Βιοαισθητήρες -Aνοσοαισθητήρες Αισθητήρες DNA ρ. Χρίστος Μαστιχιάδης Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων- Ραδιοδιαγνωστικών προϊόντων Εργαστήριο ανοσοαναλύσεων ΕΚΕΦΕ «ΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» cmasti@rrp.demokritos.gr ΘΕΡΙΝΟ ΣΧΟΛΕΙΟ ΑΓΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 11-22/7/05
Ορισµός Βιοαισθητήρα Σήµα Μετατροπέας σήµατος Βιοµόριο αναγνώρισης Μετατροπέας σήµατος Βιοµόριο αναγνώρισης Αναλύτης
Που χρησιµοποιούνται οι βιοαισθητήρες Κλινική διάγνωση και στη βιοιατρική Ποιοτικό έλεγχο και φαρµακευτική ανάλυση Μικροβιολογία: Ανίχνευση ιών και βακτηρίων Παραγωγή και τον ποιοτικό έλεγχο των τροφίµων Κτηνιατρική διάγνωση Έλεγχος βιοµηχανικών αποβλήτων Προσδιορισµός βιοµηχανικών (τοξικών) αερίων Έλεγχος της ρύπανσης του περιβάλλοντος Στρατιωτικές εφαρµογές: Ανίχνευση ουσιών χηµικού/βιολογικού πολέµου
Κατάταξη βιοαισθητήρων Α. Με βάση το είδος των βιοµορίων αναγνώρισης Ενζυµικοί βιοαισθητήρες (ένζυµο) Ανοσοαισθητήρες (αντίσωµα) Βιοαισθητήρες DNA (ολιγονουκλεοτίδια) Βιοαισθητήρες υποδοχέων-δεσµευτικών πρωτεϊνών Βιοαισθητήρες κυττάρων-ιστών-µικροοργανισµών Βιοµιµητικοί αισθητήρες (τεχνητές µεµβράνες, µοριακά αποτυπωµένα πολυµερή, χηµικά και γενετικά τροποποιηµένα βιοµόρια) Β. Με βάση τον τρόπο δράσης του βιοµορίου αναγνώρισης Βιοκαταλυτικοί βιοαισθητήρες Βιοαισθητήρες συγγένειας
Πλεονεκτήµατα ανοσοαισθητήρων σε σχέση µε τους ανοσοπροσδιορισµούς Συνεχής λειτουργία Χαµηλότερη κατανάλωση αντιδραστηρίων Μικρότερος χρόνος ανάλυσης υνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισµού διαφορετικών ουσιών Μικρότερο κόστος ανάλυσης υνατότητες κατασκευής φορητών διατάξεων
Τρόποι ταξινόµησης ανοσοαισθητήρων Οι ανοσοαισθητήρες ταξινοµούνται µε βάση: τη χρήση ή µη ιχνθέτη τον τύπο του ανοσοπροσδιορισµού το υλικό κατασκευής του στερεού φορέα τη χηµεία πρόσδεσης του βιοµορίου αναγνώρισης στο στερεό φορέα τη φυσικοχηµική παράµετρο
Τύποι ανοσοχηµικών προσδιορισµών Ι Ανταγωνιστικός ανοσοπροσδιορισµός A + (Α) ακινητοποιηµένο αντίσωµα B + (Β) ακινητοποιηµένο αντιγόνο Ιχνηθέτης Αναλύτης Ακινητοποιηµένος αναλύτης
Τύποι ανοσοχηµικών προσδιορισµών ΙΙ Μη ανταγωνιστικός ανοσοπροσδιορισµός + Αντίσωµα σύλληψης Αναλύτης Αντίσωµα ανίχνευσης
Τρόποι ταξινόµησης ανοσοαισθητήρων Οι ανοσοαισθητήρες ταξινοµούνται µε βάση: τη χρήση ή µη ιχνθέτη τον τύπο του ανοσοπροσδιορισµού το υλικό κατασκευής του στερεού φορέα τη χηµεία πρόσδεσης του βιοµορίου αναγνώρισης στο στερεό φορέα τη φυσικοχηµική παράµετρο
Ταξινόµηση ανοσοαισθητήρων βάσει της φυσικοχηµικής παραµέτρου I Ηλεκτροχηµικοί ανοσοαισθητήρες Αµπεροµετρικοί Ποτενσιοµετρικοί Αγωγιµοµετρικοί Πιεζοηλεκτρικοί ανοσοαισθητήρες Ακουστικών κυµάτων κύριας µάζας (µικροζυγοί κρυστάλλου χαλαζία) Επιφανειακών κυµάτων (SAW)
