Ενζυμική Βιοτεχνολογία

Ιωάννης Κλώνης Ενζυμική Βιοτεχνολογία 2η αναθεωρημένη έκδοση E-BOOK ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ Iδρυτική δωρεά Παγκρητικής Eνώσεως Aμερικής Hρακλειο 2011

ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ Ίδρυμα Tεχνολογίας και 'Ερευνας Hράκλειο Kρήτης, T.Θ. 1385, 711 10. Tηλ. 2810 391097, Fax: 2810 391085 Aθήνα: Mάνης 5, 10681. Tηλ. 210 3849020-23, Fax: 210 3301583 e-mail: info@cup.gr www.cup.gr ΣΕΙΡΑ: ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ / ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΣΕΙΡΑΣ: ΣΤΕΦΑΝΟΣ ΤΡΑΧΑΝΑΣ 2010, Πανεπιστημιακες Εκδοσεις Κρητης & Ιωαννησ Κλωνησ Στοιχειοθεσία - σελιδοποίηση: Παρασκευή Βλάχου (ΠΕΚ) Σχεδίαση και προσαρμογή σχημάτων: Ιάκωβος Ουρανός Εκτύπωση & βιβλιοδεσία: Colour Plus αβεε Σχεδίαση εξωφύλλου: Βάσω Αβραμοπούλου ISBN 978-960-524-304-3

Περιεχόμενα Πρόλογος Πρόλογος 2ης έκδοσης Συμβολισμοί xiii xv xvii ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Εισαγωγή στα ένζυμα 1.1 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ 1 1.2 ΟΝΟΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ 1 1.3 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ 3 1.3.1 Μονάδες ενζυμικής δραστικότητας 3 1.3.2 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας 5 1.4 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ 8 1.4.1 Η ανακάλυψη των ενζύμων 8 1.4.2 Οι πρώτες εφαρμογές των ενζύμων 9 1.4.3 Η σύγχρονη ενζυμική τεχνολογία 10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Εφαρμοσμένη ενζυμική κινητική 2.1 ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΣ 13 2.1.1 Φάση I : έναρξη της ενζυμικής αντιδράσεως 14 2.1.2 Φάση II : σταθεροποιημένη κατάσταση 15 2.1.3 Φάση III : μη γραμμικό και κύριο τμήμα της ενζυμικής αντιδράσεως 22 2.2 ΕΚΤΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΣ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΑ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ (K eq ) 23 2.3 ΧΗΜΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ 24 2.3.1 Yπόστρωμα και προϊόν ως αναστολείς του ενζύμου 25 2.3.2 Συναγωνιστική και μη συναγωνιστική αναστολή του ενζύμου 28 2.3.3 Mη αντιστρεπτή αναστολή (αδρανοποίηση) του ενζύμου 30 2.4 ΦΥΣΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ 32 2.4.1 Eπίδραση της θερμοκρασίας 32 2.4.2 Επίδραση του ph 34 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Τύποι και κινητική ενζυμικών βιοαντιδραστήρων 3.1 ΤΥΠΟΙ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΩΝ 37 3.1.1 Bιοαντιδραστήρας διαλείποντος έργου πλήρους αναμίξεως 38 3.1.2 Συνεχής βιοαντιδραστήρας πλήρους αναμίξεως 40

viii ENZYMIKH BIOTEXNOΛOΓIA 3.1.3 Bιοαντιδραστήρας στήλης 40 3.1.4 Bιοαντιδραστήρας κοίλων ινών 41 3.2 ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΩΝ 43 3.2.1 Bιοαντιδραστήρας διαλείποντος έργου πλήρους αναμίξεως 43 3.2.2 Συνεχής βιοαντιδραστήρας πλήρους αναμίξεως 44 3.2.3 Bιοαντιδραστήρας στήλης 45 3.2.4 Aπαίτηση βιοαντιδραστήρων σε συγκέντρωση ενζύμου 46 3.2.5 Aναστολή ενζυμικής δραστικότητας και ενζυμική σταθερότητα 46 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Κατιούσα επεξεργασία: τεχνολογία καθαρισμού ενζύμων 4.1 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ 49 4.2 ΠΗΓΕΣ ΕΝΖΥΜΩΝ 51 4.3 Πρωτoκολλο Kατιοyσας Eπεξεργασiας 55 4.3.1 Ρύθμιση πειραματικών παραγόντων 56 4.3.2 Έλεγχος της πορείας του πρωτοκόλλου καθαρισμού ενζύμου 59 4.3.3 Ένα τυπικό πρωτόκολλο καθαρισμού ενζύμου 60 4.4 Σταδιο Α : Διαχωρισμοσ Στερεων και Υγρων - Διαυγaση 63 4.4.1 Φυγοκέντριση 63 4.4.2 Διήθηση 67 4.5 Διαρρηξη Κυτταρων 78 4.5.1 Μη μηχανικές τεχνικές διαρρήξεως κυττάρων 79 4.5.2 Μηχανικές τεχνικές διαρρήξεως κυττάρων 81 4.5.3 Κινητική μηχανικών τεχνικών διαρρήξεως κυττάρων 83 4.5.4 Τεχνική διαρρήξεως συναρτήσει βιολογικού υλικού 85 4.6 Σταδιο Β : Σταδιο Χαμηλου Καθαρισμου 86 4.6.1 Kατακρήμνιση με άλατα 87 4.6.2 Kατακρήμνιση με οργανικούς διαλύτες 89 4.6.3 Kατανομή σε υδατικά διφασικά συστήματα 90 4.7 Σταδιο Γ : Σταδιο Υψηλου Καθαρισμου 93 4.7.1 Γενικά περί τεχνικών και υλικών υγρής χρωματογραφίας στήλης 93 4.7.2 Xρωματογραφία διαπερατότητας 98 4.7.3 Xρωματογραφία ιοντοανταλλαγής 101 4.7.4 Μεταλλοχηλική χρωματογραφία 105 4.7.5 Υδρόφοβη χρωματογραφία 106 4.7.6 Xρωματογραφία συγγένειας 107 4.8 Βασικες Εννοιεσ Κλιμακωσεως Τησ Διεργασιασ Καθαρισμου Ενζυμων 117 4.8.1. Επιλογή της κλίμακας παραγωγής 118 4.8.2. Εξέταση κρίσιμων παραγόντων 118 4.8.3 Πρακτικά/τεχνικά θέματα κατά την κλιμάκωση 120 4.9 Σταδιο Δ: Μορφοποιηση Προϊοντοσ (Καθαρου Ενζυμου) 127 4.10 Παραγωγη ετερολογων γονιδιακων προϊοντων 130 4.10.1 Eτερόλογα προϊόντα από μικροοργανισμούς 130 4.10.2 Eτερόλογα προϊόντα από ζώα 134 4.10.3 Eτερόλογα προϊόντα από φυτά 135 4.11 Παραδειγματα Kατιουσας Eπεξεργασιας 136 4.11.1 Διαχωρισμός των ενζύμων γαλακτικής αφυδρογονάσης (ldh) και πυροσταφυλικής κινάσης (pk), και καθαρισμός της ldh 136 4.11.2 Kαθαρισμός ιστικού ενεργοποιητή πλασμινογόνου (tpa) από καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων 137 4.11.3 Kαθαρισμός της αυξητικής ορμόνης σωματοτροπίνης μόσχου από ανασυνδυασμένη Escherichia coli 141 4.11.4 Kαθαρισμός ανθρώπινης σωματομεδίνης (IGF-1) από ανασυνδυασμένη Escherichia coli 144 4.11.5 Kαθαρισμός L-ασπαραγινάσης από κύτταρα Erwinia carotovora 146 4.11.6 Kαθαρισμός της πρωτεάσης χυμοσίνης από ήνυστρο μόσχου 146 4.11.7 Kαθαρισμός αλκαλικής φωσφατάσης από έντερο μόσχου 150

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ix ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ακινητοποιημένα ένζυμα 5.1 Γενικα 153 5.2 Eπιδραση της ακινητοποιησης στα μοριακα χαρακτηριστικα του ενζυμου 153 5.2.1 Mεταβολές στη στερεοδιάταξη 154 5.2.2 Στερεοχημικοί περιορισμοί 155 5.2.3 Λειτουργική σταθερότητα 156 5.3 Eπιδραση της ακινητοποιησης στα κινητικα χαρακτηριστικα του ενζυμου 157 5.3.1 Φαινόμενα κατανομής 158 5.3.2 Φαινόμενα περιορισμού διαχύσεως (μεταφοράς μάζας) 162 5.3.3 Εξωτερικός περιορισμός διαχύσεως υποστρώματος 164 5.3.4 Εσωτερικός περιορισμός διαχύσεως υποστρώματος 168 5.3.5 Προσδιορισμός κινητικών παραμέτρων και διαχυτικότητας υποστρώματος σε ακινητοποιημένο ένζυμο 173 5.4 Επιδραση της ακινητοποιησης στην Αναστολη Ενζυμικης Αντιδρασεως 175 5.4.1 Αναστολή ακινητοποιημένου ενζύμου από υπόστρωμα με περιορισμό διαχύσεως 176 5.4.2 Αναστολή ακινητοποιημένου ενζύμου από προϊόν με περιορισμό διαχύσεως 177 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Τεχνικές ακινητοποιήσεως ενζύμων και δεσμευτών 6.1 Tεχνικες ακινητοποιησεωσ μεσω ΔεσμεYσεωσ 179 6.1.1 Χημικές ομάδες ενζύμων που αντιδρούν με στερεούς φορείς 179 6.1.2 Xημικές τεχνικές ακινητοποιήσεως σε στερεό φορέα 181 6.1.3 Xημικές τεχνικές σχηματισμού ενζυμικού πλέγματος 193 6.1.4 Φυσικές τεχνικές ακινητοποιήσεως σε στερεό φορέα 195 6.2 Tεχνικες ακινητοποιησεωσ μεσω εγκλωβισμου 196 6.2.1 Ακινητοποίηση μέσω εγκλωβισμού σε πολυμερή υλικά 196 6.2.2 Ακινητοποίηση μέσω εγκλωβισμού σε κοίλες ίνες 197 6.2.3 Ακινητοποίηση μέσω εγκλωβισμού σε μικροκαψύλια 198 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Εφαρμογές των ενζύμων στη βιομηχανία τροφίμων 7.1 Eνζυμικη Eπεξεργασια του Αμυλου 202 7.1.1 Πηκτωματοποίηση, ρευστοποίηση και δεξτρινοποίηση του αμύλου 204 7.1.2 Σακχαροποίηση και παρασκευή προϊόντων γλυκιάς γεύσης 206 7.2 Tα ενζυμα στην αρτοποιϊα 211 7.2.1 Ένζυμα στην παρασκευή άρτου και αρτοσκευασμάτων 212 7.2.2 Η ασπαραγινάση στην απάλειψη του ακρυλαμιδίου από προϊόντα αρτοποιίας 213 7.3 Tα ενζυμα στην ζυθοποιϊα 214 7.3.1 Παρασκευή και τροποποίηση της βύνης 215 7.3.2 Παρασκευή και βρασμός του βυνογλεύκους 217 7.3.3 Zύμωση του βυνογλεύκους και ωρίμανση του ζύθου 219 7.4 Tα ενζυμα στην παρασκευη προϊοντων φρουτων 221 7.4.1 Φρουτοχυμοί από φρούτα με πυρήνα ή γίγαρτα 222 7.4.2 Προϊόντα από εσπεριδοειδή φρούτα 224 7.5 Tα ενζυμα στην οινοποιϊα 225 7.6 Tα ενζυμα στην παρασκευη βρωσιμων ελαιων 229 7.6.1 Παρασκευή ελαιολάδου 229 7.6.2 Παρασκευή άλλων φυτικών ελαίων 231 7.6.3 Εξευγενισμός ελαίων 231 7.6.4 Παρασκευή ιχθυελαίων 232

x ENZYMIKH BIOTEXNOΛOΓIA 7.7 Eφαρμογες των ενζυμων στην παρασκευη γαλακτοκομικων προϊοντων 233 7.7.1 Παρασκευή τυριού 233 7.7.2 Προστασία γαλακτοκομικών προϊόντων 237 7.7.3 Eνζυμική υδρόλυση της λακτόζης 237 7.8 Tα ενζυμα στην παρασκευη πρωτεϊνικων προϊοντων 242 7.8.1 Πρωτεϊνικό υδρόλυμα σόγιας 243 7.8.2 Eκχύλισμα ζυμομύκητα 243 7.8.3 Πρωτεΐνες αίματος 246 7.8.4 Άλλα προϊόντα: πρωτεΐνες κρέατος και ψαριών 247 7.9 Tα ενζυμα ως συντηρητικα 248 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Εφαρμογές των ενζύμων σε μεγάλη κλίμακα 8.1 Tα ενζυμα στη χαρτοποιϊα 251 8.1.1 Χημική διεργασία πολτοποιήσεως του ξύλου 252 8.1.2 Ξυλανάσες και λακάσες στη διεργασία λεύκανσης του ξυλοπολτού 252 8.1.3 Ένζυμα στη διεργασία παραγωγής χαρτιού 253 8.2 Tα ενζυμα στην υφαντουργια 254 8.2.1 Aποκολλάρισμα των ινών υφασμάτων 254 8.2.2 Bιοεξευγενισμός υφασμάτων 255 8.2.3 Φινίρισμα ρουχισμού τζιν 255 8.2.4 Eξουδετέρωση λευκαντικών χημικών 256 8.3 Tα ενζυμα στη βυρσοδεψια 256 8.4 Tα ενζυμα στα (βιολογικα) απορρυπαντικα 258 8.4.1 Πρωτεάσες εναντίον πρωτεϊνούχων ρύπων 259 8.4.2 Λιπάσες εναντίον λιπαρών ρύπων 262 8.4.3 Αμυλάσες εναντίον αμυλούχων ρύπων 263 8.4.4 Κυτταρινάσες για βιοεξευγενισμό βαμβακερού ρουχισμού 263 8.4.5 Ένζυμα λεύκανσης 263 8.5 Eφαρμογες των ενζυμων στις ζωοτροφες 264 8.5.1 Φυτάση για βιοδιαθεσιμότητα του φωσφόρου 264 8.5.2 β-γλυκανάση για βιοδιαθεσιμότητα των β-γλυκανών 265 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Εφαρμογές των ενζύμων στη χημική βιομηχανία 9.1 Tα ενζυμα στην παρασκευη αμινοξεων και παραγωγων τουσ 269 9.1.1 Παρασκευή οπτικά καθαρών αμινοξέων και παραγώγων τους από ρακεμικά μίγματα 271 9.1.2 Eνζυμική παρασκευή αμινοξέων 276 9.2 Tα ενζυμα στην παρασκευη φυτοφαρμακων 279 9.2.1 Αρυλοξυ-προπιονικά ζιζανιοκτόνα 279 9.2.2 Φωσφινικά ζιζανιοκτόνα 280 9.2.3 Πυρεθροϊκά εντομοκτόνα 281 9.3 Tα ενζυμα στην συνθεση ολιγοσακχαριτων και σακχαρο-ενωσεων 282 9.3.1 Σύνθεση δισακχαριτών με γαλακτοζιτάσες 283 9.3.2 Σύνθεση τρισακχαρίτη και σακχαρο-ενώσεων με γλυκοζυλοτρανσφεράσες 284 9.4 Tα ενζυμα στην παρασκευη αλλων χημικων ενωσεων βιομηχανικου ενδιαφεροντοσ 286 9.4.1 Υδρατάση νιτριλίου για την παραγωγή ακρυλαμιδίου, νικοτιναμιδίου και 5-κυανοβαλεραμιδίου 287 9.4.2 Νιτριλάση για την παραγωγή 1,5-διμεθυλο-2-πιπεριδόνης 288 9.4.3 Οξυνιτριλάσες για την παραγωγή εναντιομερών κυανοϋδρινών 289 9.4.4 Χρωστική indigo 289 9.5 Tα ενζυμα στην παρασκευη συμπληρωματων διατροφησ 289 9.5.1 Παραγωγή ασκορβικού οξέος 290 9.5.2 Παραγωγή L-καρνιτίνης 292

