1 ο Εργαστήριο PyMOL 07/11/14 ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Ευάγγελος Τόπακας Username: biotech Password: applbiot1
Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Βιοτεχνολογίας Θεματικές ενότητες/υπολογιστικά προγράμματα: - Απεικόνιση πρωτεϊνικών μορίων και ανάλυση της δομής τους με τη χρήση υπολογιστικών προγραμμάτων (PyMol). - Μεταβολική Μηχανική: Προσομοίωση και έλεγχος μεταβολικών οδών μέσω του υπολογιστικού Προγράμματος Gepasi. - Βιοπληροφορική, βάσεις δεδομένων γονιδιωματικής. Βιβλιογραφικές Εργασίες (ομαδικές 2-4 ατόμων): Παραδίδεται γραπτή εργασία και γίνεται προφορική παρουσίαση διάρκειας 15 λεπτών στο τέλος της διάρκειας του εξαμήνου. Ο τελικός βαθμός θα προκύπτει από τη συνολική απόδοση σε αναλογία 50% εξετάσεις, 30% εργαστήριο, 20% βαθμολόγηση της εργασίας. Απαραίτητη προϋπόθεση για την προαγωγή του μαθήματος είναι ο βαθμός 5 στις τελικές εξετάσεις. Η παρακολούθηση των εργαστηριακών μαθημάτων και η εκπόνηση της εργασίας είναι υποχρεωτική. Σελίδα μαθήματος: http://www.chemeng.ntua.gr/the_course/applied_biotechnology
Τι είναι; PyMOL Είναι πρόγραμμα 3D απεικόνισης κρυσταλλικών δομών πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA & trna) και υδατανθράκων όπως και μικρών μορίων (φαρμάκων, παρεμποδιστών, μεταβολιτών, ανόργανων αλάτων, διαλυτών κτλ). Αποτελεί βασικό εργαλείο της Πρωτεϊνικής Μηχανικής. Σκοπός: Εύρεση καταλυτικών μηχανισμών ενζύμων Βιοτεχνολογικής σημασίας (Ενέργεια, Τρόφιμα, Υλικά), μορίων στόχων στη Βιομηχανία Φαρμάκων, κτλ.
Κεντρικός Μεταβολισμός Άνθρακα του S. cerevisiae Καθορισμένη Στοιχειομετρία Κινητικοί Παράμετροι Κεντρικά Μονοπάτια Γλυκόλυση Μεταφορείς Εξοζών Κόμβος Πυροσταφυλικού Μονοπάτι Φωσφορικών Πεντοζών Κύκλος Γλυοξυλικού Οξέος Κύκλος TCA (Krebs) Κύρια Προϊόντα Άνθρακα Βιομάζα C1: CO 2 C2: Αιθανόλη, οξικό C3: Πυροσταφυλικό, γλυκερόλη 4 P i NADH NAD+ ATP Citrate FADH2 M Fumarate Glycerol ADP Oxaloacetate Malate Succinate ATP CO 2 ADP Glycerol-3-phosphate FADH2 M Glucose ATP ADP Glucose-6-phosphate Fructose-6-phosphate ATP ADP Glycerone-P ATP AMP,P NADH NAD+ Glyceraldehyde-3-phosphate NADH NADH 1,3-Diphosphoglycerate CO 2 Citrate M Malate ADP ATP ADP ATP 3-Phosphoglycerate 2-Phophoglycerate Phosphenolpyruvate ADP ATP CO 2M NADPH M NADP+ M Pyruvate Pyruvate M Malate M Fumarate M FAD M Succinate ADP ATP Fructose-1,6-bisphosphate P i, NAD+ FAD Glucono-1,5-lactone-6-phosphate P i, NAD+ CO 2 CoA M NAD+ M NAD+ M