Универзитет у Новом Саду Пољопривредни факултет Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Милан Булајић Утицај етарских уља на клијавост и развиће одабраних дикотила Мастер рад Нови Сад, 2015.
Универзитет у Новом Саду Пољопривредни факултет Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Кандидат: Дипл. инж. Милан Булајић Ментор: Доц. др Бојан Константиновић Утицај етарских уља на клијавост и развиће одабраних дикотила Мастер рад Нови Сад, 2015.
Комисија за оцену и одбрану мастер рада Доц. др Бојан Константиновић, - ментор Ужа научна област: Хербологија Пољопривредни факултет, Нови Сад Проф. др Љиљана Николић, - председник комисије Ужа научна област: Ботаника Пољопривредни факултет, Нови Сад Проф. др Сања Лазић, - члан комисије Ужа научна област: Фитофармација Пољопривредни факултет, Нови Сад
САДРЖАЈ: Резиме...1 Summary...2 1. УВОД...3 2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ...5 2. 1. Етарска уља...5 2. 2. 1. Физички параметри етарских уља...8 2. 2. 2. Хемијски састав етарских уља...10 2. 2. 3. Методе добијања етарских уља...11 2. 2. 4. Ароматични продукти који се добијају описаним поступцима...12 2. 2. 5. Токсичност и иритантност етарских уља...14 2. 2. 6. Чување етарских уља...14 2. 2. 7. Уљне комбинације синергичког деловања...15 2. 2. Aлелопатија...15 2. 3. Опис гајених биљних врста које су коришћене као тест биљке...16 2. 3. 1. Салата (Lactuca sativa L.)...16 2. 3. 2. Рукола (Eruca sativa, Mill. syn. Eruca vesicatoria)...17 2. 3. 3. Бела детелина (Trifolium repens L.)...17 2. 3. 4. Фацелија (Phacelia tanacetifolia Benth.)...17 2. 4. Карактеристике тестираних етарских уља...18 2. 4. 1. Ким (Carum carvi L.)...18 2. 4. 2. Коријандер (Coriandrum sativum L.)...19 2. 4. 3. Коморач (Foeniculum vulgare Mill.)...20
3. ЗАДАТАК И ЦИЉ РАДА...22 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОД РАДА...23 5. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА...28 5. 1. Утицај етарских уља на клијавост...28 5. 2. Утицај етарских уља на пораст клијанаца...34 6. ЗАКЉУЧАК...36 7. ЛИТЕРАТУРА...37
Резиме Последњих неколико година примена етарских уља у пољопривреди постаје све интензивнија. Негативне последице континуиране примене синтетичких пестицида, навеле су истраживања ка тражењу алтернативних начина сузбијања корова, штеточина и патогена. Испитивања утицаја етарских уља на гајене биљке налазе се на самом почетку, мада према појединим резултатима ова уља имају задовољавајуће пестицидно, репелентно или симултано деловање. Етарска уља представљају комплексне смеше различитих хемијских једињења, са изразитим фармаколошким и фитофармаколошким својствима. Испитивања спроведена у мастер раду имала су за циљ утврђивање утицаја различитих концентрација етарских уља кима (Cаrum carvi L.), коријандера (Coriandrum sativum L.), и коморача (Foeniculum vulgare Mill.) на клијавост семена, развој и пораст клијанаца семена гајених биљака салате (Lactuca sativa L.), руколе (Eruca sativa, Mill.), беле детелине (Trifolium repens L.) и фацелије (Phacelia tanacetifolia Benth.). Резултати испитивања утицаја етарских уља на клијавост, показују да при различитој концентрацији примене, иста делују стимулативно или инхибиторно, у зависности од тест биљке. Повећањем концентрације етарског уља до одређених концентрација утврђен је стимулативни ефекат на дужину клијанаца, након тога повећавањем концентрације уља долази до инхибиторног ефекта. Кључне речи: етарска уља, Carum carvi, Coriandrum sativum, Foeniculum vulgare, клијавост семена, дужина клијанаца 1
Summary The last few years the application of essential oils in agriculture is becoming more intense. The negative consequences of continued use of synthetic pesticides, led the research towards finding alternative ways of controlling weeds, pests and pathogens. Examination of the effect of essential oils on cultivated plants are located at the very beginning, although in some results these oils have satisfactory pesticidal, repellent or simultaneous action. Essential oils are complex mixtures of various chemical compounds with distinct pharmacological and phytopharmacologic performance. Tests conducted in the master work was aimed to determine the influence of different concentrations of the essential oils of cumin (Cаrum carvi L.), coriander (Coriandrum sativum L.), and fennel (Foeniculum vulgare Mill.) on seed germination, seedling growth and seed development of grown plants lettuce (Lactuca sativa L.), arugula (Eruca sativa, Mill.), white clover (Trifolium repens L.) and phacelia (Phacelia tanacetifolia Benth.). Research results of influence that essential oils have on germination, show that at different concentrations of application, oils act stimulating or inhibitory, depending on the test plants. With increase of oil concentration we established stimulative effect on the length of the seedlings, thereafter increase of oil concentration leads to the inhibitory effect. Keywords: essential oils, Carum carvi, Coriandrum sativum, Foeniculum vulgare, seed germination 2
1. УВОД Последњих неколико деценија, употреба конвенционалних пестицида у сузбијању штетних агенаса у пољопривреди, била је стандрардна пракса. Међутим, учесталом и вишедеценијском применом ових средстава, јављају се последице, које на директан или индиректан начин утичу на здравље људи, животиња и штете на околину. Последице накупљања резидуа и присуство пестицида у животној средини у количинама преко нормалних (Директива о водама ЕУ, 2000) доводе до нарушавања биолошке равнотеже, смањења биодиверзитета и инкорпорације истих у ланцу исхране. Одређени број пестицида хемијског порекла је данас искључен из употребе (органохлорни исектициди, неуротоксини, метил бромид и др.), Како због потенцијалног ризика по људско здравље, загађења животне средине, ефекта на нециљане организме, тако и због развоја резистентности код циљаних штетних организама. Због наведеног, намеће се потреба за проналажењем и увођењем у употребу знатно мање опасних и отровних супстанци (Клокочар - Шмит и сар., 2006). Новија истраживања се ослањају на царство биљака, које имају способност синтезе секундарних једињења, која су мање токсична, или са одбијајућим ефектом, или могу деловати инхибиторно на раст и развој штетних организама (Bernbaum, еt al., 1996). Са научног становишта, биљке представљају огроман извор биолошки активних супстанци са инсектицидним, акарицидним, нематоцидним, бактерицидним, хербицидним, вируцидним и родентицидним деловањем (Korunić, еt al., 2008). Биљни пестициди подразумевају примену етарских уља у заштити биља, односно, они су алтернатива хемијским, синтетичким једињењима. Употреба биљних екстраката у сузбијању штетних агенаса позната је од давнина и сматра се старом колико и заштита биљака (Zibaee, еt al., 2010). Одавно је познато да биљке садрже бројне одбрамбене механизме, којима се штите од напада разних штетних агенаса (Гашић и Обрадовић, 2012). 3