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ xi ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 Εφαρμογές των ενζύμων στη φαρμακευτική βιομηχανία 10.1 TΑ ΕΝΖΥΜΑ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ 297 10.1.1 Παρασκευή ημισυνθετικών πενικιλλινών 300 10.1.2 Παρασκευή ημισυνθετικών κεφαλοσπορινών 302 10.2 TΑ ΕΝΖΥΜΑ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ 304 10.3 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΣ ΥΠΕΡΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΑΙΜΙΑΣ 310 10.4 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΥ HIV 312 10.5 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΣ ΥΠΕΡΤΑΣΗΣ 314 10.6 ΕΝΖΥΜΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΤΟΣ 315 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 Θεραπευτικές εφαρμογές των ενζύμων στην ιατρική 11.1 ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΕΝΖΥΜΩΝ 318 11.1.1 Πνευμονικά νοσήματα (εμφύσημα): α 1 -αντιθρυψίνη 318 11.1.2 Φαινυλκετονουρία: υδρολάση φαινυλαλανίνης 319 11.1.3 Νόσος SCID: απαμινάση αδενοσίνης 320 11.1.4 Νόσος του Gaucher: γλυκοκερεβροζιτάση 320 11.1.5 Παγκρεατικά υδρολυτικά ένζυμα 321 11.1.6 Τεχνητά όργανα 322 11.2 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΩΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΑ ΜΕΣΑ 323 11.2.1 Κυστική ίνωση: DNAάση 323 11.2.2 Λεμφοκυτταρική λευχαιμία: L-ασπαραγινάση 323 11.2.3 Θρομβολυτικά ένζυμα 324 11.2.4. Οξειδωτική καταπόνηση: δισμουτάση σουπεροξειδίου 327 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 Εφαρμογές των ενζύμων στην ανάλυση 12.1 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΩΣ ΔΕΙΚΤΕΣ 329 12.2 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΩΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 331 12.2.1 Προσδιορισμός κρεατινίνης 333 12.2.2 Προσδιορισμός γλυκόζης 333 12.2.3 Προσδιορισμός χοληστερόλης 335 12.2.4 Προσδιορισμός τριγλυκεριδίων 335 12.2.5 Προσδιορισμός ουρίας και ουρικού οξέος 337 12.2.6 Προσδιορισμός οξαλικού οξέος 338 12.2.7 Προσδιορισμός μεθοτρεξάνης 340 12.2.8 Προσδιορισμός παρακεταμόλης 340 12.3 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΣΕ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ 340 12.3.1 Μη ομοιογενείς τεχνικές ΕΙΑ 341 12.3.2 Ομοιογενείς τεχνικές ΕΙΑ 343 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13 Ενζυμικοί βιοαισθητήρες 13.1 ΑΜΠΕΡΟΜΕΤΡΙΚΟΙ ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ 346 13.1.1 Βιοαισθητήρας βασισμένος στο ηλεκτρόδιο οξυγόνου του Clark 346 13.1.2 Βιοαισθητήρας βασισμένος στο ηλεκτρόδιο Η 2 Ο 2 348 13.1.3 Μεσαζόμενοι ενζυμικοί βιοαισθητήρες 349 13.2 ΠΟΤΕΝΣΙΟΜΕΤΡΙΚΟΙ ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ 355 13.2.1 Το ηλεκτρόδιο ph υάλινης μεμβράνης ως βάση σχεδιασμού ενζυμικών βιοαιασθητήρων 356 13.2.2 Οι ημιαγωγοί ως βάση σχεδιασμού ενζυμικών βιοαιασθητήρων στερεάς κατάστασης (ENFETs) 358 13.3 ΑΓΩΓΙΜΕΤΡΙΚΟΙ ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ 361 13.4 ΟΠΤΙΚΟΙ ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ 362 13.4.1. Ενζυμικοί βιοαισθητήρες με οπτικές ίνες 363

xii ENZYMIKH BIOTEXNOΛOΓIA 13.4.2 Τεχνική οπτικής απορρόφησης 365 13.4.3 Τεχνική φθορισμομετρίας 367 13.4.4 Τεχνική χημειοφωταύγειας 368 13.4.5 Τεχνική βιοφωταύγειας 369 13.4.6 Τεχνική συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) 370 13.5 ΛΟΙΠΑ ΕΙΔΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΩΝ 371 13.5.1 Πιεζοηλεκτρικοί βιοαισθητήρες 372 13.5.2 Ακουστικοί βιοαισθητήρες 373 13.5.3 Θερμικοί βιοαισθητήρες 373 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14 Ενζυμική κατάλυση σε οργανικούς διαλύτες 14.1 ΠΩΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΕΡΟΝΤΑΙ ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΣΕ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΜΕ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΔΙΑΛΥΤΗ 376 14.2 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΕΝΑΝΤΙΟΜΕΡΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ 377 14.2.1 Παρασκευή L-μενθόλης 377 14.2.2 Παρασκευή ζιζανιοκτόνων 379 14.3 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΙΠΑΡΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ 380 14.3.1 Eκλεκτική μετεστεροποίηση τριγλυκεριδίων 380 14.3.2 Παρασκευή εστέρων λιπαρών οξέων 381 14.4 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ 382 14.4.1 Παρασκευή ανθρώπινης ινσουλίνης 383 14.4.2 Παρασκευή ασπαρτάμης 388 Προτεινόμενη βιβλιογραφία 391 Πηγές σχημάτων 393 Λεξιλόγιο επιστημονικών όρων 395 Ευρετήριο 409