Succinate M NADH NAD+ Glycine Citrate NADH NAD+ Ethanol Acetaldehyde Oxaloacetate NADH NAD+ CO 2M NADPH NADP+ 3-Phosphohydroxypyruvate 5,10-Methylene-THF NADH CO 2 NH 3 NADH M ATP M NADH M CoA M L-Aspartate-4-semialdehyde Oxaloacetate 2-Oxoglutarate NADPH NADH L-glutamate NADP+ NAD+ L-Serine THF NAD+ THF Glycine Acetyl-CoA M Oxaloacetate M L-Glutamate M NADP+ M Citrate M Isocitrate M Mitochondrion Cytosol NAD+ M NADH M NADPH M 2-Oxoglutarate M CO 2M Succinyl-CoA M ADP M,P im Ribulose-5-phosphate NADPH CO 2 Xylose-5-phosphate NADP+ Ribulose-5-phosphate 6-Phosphogluconate L-Aspartate 3-Phosphoserine P i H 2 O Acetaldehyde NH 3M CoA M CO2M ATP ADP CoA L-Alanine NAD+ NADH NADP+ NADPH Malate Glyoxylate NAD+ CoA M M NADH M O-Phospho-L-homoserine Isocitrate 4-Phospho-L-aspartate 2-Oxobutanoate NH 3 L-Homoserine L-Threonine Acetyl-CoA Succinate NADP+ M NADPH M Oxalosuccinate M CO 2M NADPH NADP+,P i ATP ADP H 2 O P i L-Serine NH 3M NAD+ NADH Acetate THF Glycine L-Threonine NH 3 Glycine 5,10-Methylene-THF
NYLON, Polymers O N N CH 2 x N O Poly-Amides O O O Succinic Anhydride n CH 3 O H 2 N O O O N NH 2 O 2 g-butyrolactone NMP HO Μοντέλο Βιοδιϋλιστηρίου OH 1,4-Butanediol O O διεργασιών ζύμωσης και βιοκατάλυσης O O OH Petrochemical HO O Succinic Acid Succindiamide Παραγωγή δομικών μορίων μέσω από αειφόρο/ανανεώσιμη βιομάζα Maleic Anhydride Specialty & Fine NMP Solvent Solvent H H 3 C O O O CH 3 O O N THF Solvent O DBE Tetrahydrofuran 2-Pyrrolidone PBS Polymers
P i NADH NAD+ ATP Glycerol ADP ATP CO 2 Oxaloacetate ADP Glycerol-3-phosphate Glucose ATP ADP Glucose-6-phosphate Fructose-6-phosphate ATP ADP Glycerone-P ATP AMP,P NADH NAD+ Glyceraldehyde-3-phosphate NADH NADH 1,3-Diphosphoglycerate CO 2 ADP ATP ADP ATP 3-Phosphoglycerate 2-Phophoglycerate Phosphenolpyruvate ADP ATP Pyruvate Pyruvate M ADP ATP Fructose-1,6-bisphosphate P i, NAD+ Glucono-1,5-lactone-6-phosphate P i, NAD+ CO 2 NADH NAD+ Glycine Citrate NADH NAD+ Ethanol Acetaldehyde Oxaloacetate NADH NAD+ CO 2M NADPH NADP+ 3-Phosphohydroxypyruvate 5,10-Methylene-THF NADH CO 2 NH 3 L-Serine THF NAD+ THF Glycine NADH M Acetyl-CoA M Ribulose-5-phosphate NADPH CO 2 Xylose-5-phosphate NADP+ Ribulose-5-phosphate 6-Phosphogluconate L-Aspartate L-Aspartate-4-semialdehyde Oxaloacetate 2-Oxoglutarate NADPH NADH L-glutamate NADP+ NAD+ 3-Phosphoserine P i H 2 O Acetaldehyde CoA M ATP ADP CoA L-Alanine NAD+ NADH NADP+ NADPH Malate Glyoxylate