Будући да су, у последње време, оваква истраживања све актуелнија, и интересантнија, и у овом раду је анализиран утицај различитих концетрација етарских уља. Три представника из фамилија Apiaceae: ким (Cаrum carvi L.), коријандер (Coriandrum sativum L.), и коморач (Foeniculum vulgare Mill.) на клијавост и пораст клијанаца одабраних врста дикотила. 4
2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 2. 1. Етарска уља Етарска уља су лако испарљиве уљасте течности, добијене из ароматичних биљака различитим физичким поступцима. Етарска уља биљкама дају карактеристичан мирис и арому. Етарска уља су најчешће течности, мада могу бити и у чврстом и получврстом агрегатном стању, у зависности од температуре. Растворљива су у чистом алкохолу, мастима и уљима, али не и у води. На ваздуху испаравају не остављајући масан траг. Светска годишња производња етарских уља се процењује на отприлике 50.000 тона, од тога 50% чине цитрусна уља (наранџа, лимун, мандарина, грејпфрут), 20% уља биљних врста рода Mentha, а остатак се, махом, добија из ароматичних биљака фамилија Rutaceae, Lamiaceae, Apiaceae, Asteraceae и Myrtaceae (Китић, 2002). Етарска уља су се употребљавала почетком десетог века и тада су се добијала мацерирањем биљака у топлим биљним уљима или још чешће у животињским мастима, али је врло мало података о безбедности тих уља која су се тада употребљавала. Данас етарска уља примењују људи различитих струка што захтева суштинско познавање безбедности (Khalili et al, 2008). Етарска уља су комплексне смеше различитих хемијских једињења (у једном етарском уљу може се наћи и до 800 једињења). Доминантна група једињења етарског уља су терпени, односно монотерпени, сесквитерпени и дитерпени, као и њихови оксидовани продукти. Поред терпена, у етарским уљима могу се наћи и друга испарљива једињења: алифатична (типа додекана, тридекана, тетрадекана, деканола, метилдодеканала, метило-леата и др.), ароматична (деривати бензоеве киселине, фенилпропаноиди, кумарини, еугенол, сафрол, миристицин, кониферил - алкохол и апиол) и специфична једињења која садрже сумпор (најчешће изосулфоцијанати и органски дисулфиди) и азот (деривати индола или алифатични амини), Китић (2006). 5
Осим код виших биљака, етарска уља се могу наћи и у неким биљкама ниже телесне организације (мрке и црвене алге). Голосеменице их садрже у листовима и иглицама четине (Pinus). Могу бити равномерно распоређена у свим органима или усредсређена само на извесне органе. Ако нека биљка садржи етарска уља у више органа, тада поједини органи садрже релативно исти квалитет уља (цејлонско циметно шибље). Дешава се да различити органи једне исте биљке садрже етарско уље различитог састава (нпр. цимет) (Китић, 2002). Количина етарског уља у биљном материјалу варира и зависи од низа фактора (Бркић и сар., 1998). Негде је то количина од 0,1%, док негде садржај може да иде и до 10%. Оно што је важно код приноса јесте познавање правог времена жетве биљног материјала који ће се екстраковати (Секулић, Маринковић 1998). Експериментима је доказано да етарска уља испољавају и дневна и сезонска варирања, у приносима, а тако и у самом квалитетету (Ристић и сар., 1998). У остале факторе који могу да утичу на садржај уља су услови гајења ароматичних биљака, а притом се мисли пре свега на квалитет земљишта и климатске услове и места гајења (Dajić Stefanović еt al., 2009). Етарска уља су природни антиоксиданти и немају дуг век трајања. Морају се чувати на хладном месту, у тамним стакленим или порцуланским боцама, са брушеним стакленим или силиконским поклопцима. Један од начина чувања етарских уља је мешање уља са етанолом, чиме се смањује брзина разградње једињења присутних у уљу. Из биљних органа се етарска уља могу изоловати на више начина. Циљ је да се добије максимална количина квалитетног етарског уља. Приликом производње етарских уља долази до промене састава проузроковане ензимском и топлотном разградњом, хидролизом, изомеризацијом или полимеризацијом компонената које чине ову сложену смешу (Пекић, 1983). На избор методе за изоловање уља утиче хемијски састав уља и део биљке у коме се уље налази (корен, стабло, лист, цвет, плод и семе). Дуго се сматрало да једињења која улазе у састав етарских уља немају значајну улогу у физиолошким процесима биљке, нити представљају део њеног адаптивног система. Претпостављало се да су многа штетна за организам, због чега су изолована у специјализованим ћелијама и одстрањују се из организма као екскрети. Бројним 6
експериментима је доказано да етарска уља активно учествују у метаболизму биљке (физиолошка функција) и да су биљци значајна за адаптацију на постојеће еколошке услове (еколошка функција). Варирањем количине и састава етарског уља биљке реагују на варијабилности у еколошким условима животне средине. Сматра се да етарска уља доприносе бољем подношењу променљивих услова животне средине. У стресним климатским околностима етарска уља могу утицати на смањење транспирације или побољшање општег температурног стања биљног организма. Такође, мирисом могу помоћи у привлачењу инсеката опрашивача (Jančić, Lakušić, 1995). Претпоставља се да је метаболизам етарских уља под контролом примарног метаболизма и да зависи од баланса фотосинтезе и искоришћења њених продуката (Ђукић и сар 2004). Поједине компоненте уља делују, како мирисом тако и другим биохемијским својствима, привлачно или одбојно на друге организме. На тај начин, ове компоненте утичу на успостављање различитих односа биљака са другим живим бићима (биљкама, животињама, микроорганизмима и човеком). Од давнина се зна да око појединих биљних врста не расту друге зељасте биљке, тј. да биљке испољавају фитотоксично дејство на друге биљне врсте, које се огледа у инхибицији клијања или раста ових врста. Прво научно тумачење такве појаве у непосредној околини жбунова жалфије, Salvia officinalis (Lamiaceae) и пелина, Artemisia absinthium (Asteraceae) дао је (Müller, 1966). Он је овај ефекат приписао дејству монотерпена, камфора и 1,8- цинеола, познатих инхибитора клијања (детектованих у земљишту и атмосфери у непосредној близини ових биљних врста. Слична појава је запажена и у непосредној близини еукалиптуса, Eucalyptus globulus (Myrtaceae), где се претпоставља да компоненте етарског уља α- и β- пинен, α- феландрен и 1,8- цинеол инхибирају клијање коренка клице (Müller, Del Moral,, 1970). Као секундарни метаболити, етарска уља су важна за опстанак биљака јер привлаче инсекте опрашиваче штите биљке од микрооргаизама и одбијају друге штетне врсте. Садрже веома сложену комбинацију природно активних састојака, чија је количина, присутност и специфичност смеше зависе од типа земљишта, географског региона у коме биљке расту, климе, надморксе висине, начина убирања, чувања и поступка добијања (Mарковић, 1995). Већина биљака које се користе за производњу етарског уља, било да су оне самоникле или су гајене, имају бројне варијетете, подваријетете, а често и сорте, 7
