مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایالم بررسي ميزان مقاومت به داروهاي کارباپنم و توليد آنزيم کارباپنماز KPC در سويه هاي کلبسيالپنومونيه جدا شده از نمونه هاي باليني 1( گروه زيست شناسي دانشكده علوم دانشگاه اصفهان چكيده تاریخ دریافت: 24/4/92 و تعيين الگوي مقاومت اکتسابي آن ها 1 1 داريوش شکري محمد رباني خوراسگاني اصفهان ايران تاریخ پذیرش: 24/6/51 مقدمه: وجود مقاومت آنتي بيوتيکي در سويه هاي کلبسيالپنومونيه يکي از چالش ها و نگراني هاي سالمتي انسان است. اهداف اين مطالعه بررسي فراواني مقاومت به داروهاي کارباپنم در سويه هاي کلبسيالپنومونيه و تعيين الگوي مقاومت اکتسابي آن ها به منظور به دست آوردن کاراترين آنتي بيوتيک ها و بررسي فنوتيپي فراواني آنزيم کارباپنماز KPC بود. مواد و روش ها: اين مطالعه مقطعي-توصيفي بر روي نمونه هاي باليني شامل ادرار مياني نمونه هاي تنفسي مايعات استريل و خون جمع آوري شده از بيمارستان الزهرا)س( شهر اصفهان در طي يک سال انجام شد. الگوي مقاومت اکتسابي سويه هاي جدا شده کلبسيالپنومونيه نسبت به 13 آنتي بيوتيک مختلف از 31 کالس آنتي بيوتيکي محاسبه شد و تعداد سويه هاي مقاوم چند دارويي) MDR ( مقاوم دارويي گسترده) XDR ( و مقاوم دارويي همه جانبه) PDR ( طبق تعريف جديد CDC تعيين گرديد. تمامي اطالعات توسط نرم افزار WHOnet 5.6 تجزيه و تحليل گرديد. در سويه هاي مقاوم به کارباپنم ها کمترين غلظت ممانعتي) MIC ( به روش E-test براي ايمي پنم و مروپنم محاسبه گرديد و ميزان مقاومت آنزيم KPC به روش فنوتيپي هاچ اصالح شده بررسي شد. يافته هاي پژوهش: موثرترين آنتي بيوتيک ها بر عليه 89 سويه کلبسيالپنومونيه جدا سازي شده به ترتيب کولسيتين تيگسيکلين و کلرامفينيکل بودند. هم چنين نتايج نشان داد که 88 درصد سويه ها MDR و تقريبا 6 درصد نيز XDR بودند ولي هيچ سويه PDR يافت نشد. مقاومت به آنتي بيوتيک هاي خانواده کارباپنم براي دوري پنم برابر 66/1 براي ارتاپنم برابر 68/6 براي ايميپنم برابر 55/3 )به روش )Etest و 59/2 )به روش انتشار از ديسک( و براي مروپنم برابر 65/1 )به روش )Etest و 66/1 )به روش انتشار از ديسک( بود. تست فنوتيپي آنزيم کارباپنماز KPC براي 17 سويه) 13 درصد( از سويه هاي کلبسيالپنومونيه مثبت بود. بحث و نتيجه گيري: مطالعه حاضر نشان دهنده فراواني بسيار باالي سويه هاي MDR مقاومت باال به داروهاي کارباپنم و ميزان باالي آنزيم کارباپنماز KPC در سويه هاي کلبسيالپنومونيه است که نياز فوري به بازنگري و اصالح الگوي مصرف آنتي بيوتيک ها را نشان مي دهد. واژه هاي کليدي: کلبسيالپنومونيه کارباپنم ها آنزيم کلبسيالپنومونيه کارباپنماز) KPC ( Email:m.rabbani@biol.ui.ac.ir * نویسنده مسئول: گروه زیست شناسي دانشكده علوم دانشگاه اصفهان اصفهان ایران 81
بررسی میزان مقاومت به داروهاي کارباپنم و تولید آنزیم کارباپنماز... محمد ربانی خوراسگانی و همکاران مقدمه سازمان بهداشت جهاني باکتري هاي مقاوم به آنتي بيوتيک ها را جزو مهم ترين خطرات تهديدکننده بهداشت جهاني معرفي کرده است که درصد فراواني از مرگ و ميرهاي ساالنه بيمارستاني را به خود اختصاص مي دهند) 3 (. از ميان اين باکتري ها باکتري هاي خانواده انتروباکترياسه با توجه به فراواني باالي آن ها اهميت بيشتري دارند و از اين خانواده جنس کلبسيالپنومونيه با توجه به فراواني باال و ايجاد عفونت هاي مختلف و نيز مقاومت باال به آنتي بيوتيک ها داراي اهميت ويژه اي است) 2 (. داروهاي کارباپنم )شامل ارتاپنم ايمي پنم دوري پنم و مروپنم( در درمان بيماري هاي ناشي از باکتري هاي مقاوم به بتاالکتام بسيار موثر بودهاند) 1-5 (. به دليل طيف وسيع فعاليت آن ها و پايداري در مقابل هيدروليز توسط اغلب بتاالکتامازها کارباپنم ها داروهاي انتخابي براي درمان عفونت هاي ناشي از باسيل هاي گرم منفي مقاوم به پني سيلين يا سفالوسپورين مي باشند) 6 (. شيوه عمل کارباپنم ها مهار سنتز ديواره سلولي در باکتري ها مي باشد و باعث افزايش نفوذپذيري غشاي خارجي سلول ها و اثر روي سيستم پمپ آن ها مي شوند) 6 5 (. با اين وجود ظهور بتاالکتامازهاي هيدروليز کننده کارباپنم با واسطه پالسميد و انتشار آن ها در ميان باکتري هاي گرم منفي به خصوص خانواده انتروباکترياسه در حال افزايش است) 5 (. مکانيسم مقاومت به کارباپنم به کاهش بيان پروتئين هاي غشاي خارجي افزايش فعاليت سيستم پمپ و توليد بتاالکتامازهاي کارباپنماز که مي توانند کارباپنم ها را با عمل هيدروليز غير فعال کنند نسبت داده شده است) 1 6 (. آنزيم KPC )مخفف کلبسيال پنومونيه کارباپنماز( يکي از آنزيم هاي هيدروليزکننده کارباپنم است که بر روي پالسميدهاي قابل انتقال يافت شده است و بنا بر اين مي تواند به سرعت در بين باکتري هاي مختلف مبادله شده و باعث ايجاد مقاومت شديد شود) 6 5 (. تشخيص باکتري هاي مقاوم و بررسي نوع و مکانيسم مقاومت آن ها به منظور دستيابي به بهترين راهکار براي حذف آن ها قابل اهميت است. از طرف ديگر به کمک تعيين الگوي حساسيت آنتي بيوتيکي اين باکتري ها مي توان براي دستيابي به آنتي بيوتيک هاي کارا و قابل استفاده بر عليه آن ها در درمان آن ها بهره گرفت. دسته بندي هاي مختلفي براي ارگانيسم هاي مقاوم در مقاالت پزشکي يافت مي شود که مهم ترين آن ها شامل سه دسته مقاومت دارويي چندگانه مقاومت دارويي گسترده و مقاومت دارويي همه جانبه مي باشد) 3 6 (. تا سال 2733 ميالدي تعريف استانداردي براي اين مفاهيم وجود نداشت و تعاريف بسيار مختلفي از آن ها ارائه شده بود اما در اين سال يک الگوي استاندارد مقاومت در چند باکتري اصلي مقاوم از جمله در خانواده انتروباکترياسه توسط مرکز کنترل بيماري ها پيشنهاد شد. براي اين خانواده توسط 13 آنتي بيوتيک مختلف از 31 کالس آنتي بيوتيکي اين استانداردسازي انجام گرفت و با توجه به نوع باکتري و آنتي بيوتيک هاي پيشنهاد شده توسط موسسه استاندارد آزمايشگاهي و کلينيکي الگوهاي XDR MDR و PDR تعيين گرديد) 6 1 (. تاکنون اين استانداردسازي براي باکتري کلبسيالپنومونيه در ايران انجام نشده است و محققان ايراني از تعاريف مختلفي در مقاالت و تحقيقات خود بهره جسته اند. بهره گيري از اصطالحات بين المللي استاندارد براي تعريف ارگانيسم هاي مقاوم و ارتقاي مقايسه الگوهاي مقاومت آنتي بيوتيکي و استفاده از آن ها در مطالعات اپيدميولوژيکي بومي منطقه اي و جهاني اين استانداردسازي را ضروري مي سازد. اين امر به شناسايي بهتر باکتري هاي مهم داراي مقاومت در کشور و مقايسه آن ها با باکتري هاي مشابه ديگر در جهان و اتخاذ تصميم مناسب در مورد نحوه برخورد با آن ها تاثير مي گذارد و به دستيابي به آنتي بيوتيک ه يا کارآمد کمک مي کند. با توجه به اهميت ويژه داروهاي کارباپنم در درمان عفونت هاي غير قابل درمان با آنتي بيوتيک هاي معمول و نيز لزوم دستيابي به آنتي بيوتيک ه يا کارآمد ديگر براي درمان اين عفونت ها اين مطالعه با هدف بررسي فراواني مقاومت به داروهاي کارباپنم در سويه هاي کلبسيالپنومونيه و تعيين الگوي مقاومت اکتسابي آن ها بر طبق تعريف جديد مرکز کنترل بيماري ها و 81
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایالم هم چنين بررسي فنوتيپي فراواني آنزيم کارباپنماز کلبسيالپنومونيه در اين سويه ها صورت گرفته است. مواد و روش ها الف( جداسازي و شناسايي باکتري ها: اين مطالعه مقطعي-توصيفي بر روي نمونه هاي باليني شامل نمونه هاي ادرار مياني تنفسي مايعات استريل شامل مايع مغزي-نخايي مايع شکمي)پريتوئن( مايع پريکارديال و همين طور نمونه خون به انجام رسيد. سويه هاي مختلف باکتري کلبسيالپنومونيه در طي يک سال)فروردين 81 تا فروردين 86( از نمونه هاي مختلف باليني فوق از بيمارستان الزهرا)س( شهر اصفهان جداسازي و شناسايي شدند. شناسايي جدايه ها به کمک آزمون هاي فنوتيپي و بيوشيميايي شامل تست هاي VP MR TSI سيمون سيترات اورهاز SIM ليزين دکربوکسيالز اورنيتين دکربوکسيالز فنيل آالنين دآميناز و ONPG انجام شد) 9 (. ب( تعيين الگوي حساسيت آنتي بيوتيکي و الگوهاي مقاومت MDR PDR و :XDR الگوي حساسيت آنتي بيوتيکي به آنتي بيوتيک هاي رايج مورد استفاده در سويه هاي جداسازي شده با توجه به راهنماي سال CLSI 2731 و دستورالعمل سال 2733 CDC توسط روش ديسک ديفيوژن)کربي-بائر( تعيين گرديد که شامل 13 آنتي بيوتيک مختلف از 31 کالس آنتي بيوتيکي بود و در جدول شماره 3 ليست آن ها آمده است) 6 1 (. بر طبق اين جدول الگوهاي مقاومت جديد MDR PDR و XDR بدين ترتيب تعريف گرديد: يک باکتري MDR به عنوان باکتري غيرحساس به حداقل يک عامل در سه يا تعداد بيشتري از دسته هاي ضدميکروبي در نظر گرفته مي شود باکتري XDR باکتري غيرحساس به حداقل يک عامل در همه دسته هاي ضدميکروبي به جز دو يا يک دسته مي باشد)يعني سويه باکتري حساس به يک يا دو دسته باقي مي ماند( و PDR غيرحساس به همه عوامل در همه دسته هاي ضدميکروبي)يعني هيچ عامل به عنوان حساس براي آن ارگانيسم در نظر گرفته نمي شود(. بنا بر اين يک سويه باکتريايي که به عنوان XDR در نظر گرفته مي شود MDR نيز مي باشد) 6 (. جدول شماره 1. دسته ها و عوامل ضدميكروبي مورد استفاده براي تعريف MDR PDR و XDR در خانواده انتروباکترياسه) 6 ( آمينوگليکوزيدها دسته آنتي بيوتيک ها سفالوسپورينهاي ضد MRSA پني سيلين هاي ضد سودوموناسي+ مهارکنندههاي بتاالکتاماز کارباپنم ها سفالوسپورين هاي غير وسيع الطيف نسل اول و دوم سفالوسپورين هاي وسيع الطيف نسل سوم و چهارم سفامايسين ها فلوروکوئينولون ها مهارکنندههاي مسير فوالت گلي سيکلين ها منوباکتام ها پني سيلين ها پني سيلين ها+ مهارکننده هاي بتاالکتامازها فنيکول ها فسفونيک اسيدها پلي ميکسين ها تتراسيکلين ها انواع جنتامايسين توبرامايسين آميکاسين نتيلمايسين سفتارولين تيکارسيلين-کالوونيک اسيد پيپيراسيلين-تازوباکتام ارتاپنم ايميپنم مروپنم دوري پنم سفازولين سفوروکسيم سفوتاکسيم سفتازيديم سفپيم سفوکسيتين سفوتتان سيپروفلوکساسين تريمتوپريم- سولفامتوکسازول تيگسيکلين آزترونام آمپي سيلين آموکسي سيلين-کالوونيک اسيد آمپيسيلين-سولباکتام کلرامفينيکل )براي عفونتهاي غيرادراري( فسفومايسين کلسيتين تتراسيکلين داکسيسيکلين مينوسيکلين :MDR غيرحساس به حداقل يک عامل در 1 يا تعداد بيشتري از دسته هاي آنتي بيوتيکي ليست شده در اين جدول :XDR غيرحساس به حداقل يک عامل در همه دسته هاي آنتي بيوتيک به جز يک يا دو دسته :PDR غيرحساس به همه عوامل آنتي ميکروبيال در همه دستههاي ليست شده 02
بررسی میزان مقاومت به داروهاي کارباپنم و تولید آنزیم کارباپنماز... محمد ربانی خوراسگانی و همکاران ج(بررسي فنوتيپي مقاومت :KPC بر اساس پيشنهاد CLSI براي بررسي فنوتيپي مقاومت KPC در سويه هاي جداسازي شده عدم حساسيت)مقاومت و يا نيمه حساس بودن( به يکي يا تعداد بيشتري از آنتي بيوتيک هاي خانواده کارباپنم و يا مقاومت به يکي يا تعداد بيشتري از سفالوسپورين هاي نسل سوم از جمله سفوتاکسيم و سفتازيديم براي شناسايي اوليه باکتري هاي احتمالي داراي مقاومت KPC مورد استفاده قرار گرفت و تست تاييدي توليد آنزيم توسط آزمون تغيير يافته هاج انجام شد) 1 8 (. در اين روش ابتدا تعليق باکتري استاندارد E.coli ATCC 25922 به غلظت نيم مک فارلند تهيه و به کمک سرم فيزيولوژي به غلظت يک دهم رسانده شد. سپس با استفاده از سوآب در سطح محيط مولر هينتون آگار به صورت چمني کشت داده شد و ديسک آنتي بيوتيکي ارتاپنم 37µg در مرکز محيط قرار داده شد. در مرحله بعد از باکتري هاي جدا شده مشکوک به وجود آنزيم کارباپنماز به کمک سواپ از لبه ديسک ارتاپنم)گذاشته شده در مرکز( تا لبه پليت به صورت يک خط مستقيم کشيده و در نهايت پليت ها به مدت 26 ساعت در دماي 15 درجه سانتي گراد نگهداري شدند. سويه هاي توليدکننده آنزيم کارباپنماز باعث ميشوند که هاله عدم رشد اطراف ديسک مرکزي به صورت مضرسي شکل درآيد)نماي برگ شبدري( در حالي که سويه هاي منفي تغييري در اين هاله به وجود نمي آورند و هاله اطراف آن ها يک دست باقي مي ماند. د( تعيين کمترين غلظت ممانعت کننده به روش :Etest تست تاييدي مقاومت به کارباپنم ها با روش تعيين کمترين غلظت ممانعت کننده يا MIC به روش Etest براي آنتي بيوتيک هاي مروپنم و ايمي پنم به انجام رسيد که به اين منظور ابتدا غلظتي برابر نيم مک فارلند از جدايه هايي که به يکي از ديسک هاي کارباپنم مقاومت داشتند تهيه گرديده و بر روي محيط مولر هينتون آگار به روش کشت چمني به کمک سواب استريل کشت داده شدند و بعد از چند دقيقه دو نوار Etest از ايمي پنم و مروپنم بر روي پليت قرار گرفتند و سپس به مدت 26 ساعت در انکوباتور 15 درجه سانتي گراد قرار داده شدند و سپس عدد MIC آن ها قرائت گرديد. يافته هاي پژوهش از نمونه هاي باليني مختلف در طي يک سال مطالعه تعداد 89 سويه مختلف باکتري کلبسيالپنومونيه جداسازي و شناسايي شدند که شامل ادرار مياني) 22 عدد( نمونه هاي تنفسي) 59 عدد( مايعات استريل بدن )9 عدد( و نمونه خون) 37 عدد( بودند. نتايج الگوي مقاومت سويه هاي باکتري کلبسيالپنومونيه به آنتي بيوتيک هاي استفاده شده به کمک نرم افزار WHOnet 5.6 طبق الگوي جديد CDC در شکل شماره 3 آمده است. همان طور که از اين شکل مشخص است موثرترين آنتي بيوتيک ها بر عليه سويه هاي کلبسيالپنومونيه به ترتيب آنتي بيوتيک هاي کولسيتين) 86/8 درصد حساس( تيگسيکلين) 86/8 درصد حساس( و کلرامفينيکل) 96/1 درصد حساس( بودند و مقاومت بسيار باال)باالي 87 درصد مقاومت( در مورد آنتي بيوتيک هاي آمپي سيلين سفازولين سفتارولين سفوروکسيم سفتازيديم سفوتاکسيم و آزترئونام ديده شد. هم چنين نتايج به دست آمده توسط نرم افزار WHOnet 5.6 نشان داد که از بين 89 سويه جداسازي شده 81 سويه) 88 درصد( MDR بودند و 6 سويه)تقريبا 6 درصد( نيز XDR بودند و هيچ سويه PDR يافت نشد. 08
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایالم شكل شماره 1. نتايج الگوي مقاومت سويه هاي کلبسيالپنومونيه به کمک نرم افزار WHOnet 5.6 طبق الگوي جديد :CTX سفپيم :FEP سفازولين :CZO آمپي سيلين/سولباکتام :SAM آمپي سيلين :AMP آميكاسين :AMK.CDC سفوتاکسيم :CTT سفوتتان :FOX سفوکسيتين :CPT سفتارولين :CAZ سفتازيديم :CHL کلرآمفينيكل :CIP سيپروفلوکساسين :COL کوليستين :DOX داکسي سيكلين :FOS فسفومايسين :MNO مينوسيكلين :TZP پيپيراسيلين/تازوباکتام :TCY تتراسايكلين :TCC تيكارسيلين/کالوونيک اسيد :TOB توبرامايسين سنجش مقاومت سويه ها نسبت به آنتي بيوتيک هاي خانواده کارباپنم شامل ايمي پنم مروپنم دوري پنم و ارتاپنم نشان مي دهد که درصد سويه هاي مقاوم براي دوري پنم برابر 66/1 براي ارتاپنم برابر 68/6 براي ايمي پنم برابر 55/3 )به روش )Etest و 59/2 )به روش انتشار از ديسک( و براي مروپنم برابر 65/1 )به روش )Etest و 66/1 )به روش انتشار از ديسک( بود)شکل شماره 2(. محدوده عدد کمترين غلظت ممانعت کننده يا MIC و تعداد سويه ها در شکل :AMC سفوروکسيم :CXM آزترئونام :ATM کوتريموکسازول :SXT آمپي سيلين/کالوونيک اسيد :TGC تيگسيكلين :NET نتيلمايسين شماره 1- الف و 1- ب براي آنتي بيوتيک هاي ايمي پنم و مروپنم مشخص است و در شکل شماره 6 يک نمونه از محاسبه MIC به روش Etest آمده است. همان طور که از اين شکل معلوم است بيشترين غلظت مهاري در مورد هر دو آنتي بيوتيک غلظت 66 مي - باشد که ميزان باالي مقاومت را نشان مي دهد. در مورد هر دو آنتي بيوتيک محدوده MIC از عدد 7/766 تا 66 ميکروگرم در ميکروليتر متغير است اما اکثر سويه ها در محدوده مقاوم قرار دارند. شكل شماره 2. درصد سويه هاي مقاوم نيمه حساس و حساس به آنتي بيوتيک هاي خانواده کارباپنم در سويه هاي کلبسيالپنومونيه 00
بررسی میزان مقاومت به داروهاي کارباپنم و تولید آنزیم کارباپنماز... محمد ربانی خوراسگانی و همکاران )الف( )ب( شكل شماره. 3 محدوده MIC ايمي پنم)الف( و مروپنم)ب( برحسب ميكروگرم در ميلي ليتر در مورد سويه هاي کلبسيالپنومونيه. محور X نشان دهنده عدد MIC و محور Y تعداد سويه هاي داراي هر عدد MIC است. شكل شماره 4. عدد MIC در اين سويه کلبسيال پنومونيه براي مروپنم بيشتر از 32 و براي ايمي پنم برابر با 4 مي باشد. عدد MIC نقطه اي است که دو طرف هاله عدم رشد همديگر را قطع کرده اند. 02
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایالم نتايج نشان داد که تست فنوتيپي آنزيم کارباپنماز KPC براي 17 سويه) 13 درصد( از سويه هاي کلبسيال پنومونيه مثبت بود)شکل شماره 6( و تست تاييدي مقاومت به کارباپنم ها با روش تعيين کمترين غلظت ممانعتي) MIC ( به روش Etest نيز تاييدکننده اين مقاومت بود)شکل شماره 5(. شكل شماره 4. نتيجه مثبت آزمون هاج تغييريافته به شكل مضرسي و برگ شبدري در مورد سه سويه کلبسيالپنومونيه در اينجا مشخص است. شكل شماره 5. تست تاييدي مقاومت به کارباپنم ها با روش تعيين کمترين غلظت ممانعتي) MIC ( به روش Etest در مورد دو آنتي بيوتيک مروپنم و ايميپنم. همان طور که ديده مي شود هيچ هاله عدم رشدي وجود ندارد و بنا بر اين عدد MIC براي هر دو آنتي بيوتيک بيشتر از 32 مي باشد. بحث و نتيجه گيري باکتري کلبسيالپنومونيه يک باکتري گرم منفي متعلق به خانواده انتروباکترياسه است که به عنوان يکي از شايع ترين عوامل ايجاد کننده عفونت هاي انساني شناخته مي شود و به علت مقاومت دارويي باال بسيار مورد توجه است) 37 33 (. با توجه به افزايش روزافزون مقاومت آنتي بيوتيکي در اين باکتري به خصوص در مورد سويه هايي که آنتي بيوتيک هاي موثر قبلي ديگر بر عليه آن ها اثر درماني نداشتند معرفي داروهاي خانواده کارباپنم با توجه به طيف اثر وسيع مورد توجه قرار گرفتند اما مقاومت به آن ها نيز در مطالعات متعددي گزارش شده است) 8-35 (. در مطالعه حاضر 02
بررسی میزان مقاومت به داروهاي کارباپنم و تولید آنزیم کارباپنماز... محمد ربانی خوراسگانی و همکاران مقاومت XDR تقريبا 6 درصد بود و هيچ سويه PDR در مطالعه ما يافت نشد اما همين تعداد سويه XDR که فقط به داروهاي کوليستين و کلرامفنيکل و يا تيگسيکلين حساس بودند که داروهايي با عوارض جانبي بااليي هستند)به خصوص کوليستين( توجه به الگوي صحيح مصرف آنتي بيوتيکي را در بيمارستان هاي ايران را يادآور مي شود. مطالعه ژاپني نژاد و همکاران در سال 2736 در تهران نشان دهنده مقاومت باالي سويه هاي کلبسيالپنومونيه در آنتي بيوتيک هاي مختلف بود که با مطالعه ما تا حدودي مطابقت داشت و هم چنين آن ها نشان دادند که در سويه هاي مقاوم به کارباپنم ها 377 درصد حساسيت به کوليستين وجود دارد که کامال با مطالعه ما مطابقت دارد) 38 (. در مقايسه با کشورهاي ديگر هم چنين مي توان گفت ميزان MDR مطالعه ما در مقايسه با نتايج اعالم شده توسط سوبا و همکاران از هند که در سال 2773 ميزان مقاومت دارويى چندگانه ايزوله هاى کلبسيالپنومونيه را 377 درصد گزارش کرده بودند کمتر است اما از نتايج يوال و همکاران که در سال 2778 ميزان شيوع سويه هاي اين باکتري را 11/13 درصد گزارش کرده اند بيشتر است) 27 23 (. مطالعه سانچز و همکاران در طول 32 سال در اياالت متحده بر روي 1312156 نمونه کلبسيالپنومونيه نشان دهنده مقاومت در حال افزايش اين سويه ها به آنتي بيوتيک هاي کوتريموکسازول آزترئونام ايمي پنم مروپنم سفتازيديم سفترياکسون سفپيم جنتامايسين آميکاسين سيپروفلوکساسين توب رامايسين پيپيراسين/تازوباکتام و تتراسايکلين بود ولي در تمامي اين آنتي بيوتيک ها ميزان مقاومت بسيار پايين تر از مطالعه ما بود) 22 (. افزايش شيوع اين سويه هاي مقاوم داراي داليل متعددي از قبيل اثر تجويز ناصحيح آنتي بيوتيک ها در درمان عفونت هاي مختلف و يا انتقال ژن هاي مقاومت توسط عوامل منتقل کننده گوناگون مانند پالسميدهاي مقاومت باکتريوفاژها ترانسپوزون ها و اينتگرون ها مي تواند باشد) 21 (. با توجه به اهميت داروهاي کارباپنم در درمان سويه هاي مقاوم باکتري کلبسيالپنومونيه به خصوص در سويه هايي که داراي آنزيم هاي بتاالکتاماز وسيع ميزان مقاومت چندگانه آنتي بيوتيکي و نيز مقاومت به خانواده داروهاي کارباپنم و الگوي اکتسابي آنتي بيوتيکي در سويه هاي