O-Phospho-L-homoserine Isocitrate 4-Phospho-L-aspartate 2-Oxobutanoate NH 3 L-Homoserine L-Threonine Acetyl-CoA Succinate NADPH NADP+,P i ATP ADP H 2 O P i L-Serine NAD+ NADH Acetate Glycine L-Threonine Citrate Malate CO 2M NADPH M NADP+ M CoA M NAD+ M NAD+ M Malate M NADH M Citrate M Oxaloacetate M NADP+ M NADPH M Isocitrate M L-Glutamate CO2M M NAD+ M Oxalosuccinate M Citrate M NADP+ M NH 3M NADH M FADH2 M FADH2 M Fumarate Succinate FAD Fumarate M FAD Succinate M M CoA M ATP M NADPH M 2-Oxoglutarate M CO 2M Succinyl-CoA M ADP M,P im NAD+ CoA M M NADH M Mitochondrion CO 2M NH 3M NH 3 Glycine THF Malate Succinate Cytosol 5,10-Methylene-THF
PyMOL Ο επίσημος ιστότοπος του λογισμικού PyMOL είναι: http://www.pymol.org/ Πρόκειται για ένα πρόγραμμα ανοικτού λογισμικού το οποίο είναι ελεύθερα διαθέσιμο ΜΟΝΟ για ακαδημαϊκή χρήση Λήψη παλαιότερης έκδοσης (v 0.99) και οδηγιών (*.pdf) από τον ιστότοπο του μαθήματος «Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία»: http://www.chemeng.ntua.gr/the_course/applied_biotech nology Αρχείο LAB.rar (password: applbiot)
PyMOL Λήψη νεότερης έκδοσης (v 1.3r1) από το επίσημο ιστότοπο μόνο για ακαδημαϊκή χρήση: URL: http://pymol.org/ep USER: dec2010 PASSWORD: mol2view OS: Windows, Mac, Linux
Δυνατότητες Προγράμματος Συμβατότητα: Το PyMOL υποστηρίζει συστήματα Unix, Macintosh, Windows όπως και ios (ipad). Χειρισμός μέσω γραφικού περιβάλλοντος (Graphical User Interface, GUI) και μέσω εντολών (command line): Ο ταυτόχρονος χειρισμός δίνει στο χρήστη τη δυνατότητα τόσο απλής όσο και εξειδικευμένης χρήσης του προγράμματος. Επιλογή ατόμων, διαίρεση και ένωση μοριακών δομών: ομές μορίων μπορεί να κοπούν, να μοιραστούν και τελικά να ενωθούν πολύ σύντομα, παράγοντας καινούργια αρχεία PDB. Ταινίες: υνατότητα δημιουργίας animation και εξαγωγή αυτών σε διάφορα πρωτόκολλα όπως GIF ή mpeg χρησιμοποιώντας εξειδικευμένες εντολές.
Δυνατότητες Προγράμματος Απεικόνιση των πρωτεϊνών με διάφορους τρόπους όπως σε επιφάνειες, cartoon ή ribbons: Η δυνατότητα απεικόνισης των πρωτεϊνών με τους τρεις αυτούς τρόπους γίνεται αρκετά εύκολα και σε ποιότητα ίδια με εκείνη του Molscript. Φωτοσκίαση: Ένα πανίσχυρο ενσωματωμένο πρόγραμμα (Ray-tracer) δίνει τη δυνατότητα στο PyMOL δημιουργίας σκιάσεων και βάθους σε κάθε εικόνα, παράγοντας έτσι εικόνες εντυπωσιακών γραφικών. Εξαγωγή: Οι εικόνες του PyMOL μπορούν να εξαχθούν σε αρχεία PNG τα οποία μεταφέρονται απευθείας στο MS Powerpoint.
Cartoon μοντέλο Παραδείγματα
Παραδείγματα Χωροπληρωτικό μοντέλο
Μικτό μοντέλο Παραδείγματα
Παραδείγματα RNA DNA
Μοριακά βίντεο Παραδείγματα
Παραδείγματα Δομή μιτοχονδριακού μεταφορέα ADP/ATP σε συναρμογή με τον παρεμποδιστή του καρβοξυατρακτυλοζιδίου Το ATP παρέχει ενέργεια σε βιοσυνθετικές αντιδράσεις μέσα στο κυτταρόπλασμα με την υδρόλυσή του προς ADP και ανόργανο φώσφορο. Η αναγέννηση του ATP από ADP γίνεται στο μιτοχόνδριο. Η μετακίνηση των παραπάνω από και προς το μιτοχόνδριο γίνεται μέσω ενός διαμεμβρανικού μεταφορέα [PDB: 1YM6 & 1YMJ]. http://www.youtube.com/watch?v=fboyaqnk3cw
Protein Data Bank (PDB) http://www.pdb.org Εύρεση πρωτεϊνικών μορίων από την τράπεζα δεδομένων: - Παροχή πληθώρας εργαλείων και πληροφοριών για τη μελέτη της δομής βιολογικών μακρομορίων συσχετίζοντας την πρωτοταγή δομή με την λειτουργία τους. - ιατήρηση κοινού τρόπου αποθήκευσης δεδομένων σε παγκόσμια κλίμακα
Εύρεση Πρωτεϊνικών Δομών Επιλογή πρωτεΐνης στόχου για δομικές μελέτες. Παραγωγή και απομόνωση της υπό μελέτη πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNΑ. Βιοχημικός χαρακτηρισμός και βιοτεχνολογική αξιολόγηση της παραγόμενης πρωτεΐνης. Προσπάθεια κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης. Εύρεση και απομόνωση κρυστάλλου, αξιολόγηση και επίδραση ακτίνων Χ με σκοπό την εύρεση της τρισδιάστατης δομής. Μηχανιστικές μελέτες της πρωτεΐνης, σχέση δομήςδράσης.
Επιλογή Πρωτεΐνης Επιλογή πρωτεΐνης στόχου για δομικές μελέτες: Πρωτεΐνες με υψηλή Βιοτεχνολογική σημασία σε τομείς έρευνας όπως στη βιομηχανία φαρμάκων, καλλυντικών και παραγωγής ενέργειας (Βιοκαύσιμα) Εύρεση γονιδίου με χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής χρησιμοποιώντας γνωστά γονιδιώματα (public access).
Παραγωγή Πρωτεϊνών Παραγωγή της υπο μελέτη πρωτεΐνης με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNΑ: Κλωνοποίηση και υπερέκφραση της πρωτεΐνης στόχου χρησιμοποιώντας μικροοργανισμούς ξενιστές (E. coli, P. pastoris κτλ) και απομόνωση της σε ιδιαίτερα υψηλή ποσότητα και καθαρότητα κατάλληλη για κρυσταλλογραφικές μελέτες.
Βιοχημικός Χαρακτηρισμός Λήψη δεδομένων απαραίτητων για την ταξινόμηση μιας πρωτεΐνης με βάση τα καταλυτικά της χαρακτηριστικά όπως και την εύρεση νέων ιδιοτήτων άγνωστων μέχρι σήμερα. 100 Enzyme Kinetics Data 80 Rate 60 40 20 0 0,026 0,024 0,022 0,02 0,018 0,016 0,014 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 0 2 4 6 1 / [Substrate] 1 / Rate 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 [Substrate]
Κρυστάλλωση Πρωτεϊνών Πρέπει οι πρωτεΐνες να αλληλεπιδράσουν μεταξύ τους Μόρια H 2 O παρεμποδίζουν την αλληλεπίδραση Εφαρμογή αλάτων τα οποία λόγω ισχυρής ιοντικής δύναμης έλκουν τα μόρια H 2 O, αφήνοντας έτσι τις πρωτεΐνες να αλληλεπιδράσουν **** ΑΡΓΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ****
Κρυστάλλωση Πρωτεϊνών Αλληλεπίδραση πρωτεϊνών μεταξύ τους αυξάνοντας τον βαθμό οργάνωσης του κρυσταλλικού πλέγματος *** Αύξηση οπτικής διαπερατότητας ***
Δοκιμές Κρυστάλλωσης Χρήση πολλών συνθηκών κρυστάλλωσης (ρυθμιστικά διαλύματα διαφόρων αλάτων) Τα άλατα/ουσίες με σκοπό την μείωση της διαλυτότητας της πρωτεΐνης μεταβάλλουν: ph, διηλεκτρική σταθερά δ/τος, εντροπία (μεγάλου ΜΒ πολυμερή) κτλ
Δοκιμές Κρυστάλλωσης Αν μετά από εκατοντάδες/χιλιάδες δοκιμές δεν κρυσταλλώνεται η πρωτεΐνη μας και είναι τεράστιας επιστημονικής σημασίας η γνώση της 3D δομής της τότε μεταβάλλουμε την βαρύτητα των συνθηκών ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΙΚΡΟΒΑΡΥΤΗΤΑΣ
Αυτόματη Κρυστάλλωση
Εύρεση Κρυστάλλων http://www.youtube.com/user/sblnewcastle#p/u/5/yycb4pu0dnu
Απομόνωση Κρυστάλλων Χρήση κρίκου και δοκιμή αιώρησης του κρυστάλλου σε ελάχιστη ποσότητα κρυοπροστατευτικού διαλύματος. οκιμή σταθερότητας σε ρεύμα παγωμένου αζώτου (~ -196 o C).
Επίδραση Ακτινοβολίας Το μήκος κύματος των ακτίνων-χ είναι συγκρίσιμο με τις διατομικές αποστάσεις (10-9 m, 1 Å) οπότε είναι δυνατή η περίθλαση των ακτίνων από δείγματα κρυστάλλων -> ανάλυση σε ατομική κλίμακα
Εφαρμογή Ακτίνων Χ Για τη διευκρίνηση της πρωτεϊνικής δομής, το μόριο βομβαρδίζεται με φωτόνια υψηλής ενέργειας τα οποία ανακλώνται στα ηλεκτρονικά νέφη των ατόμων
Σύγχροτρο-Δακτύλιοι Αποθήκευσης Χρήση ισχυρής πολωμένης δέσμης φωτονίων μήκους κύματος ακτινοβολίας Χ για την διευκρίνιση της δομής πρωτεϊνών.
Πρωτεϊνικό Αποτύπωμα Χρήση λογισμικών για την εύρεση παραμέτρων οι οποίες αποτελούν τη βάση για τον εντοπισμό των ατόμων της πρωτεΐνης στον τρισδιάτατο χώρο. Οι κουκίδες είναι το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης ακτίνων Χ με τα ηλεκτρονικά νέφη των ατόμων της πρωτεΐνης. Αποτίμηση γεωμετρικών συσχετίσεων μεταξύ των κουκίδων Αποτίμηση έντασης κουκίδων http://www.youtube.com/user/sblnewcastle#p/u/1/yiruthdnx6i
Σχεδιασμός Πρωτεινικου Μοντέλου
Σχεδιασμός Πρωτεινικου Μοντέλου
Συνοπτικά
Βασικές γνώσεις πρωτεϊνών
Υδρόφιλα Αμινοξέα Συμβάλλουν στη δημιουργία δεσμών υδρογόνου Συμβάλλουν στη φόρτιση της πρωτεΐνης
Υδρόφοβα Αμινοξέα
Δημιουργία Πεπτιδικών Δεσμών
Δημιουργία Πεπτιδικών Αλυσίδων
Αρχιτεκτονική Πρωτεϊνών 4 Επίπεδα Δομών
β-πτυχωτά Φύλλα
α-έλικες
Τριτοταγής Δομή Low Density Lipoprotein (LDL)
Τεταρτοταγής Δομή
PyMOL
Παράθυρα PyMOL
Παράθυρο Viewer
Παράθυρο εξωτερικού GUI
Φόρτωση PDB αρχείου
Περιστροφή Trackball
Παρατήρηση μίας α-αμυλάσης ημιουργία φακέλου με την ονομασία PyMOL. Άνοιγμα ιστοσελίδας www.pdb.org μέσω Mozilla Firefox. Εισαγωγή στο πεδίο PDB or keyword: <1ppi>. Κατέβασμα του PDB αρχείου στην επιφάνεια εργασίας και μεταφορά του στον παραπάνω φάκελο. Άνοιγμα αρχείου (διπλό κλικ).