хибриде и клонове, чији је хемијски састав, у зависности од случаја прилично неуједначен. Код самониклих биљака, тачно дефинисан хемијски профил уља је немогуће поставити. Биљке које спонтано расту у прирди испољавају енормна генетичка варирања која се јављају као један од механизма одржања врсте. Рецимо, ако у природи дође до појаве епифитоције неког патогена, неке биљке ће угинути док ће оне са нешто другачијим генотипом, дакле боље прилагођене, преживети. Научници који су се бавили анализом састава етарских уља биљака из природе, већ су небројано пута потврдили енормну варијабилност садржаја компоненти етарских уља чак и у случајевима где су биљке расле на међусобном растојању од само неколико метара и при томе највероватније имале исте родитеље (Дајић, Стефановић и сар., 2009). Бројност биљака које се користе ради добијања етарских уља броји преко преко 30 фамилија, са негде око 90 врста које представљају главну групу биљака које дају етарска уља. Већина зачинских биљака (каранфилић, ђумбир итд.) води порекло из тропских земаља, и обрнуто, већина ароматичних биљака (кумин, мирођија, коморач, лаванда, рузмарин, тимијан, итд.) потиче из умерених климата. Иста биљка која расте на различитим географским локалитетима и под различитим еколошким условима може да произведе етарско уље различитих карактеристика (Chatopoulou et al., 2007), те је за ту врсту варијабилности прихваћен појам хемотип. 2. 2. 1. Физички параметри етарских уља Тачка паљења представља податак за релативно проценивање запаљивости етарског уља. Представља најнижу температуру при којој је изнад уља присутно довољно паре да дође до паљења на површини течности. При овој температури пара престаје да гори када се извор паљења уклони. Релативна густина - предстаља однос масе одређене запремине уља и масе једнаке запремине воде при температури од 20 С. Вредности за релативну густину прописане су ISO стандардима уља и Фармакопејама, представљају границе унутар 8
којих се мора кретати релативна густина препарата, а изражена најчешће на три децимале. Релативна густина се одређује на апарату који се зове пикнометар. Индекс преламања (рефракција) представља однос брзине светлости у ваздуху и брзине светлости у препарату. Тај је однос једнак коефицијенту синуса угла упада и синуса угла рефракције. Вредности прописане ISO стандрадима и Фармакопејама изражене су на три децимале, а односе се ако није другачије прописано, на таласну дужину D- линије натријумовог спектра и темепратуру од 20 ± 0,5 С. Оптичка ротација представља израчунат број степени за колико раствор који у један милилитар саджи један грам оптички активне материје, скреће раван линеарно поларизоване светлости таласне дужине D- линије натријумовог спектра у слоју од 1 dm при температури од 20 ± 0,5 С. Угао скретања представња број степени за колико оптички активна течност или раствор оптички активне материје скреће раван поларизације линеарне поларизоване светлости таласне дужине D-линије натријумовог спектра при температури од 20 ± 0,5 С. Скретање равни поларизације може бити надесно и означава се са (+) или налево и означава се са (-). За мерење користи се полариметар, са могућношћу мерења најмање 0,05 са натријумовом лампом. Киселински број представља број милиграма калијум хидороксида који је потребан за неутрализацију слободних киселина у један грам етарског уља. Естарски број представља број милиграма KOH који је потребан да се хидролизују естри из један грам етарског уља (Марковић, 2011). 9
2. 2. 2. Хемијски састав етарских уља Етарска уља се састоје углавном од хемијских једињења која у себи садже водоник, угљеник и кисеоник као јединице грађе. Они се могу поделити у две групе. Прву групу чине угљоводоници састављени већином од терпена (монотерпена, сесквитерпена и дитерпена). Док другу групу чине оксигенована једињења, а углавном су то естри, алдехиди, кетони, алкохоли, феноли и оксиди, а понекад има и киселина, лактона, сумпорних и азотних једињења. Терпени су лако испраљиве фракције. Они са десет угљеникових атома су сврстани у монотероене, док сесквитерпени и дитерпени припрадају теже испарљивим фракцијама. Најчешћи су лимонен (који се налази у 90% уља рода Citrus), пинен (изолован из бора), камфен, кадинед, кариофилен (присутан у етарском уљу каранфилића, конопље, рузмарина и хмеља ), кедрен (из уља кедра), дипентен, сабинен, мирцен итд. Естри миришу слаткасто и углавном потичу из уља цветова. Они су карактеристично фунгицидни и имају воћну мирисну ноту. Најпознатији су линалиацетат, геранилацетат, као и борнилацетат, еугенилацетат и лавандулилацетат. Алдехиди се типично налазе у уљима цитруса. Цитрал, цитронелал и нерал су важни алдехиди који се значајно појављују у уљима мириса на лимун. А остали алдехиди су банзалдехид, цинамични алдехид и перилалдехид. Кетони су једани од најтоксичнијих састојака, као рецимо тујон и пулегон, мада то не значи да су они и опасни. У нетоксичне кетоне се убрајају јасмоне, фенхон, камфор, карвон, ментон, итд. (Секуловић и Марковић 1998). Феноли су одговорни за јаку биљну арому уља. Најчешћи феноли су тимол, карвакрол, метил-еугенол, метил-хавикол, сафрол, миристицин и апиол. 10
2. 2. 3. Методе добијања етарских уља Неке биљне сировине, посебно цветови, подложне су брзом кварењу па је потребно прерадити их одмах по жетви, док рецимо семе и корен је могуће ускладиштити пошто се њихова етарска уља могу изоволовати и након доста времена. Која ће метода за добијање уља бити употребљена зависи највише од квалитета и типа ароматичног продукта који се жели добити. Поступци који служе добијању етарских уља су водена дестилација, дестилација воденом паром кохабација, ректификација, екстракција угљоводоничним растварачима, суперкритична СО 2 екстракција и хладно цеђење. Код процеса водене дестилације биљни материјал који се дестилише налази се потпљен у води и кува се у њој. Процес је дужи од процеса дестилације паром и погодан је за добијање етарских уља која имају пуно естара који се разбијају на одговарајуће алкохоле и карбоксилну киселину. Код процеса дестилације воденом паром биљни материјал се не кува заједно са водом већ стоји распоређен на решетци и кроз њега се проводи водена пара која носи испарљиве молекуле етарског уља до кондезатора. Код оба дестилациона поступка молекули воде се заједно са молекулима етарског уља хладе у кондезатору кроз који пролази хладна вода и враћају се у течну фазу у прихватном суду, при чему долази до раздвајања етарског уља и воде у две фазе које се не мешају. Метода је погодна за издвајање јако испарљивих компоненти (као што су терпени). Што су молекули тежи, треба им више времена да се издвоје, што често може да уништи оне лакше испарљиве. Процес кохабација се налази у течној вези са продуктом дестилације воденом паром, односно споредним продуктом овог процеса хидролатом, који се још зове и цветна водица или хидросол. Процес ректификација се употребљава ако етарско уље садржи нечистоће, овим процесом се пречисти. 11
Процес хладно цеђење је поступак за добијанје етарских уља плодова рода Citrus. Процес се своди на примену притиска на кору плода, при чему секреторне структуре пуцају, а из њих се ослобађа етарско уље које се сакупља у посебне посуде. Екстракција угљоводоничним растварачима (петролетар, хексан), при чему се добијају и испарљиве и неиспраљиве компоненте. Продукт се зове concre и састоји се од 50% етарског уља и 50% воскова. У овом стадијуму се додаје растварач (етанол) који раствара восак. Преостала мешавина алкохола и воска се упарава под вакумом, при чему се добија absolut који у себи и даље садржи растварач (око 2% етанола). Суперкритична СО 2 екстракција прилико које се добија течни СО 2 екстрат. Метода је доста скупа, брза и без примене темепературе. Добијени изолат се разликује од класичног етарског уља. Ово је екстракција помоћу течног гаса или суперкритичног флуида, пошто се користе флуиди који се налазе на температури и притиску изнад њихових критичних вредности. Течни CO 2 се може користити као врло инертан, безбедан течни растварач, који врло ефикасно екстрахује ароматичне компоненте из биљног материјала. Предност овог поступка у односу на класичну екстракцију органским растварачима је у томе што се CO 2 након контакта са материјалом не задржава у продукту, пошто се на нормалној температури и притиску претвара у гас и одводи у атмосферу. Истовремено, етарско уље добијено суперкритичном екстракцијом има богатији, интезивнији мирис, у односу на оно добијено екстракцијом органским растварачима, јер се овим поступком екстрахује више ароматичних компоненти из биљке. Помоћу течног CO 2 могу се добити и неке ароматичне компоненте из делова биљака који немају есенцијална уља, као што су нпр.семе црвеног шипка или невена. Мора се констатовати да инвестициони и оперативни трошкови овог поступка нису мали, али је он погодан за ектракцију многих светлих уља, као што је случај код јасмина (Совиљ и Спасојевић, 2001). 2. 2. 4. Ароматични продукти који се добијају описаним поступцима Већина уља се производе дестилацијом помоћу водене паре. На овај начин се врши изоловање само испарљивих и водорастворљивих делова биљке, док се друга, често драгоцена једињења искључују (танини, гуме и горке материје). Понекад се добијено уље изнова дестилише у покушају да се ослободи од неиспарљивих једињења. 12
Нека етарска уља се редестилишу на другачијим температурама како би једне компоненте задржале, а друге одбациле, као код уља камфора које се овом приликом издели у три засебне фракције. Последњих деценија се истраживало на тему изоловања етарских уља екстракцијом течним угљендиоксиодом. Уља добијена овим поступком су показала изваредан мирисни квалитет и у себи нису садржавала остатке растварача ни испарљиве материје. Сoncre-он се добија из биљних сировина као што су корен, цвет, лист или кора, који се екстракују помоћу угљоводоничног растварача. Овај поступак је важан у случајевима где врела вода и пара утичу негативно на састав етарског уља. На овај начин се добија уље које је по саставу и мирисним својствима најближе уљу садржаном у самој биљци. Неке биљке, као лаванда и мускатна жалфија, могу се дестилисати воденом паром и из њих ће се добити етарско уље, а могу се користити и за добијање сoncre-а методом солвентне екстракције, при чему је то што се добија чврсте и воскасте структуре. Већина concre-а садржи у себи 50% воска и 50% испарљивог уља. Ређи је случај да је concre у течном стању, пошто садржи 80% етарског уља и само 20% воска. Предност concre-а је да је он стабилнији и концентрованији од чистог етарског уља. Резиноид-он се добија екстракцијом угљоводоничним растварачем из природних резиноидних материјала. За разлику од concre-а, резиноиди се припремају из сувог органског материјала. Типични резиноидни материјали су: балзами, резини, олеорезини, олеогум резини. Резиноиди могу бити вискозне течности, получврсте или чврсте, али најчешће су хомогене материје које не кристалишу. Алкохолно растворљива фракција резиноида се зове резиноидни absolut. Неки резиноидни материјали, као што су тимјан и мира, користе се за добијање било етарског уља дестилационом паром или резинског absolut-а алкохолном екстракцијом директно из сировог олеогум резина. Код неких резиноидних материјала поступак дестилације није прикладан, као код балзама бензоина, који уствари није довољно испарљив да би се из њега етарско уље изоловало на овај начин. Производ, течни бензоин, често је бензоин резиноид растворен у погодном растварачу. Absolut-он се добија из concre-а, екстакцијом етанолом (чистим алкохолом) у коме се восак,који није пожељан, разложи. Овај поступак се више пута понавља, али често и након тога део воска остаје. Неки аbsolut-и задрже у траговима етил алкохола 13
(до 2%) и као такви нису препоручљиви за терапијску примену, већ за примену у парфемима, где је најважнији мирис. 2. 2. 5. Токсичност и иритантност етарских уља Што се тиче једињења садржаним у етарским уљима иритансима се сматрају алдехиди. Међутим само 35% њих јесу иританси, а 25% сензибилизатори. Изузев бензилалдехида, алдехиди не доприносе већој токсичности етарских уља. Што се тиче кетона, токсично је негде око 65% њих. Феноли су најопаснија група једињења. Половина фенола су иританси, а 30% је токсично, а 1% карциногено. Феноли се јављају као главни конституенси у око 10-15 врста етарских уља. Најчешћи феноли у етарским уљима су анетол, еугенол, карвакрол, тимол, апиол и метилхавикол. Асарон је канцероген и токсичан, метилхавикол је умерено токичан и канцероген. Сафрол је канцероген. Ове супстанце у неком временском периоду врше хроничну иритацију и проузрокују раст и формирање канцерских ћелија као одговор на ту иритацију. 2. 2. 6. Чување етарских уља На чување етарских уља треба обратити посебну пажњу. Прописује га ISO стандард. Као што је познато она су испарљива и ако се чувају у херметички затвореним, до врха пуним, тамним стакленим и металним флашама, у потпуном одсуству кисеника (тј. ваздуха), на тамном и хладном месту могу остати непромењена годинама. Када се флашица једном отвори, дужина трајања се знатно скраћује, јер се сваким отварањем губи део испраљивих молекула. Што је више празног простора у флаши, лакше долази до оксидације уља која води прецесу деградације. Уља богата естрима могу се временом укиселити, јер естри хидролизују до карбоксилне кислеине и алкохола. Она уља која имају већи проценат алкохола су најдуготрајнија, јер поседују хемијску стабилност (Марковић, 2011). 14
2. 2. 7. Уљне комбинације синергичког деловања Синергичко деловање етарских уља представља удружено деловање саставних компоненти тог уља, које коче или поспешују деловање једни другима. Тако да не можемо генерализовано рећи да су нпр. сви алдехиди иританси. Један од разлога прављења мешавина различитих уља је разблаживање ризичних компоненти садржаних у неком од њих. Генерално, добро се слажу уља која потичу из биљке исте фамилије. Такође се мешају добро уља која имају сличан хемијски састав, као на пример камфораста уља која у себи имају висок проценат цинеола, а то су сва уља из фамилије Myrtaceae (еукалиптус, чајно дрво, итд.) али и многа друга као рецимо уље рузмарина, шпанске жалфије, итд. Нека уља као на пример уље руже, јасмина, лаванде по свему судећи могу да побољшају мирисни карактер било које мешавине, те се често могу наћи међу састојцима најпродаванијих парфема у свету. 2. 2. Aлелопатија У сузбијању корова у савременој пољопривреди примаран акценат је на коришћењу хербицида, али њихова претерана употреба може изазвати озбиљне проблеме у резистентности корова (Macias et al., 2003), еколошке загађености и нежељене ефекте на људско и животињско здравље. Све ово води ка повећању важности коришћења нехемијских и еколошких алтернатива у сузбијању корова. На тај начин се развила алелопатија. Алелопатија је дефинисана као директно или индиректно штетно или повољно дејство једне биљке, гљиве или микроорганизма, једних на друге путем продуковања алелохемијских супстанци које спадају у биолошке (Rice, 1984). Алелопатску активност коју користи род биљке у борби против корова може се искористити да се објасни позадина дејства хербицида (Singh et al., 2003, Reigosm et al., 2001). Истраживане су ароматичне биљке као потенцијалне алелопатске супстанце. (Ђикић, 2005) говори о инхибиторном ефекту кима, коријандера, мирођије на развој салате (Lactuca sativa). (Dhima et al., 2009) су открили да вишак воде у надземном делу босиљка, коријадера и оригана редукују развој и раст коштана (Echinochloa sp.). 15
2. 3. Опис гајених биљних врста које су коришћене као тест биљке 2. 3. 1. Салата (Lactuca sativa L.) Салата је једногодишња дикотиледона биљка, спада у фамилију главочика (Asteraceae) пореклом из Азије, Европе и северне Африке. Претпоставља се да је салата настала мутацијом од дивље врсте Lactuca scariola. Данас је салата често гајено поврће, у многим земљама гаји се током читаве године, комбинујући производњу на отвореном пољу и у заштићеном простору. У исхрани се најчешће користи свежа. Значај у исхрани проистиче због богатог минерално витаминског састава и освежавајућег дејстава. Познато је да регулише рад срца, бубрега, снижава крвни притисак и смањује напетост. Од минералних материја салата је богата калијумом, калцијумом, фосфором, магнезијумом, а посебно је значајан садржај гвожђа, мангана, молибдена и цинка. Неке сорте садже више витамина C и протеина, а мање угљених хидрата. Сви вегетативни органи садрже лактуцин и лактукопикрин у млечном соку који дају горак укус, а повољно делују на апетит (Ђуровка, 2008). Површине салате у свету износе просечно око милион хектара, а највећи произвођачи су Кина са 500.00 ha (22 t/ha), САД 130.000 ha (35 t/ha), и Индија 120.000 ha (6,5 t/ha). У Европи се гаји на око 144.000 ha (23 t/ha), највише у Италији 50.000 ha (20 t/ha), Шпанији 39.000 ha (23,5 t/ha) и Турској 20.000 ha (19 t/ha). Код нас се званично (статистички) салата не води посебно, а проценат је да се производи на око 2 2.500 ha (Ђуровка, 2008). У огледу је употребљено семе салате: Сорта Мајска краљица. Биљка је средње бујна, тип масленке, равне површине и обода листа, примарни листови крупни и равни са површином земљишта. Главица је зелене боје и збијених листова, по рубу са благим антоцијаном, у пречнику 11 cm, просечне масе 200-220 g. У технолошкој зрелости је за 65 дана од ницања. Гаји се као рано пролећна салата. 16
2. 3. 2. Рукола (Eruca sativa, Mill. syn. Eruca vesicatoria) Рукола се гаји као једногодишња или двогодишња биљка спада у фамилију Brassicaceae. Води порекло из Медитерана и западне Азије, где је и сада самоникла на појединим локалитетима. Узгајали су је и користили још стари Римљани, а сада се највише узгаја у Италији. У континенталном подручју се ређе гаји. Узгаја се због листова оштрог пикантног укуса и богатог витаминима C (75 mg/100g). Користи се свеже као додатак салатама, а у Италији и кувано као додатак јелима у комбинацији са другим поврћем. Има стимулативно деловање на људски организам, нарочито на желудац и црева (Ђуровка, 2008). У огледу је употребњено семе руколе: Сорта Елита. 2. 3. 3. Бела детелина (Trifolium repens L.) Бела детелина је самоникла вишегодишња зељаста биљка из породице Fabaceae. У природи се могу разликовати три морфолошки различите форме беле детелине и то: патуљаста, интермедијарна и крупнолисна. Изузетно је значајна крмна биљка која уз црвену детелину, због високог процента беланчевина и других хранљивих материја све више заузима површине под ливадама и пашњацима. Значајна је лековита, јестива и медоносна биљка. Одликује се високом хранљивом вредношћу и сварљивошћу суве материје. Веома је богата минералним материјама, па је најбоља биљка за напасање домаћих животиња (Ђукић и сар., 2004). У огледу је употребљено семе беле детелине: Сорта Mereyn. 2. 3. 4. Фацелија (Phacelia tanacetifolia Benth.) Фацелија је једногодишња биљка, пореклом из Америке, док се као медоносна биљка у Европи гаји од 19 века. Спада у фамилију Boraginaceae. Фацелија се гаји за различите намене: као биљка за пашу пчела, за силажу, за сено, за производњу еколошког ђубрива. Најчешће се гаји као медоносна биљка и заштитна култура. Као природни инсектицид је врло пожељна. Током своје вегетације фацелија потроши значајне количине кисеоника (и до 150 kg/ha). 17
Она у кратком временском периоду формира релативно велику надземну биљну масу (принос је 3-5 тона суве материје). Услед тако висoког садржаја кисеоника у биљци, након заоравања изузетно брзо се разграђује у земљи. Фацелија може да се користи код јако закоровљених усева једногодишњим или вишегодишњим травним коровима. Обзиром да дуго цвета (и до месец дана), фацелија је значајан извор нектара и полена за пчеле и друге бројне корисне инсекте (Ерић и сар., 2011). 2. 4. Карактеристике тестираних етарских уља 2. 4. 1. Ким (Carum carvi L.) Ким или дивљи кумин (fam. Apiaceae) спада у најстарије и најомиљеније зачине света. Ким садржи 3-7% етарског уља (oleum carvi aetheroleum) од чега преко 65% карвона, којег има и уљима мирођије и кумина, и око 30% терпена лимонена. Уље кима је бистра безбојна течност нагорког, ошрог и карактеристично ароматичног укуса. Етарско уље кима обично садржи велики број компонената, чак и до 30, али две компоненте карвон и лимонен чине обично више од 95%, док су све друге компоненте присутне у траговима мириса (Аћимовић 2013; Аћимовић и сар., 2014). Kарвон се може користити као инхибитор клијања кромпира, бактериостатик, као и фунгицид. Ова компонента такође поседује и инсектицидна својства. Лимонен поседује антифугална, антибактеријска, антиоксидантна и антиканцерска својства. Лимонен се користи као инксетицид за конторлу ектопаразита код кућних љубимаца, али има и ефекте на многе инсекте. Састојци етарских уља, у овом случају карвона и лимонена, и њихов кванититвни однос је главни критеријум квалитета производње кима. Познато је да је састав етарских уља генетички условљен, али такође зависи и од климатских услова током стадијума формирања плода и сазревања. Временски услови током периода раста детерминишу развој биљке и дистрибуцију њених састојака, што узрокује варијације у количини акумулираних етарских уља. Међутим, пошто ова биљка расте на врло малим подручијима, углавном у баштама и двориштима, тешко је одредити тачан утицај подручја и климе. Зна се да суша има негативно дејство на принос кима, који се може значајно смањити у условима вискоих темепература. Највиши садржај етарских уља ким има у Банату, као последица суве климе током периода вегетације. 18