کلبسيالپنومونيه مورد بررسي قرار گرفت. الگوي مقاومت اکتسابي آنتي بيوتيکي در اين سويه ها بر طبق تفاسير جديد ارائه شده توسط CDC در دسته هاي مختلف آنتي بيوتيکي تعيين گرديد و بر طبق اين تفسير جديد ميزان سويه هاي XDR MDR و PDR در اين سويه ها مشخص گرديد. با توجه به بررسي هاي انجام شده تعيين ميزان سويه هاي XDR MDR و PDR مطابق با استاندارد بين المللي تاکنون در مورد سويه هاي کلبسيالپنومونيه در ايران اعالم نشده است. هر چند در مطالعات زيادي در ايران الگوهاي مقاومت آنتي بيوتيکي و ميزان مقاومت دارويي چندگانه) MDR ( در اين باکتري بررسي شده است. در مطالعه لنگرى زاده و همکاران کلرامفنيکل نورفلوکساسين آميکاسين سيپروفلوکساسين و ايمي پنم داراي بيشترين تاثير بر روي سويه هاي کلبسيالپنومونيه در يک بيمارستان در شهر تبريز بودند و 89/63 درصد سويه ها داراي مقاومت دارويى چندگانه بودند) 36 (. مطالعه هاشمي زاده و همکاران نشان داد که بيش از 55 درصد از باکتري هاي کلبسيالپنومونيه جداسازي شده در شهر شهرکرد مقاوم به چند دارو بودند) 31 (. هم چنين مطالعه فاضلي و همکاران در شهر اصفهان در سال 2736 که بر روي 362 سويه کلبسيالپنومونيه به انجام رسيد نشان داد 327 عدد) 96 درصد( از سويه ها MDR بودند و باالترين درصد مقاومت به ديسک هاي پيپيراسيلين) 97 درصد( سفتازيديم) 16 درصد( و سفوتاکسيم) 11 درصد( مشاهده شد) 39 (. مطالعه ما نشان داد موثرترين آنتي بيوتيک ها بر عليه سويه هاي کلبسيالپنومونيه به ترتيب آنتي بيوتيک هاي کولسيتين تيگسيکلين و کلرامفينيکل بودند و مقاومت بسيار باال در مورد آنتي بيوتيک هاي آمپي سيلين سفازولين سفتارولين سفوروکسيم سفتازيديم سفوتاکسيم و آزترونام ديده شد. هم چنين اين مطالعه نشان داد 88 درصد از سويه هاي اين باکتري داراي مقاومت دارويي چندگانه بودند که از تمامي مطالعات ذکر شده درصد باالتري بود که نگراني زيادي را به وجود مي آورد. هر چند ميزان 02
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایالم الطيف) ESBLs ( هستند در اين مطالعه ميزان مقاومت به اين دسته به طور اختصاصي مورد بررسي قرار گرفت. مطالعه حاضر نشان داد که ميزان مقاومت از محدوده 55/3 درصد براي ايمي پنم تا 68/6 درصد براي ارتاپنم بود که ميزان نسبتا بااليي را نشان مي دهد. مطالعه قبلي ما نشان داده بود که از بين 15 عدد سويه کلبسيالپنومونيه به ترتيب 85 و 86 درصد مقاومت به ديسک هاي ايمي پنم و مروپنم وجود دارد) 26 ( که ميزان بسيار باالتري بود که اين مي تواند به اين دليل برگردد که در مطالعه مقطعي حاضر تمامي سويه هاي کلبسيالپنومونيه با الگوهاي مختلف مورد ارزيابي قرار گرفته است اما در مطالعه قبلي سويه هايي با مقاومت باالتر انتخاب شدند. مطالعه هاشمي زاده و همکاران نشان داد که در سويه هاي اين باکتري که از شهر شهرکرد جداسازي شده بود باالي 67 درصد مقاومت به ديسک هاي مروپنم و ايمي پنم وجود دارد و MIC آن ها باالتر از 12 ميکروگرم در ميلي ليتر بود) 31 (. در مطالعه اي در شهر تهران که توسط عظيمي و همکاران صورت گرفت ميزان مقاومت به کارباپنم ها برابر با 66 درصد به دست آمد) 25 (. در مطالعه فيض آبادي و همکاران) 26 ( در طول يک سال )2776-5( در دو بيمارستان شهر تهران الگوي حساسيت 329 سويه کلبسيالپنومونيه به 23 دسته آنتي بيوتيکي مورد مطالعه قرار گرفت که مقاومت نسبتا باال به آنتي بيوتيک هاي مختلف مشاهده شد ولي مقاومتي به داروهاي کارباپنم مشاهده نک ردند که البته از ده سال پيش که اين مطالعه صورت گرفته است تاکنون طبيعي است که ميزان اين مقاومت افزايش يافته باشد. در مطالعه فاضلي و همکاران) 39 ( در شهر اصفهان يک سال قبل از مطالعه ما که در بيمارستان هدف ما يعني بيمارستان الزهرا)س( اصفهان مطالعه مشابهي بر روي سويه هاي کلبسيالپنومونيه انجام داده بودند ميزان مقاومت به داروهاي کارباپنم به ترتيب زير بود: ارتاپنم: 57/1 درصد مروپنم: 66/9 درصد و ايمي پنم: 15/9 درصد که نسبت به مطالعه ما ميزان نسبتا کمتري را نشان مي داد که اين مسئله نشان دهنده اين است که در طول يک سال ميزان افزايش مقاومت به کارباپنم ها معني دار و رو به افزايش بوده است. تمامي سويه هاي مقاوم به کارباپنم باکتري هاي فوق به سه داروي کلرآمفينيکل کوليستين و تيگسيکلين داراي حساسيت کامل بودند و بنا بر اين مي توان از اين داروها به عنوان جايگزين کارباپنم ها در اين باکتري هاي مقاوم نام برد. در مطالعات مشابهي در جهان اثر آنتي بيوتيک هاي پلي ميکسين و تيگسيکلين بر روي سويه هاي مقاوم به کارباپنم اين باکتري نشان داده شده است. براي مثال در يک مطالعه ميزان حساسيت سويه هاي کلبسيالپنومونيه مقاوم به کارباپنم ها که حاوي ژن KPC بودند به آنتي بيوتيک تيگسيکلين 377 درصد گزارش شده است و در همين مطالعه نشان داده شده است که 99 درصد سويه ها به پلي ميکسين B و 11 درصد به آميکاسين و 57 درصد به تتراسايکلين حساسيت داشته اند) 21 (. در مطالعه ديگر در 37 بيمارستان شهر بروکلين بر روي 86 سويه مقاوم به کارباپنم ها نشان داده شد که همگي آن ها به تيگسيکلين حساس بودند و 83 درصد حساسيت به پلي ميکسين B 66 درصد حساسيت به داکسي سيکلين و مقاومت نسبتا باال به آنتي بيوتيک هاي ديگر مشاهده شد) 29 (. در اين مطالعه وجود آنزيم کارباپنماز KPC )مخفف کلبسيالپنومونيه کارباپنماز( با روش فنوتيپي تست هاج تغيير يافته) MHT ( مورد بررسي قرار گرفت. گزارشات زيادي از سويه هاي انتروباکترياسه توليد کننده آنزيم هاي KPC که بر روي پالسميد حمل مي شوند در جهان گزارش شده است که اين آنزيم ها غالبا در کلبسيالپنومونيه يافت شده اند) 32-35 (. مطالعه قبلي ما در شهر اصفهان نشان داده بود که از بين 15 سويه کلبسيالپنومونيه 65 سويه) 91 درصد( اين تست در موردشان مثبت بود) 26 (. از بين مطالعات انجام گرفته در ايران هاشميزاده و همکاران نشان دادند که 8/33 درصد از باکتري هاي کلبسيالپنومونيه جداسازي شده در شهر شهرکرد داراي ژن KPC بودند) 31 (. هم چنين عظيمي و همکاران در شهر تهران نشان دادند تمامي سويه هاي اين باکتري که داراي مقاومت به کارباپنم ها بودند تست هاج تغييريافته مثبت داشتند ولي بررسي ژنوتيپي آن ها نشان داد که ژن KPC حضور نداشت) 25 (. بررسي بينا و همکاران نيز نشان دهنده 02
بررسی میزان مقاومت به داروهاي کارباپنم و تولید آنزیم کارباپنماز... محمد ربانی خوراسگانی و همکاران ميزان 97/5 درصد آنزيم KPC در سويه هاي اين باکتري بود ولي حضور ژن آن در اين سويه ها منفي بود) 28 (. مطالعه حاضر ما نشان داد 17 سويه) 13 درصد( از سويه هاي جداسازي شده کلبسيالپنومونيه واجد آنزيم KPC هستند هر چند تست نهايي وجود اين آنزيم بايستي با روش مولکولي PCR تاييد گردد و همان طور که در باال نيز به آن اشاره شد و در مطالعات مختلفي نيز نشان داده شده است صرف مثبت بودن اين تست فنوتيپي به هيچ عنوان نشان دهنده وجود ژن KPC نمي باشد و ممکن است در مقاومت هاي ديگر کارباپنم ها نيز اين تست فنوتيپي مثبت گردد) 31-35 (. در مورد سويه هايي که به ديسک هاي کارباپنم مقاومت داشتند اما آزمون KPC در مورد آن ها منفي شده بود احتماال مکانيسم هاي ديگر مقاومت به کارباپنم ها از جمله وجود آنزيم هاي متالوبتاالکتاماز درگير هستند که براي اين موارد بايستي تست هاي شناسايي اين مکانيسم ها به انجام برسد) 31 (. نتايج اين مطالعه همانند بررسي هاي ديگر محققين از جمله کازون و همکاران) 17 ( و پاستران و همکاران) 13 ( و نيز مطالعات اشاره شده در باال نشان داد سويه هاي واجد آنزيم KPC مقاومت بااليي به ساير آنتي بيوتيک ها از جمله آمپي سيلين آميکاسين سيپروفلوکساسين سفپيم پيپراسيلين/تازوباکتام)تازوسين( سفوتاکسيم و سفتازيديم دارند که اين مي تواند به دليل وجود هم زمان چندين ژن بتاالکتاماز در اين ايزوله ها باشد و اهميت و لزوم بررسي اين آنزيم و ژن آن را در نمونه هاي مختلف گوشزد مي کند. مطالعه حاضر نشان دهنده فراواني بسيار باالي سويه هاي MDR مقاومت باال به داروهاي کارباپنم و ميزان باالي آنزيم کارباپنماز KPC در سويه ه يا باکتري کلبسيالپنومونيه است که نياز فوري به بازنگري و اصالح الگوي مصرف آنتي بيوتيک ها را گوشزد مي کند چرا که مصرف بي رويه و بدون نظارت آنتي بيوتيک هاي مختلف در آينده نزديک باعث ظهور سويه هاي PDR اين باکتري و باکتري هاي ديگر خواهد شد که ديگر هيچ آنتي بيوتيکي براي درمان آن ها را باقي نخواهد گذاشت. با توجه به ميزان مصرف باالي داروهاي خانواده کارباپنم در بيمارستان هاي ايران که در بسياري از مواقع بدون انجام تست تعيين حساسيت ميکروبي و به عنوان خط اول درمان مورد استفاده قرار مي گيرند مي توان انتظار داشت که در آينده نزديک شاهد افزايش روزافزون مقاومت به اين دسته آنتي بيوتيکي باشيم لذا اتخاذ تدابير الزم جهت اصالح نحوه تجويز و مصرف آنتي بيوتيک ها ضرورت دارد. سپاسگزاری از حوزه معاونت محترم تحقيقات و فناوري دانشگاه اصفهان به خاطر حمايت مالي و همکاري گروه زيست شناسي تشکر مي شود. References 1. Siegel JD, Rhinehart E, Jackson M, Chiarello L. Management of multidrugresistant organisms in health care setting. Am J Infect Control 2007;35:165-93. 2. Johann DDP, Laupland KB. Extendedspectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae: an emerging publichealth concern. Lancet Infect Dis2008; 8:159-66. 3. Jesudason MV. Comparison of two methods to detect carbapenemase and metallo-betalactamase production in clinical isolates. Indian J Med Res2005;121 :780-3. 4. Meletis G. Emergence of Klebsiella pneumoniae carrying blavim and blakpc genes. HIPPOKRATIA2010;14:139-40. 5. Queenan AM. Carbapenemases the versatile β- lactamases. Clin Microbiol Rev 2007;20:440-58. 6. Magiorakos AP, Srinivasan A, Carey RB, Carmeli Y, Falagas ME, Giske CG, Monnet DL. Multidrug-resistant, extensively drug resistant and pandrugresistant bacteria an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect 2011;18:268-81. 7. Sun Z, Li L, Zhu X, Ma Y, Li J, Shen Z, Jin S. Analysis on antimicrobial resistance of clinical bacteria isolated from county hospitals and a teaching hospital. J Huazhong Uni Sci Technol Med2006;26:386-8. 02
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایالم 8. Forbes BA, Saham DF, Wesisfeld AS. Diagnostic Microbiology. 3th ed. USA Mosby: Chicago;1998. p.641-725. 9. Fazeli H, Norouzibarough M, Ahadi AM, Shokri D, Solgi H. Detection of New Delhi Metallo-Beta-Lactamase-1 (NDM-1) in carbapenem- resistant Klebsiella pneumoniae isolated from a university hospital in Iran. Hippokratia2015;19:205-9. 10. Bulik CC, Fauntleroy KA, Jenkins SG, Abuali M, LaBombardi VJ, Nicolau DP, et al. Comparison of meropenem MICs and susceptibilities for carbapenemaseproducing Klebsiella pneumoniae isolates by various testing methods. J Clin Microbiol 2010; 48:2402-6. 11.Bratu S, Tolaney P, Karumudi U, Quale J, Mooty M, Nichani S, et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn NY molecular epidemiology and in vitro activity of Polymyxin B and other agents. J Antimicrob Chemother 2005;56:128-32. 12. Anderson KF, Lonsway DR, Rasheed JK, Biddle J, Jensen B, McDougal LK, et al. Evaluation of methods to identify the Klebsiella pneumoniae carbapenemase in Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2007;458:2723-5. 13. Carvalhaes CG, Picao RC, Nicoletti AG, Xavier DE, Gales AC. Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results. J Antimicrob Chemother 2010; 65:249-51. 14.Cai JC, Zhou HW, Zhang R, Chen GX. Emergence of Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, and Escherichia coli isolates possessing the plasmidmediated carbapenem-hydrolyzing β- lactamase KPC-2 in intensive care units of Chinese hospital. Antimicrob Agents Chemother 2008;52:2014-8. 15.Deshpande LM, Rhomberg PR, Sader HS, Jones RN. Emergence of serine carbapenemases (KPC and SME) among clinical strains of Enterobacteriaceae isolated in the United States medical centers report from the MYSTIC Program (1999 2005). Diagn Microbiol Infect Dis 2006;56:367-72. 16. Langarzadeh N, Ahangarzadeh M, Aghazadeh M, Hasani A. [Comparison of the prevalence of multi-drug resistant Klebsiella Pneumoniae in children and adults with urinary tract infection admitted to hospitals in Tabriz]. J Biol Sci Islam Azad Uni Zanjan 2010;4:17-19.(Persian) 17. Hashemizadeh F, Zamanzad B, Jahandideh S, Ansari N, Gholipor A, Hashemizadeh F, et al. [KPC-producing Klebsiella pneumoniae ESBL detection in clinical samples in Iran]. J Lorestan Uni Med 2013;15:104-14.(Persian) 18. Fazeli H, Dolatabadi RK, Taraghian A, Isfahani BN, Moghim S, Norouzi M. Carbapenem resistance pattern of multiple drug-resistant and extended-spectrum betalactamase-positive Klebsiella pneumonia in Isfahan. Int J Ent Pathol 2014; 2:21-8. 19. Japoninejad A, Ghaznavirad E, Belkum A. Characterization of Plasmid-mediated AmpC and Carbapenemases among Iranain Nosocomial isolates of Klebsiella pneumoniae using phenotyping and genotyping methods. Osong Public Health Res Perspect 2014;5:333-8. 20. Subha A, Ananthan S. Extended spectrum beta-lactamase production and multi-drug resistance in Klebsiella species isolated from children under five with intestinal and extraintestinal infections. Indi J Med Res 2001;113:181-5. 21. Ullah F, Malik SA, Ahmed J. Antimicrobial susceptibility pattern and ESBL prevalence in Klebsiella pneumoniae from urinary tract infections in the North- West of Pakistan. Afric J Microb Res 2009;3:676-80. 22. Sanchez GV, Master RN, Clark RB, Fyyaz M, Duvvuri P, Ekta G, Bordon J. Klebsiella pneumoniae antimicrobial drug resistance United States 1998-2010. Emerg Infect Diseases 2013;19:133-8. 23. Martinez JL, Baquero F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity and antibiotic resistance. Clin Microb Rev 2002;4:647-79. 24. Shokri D, Mobasherizadeh S, Norouzi M, Yaran M. [Isolation and identification of carbapenemase KPC producing strains of Enterobacteriaceae and determination of their antibiotic susceptibility patterns]. J Isfahan Med Sch 2013; 31:1247-56.(Persian) 25. Azimi L, Rastegar Lari AA, Talebi M, Ebrahimzadehnamvar AM, Soleymanzadeh S. Evaluation of phenotypic methods for 01
بررسی میزان مقاومت به داروهاي کارباپنم و تولید آنزیم کارباپنماز... محمد ربانی خوراسگانی و همکاران detection of Klebsiellae pneumoniae carbapenemase producing K. pneumoniae in Tehran Iran. J Med Bacteriol 2013;2:26-31. 26. Feizabadi MM, Etemadi G, Yadegarinia D, Rahmati M, Shabanpoor S, Bokaei S. Antibiotic-resistance patterns and frequency of extended-spectrum beta-lactamaseproducing isolates of Klebsiella pneumoniae in Tehran. Pol J Radiol 2006;12:362-5. 27. Castanheira M, Sader HS, Deshpande LM, Fritsche TR, Jones RN. Antimicrobial activities of tigecycline and other broadspectrum antimicrobials tested against serine carbapenemase and metallo-betalactamase-producing Enterobacteriaceae report from the SENTRY antimicrobial surveillance program. Antimicrob Agents Chemother2008;52:570-3. 28. Gupta V, Kumarasamy K, Gulati N, Garg R, Krishnan P, Chander J. AmpC β- lactamases in nosocomial isolates of Klebsiella pneumoniae from India. Indian J Med Res2012 Aug;136:237-41. 29. Bina M, Pournajaf A, Mirkalantari S, Talebi M, Irajian G. Detection of the Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) in K. pneumoniae isolated from the clinical samples by the phenotypic and genotypic methods. Iran J Pathol 2015;10:199-205. 30. Cuzon G, Naas T, Truong H, Villegas MV, Wisell KT, Carmeli Y. Worldwide diversity of Klebsiella pneumonia that produces β-lactamase blakpc-2 gene. Emerg Infect Dis 2010;16:1349-56. 31. Pasteran F, Mendez T, Guerriero L, Rapoport M, Corso A. Sensitive screening tests for suspected class a carbapenemase production in species of Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2009;47:1631-9. 01
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایالم Evaluation of Carbapenems Resistance and Frequency of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) Enzyme in Klebsiella pneumoniae Strains Isolated from Clinical Samples and Determination of their Acquired Resistant profiles Shokri D 1, Rabbanikhorasgani M 2* (Received: July 20, 2015 Accepted: September 6, 2015) Abstract Introduction: The resistance of Klebsiella pneumoniae strains to antibiotics is an important challenge for human health. The aims of this study were evaluation of the carbapenemase resistance and Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) enzyme in Klebsiella pneumoniae isolates and determination of their acquired resistance profiles. Materials & methods: In a cross-sectional study, Klebsiella pneumoniae strains were isolated from different clinical specimens during one year. Their acquired resistance profiles were determined by 31 antibiotics from 17 classes and the numbers of Multidrug resistance (MDR), extended drug resistance (XDR) and pan drug resistant (PDR) strains were determined. In carbapenem resistant strains, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of imipenem and meropenem were calculated by Epsilometer test (Etest) method. Prevalence of the KPC enzyme in these strains was determined by phenotype method using Modified Hodge Test. 1. Dept of Biology, Faculty of Sciences, Isfahan University, Isfahan, Iran * Correspondin author E.mail: m.rabbani@biol.ui.ac.ir Findings: Among the 98 isolated Klebsiella pneumoniae strains, the most effective antibiotics were colistin, tigecycline and chloramphenicol respectively. The 99% of strains were MDR and 6% were XDR and no PDR strain was detected. Resistance to carbapenems in these strains were 64.3% for Doripenem, 69.4% for Ertapenem, 58.2% for imipenem (55.1% in E-test method) and 64.3 for meropenem (65.3% in E-test method). Expression of KPC enzymes in 71% of strains was identified. Discussion & Conclusions: This study demonstrates the high prevalence of MDR strains and carbapenem drugs resistance and also high frequency of Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) enzyme in the Klebsiella pneumoniae isolates that it shows the urgent revision of the patterns of antibiotics consumption is necessary. Keywords: Carbapenem, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) Scientific Journal of Ilam University of Medical Sciences 22