Ταξινόµηση ανοσοαισθητήρων βάσει της φυσικοχηµικής παραµέτρου II Α. Φθίνοντος κύµατος Οπτικοί ανοσοαισθητήρες Φθορισµοανοσοαισθητήρες (επίπεδοι, τριχοειδείς, οπτικών ινών) Συµβολοµετρικοί Φράγµατος σύζευξης Συντονισµού επιφανειακών πλασµονίων Συντονιζόντων κατόπτρων Β. Λοιποί Ελλειψοµετρικοί Συµβολής ανακλώµενων οπτικών ακτινοβολιών
Ηλεκτροχηµικοί Ι: Αµπεροµετρικοί Υπόστρωµα Ένζυµο Ηλεκτρενεργός ουσία Ηλεκτρόδιο Πλεονέκτηµα: Γραµµική συσχέτιση έντασης ρεύµατος και συγκέντρωσης ηλεκτρενεργού ουσίας Μειονεκτήµατα: Εξάρτηση της απόκρισης από την ταχύτητα µεταφοράς των ηλεκτρενεργών µορίων στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου Παρεµποδίσεις από ενδογενείς ηλεκτρενεργές ουσίες του δείγµατος Αντιµετώπιση: χρήση διαµεσολαβητών e -
Ηλεκτροχηµικοί ΙΙ: Ποτενσιοµετρικοί Α. Με βάση τα Εκλεκτικά Ηλεκτρόδια Ιόντων (ΕΗΙ) Υπόστρωµα Ένζυµο ιόν ή αέριο Ιονοφόρο ΕΗΙ ή ηλεκτρόδιο αερίων ΕΗΙ ή ηλεκτρόδιο αερίων Μειονεκτήµατα: Συσχέτιση του δυναµικού µε την ενεργότητα και όχι τη συγκέντρωση Λογαριθµική συσχέτιση ενεργότητας δυναµικού Μειωµένη εκλεκτικότητα λογω παρεµποδίσεων από άλλα ιόντα Χαµηλός λόγος σήµατος προς θόρυβο Εξαρτηση του σήµατος από την ιονική ισχύ και το ph του διαλύµατος
Ηλεκτροχηµικοί ΙΙΙ: Ποτενσιοµετρικοί Β. Με βάση την εκλεκτική σε ιόντα κρυσταλλοτρίοδο επίδρασης πεδίου Ηλεκτρόδιο πύλης Id Ηλεκτρόδιο πηγής V π Ηλεκτρόδιο Απαγωγού Ένταση ρεύµατος (Ιd) n + n + Μονωτής Πλεονεκτήµατα πύλης Εύκολη αυτοµατοποίηση Χαµηλά επίπεδα θορύβου Μικρό µέγεθος Ταυτόχρονος προσδιορισµός µίγµατος αναλυτών υναµ ικό (Vπ) Πύλης Μειονεκτήµατα Επίτευξη αποτελεσµατικής προστασίας έναντι της υγρασίας και ιόντων Επαναληψιµότητα στην απόθεση της εκλεκτικής µεµβράνης Ευαισθησία στο φως των υλικών κατασκευής
Οπτικοί ανοσοαισθητήρες φθίνοντος κύµατος Αρχές φασµατοσκοπίας εσωτερικής ανάκλασης Βάθος διείσδυσης πεδίου p d =λ/2π(n 12 sin 2 θ n 22 ) 1/2 θ 2 n 2 n 1 n 2 n 1 Κυµατοδηγούµενη δέσµη θ c θ 1 Βάθος διείσδυσης φθίνοντος πεδίου Φθίνον κύµα
Φθορισµοανοσοαισθητήρες οπτικών ινών Ι Κατηγορίες φθορισµοανοσοαισθητήρων οπτικών ινών Φθίνοντος κύµατος Οπτρόδια Α. Ανοσοαισθητήρες οπτικών ινών φθίνοντος κύµατος Μανδύας Φθίνον πεδίο Πυρήνας Μη διεγερµένα βιοµόρια από το φθίνον πεδίο ιεγερµένα βιοµόρια από το φθίνον πεδίο
Φθορισµοανοσοαισθητήρες οπτικών ινών ΙΙ Πηγή φωτός Ανιχνευτής Πηγή φωτός Ανιχνευτής Ανιχνευτής Πηγή φωτός Βιοδραστική επιφάνεια Πλεονεκτήµατα ανοσοαισθητήρων οπτικών ινών Μικρές διαστάσεις Ευκαµψία Ανθεκτικότητα Ικανότητα µετάδοσης σήµατος σε µεγάλες αποστάσεις
Επίπεδοι φθορισµοανοσοαισθητήρες Βάθος διείσδυσης φθίνοντος πεδίου Πηγή οπτικής ακτινοβολίας κυµατοδηγός CCD κάµερα
Συµβολοµετρικοί οπτικοί ανοσοαισθητήρες Βραχίονας µέτρησης Λέηζερ ιαχωριστής δέσµης Κυµατοδηγός Βραχίονας αναφοράς Ανιχνευτής
Οπτικοί ανοσοαισθητήρες φράγµατος σύζευξης Φράγµα σύζευξης είγµα θ Λέηζερ Ανιχνευτής
Οπτικοί ανοσοαισθητήρες συντονισµού επιφανειακών πλασµονίων Πηγή µονοχρωµατικού φωτός Οπτικό πρίσµα Συστοιχία φωτοδιόδων Ένταση Μεταλλικό στρώµα Βιοδραστική επιφάνεια Γωνία Φθίνον κύµα