Познато је да биљка у неодговрајућим условима акумулира више секундарних метаболита, међу којима су и етарских уља. Ким је стомахик, спазмолитик, карминатив, холагог, аперитив, еменагог, експекторанс, као и благ антимикробни агенс. Етарско уље кима подстиче рад желуца и жучи, умирујуће делује на црева, смирује грчеве и истерује гасове. Уље спречава развој бактерија у цревима које ометају правилно растварање хранљивих састојака и узрокују настанак различитих отрова у цревима. 2. 4. 2. Коријандер (Coriandrum sativum L.) Име коријандер потиче од речи корос (инсект, буба), због непријатног мириса ове биљке. Комерцијално се гаји велики број прилично раличитих варијетета. Неки типови имају крупна семена са мало етарског уља, а неки ситна семена са вишим садржајем етарског уља. Одабир варијетета ће зависити од климатских услова на датој географској локацији и од доба године који је битан за постизање максималног приноса. Коријандер је једногодишња биљка из фамилије Apiaceae, висине до 70 cm, са фино издељеним, перастим листовима. Цветови су беле до црвенскасто - љубичасте боје. Плодови су светло браон и јако су ароматични. Верује се да ова биљка води порекло из јужне Европе али се широко гаји у свим медитеранским земљама, као и у Холандији, централној и источној Европи, Канади, Кини, Индији, Мексику, Гватемали, Аргентини и на Индијском континенту. Данас су примарни извори ове биљке Русија, Египат и Индија. Уље се добија дестилацијом са воденом паром из делимично сувих, потпуно зрелих, смрсканих плодова. Приноси уља се крећу 0,4-1%. Крупнозрни коријандер који се гаји у Саскачауну (Канада) садржи 1-1,5% уља. Опис уља: бистра течност, безбојна до бледожуте боје, са карактеристичним, зачинским мирисом који подсећа на линалол. Састав уља: међународни ISO стандард за уље плода коријандера прописује опсег варирања карактеристичних компоненти овог уља. Етарско уље коријандра тестирано на кожи људи у концентрацији од 6% није довело до иритације или сензибилизације (Kligman 1971). 19
Упркос овим подацима етарско уље коријандра је било тестирано као потенцијални алерген (Loveman, 1983). Етарско уље коријандра је добило GRAS статус од стране FEMA 1965. године, и било је одобрено од стране F.D.A. за употребу у храни 182.10 и 182.20. Европски савет је 1970. године дозволио његову примену у храни са могућношћу лимитирања активних принципа у финалним производима. Препоруке за примену: до 10% саржаја у мирисном концентрату и до 50 ppm као додатак храни ради укуса. Семе коријандера се користило хиљадама година, а пронађено је и у грчким палатама из 15 века пре нове ере. Још су га стари Египћани користили како додатак храни и лековима. Код прелома костију наносили су завоје натопљене у смеши коријандера, меда и још једног нама непознатог биљног сока. Коришћен је и за купке које би смиривале грозницу. Семе су стари Римљани користили да би ароматизовали хлеб, и као средство против надимања и стомачних тегоба различите етиологије. Индуси су сматрали семе коријандера корисним леком за бол у грудима. Малајци су млели семе у смесу коју су мешали са медом и користили за кашаљ. У европској медицини се користи као средство за искашљавање и стимуланс за апетит. Семе и етарско уље су дуго коришћени због својих одличних својстава при отклањању стомачних тегоба, посебно при ублажавању спазмотичних стања дигестивног тракта. Ово етарско уље је ароматично и оно делује као средство против надимања, за ублажавање болова изазваних реуматизмом и неуралгијом, за ублажавање бола у цревима изазваном неким пургативима (Kostić et al, 2007). Семе се од давнина користи за ароматизацију алкохолних пића и хране, укључујући и слаткише. Етарско уље се интезивно користи као ароматизер са максимумом примене од 0,012%. 2. 4. 3. Коморач (Foeniculum vulgare Mill.) Коморач је ароматична биљка из фамилије Apiaceae. Има два типа од комерцијалног значаја: горки коморач - Foeniculum vulgare Mill. subsp. vulagare var. vulgare, и слатки коморач Foeniculum vulgare Mill. subsp. vulagare var. dulce. Ова два варијетета коморача се разликују по станишту, морфологији и развојном циклусу (горки коморач је вишегодишња, док је слатки коморач једногодишња биљка), 20
али у садржају и саставу етарског уља. Коморач обично саджи 2-6% етарског уља, чија је главна компонента trans-анетол који чини 60-90% етарског уља. Варијетет vulagare се карактерише релативном високом концентрацијом фенхона (12-2 2%) и α-пинена (1,8-4,7%) и ниском концентрацијом лимонена (1,5-2,5%). За разлику од њега, var. dulce има нижу концентрацију α-пинена (0,4-0,8%) и већу концетрацију лимонена (4,2-5,4%), док је фенхон заступљен са мање од 1% (Embong et al. 1997). Зрели плдови и етарско уље коморача се користе у прехрамбеној индустрији за побољшање укуса хлеба и пецива, при производњи слаткиша, у алкохолној индустрији (Bowes и Zheljazkov 2005). Такође се додаје храни као природни конзерванс. Нашироко се користи и у фармацеутским и козметичким производима (Rather еt al. 2012). Плодови ове биљке познати су по својим хепатопротективним ефектима (Ozbek et al. 2004), као антиспазмолитик (Khalighi et al. 2008), диуретик (Beaux et al. 1997). Такође делује и антинфламаторно и аналгетички (Choi i Hwang, 2004). Поред тога, он је и галактогог: супстанца која се користи за повећање продукције млека код људи и животиња (Mahfouz i Sharaf-Eldin 2007). Такође има и антимикробна, антифугалана и антиоксидативна својства (Singh еt al. 2006; Shahat еt al. 2011). Количина и састав етарског уља зависи од унутрашњих фактора од којих је најважнија генетска структура, али и спољашњих фактора посебно од еколошких услова. Како наводи Embong et al. (1997), количина етарског уља у биљкама коморача зависи од услова године, док је састав константан, и на њега временски услови не утичу. Бројним истраживањима је установљено да агротехничке мере утичу на хемијски састав етарског уља коморача. Поготово ђубрење (Khalili еt al. 2008), наводњавање (Embong еt al. 1997), али и сорта, датум сетве, присуство болести итд. (Bowes и Zheljazkov 2005). 21
3. ЗАДАТАК И ЦИЉ РАДА Задатак и циљ истраживања јесте утврђивање утицаја различитих концетрација етарских уља кима (Cаrum carvi L.), коријандера (Coriandrum sativum L.), и коморача (Foeniculum vulgare Mill.) на клијавост семена, развој и пораст клијанаца семена гајених биљака, салате (Lactuca sativa L.), руколе (Eruca sativa, Mill.), беле детелине (Trifolium repens L.) и фацелије (Phacelia tanacetifolia Benth.) Добијени резултати треба да укажу да ли семена анализираних дикотиледоних биљака под утицајем етарских уља смањују или повећавају клијавост и да ли има утицаја на пораст клијанаца у зависности од концентрације етарских уља којим је семе третирано. 22
4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОД РАДА Ситнозрни коријандар (Coriandrum sativum L. var microcarpum), једногодишњи ким (Carum carvi L. var. annuum) и вишегодишњи (горки) коморач (Foeniculum vulgare Mill. var vulgare) гајени су на експерименталном пољу у Мошорину (45 18' N, 20 09' E, надморска висина 111 m) током 2013. и 2014 године. Земљиште на ком је изведен оглед је класификовано као карбонатни чернозем (8,4 % Ca CO3), слабо алкалне реакције (ph 7,3), слабо хумозно (2,7 %) са средњим садржајем укупног азота (0,18 %). Обезбеђеност лакоприступачним фосфором (81,6 mg/100g земљишта) и калијумом (75,1 mg/100g земљишта) је превисока. Екстракција етарског уља из самлевених плодова изведена је поступком хидродестилације на апаратури по Clevenger-у у трајању од 3 сата, а одређивање компонената етарског уља путем гасне-хроматографије / масене-спектрометрије (GC / MS). За GC / MS анализу је коришћен гасни хроматограф Agilent 6890 систем повезан са селективним масеним детектором "Agilent 5973MSD", у позитивном режиму EI. Раздвајање је вршено на капиларној колони "Agilent 19091 S-433 HP-5MS", дужине 30 m, унутрашњег пречника 0,25 mm и дебљине филма 0,25 μm. Као носећи гас коришћен је хелијум са протоком од 0,1 ml/min мерено на 210 C. Температура колоне је била линеарно програмирана од 60 C do 285 C, а брзина подизања температуре од 4,3 C/min. Ињектиона температура је била 250 C, температура извора 200 C; температура интерфејса 250 C; енергија јонског извора, 70 ev. Мерење маса вршено је у опсегу 40-350 Daltona са 11,47 сканова у минуту. Идентификација компоненти је изводена на основу ретенционог индекса и поређењем масених спектара са спектрима библиотека "Wiley" и "NIST". 23
Плод коријандра (Coriandri fructus) садржи од 0,8 до 1,8% етарског уља (Coriandri aethroleum) која је бистра безбојна или жућкаста течност наљутог укуса и пријатног ароматичног мириса. У етарском уљу коријандра пореклом из Европских земаља доминира монотерпенски алкохол линалол са 58,0-80,3%, а потом следе γ- терпинен (0,3-11,2%), α- пинен (0,2-10,9%), p-цимен (0,1-8,1%), камфор (3,0-5,0%) и геранил ацетат (0,2-5,4%) (Aćimović 2013; Aćimović 2014). У огледима смо користили етарско уље коријандера које је имало 21 компоненту (Табела 1), са уделом линалола од 72,0%, γ-терпинен од 8,6% и α-пинен од 6,7%, док су све остале компоненте биле присутне са мање од 5%. Табела 1. Компоненте и њихов удео у етарском уљу коријандера Компонента R.t. R.I. Udeo komponente triciklen 5.551 922 trag α-hujen 5.622 932 trag α-pinen 5.809 935 6,7 kamfen 6.218 950 0,7 sabinen 6.908 975 0,3 β-pinen 7.019 980 0,6 mircen 7.398 993 0,8 α-terpinen 8.240 1018 trag p-cimen 8.546 1027 0,8 limonen 8.690 1031 1,8 γ-terpinen 9.79 1061 8,6 terpinolen 10.941 1093 0,4 linalol 11.448 1101 72,0 kamfor 13.234 1147 3,6 borneol 14.140 1167 trag terpinen-4-ol 14.664 1179 0,1 α-terpineol 15.239 1192 0,2 karvon 17.468 1251 trag geraniol 18.040 1254 2,2 geranil acetat 23.812 1388 1,1 trans-kariofilen 25.379 1424 0,1 ~100.0 R.t. ретенционо време R.I. ретенциони индекс, trag компонента приноса са мање од 0,1% Плод кима (Carvi fructus) садржи од 1 до 6% етарског уља (Carvi aethroleum) које је бистра безбојна течност нагорког и оштрог укуса и карактеристичног ароматичног мириса. Етарско уље кима обично садржи велики број компоненната, чак и до 30, али 24
две компоненте карвон и лимонен чине обично више од 95%, док су све друге компоненте присутне у траговима мириса (Аћимовић 2013; Аћимовић и сар., 2014). Етарско уље кима које смо користили у огледима чинило је 14 компоненти (Табела 2), од којих су најзаступљенији били карвон са 50,2% и лимонен са 48,4%, док су све остале компоненте биле заступљене са мање од 1%. Табела 2. Компоненете и њихов удео у етарском уљу кима Komponenta R.t. R.I. Udeo komponente α-pinen 5.838 933 trag sabinen 6.914 976 trag mircen 7.400 994 0,3 p-cimen 8.553 1029 0,1 limonen 8.732 1038 48,4 γ-terpinen 9.797 1061 0,4 trans-p-menta-2,8-dien-1-ol 12.218 1137 trag cis-limonen oksid 12.805 1133 trag trans-limonen oksid 12.960 1140 0,1 trans-dihidro karvon 15.856 1206 0,1 trans-karveol 16.472 1222 0,1 neo,izo-dihidro karveol 16.886 1228 0,1 karvon 17.644 1251 50,2 trans-kariofilen 25.379 1419 0,1 ~100.0 R.t. ретенционо време R.I. ретенциони индекс, trag компонента приноса са мање од 0,1% Плод горког коморача (Foeniculi fructus) треба да садржи најмање 4% етарског уља (Foeniculi aethroleum) које је бистро безбојно до светло жуте боје, слатког и ароматичног укуса и мириса, са најмање 60% trans - анетола и најмање 15% фенхона (Ph. Jug. V 2001). Етарско уље коришћено у огледу имало је 16 компоненти (Табела 3), а најзаступљенији је био транс-анетол са 67,1%, потом фенхон са 22,6%, док су све остале компоненте биле присутне са мање од 5%. 25
Табела 3. Компоненте и њихов удео у етарском уљу коријандера Komponenta R.t. R.I. Udeo komponente α-pinen 5.738 936 3,3 kamfene 6.144 951 0,2 sabinen 6.826 976 0,1 β-pinen 6.933 980 0,2 mircen 7.317 994 1,0 α-felandren 7.774 1008 0,3 p-cimen 8.454 1028 trag limonen 8.586 1031 2,2 β-ocimen 8.906 1040 trag γ-terpinen 9.671 1060 0,6 cis-sabinen hidrat 9.979 1064 trag fenhon 10.781 1084 22,6 kamfor 13.095 1142 0,4 methil kavikol 15.408 1200 2,0 cis-anetole 17.884 1248 trag trans-anetol 19.464 1282 67,1 ~100.0 R.t. ретенционо време R.I. ретенциони индекс, trag компонента приноса са мање од 0,1% За анализу клијавости и раста клијанаца одабраних дикотила у студији фитотоксичног ефекта корштена су етарска уља из семена биљних врста: Lactuca sativa L., Trifolium repens L., Eruca sativa Mill., Phacelia tanacetifolia Benth. Семена су површински стерилисана потапањем у раствор фунгицида на бази манкозеба, у трајању од 15 секунди, а затим постављена у Петри посуде. Семена су постављена између три слоја филтер хартије, који су импрегнирани дестилованом водом или различитим растворима етарских уља у количини од 7 ml по Петри посуди. Етарска уља, у вода - ацетон раствору (99,5:0,5), примењени су у дозама 2.5 µ/ml, 1.25 µ/ml, 0.625 µ/ml, 0.25 µ/ml, 0.125 µ/ml, и 0.06 µ/ml. Контрола која је третирана раствором ацетоном и дестилованом водом није показала разлику у поређењу са контролом која је била третирана само дестилованом водом. Петри посуде су постављене у клима комору (слика 1), са просечном дневном температуром од 24 C и просечном ноћном температуром која је износила 20 C, са влажношћу ваздуха од 80 % и природним фотопериодом. 26
Слика 1. Постављање Петри посуда у клима комору (Фото: Оригинал) Оглед је праћен сваки дан (Слика 2), а након четири дана мерена је дужина клијанаца (mm), а четвртог дана утврђен је укупан број проклијалих семена. Свака варијанта урађена је у четири понављања са по 15 семена у свакој Петри посуди. Резултати су приказани као просечне вредности броја проклијалих семена и дужине клијанаца. Статистичка обрада података урађена је у програму Statistica 13. Слика 2. Свакодневно праћење огледа (Фото: Оригинал) 27
5. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 5. 1. Утицај етарских уља на клијавост Клијање семена је важна фаза у животном циклусу семена, пре свега јер је то почетна етапа развоја биљака. Такође, успешност даљег раста биљака, зависи од успешности клијања семена (Јовичић и сар. 2011). Многи биотички и абиотички фактори утичу на клијање семена, а такође и на главну компоненту квалитета семена клијавост. Употребом различитих етарских уља у шест концентрација, забележене су варијације у погледу клијавости семена испитиваних биљака. При концентрацији од 0,06 µ/ml најмања просечна клијавост семена од 2,25, утврђена је применом етарских уља Carum carvi и Coriadnrum sativum код биљке Phacelia tanacetifolia. Највиша просечна клијавст утврђена је применом етарског уља Coriandum sativum, код гајене биљке Trifolium repens, а износила је 13,50 (Слика 3). Код примене сва три испитивана етарска уља Carum carvi, Coriadnrum sativum и Foeniculum vulgare забележене су високо значајне статистичке разлике у погледу клијавости семена код биљака Phacelia tanacetifolia и Trifolium repens. Стимулативни ефекат утврђен је код етарског уља Coriandrum sativum L. У контролним варијантама, просечан број клијавих зрана кретао се од 2,75 код Phacelia tanacetifolia до 10,58 код Lactuca sativa (Табела 4). 28
Слика 3. Највиша просечна клијавст утврђена је применом етарског уља Coriandum sativum, код гајене биљке Trifolium repens (Фото: Оригинал) Табела 4. Резултати утицаја етарског уља концентрације 0,06 µ/ml на клијавост семена Етарско уље Тест биљка Клијавост* Carum carvi Phacelia tanacetifolia 2,25 a Coriandrum sativum Phacelia tanacetifolia 2,25 a Kontrola Phacelia tanacetifolia 2,75 a Foeniculum vulgare Phacelia tanacetifolia 4,00 a Carum carvi Eruca sativa 7,75 b Coriandrum sativum Lactuca sativa 8,75 b Carum carvi Lactuca sativa 9,00 b Coriandrum sativum Eruca sativa 9,50 bc Foeniculum vulgare Lactuca sativa 9,50 bc Kontrola Eruca sativa 9,91 bc Kontrola Trifolium repens 10,08 bcd Kontrola Lactuca sativa 10,58 bcd Foeniculum vulgare Eruca sativa 10,75 bcd Foeniculum vulgare Trifolium repens 12,25 cd Carum carvi Trifolium repens 12,50 cd Coriandrum sativum Trifolium repens 13,50 d *иста слова означавају исти ниво значајности без статистички значајне разлике (p < 0.05) **различита слова означавају различите нивое са статистички значајним разликама (p < 0.05) 29
При концентрацији етарских уља од 0,125 µ/ml, најмања просечна клијавост семена од 2,25 је утврђена код примене етарских уља Carum carvi. и Coriadnrum sativum код биљне врсте Phacelia tanacetifolia. Док је највиша клијавост при истој концентрацији етарског уља утврђена применом етарског уља Coriandum sativum, код гајене биљке Trifolium repens, и износила је 12,00. Код примене сва три етарска уља, забележена је значајна статистичка разлика, у погледу клијавих семена гајених биљака Phacelia tanacetifolia, и Trifolium repens (Табела 5). У контролним варијантама, просечан број клијавих зрана кретао се од 2,75 код Phacelia tanacetifolia до 10,58 код Lactuca sativa. Табела 5. Резултати утицаја етарског уља концентрације 0, 125 µ/ml на клијавост семена Etarsko ulje Test biljka Klijavost* Coriandrum sativum Phacelia tanacetifolia 2,25 a Kontrola Phacelia tanacetifolia 2,90 a Foeniculum vulgare Phacelia tanacetifolia 3,00 a Carum carvi Phacelia tanacetifolia 3,50 a Carum carvi Eruca sativa 4,50 ab Carum carvi Lactuca sativa 7,00 bc Coriandrum sativum Lactuca sativa 8,00 cd Carum carvi Trifolium repens 8,50 cd Foeniculum vulgare Lactuca sativa 9,50 cde Foeniculum vulgare Eruca sativa 9,75 cde Kontrola Eruca sativa 9,98 cde Kontrola Trifolium repens 10,20 de Coriandrum sativum Eruca sativa 10,25 de Kontrola Lactuca sativa 10,72 de Foeniculum vulgare Trifolium repens 10,75 de Coriandrum sativum Trifolium repens 12,00 e *иста слова означавају исти ниво значајности без статистички значајне разлике (p < 0.05) **различита слова означавају различите нивое са статистички значајним разликама (p < 0.05) 30
При концентрацији од 0,25 µ/ml, најмања просечна клијавост зрна је утврђена применом етарског уља Coriadnrum sativum код биљке Phacelia tanacetifolia и износи 2,25. При истој концентрацији највиша клијавост је утврђена применом уља Coriadnrum sativum код биљке Trifolium repens и износи 13,00. Код примене сва три испитивана етарска уља утврђене су високо значајне статистичке разлике у погледу клијавости семена биљака Phacelia tanacetifolia и Trifolium repens (Табела 6). У контролним варијантама, просечан број клијавих зрана кретао се од 3,20 код Phacelia tanacetifolia до 11,05 код Lactuca sativa. Табела 6. Резултати утицаја етарског уља концентрације 0,25 µ/ml на клијавост семена Етарско уље Тест биљка Клијавост* Coriandrum sativum Phacelia tanacetifolia 2,25 a Kontrola Phacelia tanacetifolia 3,20 a Carum carvi Phacelia tanacetifolia 3,25 a Foeniculum vulgare Phacelia tanacetifolia 3,25 a Coriandrum sativum Lactuca sativa 8,00 b Coriandrum sativum Eruca sativa 8,25 b Foeniculum vulgare Eruca sativa 9,00 bc Carum carvi Lactuca sativa 9,50 bc Kontrola Eruca sativa 9,91 bc Carum carvi Eruca sativa 10,00 bc Kontrola Trifolium repens 10,24 bc Foeniculum vulgare Lactuca sativa 10,50 bcd Kontrola Lactuca sativa 11,05 cd Carum carvi Trifolium repens 11,75 cd Foeniculum vulgare Trifolium repens 12,00 cd Coriandrum sativum Trifolium repens 13,00 d *иста слова означавају исти ниво значајности без статистички значајне разлике (p < 0.05) **различита слова означавају различите нивое са статистички значајним разликама (p < 0.05) 31
При концентрацији од 1,25 µ/ml, утврђена је најмања просечна клијавост применом етарског уља Foeniculum vulgare код биљке Phacelia tanacetifolia која износи 3,50. При истој концентрацији највиша клијавост је утврђена применом етарског уља Carum carvi код биљке Lactuca sativa која износи 14,25. У контролној варијанти просечан број клијалих зрна кретао се од 2,80, код Phacelia tanacetifolia до 10,20 код Lactuca sativa и Trifolium repens (Слика 4,Табела 7). Слика 4. Број клијалих семена Trifolium repens у контролној варијанти (Фото:Оригинал) Табела 7. Резултати утицаја етарског уља концентрације 1,25 µ/ml на клијавост семена Етарско уље Тест биљка Клијавост* Kontrola Phacelia tanacetifolia 2,80 a Foeniculum vulgare Phacelia tanacetifolia 3,50 a Coriandrum sativum Phacelia tanacetifolia 4,25 a Carum carvi Phacelia tanacetifolia 5,25 a Carum carvi Eruca sativa 9,25 b Foeniculum vulgare Eruca sativa 9,75 bc Foeniculum vulgare Lactuca sativa 9,75 bc Kontrola Eruca sativa 10,00 bc Kontrola Trifolium repens 10,20 bc Coriandrum sativum Lactuca sativa 11,00 bcd Kontrola Lactuca sativa 10,20 bcd Foeniculum vulgare Trifolium repens 11,75 cde Coriandrum sativum Eruca sativa 11,75 cde Coriandrum sativum Trifolium repens 12,75 def Carum carvi Trifolium repens 14,00 ef Carum carvi Lactuca sativa 14,25 f *иста слова означавају исти ниво значајности без статистички значајне разлике (p < 0.05) **различита слова означавају различите нивое са статистички значајним разликама (p < 0.05) 32