Πρόλογος 1ης έκδοσης H ενζυμική βιοτεχνολογία αποτελεί το μεγαλύτερο υποσύνολο της βιοτεχνολογίας, οι δε ρίζες των πρώτων εφαρμογών της φθάνουν μέχρι την αρχαιότητα, στην παρασκευή βρώσιμων προϊόντων. Σήμερα, αυτός ο κλάδος της επιστήμης έχει αναπτυχθεί σε εξαιρετικό βαθμό, ενώ οι γνώσεις μας και οι εφαρμογές οι οποίες αφορούν στα ένζυμα συνεχώς διευρύνονται. Aυτό είναι αποτέλεσμα του ότι οι βιολογικοί καταλύτες εμπλέκονται, αμέσως ή εμμέσως, σε όλες σχεδόν τις δραστηριότητες παραγωγής βιοπροϊόντων, βελτιώσεως μεθόδων στις οποίες μετέχουν βιολογικά συστήματα και παροχής καλύτερων υπηρεσιών σχετικών με την υγεία και γεωργία. Ως τεχνολογία αιχμής, και επί τη βάσει των σημερινών της εφαρμογών, η ενζυμική βιοτεχνολογία διατηρεί εξαιρετικές προοπτικές και για τον επόμενο αιώνα. Σκοπός του παρόντος βιβλίου είναι αφ ενός να προσφέρει στους φοιτητές των ανώτατων εκπαιδευτικών ιδρυμάτων βασική γνώση στο υπό εξέταση αντικείμενο, αφ ετέρου να καταστεί χρήσιμο βοήθημα στους διδάσκοντες, αλλά και σε όσους ενδιαφέρονται να εισαχθούν και να γνωρίσουν θέματα ενζυμικής βιοτεχνολογίας και βιοτεχνολογίας γενικότερα. Φυσικά, λόγω του μεγάλου εύρους του εξεταζόμενου πεδίου, φρονώ ότι το παρόν δεν εξαντλεί το αντικείμενο προκειμένου κάτι τέτοιο να υλοποιηθεί, θα χρειαζόταν ένα πολύτομο έργο. Kατεβλήθη προσπάθεια να συμπεριληφθούν γνώσεις παραδοσιακής και σύγχρονης ενζυμικής βιοτεχνολογίας, ενώ πολλά θέματα εξετάζονται λεπτομερέστερα και απο πρακτική άποψη. Oι επί μέρους θεματολογικές περιοχές έχουν επιλεγεί και αναπτυχθεί με γνώμονα ότι το βιβλίο απευθύνεται μάλλον σε ευρύ φάσμα αναγνωστών εκ των θετικών επιστημών και όχι σε έναν επιστημονικό κλάδο ή σε ένα πανεπιστημιακό τμήμα ειδικά. Eν τούτοις, η φύση του εξεταζόμενου θέματος είναι τέτοια, ώστε αναπόφευκτα προβάλλονται περισσότερο η τεχνολογία και οι υλοποιηθείσες, κυρίως βιομηχανικώς και εμπορικώς, δυνατότητες των ενζύμων. Σε ορισμένες περιπτώσεις εξετάζονται επιλεκτικά και μη ενζυμικές πρωτεΐνες, λόγω της ειδικής σημασίας τους. Eπίσης, καθίσταται σαφής η χρησιμότητα της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA, κυρίως στην παραγωγή πρωτεϊνών και ενζύμων. H κατανόηση του κειμένου βοηθείται απο την παρουσία πολλών σχημάτων, ενώ έχουν αποδοθεί στα ελληνικά οι σημαντικότεροι αγγλικοί όροι, ώστε να βοηθηθούν όσοι αναγνώστες ανατρέξουν σε ξενόγλωσσες πηγές. H παράθεση αριθμητικών δε-

xiv ENZYMIKH BIOTEXNOΛOΓIA δομένων σε ορισμένες περιπτώσεις έγινε ώστε να δοθεί κάποια ποσοτική αίσθηση των υπό συζήτηση μεγεθών. H συγγραφή του βιβλίου άρχισε ενωρίς το 1992, μόλις ανέλαβα την θέση του αναπληρωτή καθηγητή στο Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Aθηνών. Aυτό είχε ως αποτέλεσμα την πίεση για διδακτικό βιβλίο, σε συνδυασμό με το κενό το οποίο υπήρχε. Tο αρχικό κείμενο είχε διαμορφωθεί εντός του 1995. Έκτοτε τροποποιήθηκε αρκετές φορές, στην προσπάθεια για ενημέρωση και βελτίωση της ύλης, έως τις αρχές του 1997, οπότε και έλαβε την οριστική του μορφή. Eπιθυμώ να ευχαριστήσω θερμά τους συναδέλφους οι οποίοι, με την κριτική τους ανάγνωση τμημάτων του αρχικού κειμένου, συνέβαλαν στην αρτιότερη εμφάνισή του. Iδιαιτέρως ευχαριστώ την κ. Διονυσία Δασκάλου των Πανεπιστημιακών Eκδόσεων Kρήτης, για την αξιέπαινη προσπάθεια την οποία κατέβαλε και τη φροντίδα την οποία έδειξε προκειμένου να υλοποιηθεί το παρόν, ακόμη δε περισσότερο για την ανεκτικότητά της στις όποιες μεταβολές της ζητούσα. Eυχαριστίες απευθύνονται στον κ. Bίκτωρα Aθανασιάδη για τη φιλολογική του συνδρομή, και στον κ. Θεόδωρο Mίχο για την σχεδιαστική του φιλοπονία. Tέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ στις Πανεπιστημιακές Eκδόσεις Kρήτης και στον διευθυντή τους, συνάδελφο κ. Στέφανο Tραχανά, οι οποίες δεν εφείσθησαν κόπων και εξόδων προκειμένου να εξασφαλίσουν το παρόν. Ωστόσο, η αίσθηση ικανοποιήσεως όλων όσων συμμετείχαν στην προσπάθεια αυτή θα γίνει αντιληπτή τότε μόνον όταν το παρόν βιβλίο εκπληρώσει τον σκοπό του και αυτό θα το κρίνουν οι αναγνώστες του. Θα είμαι υπόχρεος σε όλους εκείνους οι οποίοι θα μου δώσουν τη ευκαιρία να γνωρίσω τις εμπειρίες τους απο την χρήση του παρόντος, ώστε αυτές να ληφθούν υπ όψιν κατά την διαμόρφωση της επόμενης έκδοσης. Aθήνα, Iούλιος 1997 Iωάννης Δ. Kλώνης

Πρόλογος 2ης έκδοσης Τα δώδεκα χρόνια από την παρουσίαση της πρώτης έκδοσης της ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ κρίθηκαν ως περισσότερο από αρκετά προκειμένου η εμπειρία που έχει συλλεχθεί και οι επιστημονικές εξελίξεις να με ωθήσουν σε ένα νέο εγχείρημα, προϊόν του οποίου είναι το παρόν πόνημα. Κατ ουσία, η 2 η έκδοση είναι ένα νέο βιβλίο, εφόσον η ύλη του παλαιού εκσυγχρονίσθηκε και αναθεωρήθηκε σχεδόν ολοσχερώς. Τα επτά κεφάλαια του παλαιού βιβλίου εξελίχθησαν σε δεκατέσσερα, τα οποία πλέον εμπλουτίζονται από την παρουσία 190 σχημάτων και 20 πινάκων. Το ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 είναι νέο και αποτελεί εισαγωγή στα ένζυμα, παρουσιάζοντας εν συντομία τις κατηγορίες, τον προσδιορισμό και την ιστορία των ενζύμων, από τεχνολογική σκοπιά. Το ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 που αφορά στην εφαρμοσμένη ενζυμική κινητική, αν και βασίσθηκε σε εκείνο της 1 ης έκδοσης, τώρα περιέχει πρακτικά παραδείγματα και επιπλέον ενότητες για την επίδραση χημικών και φυσικών παραγόντων στη διεργασία καταλύσεως. Το ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 διατηρήθηκε στην αρχική του μορφή, έχοντας υποστεί τις επιβεβλημένες διορθώσεις. Το ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 που αφορά στον καθαρισμό των ενζύμων (κατιούσα επεξεργασία) έχει υποστεί σημαντικές βελτιώσεις, επεξηγήσεις, μαθηματικές προσεγγίσεις, και εκτεταμένες προσθήκες ύλης, σε όλη του την έκταση. Το ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 αφορά στα ακινητοποιημένα ένζυμα, ειδικότερα, στην επίδραση της ακινητοποιήσεως στα μοριακά και κινητικά χαρακτηριστικά του ενζύμου. Εκπονήθηκε συνολικά εκ νέου, με ικανοποιητική μαθηματική εμβάθυνση της ύλης, για βιβλίο που προορίζεται για προπτυχιακούς φοιτητές διαφόρων τμημάτων ΑΕΙ. Στο κεφάλαιο αυτό δεν περιλαμβάνονται οι τεχνικές ακινητοποιήσεως ενζύμων (και μορίων-δεσμευτών), αντικείμενο το οποίο αντιμετωπίζεται χωριστά στο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 που ακολουθεί. Τα ΚΕΦΑΛΑΙΑ 7-13 αποτελούν, τύποις, εξέλιξη του κεφαλαίου 5 της 1 ης έκδοσης, το οποίο αφορούσε στις εφαρμογές των ενζύμων. Λόγω του υπερβολικού όγκου της διαμορφωθείσης σύγχρονης ύλης, κρίθηκε σκόπιμο να δημιουργηθούν πλέον χωριστά κεφάλαια, τα οποία να πραγματεύονται με περισσότερη λεπτομέρεια ενότητες εφαρμογών των ενζύμων. Στην παρούσα έκδοση, οι εφαρμογές των ενζύμων στη βιομηχανία τροφίμων απαντούν στο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7, σε προϊόντα μεγάλου όγκου στο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8, στη χημική βιομηχανία στο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9, στη φαρμακευτική βιομηχανία στο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10, στη θεραπευτική (ιατρική) στο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11, και

xvi ENZYMIKH BIOTEXNOΛOΓIA στην ανάλυση στο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12. Σε κάθε περίπτωση, η ύλη έχει αναθεωρηθεί και εκσυγχρονισθεί, περιλαμβάνοντας πολλά νέα και σημαντικά παραδείγματα. Η ενότητα που αφορούσε τους βιοαισθητήρες και εμφανίζονταν ως μέρος του κεφαλαίου 5 της 1 ης έκδοσης, γράφτηκε εξαρχής πλήρως, και εμφανίζεται πλέον ως ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13. Τελευταία, όχι όμως λιγότερο σημαντική, ενότητα του βιβλίου αποτελεί η ενζυμική κατάλυση σε οργανικούς διαλύτες (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14), ενώ το τελευταίο κεφάλαιο της 1 ης έκδοσης (Τροποποίηση του Ενζυμικού Μορίου) αφαιρέθηκε, εφόσον αντίστοιχο κεφάλαιο (Ενζυμική Μηχανική) με σύγχρονη και εκτεταμένη ύλη, περιλαμβάνεται σε πρόσφατο βιβλίο του συγγραφέα με τίτλο Ενζυμολογία (Εκδόσεις Έμβρυο, 2007). Ελπίζω η νέα μορφή του βιβλίου, αφ ενός να προσφέρει βασική και ουσιαστική γνώση στους φοιτητές των Α.Ε.Ι. στο αντικείμενο που πραγματεύεται, αφ ετέρου να αποβεί χρήσιμο βοήθημα στους διδάσκοντες. Ωστόσο, το εάν και κατά πόσον το βιβλίο τελικά θα εκπληρώσει το σκοπό του, επαφίεται στην κρίση των αναγνωστών. Αθήνα, Ιούλιος 2009 Ιωάννης Δ. Κλώνης

Συμβολισμοί KEΦAΛAIA 2, 3 A Σταθερά του Arrhenius D Pυθμός αραιώσεως [E] Συγκέντρωση ελεύθερου ενζύμου E a Ενέργεια ενεργοποιήσεως [E t ] Συνολική συγκέντρωση ενζύμου E t Συνολική ποσότητα ενζύμου [E (t) ] Συγκέντρωση ενζύμου σε χρόνο t [E (0) ] Συγκέντρωση ενζύμου σε χρόνο μηδέν (t = t 0 ) (Σ) E 0 Ποσότητα ενζύμου σε συνεχή βιοαντιδραστήρα πλήρους αναμίξεως (ΣT) E 0 Ποσότητα ενζύμου σε βιοαντιδραστήρα στήλης [ES] Συγκέντρωση συμπλόκου ενζύμου - υποστρώματος f(de) Συντελεστής διορθώσεως [I] Συγκέντρωση αναστολέα ενζύμου k d Σταθερά φθοράς ενζυμικής δραστικότητος k 3 E 0 Συνολική ποσότητα ενζύμου στον βιοαντιδραστήρα k 1, k 2, k 3, k 4 Σταθερές ταχυτήτων ενζυμικής αντιδράσεως k 3 Σταθερά ταχύτητας διαστάσεως του συμπλόκου ενζύμου - υποστρώματος ES προς προϊόν P και ένζυμο E k cat Σταθερά καταλύσεως K eq Σταθερά ισορροπίας ενζυμικής αντιδράσεως K i Σταθερά αναστολής ενζυμικής αντιδράσεως (ή σταθερά διαστάσεως του συμπλόκου ενζύμου - αναστολέα EI) K m Σταθερά Michaelis-Menten ελεύθερου ενζύμου K m Σταθερά Michaelis-Menten ακινητοποιημένου ενζύμου K m( ) Σταθερά Michaelis-Menten αντιδράσεως προς τα αριστερά K m(r) Σταθερά Michaelis-Menten αντιδράσεως προς τα δεξιά K p Σταθερά αναστολής ενζυμικής αντιδράσεως υπό αναστολή προϊόντος (ή σταθερά διαστάσεως του συμπλόκου ενζύμου - προϊόντος EP) K s Σταθερά αναστολής ενζυμικής αντιδράσεως υπό αναστολή υποστρώματος (ή σταθερά διαστάσεως του συμπλόκου υποστρώματος - ενζύμου - υποστρώματος SES) [P] Συγκέντρωση προϊόντος PE Φυσιολογική αποδοτικότητα Q Oγκομετρικός ρυθμός ροής R Σταθερά αερίων [S] Συγκέντρωση υποστρώματος [S 0 ] Aρχική συγκέντρωση υποστρώματος t Xρόνος t i Xρόνος ενζυμικής αντιδράσεως παρουσία αναστολέα I t 1/2 Xρόνος υποδιπλασιασμού ή ημιζωής t R Xρόνος παραμονής T Aπόλυτη θερμοκρασία u Tαχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως u 0 Aρχική ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως Tαχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως u i

xviii ENZYMIKH BIOTEXNOΛOΓIA παρουσία αναστολέα (αντιστρεπτή αναστολή) u s Tαχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως υπό αναστολή υποστρώματος u p Tαχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως υπό αναστολή προϊόντος V Λειτουργικός όγκος βιοαντιδραστήρα V l Συνολικός όγκος περιεχομένου υγρού στον βιοαντιδραστήρα V 0 Kενός ή νεκρός όγκος V max Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως ελεύθερου ενζύμου V max Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως ακινητοποιημένου ενζύμου i V max Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως παρουσία αναστολέα (μη- αντιστρεπτή αναστολή) V max( ) Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως προς αριστερά V max(r) Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως προς δεξιά V (t) Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής max αντιδράσεως σε χρόνο t V (0) Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής max αντιδράσεως σε χρόνο μηδέν (t = t 0 ) X Kλάσμα μετατροπής X (t) Kλάσμα μετατροπής εντός χρόνου λειτουργίας βιοαντιδραστήρα t X (0) Kλάσμα μετατροπής εντός χρόνου λειτουργίας βιοαντιδραστήρα t = t 0 c i C C equ C feed C b C labor C M C p C reg C S C t C tot KEΦAΛAIO 4 Ιοντική συγκέντρωση Συγκέντρωση σε κάποιο σημείο του υγρού φιλμ Κόστος εγκαταστάσεως και συντηρήσεως συσκευών Κόστος αρχικού βιολογικού υλικού τροφοδοσίας της στήλης Συγκέντρωση πρωτεΐνης στην κάτω φάση διφασικού συστήματος Κόστος εργασίας προσωπικού Κόστος υγρής φάσης ( υγρού ρεύματος ) Συγκέντρωση στο διήθημα Κόστος αναγεννήσεως στήλης Κόστος στατικής φάσης (χρωματογραφικού υλικού) Συγκέντρωση πρωτεΐνης στην άνω φάση διφασικού συστήματος Συνολικό ωριαίο κόστος C w d p Συντελεστής οπισθέλκυσης Διάμετρος σωματιδίου D Συντελεστής διαχύσεως του συστατικού Συντελεστής διαχυτικότητας Διηλεκτρική σταθερά [Ε] Συγκέντρωση δραστικού ενζύμου F Ρυθμός ροής βιολογικού υλικού στη συσκευή ομοιογενοποιήσεως F Oπισθέλκουσα δύναμη Ι Ιοντική ισχύς διαλύματος J ρυθμός διηθήματος K Σταθερά του Boltzman k c Συντελεστής διαπερατότητας πίτας στερεού k Σταθερά πρώτης τάξης της ταχύτητας ελευθερώσεως πρωτεΐνης D m D s k k r Κ Κ s K d K p L L c M Μ solvent P P max Q t R t w r R R b Re R c Σταθερά πρώτης τάξης της ταχύτητας μεταβολής (μειώσεως) της Ειδικής Δραστικότητας (ΕΔ) Σταθερά πρώτης τάξης της ταχύτητας διεργασίας διαρρήξεως Σταθερά κατακρημνίσεως Σταθερά εξαλατώσεως Συντελεστές κατανομής ή διαπερατότητας σε χρωματογραφία Συντελεστής κατανομής σε διφασικό σύστημα Mήκος διαδρομής ροής υλικού στην κεφαλή και μήκος στήλης χρωματογραφίας Πάχος πίτας στερεού Μοριακή μάζα πρωτεΐνης Μοριακό βάρος διαλύτη Συγκέντρωση εκλυόμενης πρωτεΐνης Μέγιστη συγκέντρωση εκλυόμενης πρωτεΐνης Oγκομετρικός ρυθμός ροής Χρόνος που κατακρατήθηκε ( παρέμεινε ) το μόριο στη στήλη Χρόνος που αντιστοιχεί στο πάχος της ζώνης του μορίου Aκτίνα σωματιδίου Aπόσταση σωματιδίου από άξονα περιστροφής κεφαλής φυγοκέντρου Aπόσταση πυθμένα δοχείου από άξονα περιστροφής κεφαλής φυγοκέντρου Aριθμός του Reynolds Aντίσταση πίτας στερεού

ΣΥΜΒΟΛΙΣΜΟΙ xix R m R in R out R in R out R t S S 0 t Τ TRP u u d u op u y ν V V e V i V t V 0 V p Aντίσταση φίλτρου Εσωτερική ακτίνα στιβάδας στερεών ( πίτας ) που εναποτίθενται σε σωληνοειδή κεφαλή φυγοκέντρου Εξωτερική ακτίνα στιβάδας στερεών ( πίτας ) που εναποτίθενται σε σωληνοειδή κεφαλή φυγοκέντρου Eσωτερική ακτίνα δίσκων από άξονα περιστροφής σε κεφαλή δίσκων φυγοκέντρου συνεχούς ροής Eξωτερική ακτίνα δίσκων από άξονα περιστροφής σε κεφαλή δίσκων φυγοκέντρου συνεχούς ροής Aπόσταση μηνίσκου υγρού από άξονα περιστροφής κεφαλής φυγοκέντρου Διαλυτότητα (συγκέντρωση) πρωτεΐνης Διαλυτότητα (συγκέντρωση) πρωτεΐνης σε διάλυμα με ιοντική ισχύ Ι = 0 ή σε διάλυμα απουσία οργανικού διαλύτη Xρόνος Απόλυτη θερμοκρασία Διαεπεξεργασία (throughput): ανακτηθέν προϊόν αποδεκτών προδιαγραφών ανά ώρα Tαχύτητα γραμμικής ροής σε στήλη χρωματογραφίας Tαχύτητα διαχύσεως εσωτερικά στο χρωματογραφικό υλικό Άριστη γραμμική ταχύτητα ροής Γραμμική ταχύτητα ροής προς την κατεύθυνση y, Γραμμική ταχύτητα σωματιδίου κατά τη φυγοκέντριση Όγκος διηθήματος Όγκος εκλούσεως ενζύμου από στήλη χρωματογραφίας Εσωτερικός όγκος (όγκος πόρων της στερεάς φάσης που καταλαμβάνεται από τη στατική υγρή φάση. Συνολικός όγκος υγρής φάσης στη χρωματογραφική στήλη Νεκρός όγκος (εξωτερικός όγκος μεταξύ σφαιριδίων χρωματογραφικής στήλης) Όγκος υγρού ρεύματος που συλλέχθηκε φέροντας ποσότητα x p V solute Μοριακός όγκος διαχεόμενου μορίου V Όγκος του βιολογικού υλικού στη συσκευή ομοιογενοποιήσεως V b Όγκος κάτω φάσης (φάσης δεξτράνης ή άλατος) V t Όγκος άνω φάσης (φάσης PEG) W s Βάρος χρωματογραφικού υλικού x Απόσταση από τη μεμβρανική επιφάνεια Υ t (%) Εκατοστιαία ποσότητα ενζύμου στην άνω φάση (φάση PEG) z i Ιοντικό φορτίο (σθένος) Α Επιφάνεια μέσω της οποίας πραγματοποιείται η ροή Α Πειραματικά προσδιοριζόμενη σταθερά εξαρτώμενη από την P max Α Eμβαδόν επιφάνειας της τομής του σωματιδίου (σφαιριδίου) που προβάλει αντίθετα προς την κατεύθυνση ροής Β Πειραματικά προσδιοριζόμενη σταθερά εξαρτώμενη από την ΕΔ max δ Πάχος υγρού φιλμ Δp Συνολική πτώση πιέσεως (διαφορά πιέσεως) Δρ Διαφορά πυκνότητας μεταξύ σωματιδίου και υγρού μέσου ζ Aριθμός δίσκων κεφαλής συνεχούς ροής η Iξώδες (συντελεστής δυναμικού ιξώδους) Η Ισοδύναμο ύψος προς μία θεωρητική πλάκα λ Παράγων εξαρτώμενος από φορτίο και πυκνότητα των συστατικών διφασικού συστήματος ν Αριθμός επαναλήψεων ν Συντελεστής κινητικού ιξώδους N Αριθμός θεωρητικών πλακών στήλης N cycle Αριθμός κύκλων λειτουργίας της στήλης χρωματογραφίας ρ m Πυκνότητα υγρού μέσου ρ p Πυκνότητα σωματιδίου Ρ M,p Πυκνότητα υγρού ρεύματος ή μέσου στο οποίο υπάρχει το προϊόν Σ Φυγοκεντρικός συντελεστής (συντελεστής Sigma) φ Γωνία μεταξύ του χώρου διαχωρισμού (κωνοειδών δίσκων) και της καθέτου επί του άξονα περιστροφής.

xx ENZYMIKH BIOTEXNOΛOΓIA x p Ψ ω Βάρος προϊόντος (ενζύμου) στο κλάσμα υγρού ρεύματος παραγωγής (g ενζύμου/g υγρού που συλλέχθηκε) Παράγων συσχετίσεως διαλύτη Γωνιακή ταχύτητα KEΦAΛAIO 5 d p Διάμετρος σφαιριδίου φορέα D s Διαχυτικότητα υποστρώματος στην υγρή φάση D s Διαχυτικότητα υποστρώματος εσωτερικά στον πορώδη φορέα [E ] Συγκέντρωση ακινητοποιημένου ενζύμου e Φορτίο ηλεκτρονίου h s Συντελεστής μεταφοράς υποστρώματος [H + ] Συγκέντρωση πρωτονίων στην κύρια υγρή φάση [H + ] Συγκέντρωση πρωτονίων στο e ενζυμικό μικροπεριβάλλον k Σταθερά του Boltzmann K m Σταθερά Michaelis-Menten ελεύθερου ενζύμου L Πάχος φορέα-μεμβράνη K m Σταθερά Michaelis-Menten ακινητοποιημένου ενζύμου m c Συγκέντρωση της στερεάς φάσης στον ενυδατωμένο της όγκο p s Συντελεστής κατανομής υποστρώματος μεταξύ ενζυμικού μικροπεριβάλλοντος και κύριας υγρής φάσης σε σύστημα ακινητοποιημένου ενζύμου ph 0 Άριστο ph ενζυμικής αντιδράσεως p H+ Συντελεστής κατανομής πρωτονίων r Ακτίνα σφαιριδίου φορέα [S] Συγκέντρωση υποστρώματος κύριας υγρής φάσης [S e ] Συγκέντρωση υποστρώματος εσωτερικά στο φορέα (ενζυμικό μικροπεριβάλλον) T Aπόλυτη θερμοκρασία u Tαχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως u Ταχύτητα αντιδράσεως ακινητοποιημένου ενζύμου u 0 Ταχύτητα αντιδράσεως ακινητοποιημένου ενζύμου χωρίς περιορισμό διαχύσεως V max Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως V 0 Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής max αντιδράσεως σε ph 0 V max Mέγιστη ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως ακινητοποιημένου ενζύμου V max Μέγιστη ταχύτητα αντιδράσεως ανά μονάδα όγκου φορέα Z Μέτρο του αριθμού φορτίων στην στερεά φάση H+ α e Ενεργότητα πρωτονίου στο ενζυμικό μικροπεριβάλλον α H+ Ενεργότητα πρωτονίου στην κύρια υγρή φάση γ Συντελεστής ενεργότητας ιόντος δ Πάχος στιβάδας του Nernst ε Οριακή τιμή του παράγοντα αποτελεσματικότητας η η Παράγων αποτελεσματικότητας κ Αποτελεσματική σταθερά Michaelis (οριακή τιμή της φαινομενικής σταθεράς Michaelis) για ακινητοποιημένο ένζυμο με εξωτερικό περιορισμό διαχύσεως κ Αποτελεσματική σταθερά Michaelis (οριακή τιμή της φαινομενικής σταθεράς Michaelis) για ακινητοποιημένο ένζυμο με εσωτερικό περιορισμό διαχύσεως λ ανηγμένη απόσταση, μέσα στον πόρο από την επιφάνεια του φορέα μ Μέτρο υποστρώματος για εξωτερικό περιορισμό διαχύσεως (αριθμός του Damköhler) σ Ανηγμένη συγκέντρωση υποστρώματος εσωτερικά στο φορέα ή και στην επιφάνεια του καταλυτικού φορέα σ 0 Ανηγμένη συγκέντρωση υποστρώματος στην κύρια υγρή φάση φ Μέτρο υποστρώματος για εσωτερικό περιορισμό διαχύσεως (μέτρο του Thiele) x Απόσταση από την επιφάνεια του φορέα-μεμβράνη ψ Ηλεκτροστατικό δυναμικό φορέα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Εισαγωγή στα ένζυμα 1.1 ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ Τα ένζυμα (enzymes) είναι βιομόρια με πρωτεϊνική σύσταση, έχουν δε ως φυσιολογική τους λειτουργία την κατάλυση βιοχημικών αντιδράσεων. Για το λόγο αυτό ονομάζονται και βιοκαταλύτες. Ειδικότερα, η λειτουργία ενός ενζύμου έγκειται στην επιτάχυνση της αντιδράσεως την οποία καταλύει (δηλαδή στην αύξηση της ταχύτητας), ώστε να επιτευχθεί το σημείο ισορροπίας συντομότερα, συγκριτικά με την αντίδραση απουσία ενζύμου. Το ένζυμο δεν επηρεάζει το σημείο ισορροπίας της αντιδράσεως, ούτε υφίσταται κάποια μόνιμη αλλοίωση στο πέρας της αντιδράσεως. Οι όποιες ενδεχόμενες αλλοιώσεις του ενζύμου κατά την αντίδραση είναι παροδικές και αναιρούνται στο τέλος της. Το 1986, o Thomas Cech ανακάλυψε τα ριβόζυμα (ribozymes), τα οποία είναι καταλυτικά μόρια RNA, οπότε πλέον γνωρίζουμε ότι στη φύση, βιοκαταλύτες δεν είναι μόνον τα ένζυμα. Ως υποστρώματα (substrates) κάθε ενζύμου θεωρούνται οι ενώσεις επί των οποίων το ένζυμο επιφέρει την καταλυτική του δράση, σχηματίζοντας συγκεκριμένα προϊόντα. Ορισμένα ένζυμα, προκειμένου να δράσουν, δεσμεύουν μη πρωτεϊνικά μόρια, τους συμπαράγοντες (cofactors). Συχνά ο συμπαράγων είναι κάποιο μεταλλοϊόν ή οργανικό μόριο αντιστρεπτά και χαλαρά δεσμευμένο στο ένζυμο, οπότε ονομάζεται συνένζυμο (coenzyme). Στην περίπτωση που ο συμπαράγων είναι ισχυρά δεσμευμένος στο ένζυμο, π.χ. μέσω ομοιοπολικού δεσμού, και δεν απομακρύνεται μετά το πέρας της αντιδράσεως, ονομάζεται προσθετική ομάδα (prosthetic group). Το σύμπλοκο ενζύμου-συμπαράγοντα είναι δραστικό και ονομάζεται ολοένζυμο (holoenzyme), ενώ ένζυμο χωρίς το συμπαράγοντα είναι αδρανές και ονομάζεται αποένζυμο (apoenzyme). 1.2 ΟΝΟΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ Τα ένζυμα ονομάζονται με εμπειρικά ονόματα, τα οποία χρησιμοποιούνται στη πράξη, και με συστηματικά ονόματα, τα οποία βασίζονται σε ορισμένους κανόνες, είναι δύσχρηστα και σπανίως χρησιμοποιούνται. Ακόμα και για τα εμπειρικά ονόματα υπάρχουν κάποιοι γενικοί κανόνες. Η κατάληξη άση