Οπτικοί ανοσοαισθητήρες συντονιζόντων κατόπτρων Στρώµα δεξτράνης Στρώµα συντονισµού υψηλού δδ Φθίνον πεδίο Στρώµα σύζευξης χαµηλού δδ Πολωτής Υάλινο πρίσµα υψηλού δδ ανιχνευτής Πηγή φωτός
Πλεονεκτήµατα οπτικών ανοσοαισθητήρων Ποικιλία µεταλλακτών και ιχνηθετών Σήµα λιγότερο ευάλωτο σε παρεµβολές συστατικών του δείγµατος Ταχύτητα στη µέτρηση του σήµατος υνατότητα παρακολούθησης της ανοσοαντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο Αυξηµένες δυνατότητες σµίκρυνσης Αυξηµένες δυνατότητες ταυτόχρονου προσδιορισµού διαφορετικών ουσιών στο ίδιο δείγµα
Αρχή λειτουργίας τριχοειδούς ανοσοαισθητήρα Οπτική δέσµη διέγερσης Φθορισµός PRL FSH hcg Ηλεκτρονικά Ένταση φθορισ µού Μήκος τριχοειδούς (mm)
Τριχοειδής ανοσοαισθητήρας: διάταξη
Tριχοειδής φθορισµοανοσοαισθητήρας Ι Γιατί τριχοειδής; Υψηλός λόγος ενεργού επιφανείας προς όγκο δείγµατος Γραµµική γεωµετρία που επιτρέπει τη δηµιουργία διακριτών ζωνών βιολογικής δραστικότητας Μπορεί να χρησιµοποιηθεί ως οπτικός κυµατοδηγός, ως στερεός φορέας ακινητοποίησης των βιοµορίων και ως σωλήνας αντίδρασης. Μικρές διαστάσεις που επιτρέπουν χαµηλή κατανάλωση ανοσοαντιδραστηρίων
Tριχοειδής φθορισµοανοσοαισθητήρας ΙΙ Σύγκριση της ταχύτητας ανοσοαντίδρασης µε φρεάτια µικροτιτλοδότησης Fluorescence - Capillaries (RFU) 400 300 200 100 0 0 100 200 300 400 500 Time (min) 140 120 100 80 60 40 20 0-20 Fluorescence - Microtitration Wells (RFU) Τριχοειδής ανοσοαισθητήρας ( ) Φρεάτια µικροτιτλοδότησης ( )
Tριχοειδής φθορισµοανοσοαισθητήρας Ι Γιατί τριχοειδής; Υψηλός λόγος ενεργού επιφανείας προς όγκο δείγµατος Γραµµική γεωµετρία που επιτρέπει τη δηµιουργία διακριτών ζωνών βιολογικής δραστικότητας Μπορεί να χρησιµοποιηθεί ως οπτικός κυµατοδηγός, ως στερεός φορέας ακινητοποίησης των βιοµορίων και ως σωλήνας αντίδρασης. Μικρές διαστάσεις που επιτρέπουν χαµηλή κατανάλωση ανοσοαντιδραστηρίων
Tριχοειδής φθορισµοανοσοαισθητήρας ΙΙΙ Γιατί πλαστικό; Πλεονεκτήµατα: Απλή µεθοδολογία ακινητοποίησης των βιοµορίων µέσω προσρόφησης Χαµηλό κόστος παραγωγής Πρόβληµα: Αυτοφθορισµός των πλαστικών Κατασκευή βιοδραστικών ζωνών Με µικροσύριγγες ακριβείας Με φωτολιθογραφία
Tριχοειδής φθορισµοανοσοαισθητήρας ΙV Ταυτόχρονος µη ανταγωνιστικού τύπου ανοσοπροσδιορισµός τριών ορµονών 1,5 PRL 1000 PRL Volts 1,0 0,5 FSH hcg RFU 100 10 FSH hcg 0,0 0-100000 -200000 Steps (5000steps=1mm) 1 10 100 1000 Analyte concentration Σήµα που λαµβάνεται κατά την σάρωση διαφορετικών τριχοειδών Ανοικτά σύµβολα: Ανοσοαισθητήρας τριπλής ζώνης Κλειστά σύµβολα: Ανοσοαισθητήρας µονής ζώνης
Tριχοειδής φθορισµοανοσοαισθητήρας V Ταυτόχρονος ανταγωνιστικού τύπου ανοσοπροσδιορισµός δύο παρασιτοκτόνων RFU 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 PMC HEX (Bx/Bo) 100 80 60 40 HEX PMC 0,2 20 0,0 0-100000 -200000 Steps (5000steps = 1mm) 0 0,1 1 10 100 1000 Concentration of Hex or PMC (ng/ml) Σήµα που λαµβάνεται κατά την σάρωση διαφορετικών τριχοειδών Κόκκινα σύµβολα: Ανοσοαισθητήρας διπλής ζώνης Μπλε σύµβολα: Ανοσοαισθητήρας µονής ζώνης
Tριχοειδής φθορισµοανοσοαισθητήρας VI Ανίχνευση σήµατος σε πραγµατικό χρόνο 3 0 m in 0, 6 1 5 m in Signal (V) 0, 4 1 0 m in 5 m in 0, 2-2 0 0 0 0 0-1 5 0 0 0 0-1 0 0 0 0 0-5 0 0 0 0 0 s t e p s ( 1 m m = 5 0 0 0 s t e p s )
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας Ι Αρχή λειτουργίας του οπτολεκτρονικού βιοαισθητήρα µονολιθικά ολοκληρωµένου σε ψηφίδες πυριτίου
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας ΙΙ Α Γ Β Μικροφωτογραφίες: (Α) των οπτικών ινών, (Β) της πηγής φωτός (LED) και (Γ) της µικρορευστοµηχανικής κυψελίδας.
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας ΙΙΙ Επιλογή νανοσωµατίδια χρυσού ως ιχνηθέτη Intensity (arbitrary units) 160 120 80 40 0 1 2 400 500 600 700 800 Wavelength (nm) 0,06 0,04 0,02 0,00 Absorption 1. Φάσµα εκποµπής της ολοκληρωµένης πηγής 2. Φάσµα απορόφησης 920 pm Αυ-στρεπτταβιδίνης
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας ΙV Μέτρηση σήµατος σε πραγµατικό χρόνο µε χρήση µικρορευστοµηχανικής κυψελίδας (S 0 /S t ) 3 2 1 2 1. Συνεχή ροή 2. Χωρίς ροή 3. Μη ειδική δέσµευση 0,9 1 3 0 500 1000 1500 Χρόνος (sec)
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας V Ευαισθησία ανίχνευσης οπτοηλεκτρονικού βιοαισθητήρα µέσω του µοντέλου βιοτίνης-στρεπταβιδίνης 5 4 1 3 2 (S 0 /S 30 ) 2 1,5 1 συνεχής ροή 2 χωρίς ροή 1,0 0 10 20 30 1 0 200 400 600 800 1000 Au-Streptavidin (pm)
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας VI Ενίσχυση του σήµατος µέσω επαργύρωσης των νανοσωµατιδίων χρυσού 100 5 (NSP 0 /NSP) 10 1 0,0 0,2 0,4 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Au-Streptavidin (pm) 5 min 10 min 20 min
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας VII Ταυτόχρονη ανίχνευση στρεπταβιδίνης και αντισωµάτων κατά των IgG ποντικού 1,3 1,2 S 0 /S t 1,1 1,0 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) Au-στρεπταβιδίνη Au-anti mouse IgG
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας VIIΙ Ταυτόχρονος µη ανταγωνιστικού τύπου προσδιορισµός CK-MB και τροπονίνης Ι A 405 nm CK-MB 1 0,1 1 10 100 10 1 % Πτώ σ η σήµατος A 405 nm 1 0,1 0,01 0,1 1 10 100 10 1 % Πτώ σ η σήµατος CK-MB (ng/ml) Τρ ο π ο ν ίν η Ι (ng /ml) ELISA Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας
Οπτοηλεκτρονικός βιοαισθητήρας ΙX Ανίχνευση πολυµορφισµού µονήρους νουκλεοτιδίου στο γονίδιο σουλφοτρανσφεράσης της φαινόλης SULT 1A1 25 % Πτώση σήµατος 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Αριθµός ίνας Μονές ίνες Συµπληρωµατικό Ζυγές ίνες Ολιγονουκλεοτίδιο που διαφέρει κατά µία βάση
Εµπορικά διαθέσιµος βιοαισθητήρας γλυκόζης FreeStyle TM - Therasense
Εµπορικά διαθέσιµος βιοαισθητήρας συντονισµού επιφανειακών πλασµονίων BIACORE ΤΜ (LKB)
Εµπορικά διαθέσιµοι βιοαισθητήρες οπτικών ινών Endotect TM ThreeFold Sensors Analyte 2000 TM Research International