם מסוגלים להתרבות ללא הגבלה. כשנבדוק אלו גנים מתבטאים, נראה כי בתאים המודבקים, 24 שע' לאחר ההדבקה ישנו חלבון אנטיגן הנקרא: EBNA, ולאחר מכן ישנו ביטוי של חלבון נוסף,LMP ושני החלבונים הללו גורמים לשיבוש המטבוליזם והמחזור התאי, ומזרזים את יצירת הדנ"א והרנ"א התאי, ומביאים בסופו של דבר לחלוקת תאים, כך שאנו מקבלים שורה של תאים שמתחלקת כל הזמן (בד"כ אנו מכירים וירוסים המשתקים את המטבוליזם התאי). אלו none producer cells -אין יצירה של וירונים. באחוז מאוד קטן של תאים מודבקים המחזור הליטי כן יוצא לפועל, ואז תהיה סינתזה של דנ"א נגיפי, קפסיד. תאים אלו יקראו:.producer cells תאי B כאלו יהרסו (כ- 1% ). 8
בתאים המייצרים יהיו כ- 50 mrna שונים המקודדים ע"י הנגיף, כוללים חלבונים מוקדמים ומאוחרים. בתאים שאינם מייצרים (מסלול לטנטי) יהיו רק 11 גנים שמתבטאים, מתוכם 9 שיתורגמו לחלבונים ושניים שישארו כ- mrna. בין 9 החלבונים הללו ישנם 6 חלבונים גרעיניים ו- 3 חלבונים שמתבטאים בממברנה של התא המודבק. הגנום של EBV גנום גדול. בתוך הויריון הוא לינארי, ובתא המודבק הוא מעגלי. 6 גנים נוקליארים מוקדמים שמפוזרים לאורך הגנום:.EBNA-1,2,3A(3),3B(4),3C(5),LP(6) לכל ה- EBNA פרומוטור משותף. 3 גנים שמתבטאים על הממברנה:.LMP-1,2A,2B אם כן, 9 הגנים המתבטאים באימורטליזציה הם גנים שעוברים,Splicing מפוזרים לכל אורך הגנום, הפרומוטורים משותפים (ל- EBNA ולחלבונים הממברנלים-לכל אחד בנפרד) ואין הומולוגים לגנים הללו בנגיפי הרפס אחרים. EBNA1 -הראשון שהתגלה, החלבון יודע להיקשר לאתר האוריג'ין והוא מאפשר לדנ"א הנגיפי לעבור הכפלה בתור אפיזום (מעגל סגור) בתוך התא. EBNA2 שייך לחלבונים הלטנטים. חיוני לקבלת טרנספורמציה (תא אימורטלי). כשבודדו זן של נגיף שהדביק תא B ולא גרם לאימורטליזציה, ראו כי יש לו חסר בחלק המקודד ל- EBNA2. EBNA2 נקשר לרפרסור RBP ומונע את יצירת הקומפלקס שעוצר את הטרנסקריפציה לחלבונים הקשורים למחזור התא. הוא מגייס קומפלקס אחר שמפעיל את הטרנסקריפציה של הגן, ובעזרת החלבונים המשועתקים הוא מעודד את ההכפלה של התא. מתברר ששאר החלבונים הנוקלארים מתגייסים יחד עימו לאותה מטרה, כשהוא מהווה את החלבון הראשי. כאמור, יש 2 סוגי חלבונים: חלבון נוקלארי וחלבון ממברנלי. חלבון ממברנלי - LMP1 כולל 3 איזורים שונים: החלק האמינו-איזור בתוך התא, אח"כ 6 איזורים טראנס ממברנלים, ולבסוך C טרמינוס (חלק ארוך מאוד) שהוא גם בתוך הציטופלסמה. התפקיד של הקצה האמינו הוא לייצב את האיזורים הטראנס ממברנלים. הקצה הקרבוקסילי מפעיל מסלולים חשובים ב- transduction.signal מתנהג כמו אונקוגן שמפעיל מע' שלמה של סיגנלים שמגיעים לגרעין וגורמים לתאים להתרבות. EBNA1 חלבון נוקלארי (גרעיני). בלימפומה, In vivo רואים ביטוי רק של שני החלבונים הללו בעוד ש- vitro, In ישנו ביטוי של שני החלבונים הללו בנוסף לחלבונים שמנינו קודם לכן. ההבדלים העיקריים בין תאי B מודבקים בנגיף in vitro EBV לבין תאי B שהופקו מגידולי בורקיט לימפומה (ביפוסיה) vivo : in In vitro LCL In vivo תאי,in vitro B מקורם ממס' תאים תאי לימפומה מקורם בתא מונוקלונלי תאי B לא יפתחו תאים מאירים כשמזריקים תאי לימפומה לחיה יתפתחו תאים ממאירים בתאי in vitro B אין טרנסלוקציה. בתאי לימפומה ישנה טרנסלוקציה הדדית בין כרמוזום 8, בחלק של גן c-myc המקודד לאונקוגן לכרומוזום 14, בחלק של הגן Ig k או עם Igδ בכרומוזום 21. הסיבה הישירה להתפתחות של הלימפומה היא הטרנסלוקציה הזו ולא ה- EBV. הנגיף רק מכין את הקרקע להתפתחות סרטנית ע"י כך שהוא גורם להם להתרבות ביתר. כשהוא מתרבה יש יותר סיכוי למוטציה שתגרום לטרנסלוקציה-אברציות כרומוזומליות 9
מבנה הגנום היחודי של נגיפי הרפס מורכב מרצפים ספציפיים (unic) וקצוות של רצפים חוזרים. ישנן וריאציות כאלו כאשר ה- EBV הוא בעל המבנה המסובך ביותר. ל- EBV יש 5 איזורי unic עם 5 איזורים חוזרים שמפרידים בניהם. ה- EBNA1 הוא הגן המשותף לכל ה- EBV, רוב הגן מקודד באיזור,repeat3 כאשר הרצף שלו מורכב מ- 708 בסיסים, מקומבינציות שונות של החזרות: GGG-GGA-GCA (גליצין- אלנין). נוכחות הרצפים החוזרים נותנת תכונה אימונוגנית מאוד חלשה ל- EBNA1, ובנוסף מייצבת את החלבון עצמו כנגד פרוטאזות. כשגורמים להופעת אנטיגנים חדשים על פני התא אנו מצפים לתגובת נוגדנים וציטוטוקסים כנגד התאים הללו. ואכן זה מה שקורה, כש- EBV חודר לתא,in vivo B ומבטא את האנטיגנים שלו ע"ג התא המודבק, התגובה האימונית שלנו מפתחת נוגדנים כנגדו. תאי T המזהים את החלבונים הללו מפרישים ציטוטוקסים. כל ה- EBNA והLMP1 גורמים לתגובה ציטוטקסית, כולם מלבד.EBNA1 האחרון לא מעורר תגובה ציטוטוקסית, ולכן ישנם נגיפים שיכולים להתחמק מהתגובה הציטוטוקסית ולשרוד את ההתקפה האימונית. אם נוריד חלק מהרצפים החוזרים של ה- EBNA1, אז הוא כן יעורר תגובה ציטוטוקסית. EBV in vivo הנגיף מדביק קודם כל את תאי האפיתל על פני המוקוזה של מע' הנשימה, שם הנגיף יכול להתרבות ולהשתחרר- כלומר תאים אלו נושאים את המחזור הליטי שלהנגיף. הויריונים הללו יכולים להדביק תאי, B נכנסים למחזור הלטנטי (מכילים את האנטיגנים המוקדמים), רובם נהרסים ע"י תאי T, אבל חלק שורדים. באיזשהו שלב התאים יכולים להגיע שוב לתאי האפיתל, להיכנס למחזור הליטי. ולשחרר עוד וירוס. ישנם הוכחות שנגיף זה קשור לעוד סוגי סרטן בינהם קרצינומה. לא כ"כ ברור איך המנגנון עובד. את התאים הללו קשה יותר לגדל, ולכן יש פחות מימצאים. הקרצינומה נפוצה בסין כנראה כתוצאה מהרכבי תזונה יחודיים. נגיף שיכול להדביק 2 סוגי תאים באותו בע"ח: תאי אפיתל (תופעה ליטית) ותאי B (תופעות לטנטיות שיכולות להתפתח לגידול סרטני) הגנים החשובים in vitro הם אלו שיכולים לשבש מע' תאיות ולא החלבון הנגיפי, אלא דרך אינטראקציה עם החלבונים התאיים. יש עדויות שבאנשים עם מע' אימונית ירודה (בעיקר לאחר השתלות) יש הופעה מוגברת של לימפומות מסוגי B והם גורמים לתופעות ממאירות. סיכום: החפיפה בין המלריה ל- EBV חפיפה זו מעידה על התפקיד של המע' האימונית בהתפתחות מחלת הנשיקה. כאשר ילדים חשופים למלריה יש התגייסות מאוד חזקה של המע' באימונית, והיא יכולה לעורר את תאי B שבתוכם יש כבר,EBV כתוצאה מכך הם מתרבים, ולכן ההצטברות של תאונות גנטיות גוברת. VIRUS 8 יחסית חדש (פחות מ- 10 שנים), קשור לסוג סרטן- sarcoma kaporsi המתבטא בד"כ בגפיים התחתונות, ומאופיין בנגעים מאוד דרמטים של מע' האנדותל במע' הוסקולרית. סרטן זה הוא נדיר, אבל עם הופעת האיידס התברר שהוא הנפוץ ביותר מבין חולי האיידס (15-30%). הגיעו למסקנה שהגורם הוא זיהומי, והם הסתמכו על העובדה שה- sarcoma kaporsi נפוץ בקרב חולי האיידס ההומוסקסואלים, יותר מאשר בחולים שנדבקו כתוצאה ממנות דם נגועות או תינוקות לאמהות חולות. מצאו 10
מבנה הגנום: פשוט יחסית, בעל רצף ייחודי גדול( U ) ורצפים חוזרים בקצוות. הגנים כ- 87 גנים פוטינציאלים, רובם שמורים והומולוגים לגנים בהרפסים אחרים, אם כי יש גנים ייחודיים שמצאו הומולגיה להם דווקא בגנים תאיים. גנים אלו קשורים למחזור התא, ול- transduction.signal הסברה היא שבמהלך האבולוציה נגיפים אלו לקחו חלק מהגנים התאיים במהלך ההדבקה. בנגיף זה ישנה אינפקציה ליטית ואינפקציה לטנטית גנים לטנטים 7 גנים כאלו: v cyclin D (הומולוגי לגן התאי - LANA1 כולם בעלי פרומוטור משותף. עדיין לא ידוע מה הקשר בין הנגיף הזה להופעת הסרקומה. cyclic D הקשור במחזור התא), 27.11.05 שיעור 9 נגיפי הפיפלומה נפוצים מאוד בטבע בכל בע"ח. ישנם זנים יחודיים לבע"ח שונים. אין התערבבויות של הזנים בין המינים השונים. נגיפים קטנים, פעם שייכו אותם לקבוצה קב' של הפוליומה, מבחינת המבנה שלהם, אך הם שונים מבחינת הגודל. בעלי מוקלות דנ"א וקפסיד ללא ממברנה. מבנה הגנום מולקולת דנ"א אחת פר ויריון, דו גדילי ישנו איזור מוקדם המתבטאים בשלב ההדבקה המוקדם, וגנים מאוחרים המקודדים לקפסיד של הנגיף (חלבונים מבניים) בין ביטוי גנים מוקדמים למאוחרים, ישנו שלב הרפליקציה (כמו בקב' הקודמות שדיברנו עליהם) מדביקים תאי אפיתל של תאי העור והמוקוזות הפנימיות. מבנה העור: תאי האפיתל של העור הם בעלי מס' שכבות, בשקף, מעל לקו השחור-האפידרמיס כלפי חוץ. ומתחת לבזלמינה-הדרמיס. בשכבה הפנימית של האפידרמיס יש תאים בזאליים שיודעים להתרבות באופן טבעי, וכלפי מעלה ישנם שלבים שונים של התמיינות של אותם התאים הבזאלים שמתרבים, ולכל עומק האפיתל, יש את אותו תא שעובר שלב התמיינות שונה, עד לשלב האחרון ששם ניתן למצוא את חלבון הקרטין. מחזור חיים של נגיף הפפילומה נגיפי הפפילומה יודעים להדביק תאים בזאליים באמצעות פצעים מיקרוסקופים על האפיתל, דרכם הנגיף חודר. הנגיף נכנס לתאים הבזאליים ועובר הבשלה יחד עם התמיינות התאים, כלומר הוא לא יוצר ויריונים בתא הבזאלי המודבק, אלא מתקדם יחד עם התא, ורק בשכבות העמוקות הוא יוצר את החלקיקים (הויריונים). 11
לאחר ההדבקה השכבה המודבקת עוברת היפרפוליפרציה, מתרבה הרבה יותר מבד"כ, ואז ישנם תאים רבים יותר שיכולים לעבור התמיינות, כך מקבלים "גבעה" והיא היבלת המוכרת. בתאים הבזאליים המודבקים ניתן לראות ביטוי של הגנים המוקדמים של הנגיף, התא מתחיל להתמיין, וניתן לראות ביטוי של גנים נוספים, וככל שהתא מתקדם בהתמיינותו נראה גנים נוספים מתבטאים. בתאים האחרונים יתבטאו הגנים של הקפסיד, התא מת והויריונים משתחררים החוצה, ויכולים להדביק תאים חדשים. כדי לבודד את החלקיקים, החדירו את הוירוס לחית בקר (פרה) המייצרת יבלות גדולות יחסית, כך שקל יותר לבודד את הנגיף. כשבודדו אותו, וייצרו אותו,in vitro היה מאוד קשה לגדל אותו, כי הם מתרבים בתאי אפיתל הקשים לגידול, מה עוד שהם צריכים להתמיין. לכן, בידדו את הדנ"א של הנגיף, ובדקו אילו תאים הוא יכול להדביק מלבד תאי אפיתל. ראו כי הנגיף שבודד מבקר יכול לגדול גם על תאי עכבר, ולגרום להתמרה. הסתכלו לתוך התא כדי לבדוק איך הדנ"א מסתדר, ומתברר שהוא לא מתנהג כמו ה- sv40 העובר אינטגרציה לגנום, אלא נשאר כאפיזום, ובכל זאת מצליח ליצור התמרה. כאשר חתכו את הדנ"א של תאים מודבקים ע"י אנזים שפותח את הגנום במקום אחד ראו שהדנ"א הלינארי נשאר בגודלו הרגיל, כלומר הדנ"א הנגיפי נשאר עצמאי ולא עבר אינטגרציה לגנום התאי. לאחר מכן גילו זנים רבים של פפילומה, צורות אנטומיות שונות של יבלות המוגדרות כמחלות שונות, והתברר כי פחות או יותר מאחורי כל צורה קלינית מסויימת עומד זן אחר. באדם לבד יש כ- 100 זנים. עשו היברידיזציות עם הדנ"א של הנגיף, וכשהיתה הומולוגיה של 50% בין זן חדש לזן מוכר, הנגיף קיבל את אותו מס'. בהומולוגיה פחותה מזו, הזן החדש קיבל מס' חדש. האנטומיה של המחלה נובעת כאמור מזנים שונים, HPV1 נמצא ביבלות של הרגל, HPV2 ביבלות שעל הידיים. אנו נתרכז בזנים שמדביקים את המוקוזה הפנימית של איברי המין, ויכולים לגרום להתפתחות סרטנית, סרטן צוואר הרחם בעיקר. את קב' הנגיפים ניתן לחלק ל- 2 קב' שהנציגים שלהם הם: HPV6 ו- HPV16 (חשוב לזכור) HPV6 גורמים ליבלות בידיים, בעלי סיכוי נמוך להתפתחות סרטנית (נגיפים בניגמים) HPV16 מעורבים בהתפתחות סרטנית - לא גורמים ליבלת, אלא מתחילים ליצור שינויים מורפולוגים בתא המודבק, ויכולים לגרום לסרטן (סרטן צוואר הרחם). מהו סרטן? ישנם תאים שעוברים פוליפרציה ומשם עוברים התמיינות. לעומת זאת בגידול סרטני, התאים שעוברים פוליפרציה, מספרם הולך וגדל, וכל פעם יש פחות ופחות תאים שעוברים התמיינות והולכים ומתרבים ללא הגבלה, ומכסים את כל שטח האפיתל. ככל שיש יותר שטח תפוס ע"י התאים הללו, השלב הסרטני מתקדם יותר. שלב 1: (CIN1) -כאשר יש קצת יותר תאים שמתרבים על חשבון תאים העוברים דיפרנציאציה. שלב 2: הרבה יותר תאים מתרבים (חלק מהתאים עוברים רגרסיה לתאים שיכולים להתמיין) שלב 3: התאים הממאירים תופסים את רוב שטח האפיתל. עד לשלב הסופי של הסרטן החודרני, כאשר התאים פורצים את המיקום האנטומי שלהם, ויכולים לגרום לגרורות. איך נגיף הפפילומה תורם לתהליך? בתא מודבק, יש ביטוי של אנטיגנים יחד עם התמיינות התאים. בסרטן צוואר הרחם, כשהנגיף הגורם לסרטן חודר, התא אינו מתמיין,אלא מתרבה והנגיף אינו עובר את כל שלבי מחזור החיים, ומבטא רק את האנטיגנים המוקדמים, ולכן אין יצירה של נגיף ואין יצירת נוגדנים ותגובה חיסונית. 12
בשלבים שונים של נגעים שנגרמו ע"י הפיפלומה ניתן למצוא ב- 50-82% מהמקרים את האנטיגן ע"י צביעה של הנוגדן של הקפסיד. כאשר מתקדמים בהתפתחות הסרטנית (כלומר רואים שוני בתאים)- אחוזי הנוגדן הולך ויורד. התברר שבסרטן צוואר הרחם יש דנ"א של נגיף הפפילומה. בטבלה המובאת בשקף, ניתן לראות שנגיף ה- HPV16 מצוי ב- 49% מהמקרים של סרטן צוואר הרחם, HPV18 ב- 14.8% מהמקרים, ו- HPVx ב- 22% מהמקרים. בכמעט 90% מהמקרים מסרטן צוואר הרחם ניתן למצוא HPV שונים. ארגון הגנום, ותכונות החלבונים של,HPV16 (תכונות המשותפות לכל הזנים הן בבני אדם והן בבע"ח) 7-8 גנים מוקדמים 2 חלבונים מאוחרים (של הקפסיד) איך ניתן לקשור את הנגיף להתפתחות סרטנית, מלבד הידיעה שהוא מצוי בגידולים סרטניים אלו? עדויות ממערכות בבע"ח, ואומנם הוכח שיש הרבה חיות שיכולות לקבל סרטן דרך הנגיפים הללו:,CRPV הנגיף שגורם לפיפלומה בארנבות, הנגיף הראשון שבודד, שזוהה והוכח כגורם לסרטן העור. BPV-4 -גורם לסרטן בבקר ובכבשים במע' העיכול העליונה: בלשון, בושת, בעיניים. -HPV-5 הגוף מכוסה ביבלות שאינן מסוכנת, אבל באחוז לא מבוטל בחולים (שליש) יכולים להתפתח סרטנים על פני העור, ועל הלזיות האלו ניתן לראות נגיף מסויים של פפילומה. HPV16 נגיף הגורם לסרטן הרחם בבני אדם. כבר בשלבים הראשונים ביותר,(CIN1) ניתן לראות את הדנ"א של הנגיף, עובדה ששוללת את התיאוריה שהנגיף מדביק יותר בקלות תאים מותמרים. ובנוסף, כשלוקחים ביופסיות של סרטן צוואר הרחם, ומנסים לגדל את התאים בתרבית,in vitro ניתן לגדל אותם, ולמצוא בהם את הדנ"א של נגיף הפפילומה, כלומר יש לתאים נושאי הדנ"א של הנגיף יש יתרון בהתרבות במעבדה. ביבלות הרגילות, הדנ"א כאמור נשאר אפיזומלי, ובכל זאת in vitro יכול לגרום להתמרה, ו- vivo in יכול לגרום להיפרפוליפרציה-להתרבות (לא מאבדים את כושר התמיינותם). אולם בגידולים סרטניים, ניתן לראות שבשלבים 1 ו- 2, הדנ"א נשאר אפיזומלי, וככל שמתקדמים יותר ומגיעים לסרטן חודרני, הדנ"א עובר אינטגרציה עם הגנום. בויריון הדנ"א מעגלי, וכשהוא חודר לתאים הוא עובר פתיחה. איזור ה- LCR הוא איזור הבקרה. הדנ"א עובר אינטגרציה לדנ"א התאי. בשקף, בשחור-הדנ"א הויראלי, בלבן (בקצוות)-הדנ"א התאי. האינטגרציה של הדנ"א נעשית תמיד באיזור של הגן המקודד לחלבון E2. בדנ"א התאי, אין מיקום מסויים הנועד לאינטגרציה, והיא יכולה להתרחש בכל מקום. מהו הגן E2? הרצף הזה יכול לקודד ל- 3 חלבונים שונים: לחלבון המלא E2 חלבון רגולטורי, אקטיבטור המפעיל את הטרנסקריפציה של גנים מוקדמים אחרים (E6 ו- E7 ). E2tr - צורה קצרה יותר (ע"י -(splicing מתפקדת כרפרסור של הגנים המוקדמים האחרים בעיקר של E6 ו- E7. E8/E2 - צורה עוד יותר קצרה שלא ברורה תפקידה. החלבון E2 מווסת ביטוי של גנים מוקדמים, בעיקר של E6 ו- E7. בזמן האינטגרציה החלבון E2 משובש, ולכן הרגולציה על E6 ו- 7 משובשת לחלוטין, ובמקום לקבל איזון בין החלבונים הללו, נקבל ביטוי שהוא תחת בקרה של גנים תאיים אחרים (כי הגן הויראלי הוא בתוך הגנום התאי) או שהיא אינה תחת רגולציה, והחלבונים הללו מתבטאים כל הזמן. 13
באינטגרציה, יתכן כי חלק מהגנום הנגיפי הולך לאיבוד, ובכל ביופסיה שבודקים חלקים שונים הולכים לאיבוד, אך בכולם מוצאים את חלבוני E6 ו- E7. אם כן, המאפיין את כל הגידולים הסרטניים הוא נוכחות של שני רצפים E6 ו- E7 הרצפים הללו מסוגלים להדביק את הקרתינוציטים-התאים הבזאלים הראשונים שיכולים להתרבות,in vivo ולגרום להתרבות בלתי מוגבלת של התאים (אימורטליזציה).in vitro,in vivo הסתכלו על חלבונים תאיים, כדי לבדוק האם החלבונים הויראלים יכולים לעבור אינטראקציה המפעילה חלבונים תאיים. במהלך חקירתם הם הגיעו ל גנים תאיים הנקראים: tumer supressor genes או anti tumer gene שאחד מהם הוא p53 המעורב במחזור התא. גנים אלו יכולים למנוע התרבות יתר של תאים. עשו טרנסלציה לגן,in vitro E6 והדגרה עם תאים של יונקים ורצו לבדוק אם יש אינטראקציה עם גן תאי. עשו אימונופרטיסיפציה עם נוגדן כנגד p53 במטרה לבדוק את החלבון הנקשר ל- p53, אם קיים חלבון כזה, ומצאו חלבון המתאים בגודל ל- E6. עשו גם את הניסוי ההפוך בו השקיעו E6 מסומן, ובדקו האם הנוגדנים של P53 נקשרים אליו, ואכן היה קישור. המסקנה היתה כי חלבון E6 יכול ליצור קומפלקס עם החלבון התאי.p53 כשבדקו האם הקומפלקס נוצר רק בקב' הנגיפים הממאירים( HPV16 ) או גם הנגיפים הלא ממאירים (6 hpv ו- 11 ), ראו כי החלבון E6 משקיע p53 רק בקב' הנגיפים הממאירים. עוד התברר כי הן E6 והן E7 כל אחד לחוד מסוגלים לעשות את האינטרקציה הזו, אך ביחד הם עושים עבודה טובה יותר. E7 חלבון היודע לקשור את החלבון התאי רטינו בלסטומה- RB המעורב גם (כמו P53) במחזור התא (נקרא על שום הסרטן שבו הוא התגלה). כשעשו ניסיונות דומים לאלו שעשו עם E6, ראו להפתעתם כי E7 יוצר קומפלקס עם הרטינו בלסטומה גם בנגיפים לא ממאירים. כאשר הם גרמו ליצירת תחרות בין 2 הזנים, לקחו חלבון E7 מזן ממאיר לעומת חלבון E7 של זן לא ממאיר ליצירת קומפלקס עם רטינו בלסטומה, ראו שככל שעולים בריכוזים, החלבון ה- E7 של הזן הממאיר עדיף על פני חלבון E7 בזן הלא ממאיר, דבר המתבטא באפיניות גבוהה יותר של החלבון E7 מהזן הממאיר. העובדה שהחלבונים התאיים הללו הקשורים במחזור התא יוצרי קומפלקס עם החלבונים הויראלים תימנע מהם מלתפקד באופן נורמלי. חלבון E6 הוא חלבון קטן (151 ח' אמינו), בעל 2 איזורים פונקציונלים הנקראים zinc finger (מולק' של zinc מוקפת ב- 4 מולק' של ציסטאין), ובד"כ אזורים אלו יוצרים קופלקס בין עם חלבונים אחרים. E7 גם בעל מבנה zinc finger היכול לקשור חלבונים שונים. ההשערה היא שהחלבונים אלו יכולים לנטרל את התפקיד הנורמלי של החלבונים התאייים p53 ו- prb. איך ניתן לבדוק את ההשערה הזאת? ב- 95% מהמקרים של סרטן הרחם ניתן למצוא נגיפי פפילומה, וניתן לחפש את האינטראקציה בין החלבונים הנגיפיים לתאיים, כי השיבוש הוא ברמת החלבון- הרצף של הגנים התאיים הוא תקין לגמרי. ב- 1% מהמקרים הסרטניים לא נמצאו רצפים של נגיפי פפילומה, וכשהסתכלו על הרצף הגנומי של החלבונים p53 ו- prb, (חלבונים שפעילותם משובשת במקרה של סרטן צוואר הרחם הנגרם ע"י הנגיף) ראו כי הגנים שלהם פגועים- מוטציות ב- spots : hot ב- CGT ובמקרה אחר מוטציה ב- GGC (ראה שקף). בגידולים סרטניים המודבקים בפפילומה לא מצאו שום שינוי בגנים לחלבונים p53 ו- prb, מה שמחזק את התיאוריה שהחלבונים הנגיפיים מנטרלים את פעילתם של חלבונים אלו. 14
חלבוני הנגיף E1- חלבון האחראי לרפליקציה של הדנ"א (מקביל ל- EBNA1 בהרפס) E2 חלבון רגולטורי שעובד על הטרנסקריפציה של הגנים האחרים בעיקר E6 ו- 7. E4 מתבטא בשלב מתקדם יותר של דיפרנציאציה של התאים המודבקים, ויכול לקשור ציטוקרטינים, חלבונים שנוצרים בתאים המתמיינים. E5 יכול להשפיע על רצפטורים של growth factor ולכן יכול להיות מעורב בהתרבות יתר של התא. E6-7- החלבונים הטרספורמטיבים של הוירוסים ההומנים. L1 L2 החלבונים המאוחרים המרכיבים את הקפסיד. ניתן לראות שבין החלבון E7 לחלבון large T ב- SV40 ולחלבון E1A של האדנווירוס ישנה הומולוגיה, שמקורה כנראה בתפקידים דומים לכולם יש יכולת לקשור חלבונים תאיים החשובים למחזור התא. כל הנגיפים הללו הם נגיפי דנ"א גורמי סרטן. P53 החלבון הנ"ל מתבטא באופן בזאלי. רק כשיש בעיה בדנ"א אז יש ביטוי חזק יותר שלו, והוא מפעיל עוד חלבון inhibitor) (CDK העושה אינהיביציה של מחזור התא בשלב ה- G1, ואז התא מפסיק להתרבות, והוא יכול להפעיל את מערכות ה- repair DNA או לעבור אפופטוזיס. כשחודר נגיף, החלבון E6 קושר את ה- p53,אין אינדוקציה של האינהיביטור ל- CDK (WAF1) והתא ממשיך להתרבות עם הדנ"א הלא תקין, מה שמגדיל את הסיכוי לבעיה גנטית. רטינו בלסטומה- RB מסלול נוסף שמשתבש באותו תא עקב חדירת הנגיף: פקטור השעתוק התאי-, E2f1 כשהוא קשור לרטינו בלסטומה הוא מעוכב ואין שיעתוק של הגנים האחראים למעבר בין G1 ל- S. כשרטינו בלסוטמה מזורחן הוא משתחרר מה- E2, והשיעתוק יוצא לפועל. E7 הנגיפי קושר את הרטינו בלסטומה, ה- E2 התאי חופשי והוא יכול לגרום לשיעתוק ללא רגולציה, כך שהתא מתחלק כל הזמן. לסיכום: ממאירות בבן אדם תתרחש רק כאשר תהיה אינטגרציה למרות ש- vitro in יכולה להיות התמרה גם כשהגן בצורת אפיזום. האינטגרציה משבשת תמיד את הגן הויראלי E2, המהווה רגולטור מרכזי בביטוי שלי E6 ו-ו- E7. לחלבון E6 יש עוד כמה תפקודים שהתגלו בשנים האחרונות, כאשר אחד מהם הוא יכולת אקטיבציה של טלומרז, ודרך זה להאריך את יכולת התאים להתרבות. איפיון הקב' הממאירות (לא בניגניות) לעומת הלא ממאירות (בניגמיות): בתאים הלא ממאירים הנגיף הבניגמי יכול לדחוף להיפרפוליפרציה, אך התאים ממשיכים להתמיין והדנ"א נשאר אפיזומלי (גם,(in vivo ויש יצירה של חלקיקים וירונים. בתאים הממאירים הנגיף ה- risk high דוחף להיפרפוליפרציה והתאים מאבדים מכושר ההתמיינות שלהם. הדנ"א עובר אינטגרציה, ואין יצירה של ויריונים. מצד אחד הם גורמים להתפתחות סרטנית, אך מצד שני הם מגבילים את עצמם, שכן הם לא מתרבים ולא יהיו יותר וירוסים שיוכלו לעשות את ההתמרה. 15
In vitro In vivo בניגמי ) HPV6 ( מליגמי HPV16) ( בניגמי ) HPV6 ( מליגמי (HPV16) E6 ו- E7 של HPV6 E6 ו- E7 ב- HPV16 באותה אוכ' נשים לא מוצאים כמעט בנשים אסימפטומטיות (כלומר במערכת לא יכולים לדחוף לאימורטליזציה בקרתנוציטים דוחפים לאימורטליזציה של קרתנוציטים באף אחת רצפים של.HPV6 וזאת מהסיבה שנגיף ה- HPV6 גורם להדבקה אקוטית, ולא לטנטית, נקיה), ניתן למצוא בכ- 10% מהנשים בזמן נתון נוכחות של דנ"א של נגיף latent (18 מדובר ב-,16) high risk וברגע שהוא מדביק, מתפתחים סימפטומים (יבלות ברגליים, ידיים וכו').,infection כלומר ישנה הידבקות ראשונית ללא סימפטומים ולפעמים יש התקדמות ל- cin1 והלאה לשלבים הבאים. ברוב המקרים לא מתפתחת התמרה כתוצאה מההדבקה. אין התמרה הוספת אונקוגנים או אין אינטגרציה, הדנ"א אפיזומלי יש אינטגרציה לגנום קרציגנים תביא להתמרה מלאה אינם חוסמים דיפרנציאציה E6,7 לא יכולים ליצור חלבוני E6 ו- E7 חוסמים את הדיפרנציאציה E6,7 יוצרים קומפלקסים יש דיפרנציאציה יצירת חלקיקים אין דיפרנציאציה אין יצירת חלקיקים קומפלקסים, או שהם יוצרים באפיניות נמוכה עם חלבונים תאיים חיסון כנגד נגיף הפפילומה היתה בעיה גדולה ביצירת חיסון כנגד נגיף הפפילומה שמפתח סרטן צוואר הרחם בגלל יכולתו להתמיר. (כתוצאה מיכולת ההתמרה של נגיפים אלו הזרקת הנוגדנים כנגדם היוותה בעיה לאור העובדה שלא ניתן לצפות את אופן התנהגותם) לכן, במקום להזריק נגיפי פפילומה מומתים ניתן להזריק חלקיקים דמויי וירוס-חלקיקים ריקים ללא הדנ"א. חשוב להחדיר את מבנה הנגיף כולו ולא רק את החלבונים שלו, כלומר להחדיראת כל הקפסיד, כי החלבון לבד אינו אימוגני ולא מעורר יצירת נוגדנים. יתרונות: בלעדי הדנ"א הנגיף לא יהיה מתמיר. הקפסיד גורם לתגובה אימונית חזקה. ספציפיות הקפסיד ספציפי, ומעורר תגובה חיסונית ספציפית, כך ניתן לבחור מה להזריק (החסרון, שרק מה שהזרקנו יהיה אפקטיבי, ואם ישנם זנים נוספים שמעורבים בהתפתחות סרטנית שלא נלקחו בחשבון, או שלא ידעו עליהם, החיסון הזה לא יהיה יעיל כנגדם ). כך איפא יצרו חלקיקים דמויי נגיף בעיקר נגיף ה- HPV16. כשמסתכלים עליהם לא ניתן להבחין אם הם רקים או לא (ראה שקף). נעשו הרבה ניסיונות in vivo של אותם חיסונים עם כל השלבים האפשריים. בזה שפורסם לאחרונה בתקשורת, לקחו 12,000 נשים ולמחציתן הזריקו פלאסיבו, ולמחצית השניה הזריקו את דמויי הנגיף- תערובת של.HPV16,18,6,11 עורכים follow up במשך שנתיים. Follow up הוא פתולוגיה- מסתכלים על התאים, על גבי משטח גניטלי לראות אם יש שינוי בתאים "פפ שניר" (הבדיקה הרגילה בפתלוגיה הבודקת אם אין תאים סרטניים בצוואר הרחם). בדקו אם יש נוכחות של רצפי דנ"א ונוכחות של נוגדנים. התוצאות הראו שמבין 6000 הנשים שקיבלו את החיסון 100% הראו reduction כלומר, לא היה אף מקרה המעיד על התפתחות סרטנית, לעומת 5% מ- 6000 הנשים שלא קיבלו את החיסון שכן הראו סימנים כאלו. 16
30.11.05 שיעור 10 אדנווירוסים נגיפים הקשורים לגידולים אבל במערכות ניסיוניות בלבד-כלומר בהזרקה שלהם לחיות מסויימות או לתרבית תאים ניתן לגרום להופעת גידולים סרטניים, אך בטבע לא ידועה פעילות ממאירה שלהם. הנגיף בגודל ביניים (36kb) בודד לראשונה ב- 1953 מאדנואידים בילדים (גידולים שפירים באף), והוא גורם לדלקות במע' הנשימה, הצטננויות. ישנם זנים נוספים, והוא מצוי לא רק בבני אדם. מצוי בכל בעלי החוליות. באדם יש כ- 47 זנים שונים. בעלי צורה גיאומטרית אופיינית תופעות קליניות:פריניגטיס פניאומוניהה, דלקות עיניים-קוניוקטיביטיס ועוד תופעות יותר חמורות, דלקת קרום המוח (נדיר מאוד) החלוקה של הזנים השונים בבני אדם נעשית ע"י רצף הגנום מעל ל 50% הומולוגיה-אותו זן, פחות זן אחר. חלקו את הזנים השונים לקב' עפ"י הפוטנציאל האונקוגני של אותו זן, מזריקים את הוירוסים הללו בבע"ח בוגרים ובודקים אם הם מסוגלים לגרום לגידולים: A פוטנציאל אונקוגני גבוה. B- פוטנציאל חלש.in vitro אך יש,in vivo אין פוטנציאל -C בהגדלה יותר גדולה ניתן לראות את הצורה הגיאומטרית של הנגיף icsohedral- ואת הפייבר- גליקופרוטאין שדרכו נעשית הספיחה, ותחילת ההדבקה של התא. אין להם מעטפת הקפסיד מורכב מ- 252 יח' קפסומריות. 240 הקסונים 12 פנטומים מולקולת דנ"א דו סיבית לינארית ניתן למצוא לפחות 10 חלבונים מבניים בתוך החלקיק. רוב הקפסיד מורכב מהיח' המסומנות באדום בהקף והן נקראות: הקסון. שלושה מהם חלבונים זהים (חלבון מס' (2 + 3 חלבונים שונים:.9,8,6 בבסיס הגליקופרוטאין יש הרכב של חלבון שנקרא פנטון המורכב מ- 5 חלקים של חלבון 3. הפנטון יכול להיות טוקסי לתאים. כשמזריקים אותו לבד לתא, יש לו אפקט ציטפטי (גורם להרס של התא). בתוך ה- core מצויה מולק' הדנ"א, ובנוסף ישנם 4 חלבונים: שניים טרמינלפרוטאינים (TP) חלבון 5,, 7 וMU (לא ברור תפקידו של ה- MU ). חלבון 5 ו- 7 קשורים לדנ"א בצורה לא קוולנטית, הם מזכירים במבנה את ההיסטונים שמסביב לדנ"א. וחלבון ה- TP קשור בצורה קוולנטית לקצוות של מולק' הדנ"א (מסומן בורוד בשקף)-בכל קצה יש TP אחד. החלבונים: הקסון-מרכיב הקפסיד פנטון-גם מבני וגם משתתף בספיחה של הנגיף לתא הפייבר-גליקופרוטאין, נספח ישירות לתוך התא 17
בתוך ה- core : חלבון שנקשר בצורה לא קוולנטית לדנ"א ומשמש כהיסטון, -TP לרפליקציית הדנ"א של הויריון. שאר החלבונים-ראה שקף. משמש כפריימר וירוס בגודל סביר עם דנ"א בגודל של 30-38 אלף בסיסים שיכול לקודד ל- 30 עד 40 גנים. בקצוות של סיב הדנ"א ישנם רצפים חוזרים, כאשר מ-' 5 ל-' 3 ישנם Inverted repeat רצפים הפוכים (קומפלמנטרי לרצף בקצה השני) בקצוות מצויים חלבוני ה- TP. איך אפשר להיות בטוחים שהרצפים הם קומפלמנטרים? ואיך ניתן לדעת שיש חלבון בקצוות? לגבי השאלה הראשונה, מפרידים בין הסיבים וניתן לראות שאפשר לעשות היברידיזציה. לגבי השאלה השניה, המולקולה יכולה להיסגר על עצמה הודות לחלבון, ואם נפעיל פרוטאזות שחותכות את החלבון, המולקולה לא תוכל להיסגר על עצמה, ונקסל סיבים פתוחים. Inverted repeats רצפים חוזרים של כ- 100 בסיסים המשמשים לנק' התחלת הרפליקציה. הרפליקציה תהיה מהקצוות של שני הסיבים. הספיחה והחדירה נעשים בצורה מאוד מהירה תוך פחות משעתיים הדנ"א נמצא כבר בתוך הגרעין, אז מתחיל השעתוק המוקדם, הרפליקציה, השעתוק המאוחר. לאחר שעתוק החלבונים המאוחרים ו- virus in vitro התא עובר ליזיס. כלומר ההדבקה גורמת להרס של תאים אולם עיתים מאוד נדירות,,assembly ישנם מקרים של התמרה סרטנית. הספיחה הראשונית נעשית כאמור דרך הגליקופרוטאין הנקשר לרצפטור תאי-מולק' של,MHC1 ואח"כ הפנטון שבבסיס הגליקופרוטאין נקשר לרצפטור ממשפ' האינטגרינים (חלבונים טראנס ממברנלים) ונכנס פנימה. בציטופלסמה הנגיף עובר פגוציטוזיס לתוך וסיקולה, עד אשר הוא מגיע לגרעין-הפנטון מפרק את הממברנה של הוסיקולה, והויריון משתחרר ונכנס לתוך הגרעין. מתחילה מע' השעתוק. הגן הראשון שמשועתק הוא גן E1A ע"י רנ"א פולימראז תאי, כל הגנים משועתקים ע"י פולימראז תאי. לאחר מכן חל שיעתוק של כל הגנים המוקדמים, ולאחר הרפליקציה של הדנ"א משועתקים החלבונים המבניים של הקפסיד. הדנ"א הוא לינארי גם בתוך התא. כל גן משעתק כמה RNAs (תופעה של.(Splicing הגנים המוקדמים יכולים להיות משועתקים לאורך כל הגנום, מ- 2 הסיבים. הגנים המאוחרים משעותקים רק מסיב אחד. הגנים המאוחרים מחולקים ל- 5 קב', ובכל קב' יש כמה תוצרי splicing מה-' 5. ה-' 3 משותף לכולם. ישנם 4 קב' של חלבונים מוקדמים: Early 1,E1A o משמש כפקטור טרנספיקציה לכל הגנים המוקדמים האחרים. הוא לא נקשר לדנ"א, ולא ברור איך הוא מזרז את השעתוק. הוא יכול לזרז שיעתוק גנים של וירוסים אחרים, ואף גנים תאיים. -E1B o יוצר לפחות 4 טרנסקריפטים שונים, בינהם חלבון K21 הנמצא בממברנה הנוקלארית ו- K55 הנמצא בקומפלקס או עם E4-34K (חלבון ויראלי)- קומפלקס שנראה במע' הליטית או עם P53 (חלבון תאי) קומפלקס שנראה במחזור ההתמרה. לקומפלקס עם החלבון הויראלי יש תפקיד במעבר של ה- mrna הויראלי מהגרעין לציטופלסמה. Early2 מקודדים לחלבונים שקשורים לרפליקציה של הדנ"א הנגיפי. E2A o מקודד לחלבון קושר דנ"א חד סיבי, הכרחי להתחלת הרפליקציה E2B o מקודד ל- TP שקושר את הקצה '5 של כל סיב 18
o תוצר splicing של ה- E2B חלבון גדול שהוא הדנ"א פולימראז האחראי לריפליקציה של הדנ"א הויראלי. Early3 יש להם splicing 6 שונים שלא ברור מה תפקידם. 19K -חלבון o ויראלי קטן שיכול להפריע בגלוקיזילציה הנכונה של תאים שונים. משתתף בשיבוש התהליך המטבולי הנורמלי של התא. Early4 11k o שמור בין הרבה וירוסים, לא ידוע מה תפקידו E4 o יודע לקשור את החלבון K55 שנקשר ל- E1B המהווה כאמור קומפלקס בגרעין. 7 o חלבונים שתפקידם לא ידועים הרפליקציה של הדנ"א בקצה כל סיב של דנ"א קשור חלבון הטרמינל פרוטואין.(TP) הטרמינל הפרוטאין החדש שנוצר בתוך הגרעין נקשר לציטוזין טרי פוספט,(DCTP) וביחד הם משמשים כפריימר לרפליקציה, ומסונתז דנ"א חדש מ-' 5 ל-' 3 מסיב אחד. לאחר מכן יקשר חלבון TP נוסף לסיב השני, ישמש כפריימר ותהיה סינתזה של דנ"א נוסף. החלבון המקודד מ- E2A ss-dna binding protein נקשר לדנ"א חד סיבי ושומר עליו מדגרדציה. סה"כ נדרשים 3 חלבונים נגיפיים המקודדים ע"י (ss-dna binding protein) E2A ו- E2B ( TP +דנ"א פול') לרפליקציה דרושים גם פקטורים תאיים: נוקלאור-פקטור 1, 2 ו- 3 : NF1 -הכרחי להתחלת הרפליקציה, עוזר למקד את הקומפלקס של ה- TP והפולימראז למקום הנכון (לרצף החוזר בקצה הדנ"א). NF2 -טופאיזומראז עוזר בפתיחה של 2 הסיבים ע"מ שתהיה גישה לסיב יחיד. NF3 בלעדיו הרפליקציה לא יוצאת לפועל. הדנ"א החדש שנוצר ישמש כמקור לשעתוק ותרגום של החלבונים המאוחרים, כלומר החלבונים המאוחרים משועתקים רק ממולק' הדנ"א החדשות. חלק מהחלבונים המאוחרים הם מבניים וחלקם לא ניתנים לאבחנה בויריון הבשל וככל הנראה יש להם תפקיד שונה. החלבונים-הקסונים ופנטונים שמרכיבים את הקפסיד בצורה מונומרית נמצאים בציטופלסמה, נוצרים שם, וחלקם חוזרים לגרעין ומצטברים שם. הויריונים שמצטברים בגרעין נקראים:.inclusion bodies לקב' נגיפים אלו (אדנווירוסים) יש מס' סוגי אינטראקציות עם התא: המסלול הליטי המסלול השכיח ביותר בתאים פרמיסיבים (תאים הומנים) אינפקציה אבורטית- חדירה של הנגיף לתוך התא, אך הם לא מתרבים שם, לא קורה שום דבר לתא (תאי קוף). אינפקציה סמיפרמיסיבית התאים לא לגמרי פרמיסיבים, אין להם את כל מה שדרוש להתרבות הוירוס (תאי חולדות) טרנספורמציה מליגנטית אירוע נדיר, הגנום של הוירוס עובר אינטגרציה לא ספציפית עם הגנום התאי. תאים אלו שעוברים התמרה בתרבית חייבים להיות בעלי 2 גנים: E1A ו- E1B (תאי מכרסמים ובבני אדם) reduction Tumer מערכת אלימה יותר - יצירת גידול בבע"ח ע"י אינטגרציה של הדנ"א latency Viral כאשר יש הצטברות ויראלית בתאים לאורך זמן, קיים בשקדים בבני אדם. שני החלבונים החשובים במע' ההתמרה: E1A ו- E2B. E1A מסוגל לגרום לאימורטליזציה של תאים (התרבות יתר). 19
חלק אחר של E1A וחלק של E1B מספיקים כדי לקבל התמרה מלאה (כלומר גורמים גידולים לבע"ח שהוזרקו להם הנגיפים) E1B לבדו לא יכול לגרום להתמרה, והחלק המסומן בכחול בשקף אינו דרוש להתמרה. התברר שהחלבונים הללו יכולים להשקיע, ליצור קומפלקסים עם חלבונים תאיים שרובם ממשפ' הרטינו- בלסטומה (Rb) E1B. יכול לקשור את החלבון p53. לחלבונים המתמירים בנגיפי דנ"א יש לוקליזציה דומה, פונקציה דומה ורצף זהה כך שמגיעים לסכמה דומה של חלבונים שגורמים להתמרה. 4.12.05 שיעור 11 E1A הגן המוקדם הראשון (לא היחיד) שיכול לעבור שיעתוק ע"י רנ"א פולימראז תאי. נגיפים אלו לא מקודדים לרנ"א פולימראז. כל השיעתוק נעשה ע"י רנ"א פולימראז תאי נגיפי רטרו החומר הגנטי שלהם הוא רנ"א (+). קב' ייחודית הודות לנוכחות ופונקציה של אנזים מיוחד רוורס טרנסקריפטאז המעביר רנ"א לדנ"א. בתוך הקב' הזו ישנם וירוסים רבים הגורמים להתמרה (לא כולם גורמים להתמרה). הם מתחילים מסיב אחד של רנ"א, וממנו מגיעים לסליל דו כפול של דנ"א, ומשם ל- mrna. ה- mrna משמש גם סיב לתרגום חלבונים, וגם כגנום שיארז בתוך הויריון. כמו כל הוירוסים, גם לרטרו יש אינטראקציה עם התא המודבק. ברוב המקרים אנו מדברים על,RNA TUMER VIRUSES ישנם גם בעלי.RNA lytic virus הדנ"א עובר אינטגרציה - כלי לריפוי גני. האנזים רוורס טרנסקריפטאז משמש במחקרים ביולוגים. סוגי אינטראקציות אפשריים: הדבקה לא פתוגנית- הוירוסים לא הורסים את התא, אלא חודרים לגנום ומהווים חלק ממנו. וירוסים אלו נקראים: וירוסים אנדוגנים. הדבקה פתוגנית כשהנגיף מתרבה ויש ביכולתו להרוס תאים במחזור ליטי, וישנה הדבקה פתוגנית. הדבקה אונקוגנית הדנ"א הגנומי גורם להתמרה של התא בבע"ח. אינפקציה פטאלית ישנה אינפקציה של התא, אך בצורה יותר דרמטית היכולה להביא למוות של הבע"ח (כגון (HIV בשקף מובאים תמונות של וירוסים בכל מיני מצבים, בעלי צורות שונות וגודל שונה. ניתן לחלק את הוירוסים הללו ל- 2 קב': וירוסים ציטופטים-.HIV2,HIV1 וירוסים מתמירים RSV (הראשון שהתגלה ב- 1917 ), מדביק עופות, MMTV בבלוטות החלב, T. ללוקימיה של תאי הגורם שיך לקב' ה- HIV HTLV מבנה הקפסיד: דיי דומה בכל הוירוסים הללו. קוטר: 100 ננומטר בעלי ממברנה, ומלבד הליפידים ישנם 2 חלבונים בולטים: 20
טראנס ממברנלי (בתכלת) 1. יוצא מחוץ לממברנה והוא הרצפטור. 2. בתוך ההמברנה ישנו קפסיד המורכב ממס' חלבונים הנקראים חלבוני ה- gag שמשתנים בין הקב' השונות, ובתוכו מצויים 2 עותקים של רנ"א חד סיבי-הדוגמא היחידה לוירוס דיפלואידי. בתוך הויריון ישנם 3 אנזימים: 2 עותקים של רוורס טרנסקריפטאז. אינטגראז יש לו תפקיד באינטגרציה פרוטאז ארגון של מולק' רנ"א: בקצה יש את ה- 5 CAP,ובשתי הקצוות ישנם רצפים חוזרים- R, רצפי (U5 unic בקצה '5 ו- U3 קבצה ה- '3). רצפים אלו לא יעברו שיעתוק, אלו רצפים רגולטורים. בין הרצפים הללו יש את סיב הרנ"א. בתוך הסיב בקצה ה-' 5 ישנו רצף הנקרא site: (PBS) primer binding אתר קישור לפריימר, ובקצה ה- '3 פריימר ישנו רצף פוליפורין PPT (עשיר בפורינים). ממולק' זו נקבל מולק' דו סיבית של דנ"א, כאשר הרצפים בקצוות השתנו כך ששתי הקצוות כוללים את ה- וה- U5. U3 ארגון הגנום מאוד שמור, וישנם 3 גנים עיקריים המקודדים לחלבונים, והם מצויים תמיד באותו סדר מבחינה פיסית: Gag, pol ו- env. Gag הגנים של הקפסיד. הגנים של הפולימראז- RT Pol Env הגנים של המעטפת השלבים באינפקציה: ספיחה וחדירה של הויריון רוורס טרנסקריפציה של הרנ"א החד סיבי לדנ"א דו סיבי אינטגרציה של הדנ"א הדו סיבי הנגיפי לדנ"א התאי. שיעתוק, תרגום, הכפלה עטיפה של הגנומים החדשים בתוך הנגיף החדש Bodding פריצת הממברנה ויציאה החוצה. היכן מתרחשת הטרנסקריפציה? ישנו איחוי של 2 הממברנות. הקפסיד עם 2 מולקולות הרנ"א נכנס לתוך הציטופלסמה ע"י אנדוציטוזיס, ובתוך הקפסיד בציטופלסמה מתרחש המעבר מרנ"א לדנ"א. ה- dsdna יעבור לתוך הגרעין, ושם יתחיל המחזור של שיעתוק ותרגום. ה- mrna שנוצר מהדנ"א ישמש גם כ- mrna לשיעתוק וגם כגנום של הויריון שיתעטף בקפסיד. לבסוף יהיה assembling של חלבוני הקפסיד, התעטפות של הנגיף, ויציאה החוצה. הרפליקציה מולק' של רנ"א בתוך הויריון: PBS 18 נוקלאוטידים ספציפים לכל נגיף, וישנו trna נגיפי ספציפי (שמקורו מהתא הקודם שהוא הדביק) שעובר היברידיזציה ל- PBS המשמש כפריימר בצורה מושלמת. הסינתזה מתחילה מ-' 5 ל-' 3. האיזור U5 וה- R של הקצה ה-' 5 של הוירוס משועתקים ראשונים. לרוורס טרנסקריפטאז (RT) יש גם תפקיד של רנ"אז- h שמקצץ רנ"א בהיבריד דנ"א-רנ"א, והוא מקצץ את הרנ"א שעבר היברידיזציה, כך שנוצר דנ"א חד סיבי בחלק של ה- PBS. חלק זה קופץ לקצה של '3, ועובר היברידיזציה עם ה- R של ה-' 3, ומשם הוא ממשיך לסנתז דנ"א חדש על ה- U3 עד ה- PBS. ה- RT מקצץ שוב את הרנ"א שעובר היברידיזציה, כך שמתקבל דנ"א חד סיבי, חוץ מהחלק של ה- PPT poly porin ) (tract הנשאר קשור לרצף של הדנ"א ומוגן מפני החיתוך. הוא ישמש כפריימר לרפליקציה של הדנ"א השני. 21
הסיב השני משועתק לפי הטמפליט: U5,,R, U3 ו- PBS. בשלב הבא ה- PBS שסונתז יסגר על ה- PBS של סיב הטמפלייט (בצורה מעגלית) וימשיך בשעתוק עד שהוא מגיע ל- U3, ידחוף את הסיב שסונתז כבר וימשיך עד לקצה ויסנתז את ה- U5 ו- R. בסוף מתקבל דנ"א בעל 2 קצוות שיש לכל אחד מהם R,U3 ו- U5. 3 הגנים env,pol,gag יכולים ליצור חלבונים שונים ע"י splicing שונה. כך, מהגן pol מתקבל גם פולימראז וגם אינטגראז האחראי לאינטגרציית הדנ"א הויראלי לתוך הגנום התאי. האינטגרציה הדנ"א הדו סיבי יעבור אנטגרציה בתוך הדנ"א הגנומי במקום אקראי לחלוטין, ובד"כ איזור שבין 4 ל- 6 בסיסים של הדנ"א הגנומי יעבור דופליקציה. כלומר לאחר האינטגרציה הרצף הזה יופיע פעמיים משני צידיו של הגנום הוירלי. בנוסף, 2 בסיסים בקצוות של הגנום הויראלי העובר אינטגרציה הולכים לאיבוד כתוצאה מחיתוך ב-' 3 בכל סיב, ואלו יהיו תמיד AC ו- TG. ע"י האנזים אינטגראז הקצה ה-' 3 חסר הבסיסים יעבור קומלפמנטציה עם בסיסים מהגנום התאי. נוצר Gap אשר יסגר. הדנ"א הויראלי יתנהג כעת מצד אחד כמו דנ"א תאי, ומצד שני כדנ"א עצמאי הודות ל- LTR בקצותיו. הוא יכול ליצור,mRNA אשר מצד אחד עובר תרגום בריבוזומים לחלבונים, ומצד שני משמש כמולקולת רנ"א לויריון החדש. בכל ויריון יכנסו 2 עותקים של רנ"א. החלבונים לרוב מתורגמים כפרוקורסורים והם עוברים עיבוד רק כשהם בתוך הקפסיד. העיבוד הסופי נעשה ע"י הפרוטאז (תוצר של splicing של הגן.(Gag לעיבוד זה יש חשיבות מכריעה כיוון שמדובר בחלבוני קפסיד, ואת חלבוני המעטפת שהם הרצפטורים להדבקה. חלבוני הממברנה, מגיעים לממברנת התא, והקפסיד יוצא ע"י Bodding תוך שהוא לוקח חלק ממברנת התא עימו. נגיפי הרטרו הטרנספורמים: tumors - long latency ההתמרה יכולה לבוא לידי ביטוי לאחר שנים רבות. בשקף, עוף שנדבק ע"י הוירוס.ALV הוירוס נכנס לתוך תאי B, ושם הוא עובר רפליקציה ונוצרים וריונים. הפרו-וירוס עובר אינטגרציה באופן אקראי לגנום התאי. ברוב המקרים לא קורה שום דבר, אלא אם כן יהיה אירוע אינטגרציה נדיר בסמוך אונקוגן.mic מתא כזה תתפתח התמרה. הסיכוי להתפתחות הגידול הוא פונקציה של כמות ויריונים. ככל שיש יותר וירונים, יהיו יותר אינטגרציות, והסיכוי לאינטגרציה כזו גדל. קב' שניה: short latency tumors בוירוסים הללו, גן מסויים של הוירוס הוא אונקוגן בעצמו, ולכן הוא מפעיל מייד את מנגנון האונקוגן בכל מקום שהוא עובר אינטגרציה, ולכן הגידול יווצר בצורה מהירה. דוגמאות לוירוס כזה:.VSL 3 מנגנונים לטרנספורמציה ברטרווירוסים: retroviruses -Transducing נגיפים המכילים אונקוגן. Cis-activating ביטוי של האונקוגן עובד במנגנון של ציס (הנגיף עבר אינטגרציה בסמוך לגן האונקוגני התאי). activating Trans הוירוס יכול להיכנס בצורה אקראית, אבל הוא מייצר חלבון שהוא בצורה אקראית יכול להפעיל פרומוטור של האונקוגן (מנגנון טראנס). מאיפה האונקוגנים הללו הגיעו לגנום הויראלי? התברר שרצפים לאונקוגן ויראלי ניתן למצוא בתא, כלומר מקורם של האונקוגנים הללו הוא תאי, ובמהלך האבולוציה כתוצאה מהאינטגרציה הם הפכו לחלק מהגנום הויראלי. תהליך זה יכול להתרחש ע"י שיעתוק ויראלי גם אחרי הפוליA כך שמשועתק גם קטע תאי, ובתוכו האונקוגן. 22