ENZYMIKH BIOTEXNOΛOΓIA ( ase) είναι συνήθης, π.χ. αμυλάση, οξειδάση, αμινοτρανσφεράση, αποκαρβοξυλάση, ισομεράση, συνθετάση κ.λπ. Ειδικότερα, εάν η κατάληξη άση ακολουθεί το όνομα του υποστρώματος, είναι ενδεικτική υδρολυτικής δράσης του ενζύμου, π.χ. αμυλάση, λακτάση, νουκλεάση, φωσφατάση. Μία εξαίρεση αποτελούν τα ένζυμα που υδρολύουν πρωτεΐνες (πρωτεάσες ή πρωτεολυτικά ένζυμα). Στα ονόματα αυτών, συχνά, υπάρχει η κατάληξη ίνη, π.χ. θρομβίνη, θρυψίνη, πεψίνη, παπαΐνη, χυμοσίνη, κ.λπ. Ωστόσο και εδώ υπάρχουν εξαιρέσεις, π.χ. τα πρωτεολυτικά ένζυμα ινωδοκινάση και ουροκινάση. Τα ονόματα ανιοντικών υποστρωμάτων (π.χ. μηλικό οξύ) που ενυπάρχουν στο όνομα του ενζύμου, φέρουν την κατάληξη ική ( ate), π.χ. μηλική αφυδρογονάση (malate dehydrogenase). Στα εμπειρικά ονόματα των ενζύμων, συχνά ενυπάρχει πληροφορία για το υπόστρωμα στο οποίο δρα το ένζυμο. Λόγου χάριν, η αμυλάση και η κυτταρινάση δρουν υδρολυτικά στο άμυλο και στην κυτταρίνη, αντιστοίχως, ενώ η νουκλεάση σε νουκλεϊνικά οξέα. Σε άλλες περιπτώσεις, τα εμπειρικά ονόματα ενζύμων παρέχουν πληροφορίες για τη χημική ομάδα στην οποία δρα το ένζυμο, χωρίς πληροφορίες για το υπόστρωμα (μόριο), π.χ. η φωσφατάση καταλύει την απομάκρυνση (υδρολυτικά) φωσφορικής ομάδας από κάποιο υπόστρωμα. Ωστόσο, σε πολλές περιπτώσεις εμπειρικών ονόματα ενζύμων, παρέχονται πληροφορίες τόσο για το υπόστρωμα όσο και για τη φύση της αντιδράσεως, π.χ. η L-μηλική αφυδρογονάση καταλύει την αντίδραση αφαίρεσης υδρογόνων από το L-στερεοϊσομερές του μηλικού οξέος (το οποίο οξειδώνεται σε οξαλοξικό οξύ), ενώ η S-τρανσφεράση γλουταθειόνης καταλύει τη μεταφορά του υποστρώματος γλουταθειόνης (γ-l-glu L-Cys Gly), μέσω του θειολοανιόντος της L-Cys, επάνω σε κάποιο άλλο υπόστρωμα. Τέλος, λίγες είναι οι περιπτώσεις εμπειρικών ονόματα ενζύμων στα οποία είτε εμπεριέχεται πληροφορία σχετικά με τη πηγή προελεύσεως του ενζύμου (π.χ. η πρωτεάσες παπαΐνη από το φυτό Carica papaya και θερμολυσίνη από μικροοργανισμό ιαπωνικής θερμοπηγής) είτε το όνομα είναι κενό πληροφοριών (π.χ. η καταλάση (catalase) καταλύει την αντίδραση 2H 2 O 2 2Η 2 Ο + Ο 2, και η διαφοράση (diaphorase) ή διυδρολιποαμιδική αφυδρογονάση (dihydrolipoamide dehydrogenase) δρα σε χρωστικές μεταβάλλοντας το λ max, ενώ ανάγει και το λιποαμίδιο σε διυδρολιποαμίδιο, χρησιμοποιώντας NADH), είτε το όνομα έχει ιστορικές καταβολές (π.χ. η διαστάση (diastase) αποτελεί την παλαιότερη ονομασία της αμυλάσης, ενώ ως Zwischenferment ονομαζόταν η αφυδρογονάση 6-φωσφορικής γλυκόζης (glucose-6-phosphate dehydrogenase). Το 1956, προκειμένου να μειωθεί η σύγχυση περί την ονομασία των ενζύμων, η τότε Διεθνής Επιτροπή Ενζύμων πρότεινε την κατάταξη των ενζύμων σε έξι κατηγορίες σύμφωνα με τη φύση της αντιδράσεως την οποία καταλύουν. Από το 1977, οι αρμοδιότητες για την ονομασία των ενζύμων βρίσκονται στην Επιτροπή Ονοματολογίας της Διεθνούς Ενώσεως Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας. Σε κάθε ένζυμο αντιστοιχεί ένας χαρακτηριστικός και μοναδικός κωδικός ενζύμου (Enzyme Code, EC) ο οποίος αποτελείται από τέσσερα ψηφία που χωρίζονται από τελεία. Το πρώτο ψηφίο υποδηλώνει την κατηγορία του ενζύμου, η οποία αφορά στη φύση της αντιδράσεως που καταλύει: