Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών Δημόκριτος Μελέτη βιοσυμβατότητας επισημασμένων με γάλλιο-68 υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου με τα έμμορφα στοιχεία του ανθρώπινου αίματος Καραγεώργου Μαρία Τριμελής Επιτροπή: Αναπλ. Καθηγητής Δ. Σταμόπουλος, Διευθ. Ερευνών Π. Μπουζιώτη, Professor O. Tillement Ημερίδα Υπ. Διδακτόρων Τομέας Φυσικής Στερεάς Κατάστασης Φεβρουάριος 2018
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών Δημόκριτος ΣΤΟΧΟΣ Στόχος της παρούσας μελέτης αποτελεί η αξιολόγηση της βιοσυμβατότητας των επισημασμένων με το ραδιοϊσότοπο γάλλιο-68 ( 68 Ga) υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου (Fe 3 O 4 NPs), τα οποία είναι επικαλυμμένα με φωσφονική ένωση (2,3-dicarboxypropane-1,1-diphosphonic acid (-DPD)), με τα έμμορφα στοιχεία του ανθρώπινου αίματος. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή: σύσταση αίματος (βασικές κυτταρικές σειρές: ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα, αιμοπετάλια) Κρυσταλλογραφικός και μαγνητικός χαρακτηρισμός των 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs (πειραματικές τεχνικές: περίθλαση ακτίνων Χ, συμβολόμετρο υπεραγώγιμης κβαντικής συμβολής) Πειραματικό πρωτόκολλο επώασης δειγμάτων ολικού αίματος-συμπλόκων 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs Μελέτη των ποιοτικών/ποσοτικών μορφολογικών και γεωμετρικών χαρακτηριστικών των τριών βασικών κυτταρικών σειρών (πειραματικές τεχνικές: Οπτικό Μικροσκόπιο, Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης, Αναλυτής Κυτταρομετρίας Ροής) Αποτελέσματα για τα ερυθροκύτταρα Αποτελέσματα για τα λευκοκύτταρα Αποτελέσματα για τα αιμοπετάλια Συμπεράσματα-Μελλοντικοί στόχοι
Σύσταση Αίματος Πλάσμα Υποκίτρινο υγρό Αποτελείται από 91% νερό, ηλεκτρολύτες, πρωτεϊνες, λιπίδια, ορμόνες Μεταφορά ουσιών, θερμότητας, σημάτων Άμυνα οργανισμού Έμμορφα στοιχεία αίματος ΣΥΣΤΑΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Ερυθροκύτταρα Απύρηνα, εύκαμπτα κύτταρα Σχήμα αμφίκοιλου δίσκου Διάμετρος 6-8 μm Χρόνος ζωής 120 ημέρες Μεταφορά Ο 2 στους ιστούς του οργανισμού Λευκοκύτταρα Λευκοκυτταρικός τύπος Διάμετρος 7-20 μm Χρόνος ζωής 3-4 ημέρες Άμυνα οργανισμού Ενδεικτικές εικόνες ΜΑΔ των κυττάρων του αίματος: Αιμοπετάλια https://el.wikipedia.org/wiki/αίμα Κυτταρικά θραύσματα Διάμετρος 2-4 μm Χρόνος ζωής 5-9 ημέρες Πήξη αίματος
2400 311 2200 Fe3O4-DPD 2000 1800 1600 1400 1200 440 220 1000 511 800 400 600 111 422 400 533 620 444 642 200 0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 2theta (o) 60 50 M (emu/gr) Intensity (a.u.) ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΚΑΙ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ 68Ga-DPD-Fe3O4 NPs T = 36oC 40 Fe3O4-DPD NPs 30 68 Ga-Fe3O4-DPD NPs 20 10 0-10 -20-30 -40-50 -60-25 -20-15 -10-5 0 5 H (koe) 10 15 20 25 M(H) καμπύλη στους Τ = 36 οc των δειγμάτων σε υγρή μορφή. Η μαγνήτιση κόρου (Μs) του δείγματος Fe3O4-DPD ισούται με Ms = 44 emu/g, ενώ του επισημασμένου δείγματος ισούται με Ms = 8 emu/g. Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε με χρήση πλαστικής κάψουλας διαμέτρου 5mm. Δημοσίευση: Karageorgou et al. Gallium-68 Labeled Iron Oxide Nanoparticles Coated with 2,3-Dicarboxypropane-1,1diphosphonic Acid as a Potential PET/MR Imaging Agent: A Proof-of-Concept Study, Contrast Media & Molecular Imaging, Article ID 6951240, Vol. 2017, p. 1-13 (doi.org/10.1155/2017/6951240).
Πειραματικό πρωτόκολλο επώασης δειγμάτων ολικού αίματος-συμπλόκων 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs Για τη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας πραγματοποιείται λήψη 15ml ολικού αίματος από υγιή δότη και τοποθέτησή τους σε 5 δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος Vacutainer (3ml) με EDTA. Προετοιμασία δειγμάτων λευκών αιμοσφαιρίων (WBC): Στόχος αποτελεί η απομόνωση του buffy coat (λεπτό στρώμα πλούσιο σε λευκά αιμοσφαίρια) το οποίο δημιουργείται στη διεπιφάνεια μεταξύ του πλάσματος και των έμμορφων στοιχείων ολικού αίματος. α) β) Ολικό αίμα σε δοκιμαστικό σωλήνα γενικής αίματος: α) πριν και β) μετά από 1 ώρα στο πεδίο βαρύτητας Buffy coat (<1% του συνολικού αίματος, λευκοκύτταρα, αιμοπετάλια) Πλάσμα (55% ) Buffy coat Ερυθροκύτταρα (45% )
α) β) d=0.7cm d=1.4cm Εξαρτήματα που χρησιμοποιούνται στη διαδικασία διαχωρισμού λευκών αιμοσφαιρίων. Η στάθμη αίματος των 3ml στο σωλήνα οριοθετείται από το σημείο στο κόκκινο πλαίσιο της εικόνας. γ) α) Σταθεροποίηση του ρύγχους μέσω του o-ring πάνω στο καπάκι με τη τρύπα β, γ) Σταθεροποίηση της άκρης του ακροφυσίου 2.3 mm πάνω από τη διεπιφάνεια
Προετοιμασία δειγμάτων ολικού αίματος (Whole Blood-WB): 1. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων ολικού αίματος στα 2400g για 10min και απομόνωση πλάσματος φτωχού σε αιμοπετάλια (ΠΦΑ). α Λειτουργία 120-2400g (ή 1000-4500 rpm) β 2. Δημιουργία δείγματος αραιωμένου ολικού αίματος με ΠΦΑ σε αναλογία: 10x 10x Στόχος αποτελεί η αραίωση του αιματοκρίτη (Hct) του δότη από α) 35%<Hct<50% σε β) 6%<Hct<10%.
Επώαση έμμορφων στοιχείων αίματος με 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs: Τα δείγματα ολικού αίματος και buffy coat επωάζονται με 68 Ga- Fe 3 O 4 -DPD NPs σε θερμοκρασία δωματίου για t = 60 min και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs (C = 0.1 mg/ml και C = 1 mg/ml). Αφού παρασκευαστούν κατάλληλα μονοστρωματικά υμένια από τα δείγματα, τα δείγματα μελετώνται αρχικά στο Οπτικό Μικροσκόπιο (ΟΜ) και μετά στο Mικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ). Δημιουργία μονοστρωματικών υμενίων κυττάρων Cytospinner Τροφοδοτικό Αντλία κενού Στόχος είναι η δημιουργία μονοστρωματικών υμενίων κυττάρων: Α. κατάλληλης επιφανειακής κάλυψης Β. ομοιογενώς κατανεμημένα Γ. επαρκώς διαχωρισμένα Cytospinner: Ταχύτητα περιστροφής 2000στρ/min, χρόνος περ/φής 10sec
ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΠΟΙΟΤΙΚΩΝ/ΠΟΣΟΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΚΑΙ ΓΕΩΜΕΤΡΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΕΙΡΩΝ-ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Παρατήρηση των δειγμάτων με Οπτική Μικροσκοπία (ΟΜ) Η χρήση της Οπτικής Μικροσκοπίας συνέβαλε: 1. Στον έλεγχο της καταλληλότητας των δειγμάτων, που δημιουργήθηκαν, για μέτρηση με Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ). 2. Για έλεγχο πιθανής ανισοκυττάρωσης / ποικιλοκυττάρωσης στα έμμορφα στοιχεία του αίματος. Διακριτική ικανότητα d=0.61λ/nsinθ (>0.2μm) Οπτικό μικροσκόπιο Μεγέθυνση Μ=m 1 x m 2 Η παρασκευή των δειγμάτων, καθώς και οι μετρήσεις ΟΜ, πραγματοποιήθηκαν στο Ινστιτούτο Νανοεπιστήμης και Νανοτεχνολογίας, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος
Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ) Chip πυριτίου στο οποίο είναι προσαρτημένος βραχίονας με μια υπεραιχμηρή ακίδα 5-15 nm στο κάτω μέρος του 10-40 μm 100-300 μm Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στο Ινστιτούτο Νανοεπιστήμης και Νανοτεχνολογίας, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος
Αναλυτής Κυτταρομετρίας Ροής Μέθοδος Ογκομετρική μέθοδος σύνθετης αντίστασης Φωτομετρική μέτρηση Οπτική μέτρηση Περιγραφή Κυτταρικές συγκεντρώσεις και κατανομές όγκου των WBCs, RBCs, PLTs. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της HGB. Προσδιορίσμός των διαφορικών παραμέτρων 5 στοιχείων των WBC. Πραγματοποιήθηκε Γενική Εξέταση Αίματος του κάθε δείγματος και υπολογίστηκαν οι παρακάτω αναλυτές κυτ/ρίας ροής: 1. Αριθμός RBCs, WBCs, PLTs, λευκοκυτταρικός τύπος 2. Αιματοκρίτης: HCT = (MCV x RBC) x 100% 3. Αιμοπεταλιοκρίτης: PCT= (MPV x PLT) x 100% 4. Αιμοσφαιρίνη: HBG= HCT/3 5. Ο μέσος όγκος RBCs (MCV), μέσος όγκος PLTs (MPV) Οι εξετάσεις γενικής αίματος στα δείγματα πραγματοποιήθηκαν σε αιματολογικό εργαστήριο σε συνεργασία με τον Κύριο Π. Αποστολόπουλο, Βιολόγος MPV Ιστόγραμμα κατανομής όγκου ερυθρών αιμοσφαιρίων MCV MCV = 88 fl
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs: ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Εικόνες ΟΜ (20x αντικειμενικός φακός) μονοστρωματικών υμενίων ολικού αίματος με 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs (C = 1 mg/ml) που επωάστηκαν για 1h. Εκτίμηση μεγέθους 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs: (0.7±0.2 μm) 1.1 μm 0.8 μm 0.65 μm 0.7 μm 0.4 μm 0.95 μm 3 μm 3 μm
Number of NPs ΜΕΤΡΗΣΗ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΤΩΝ 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs ΜΕ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΔΥΝΑΜΗΣ Μέτρηση μεγέθους: x (556±264) nm, y (714±349) nm, z (διάμετρος) 20 180 nm, με τα περισσότερα NPs να έχουν < 60 nm. α β Number of NPs 24 22 20 bidistilled H 2 O 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 NPs diameter (nm) 20 18 16 NPs incubated in platelets-rich-plasma for 1h 14 12 10 8 6 4 2 0 0 30 60 90 120 150 180 NPs diameter (nm)
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs: ΑΝΑΛΥΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ Δείγματα NPs (χωρίς έμμορφα στοιχεία του αίματος) ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ Τ. Α. Plasma (platelets poor plasma-ppp) 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs in plasma (PPP) 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs in H 2 0 Ερυθρά Αιμοσφαίρια (RBC) 4.00-6.60 (Μ/μL) 0 0 0 Αιμοσφαιρίνη (HGB) 12.0-16.0 (gr/dl) 0 0 0 Αιματοκρίτης (HCT) 37 47 (%) 0 0 0 Μέσος Όγκος Ερυθρών (MCV) 80.0 95.0 (fl) 0 0 0 ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ Τ. Α. Λευκά Αιμοσφαίρια (WBC) 4.00-10.0 (Κ/μL) 0 0 0 Πολυμορφοπύτηνα (NEUT) 40.0-70.0 (%) 0 0 0 Λεμφοκύτταρα (LYM) 19.0-48.0 (%) 0 0 0 Μονοπύρηνα (ΜΟΝΟ) 3.4-9.0 (%) 0 0 0 Ηωσινόφιλα (EOS) 0.0-7.0 (%) 0 0 0 Βασεόφιλα (BASO) 0.0-1.5 (%) 0 0 0 ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ Τ. Α. Αιμοπετάλια (PLT) 150 400 (Κ/μL) 2 1 2 Αιμοπεταλιοκρίτης (PCT) 0.16 0.35 (%) 0 0 0 Μέσος Όγκος Αιμοπεταλίων (MPV) 7.2-11.0 (fl) 0 0 0
Ερυθρά αιμοσφαίρια (RBCs) Παρατήρηση με ΟΜ για πιθανές αλλοιώσεις στο μέγεθος και στο σχήμα των RBCs του αίματος εξαιτίας της επώασής τους με τα 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ: ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ α 8.6 μm 9 μm 9 μm 8.6 μm 9.3 μm 9.7 μm 8.6 μm 8.2 μm 10 μm 3 μm β 8.2 μm 8.2 μm 3 μm 9.3 μm 9.3 μm 8.2 μm 8.2 μm 7.9 μm 6.8 μm 8.2 μm Εικόνες ΟΜ (20x αντικειμενικός φακός) μονοστρωματικών υμενίων ολικού αίματος χωρίς NPs α) πρίν και β) μετά από 1h επώασης. Μονοστρωματικά υμένια ολικού αίματος που επωάστηκαν 1h με NPs σε γ) χαμηλή και δ) υψηλή συγκεντρωση. γ Διάμετρος RBCs: (9±0.6) μm (8.3±0.7) μm 8.2 μm 7.5 μm 8.2 μm 8.2 μm 7.9 μm 8.6 μm 7.9 μm 7.9 μm 8.2 μm 8.2 μm 9 μm 9 μm 8.6 μm 9.3 μm 8.2 μm 3 μm 7.9 μm 3 μm 8.2 μm δ (8.1±0.3) μm (8.6±0.5) μm 9 μm
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ: ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΔΥΝΑΜΗΣ Μορφολογικές αλλοιώσεις της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Εξελκώσεις διάμετρος 300 nm - 1 μm βάθος έως 20 nm Aποδομήσεις διάμετρος 200 nm - 800 nm βάθος έως 100 nm
ΕΞΕΛΚΩΣΕΙΣ N=40 κύτταρα/δείγμα Ποσοστό κυττάρων με εξελκώσεις (%) Μ.Ο εξελκώσεων/ κύτταρο Μέγεθος (nm) Βάθος (nm) REF_0 min 55 0.8±0.8 684.1±218.6 19.7±6.6 REF_60 min 52.5 0.7±0.8 633.7±145.9 18.3±2.9 WB C Νps = 0.1 mg/ml_60 min WB C Νps = 1 mg/ml_60 min ΑΠΟΔΟΜΗΣΕΙΣ N=40 κύτταρα/δείγμα 77.5 1.7±1.4 566.3±127.6 15.1±3.2 92.3 2.2±1.4 595±132 15.3±3.8 Ποσοστό κυττάρων με αποδομήσεις (%) Μ.Ο αποδομήσεων/ κύτταρο Μέγεθος (nm) Βάθος (nm) REF_0 min 67.5 1.1±1.1 512.4±166.1 41.4±14.4 REF_60 min 87.5 2.3±1.5 410.4±167 35.8±13.3 WB C Νps = 0.1 mg/ml_60 min WB C Νps = 1 mg/ml_60 min 82.5 2.0±1.4 416±148.6 34.5±33.4 61.5 1.5±1.7 448.1±138.4 32.9±9.9
S a (nm) Επιφανειακή τραχύτητα (S a ) ερυθροκυτταρικής μεμβράνης 7 6 1x1 3x3 5 4 Εξωκυτταρικό περιβάλλον 3 2 1 0 REF_0 min REF_60 min WB Cnps=0.1 mgml WB Cnps=1 mgml πάχος κυτταρικής μεμβράνης = 5-7 nm Ενδοκυτταρικό περιβάλλον
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ: ΑΝΑΛΥΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ Δείγματα ολικού αίματος ερυθρά αιμοσφαίρια Πίνακας αποτελεσμάτων Γενικής Εξέτασης Αίματος: ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ Ερυθρά Αιμοσφαίρια (RBC) Αιμοσφαιρίνη (HGB) Αιματοκρίτης (HCT) Μέσος Όγκος Ερυθρών (MCV) Τ. Α. Πρίν την επώαση Μετά από 1h επώαση 4.00-6.60 (Μ/μL) 12.0-16.0 (gr/dl) 37-47 (%) 80.0 95.0 (fl) REF WB C Νps = 0.1 mg/ml WB C Νps = 1 mg/ml REF WB C Νps = 0.1 mg/ml WB C Νps = 1 mg/ml 5.40 5.10 4.95 4.35 4.35 4.35 15.8 15.0 14.5 12.8 12.8 12.8 47.5 44.9 43.6 38.3 38.3 38.3 88.0 88.0 88.0 88.0 88.0 88.0
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΑ: ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Ενεργοποίηση ουδετερόφιλων λευκοκυττάρων με το χρόνο επώασης Τα ουδετερόφιλα σε αδρανή μορφή παρουσιάζουν σφαιρικό σχήμα (κόκκινα βέλη): α β Μη Ενεργοποιημένα 50 % Ενεργοποιημένα 50 % Μη Ενεργοποιημένα 81 % Ενεργοποιημένα 19 % Εικόνες ΟΜ (20x αντικειμενικός φακός) από δείγμα buffy coat χωρίς 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs, τo οποίo α) δεν έχει επωαστεί και β) έχει επωαστεί 1h. γ δ Μη Ενεργοποιημένα 8 % Ενεργοποιημένα 92 % Μη Ενεργοποιημένα 8 % Ενεργοποιημένα 92 % Εικόνες ΟΜ (20x αντικειμενικός φακός) από δείγμα buffy coat το οποίο έχει επωαστεί 1h και περιέχει 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs σε συγκέντρωση γ) C=0.1 mg/ml και δ) C=1mg/ml.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΑ: ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΔΥΝΑΜΗΣ Μη ενεργοποιημένο ουδετερόφιλο (Πολύλοβος πυρήνας, κοκκία, διάμετρος 15 μm) κοκκία Ενεργοποιημένο Ουδετερόφιλο (Μεταβολή σχήματος, αύξηση μεγέθους κοκκίων, διάμετρος 19 μm)
ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ Λευκά Αιμοσφαίρια (WBC) Πολυμορφοπύτηνα (NEUT) Λεμφοκύτταρα (LYM) Μονοπύρηνα (ΜΟΝΟ) Ηωσινόφιλα (EOS) Βασεόφιλα (BASO) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΑ: ΑΝΑΛΥΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ Δείγματα ολικού αίματος λευκά αιμοσφαίρια Πίνακας αποτελεσμάτων Γενικής Εξέτασης Αίματος: Τ. Α. Πρίν την επώαση Μετά από 1h επώαση 4.00-10.0 (Κ/μL) 40.0-70.0 (%) 19.0-48.0 (%) 3.4-9.0 (%) 0.0-7.0 (%) 0.0-1.5 (%) REF REF C Νps = 0.1 mg/ml REF C Νps = 1 mg/ml REF REF C Νps = 0.1 mg/ml REF C Νps = 1 mg/ml 6 6 6 4.5 6 6 45.1 43.2 46.4 45.3 46.5 50.6 46.2 49.3 48.5 46.1 44.9 41.8 7.1 6.0 2.6 7.1 6.6 5.7 0.7 1.5 2.5 0.4 2.0 1.9 0.9 0.0 0.0 1.1 0.0 0.0
α 4.9μm 2.7μm 2.4μm 4.2μm 3 μm γ 4.2μm 3.3μm 6.2μm 3.7μm 3.1μm 4.2μm 3.2μm 3μm 3μm ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ: OΠTIKO ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ 2.8μm 3.3μm 3.2μm 3.1μm 2.8μm β β 3μm 3.5μm 5.6 μm δ 3.1μm 3 μm 3.1μm 2.3μm 2.3μm 3μm 4.4μm 2.4μm 3.1μm 4μm 3.5μm 3.2μm 3μm 3.1μm 3.3μm Εικόνες ΟΜ (20x αντικειμενικός φακός) από δείγμα buffy coat χωρίς 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs, τo οποίo α) δεν έχει επωαστεί και β) έχει επωαστεί 1h. Μέγεθος PLTs: α) 3.3±0.8 μm, β) 3.3±1.0 μm Εικόνες ΟΜ (20x αντικειμενικός φακός) από δείγμα buffy coat το οποίο έχει επωαστεί 1h και περιέχει 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs σε συγκέντρωση γ) C=0.1 mg/ml και δ) C=1mg/ml. Μέγεθος PLTs: γ) 3.8±1.1 μm, δ) 3.3±0.6 μm
Αδρανής μορφή (3μm) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ: ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΔΥΝΑΜΗΣ Ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο: Ψευδοπόδια (1.5-3 μm) Ψευδοπόδια Ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο: Μεταβολή σχήματος (4-6 μm) Βάθος: 180-420 nm Βάθος 236 nm Βάθος 400 nm
Δείγματα ολικού αίματος αιμοπετάλια Πίνακας αποτελεσμάτων Γενικής Εξέτασης Αίματος: ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ Τ. Α. Πρίν την επώαση Μετά από 1h επώαση Αιμοπετάλια (PLT) Αιμοπεταλιοκρίτης (PCT) Μέσος Όγκος Αιμοπεταλίων (MPV) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΑ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ: ΑΝΑΛΥΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ 150-400 (Κ/μL) 0.16 0.35 (%) 7.2-11.0 (fl) REF WB C Νps = 0.1 mg/ml WB C Νps = 1 mg/ml REF WB C Νps = 0.1 mg/ml WB C Νps = 1 mg/ml 255 300 270 240 225 315 0.24 0.22 0.24 0.22 0.20 0.26 9.6 7.4 8.8 9.0 9.1 8.2 Η παρουσία των 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs δεν επηρεάζει τον αριθμό των PLTs 1h μετά την επώασή τους και διατηρείται σε φυσιολογικά επίπεδα. Η ενεργοποίηση των PLTs είναι ενδογενής ή πραγματοποιείται από την επεξεργασία των δειγμάτων και δεν οφείλεται στα 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η παρουσία των 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs, ακόμα και σε υψηλή συγκέντρωση, δεν επηρεάζει τον αριθμό και το μέγεθος των έμμορφων στοιχείων του αίματος 1h μετά την επώασή τους. RBCs: τα επίπεδα της HGB υποδεικνύουν τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων (μεταφορά O 2 ). αύξηση του ποσοστού των RBCs με εξελκώσεις καθώς και του αριθμού των εξελκώσεων ανά κύτταρο, η οποία εξαρτάται από τη συγκέντρωση των 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs. Παρόλα αυτά οι διαστάσεις των εξελκώσεων δεν αυξάνονται με τη συγκέντρωση. το ποσοστό των RBCs με αποδομήσεις, καθώς και ο αριθμός των αποδομήσεων ανά κύτταρο εξαρτώνται από το χρόνο επώασης και πιθανόν οφείλεται σε μηχανική καταπόνηση. η επιφανειακή τραχύτητα < του πάχους της μεμβράνης, ακεραιότητα κυττάρου. WBCs: Η ενεργοποίηση των NEUT, MONO και BASO λευκοκυττάρων υποδεικνύει φυσιολογική λειτουργία. PLTs: Η ενεργοποίηση των PLTs είναι ενδογενής ή πραγματοποιείται από την επεξεργασία των δειγμάτων και δεν οφείλεται στα 68 Ga-DPD-Fe 3 O 4 NPs.
ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ Αύξηση του αριθμού των δοτών για τη γενίκευση των αποτελεσμάτων της μελέτης Μείωση της συσσώρευσης των 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs στα όργανα του Δικτυοενδοθηλιακού Συστήματος με χορήγηση λιποσωμάτων σε καρκινικά μοντέλα Απεικόνιση της βιοκινητικής του σκιαγραφικού παράγοντα ( 68 Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs) με Μαγνητική Τομογραφία (MRI) και Τομογραφία Εκπομπής Ποζιτρονίου (PET) σε πειραματόζωα. Συγκριτική αξιολόγηση με τα ζώα στα οποία έχουν χορηγηθεί λιποσώματα Ανάπτυξη και μελέτη σκιαγραφικού παράγοντα διπλής απεικονιστικής ικανότητας SPECT/MRI ( 99m Tc-Fe 3 O 4 -DPD NPs )
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών Δημόκριτος Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας